JPH11502514A - サメ軟骨の抽出物、その製造法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、軟骨抽出物、およびそれを製造する方法に関する。抗血管形成活性、直接抗腫瘍増殖活性、抗炎症活性および抗膠原溶解活性を有する固体状抽出物は、改良された方法により得られた。この方法は水溶液中の軟骨のホモジネートを得る工程を含んでなり、このホモジネートを遠心分離し、そしてさらに分画して０〜５００ＫＤａの分子量の分子を有する全体の抽出物を得る。次いで、液状抽出物の組成を異なる方法により研究した。この抽出物をさらに分画すると、その活性成分のいくつかが予備的に特徴づけられた。全体の液状抽出物の生物学的活性の多重性のために、それは多数の疾患または症状、例えば、腫瘍増殖、血管形成、炎症および膠原溶解から成る群より選択される成分を有する疾患または症状を治療するために使用することができる。この抽出物は正常の身体機能に対して攻撃的作用をもたない。したがって、このサメ軟骨抽出物は非常に有望な治療上の価値を有する。軟骨抽出物を得る方法は、簡単でありかつ効率的である。したがって、この方法により得られる予期せざるほどに価値ある生成物は、新規な、明らかでない方法を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 サメ軟骨の抽出物、その製造法および使用 発明の背景 軟骨は無血管化された組織であり、そして抗血管形成因子を含有する潜在的候 補として研究されてきている。また、軟骨は腫瘍発生に対して比較的耐性の組織 である。軟骨に関連する腫瘍、すなわち、軟骨肉腫は、充実腫瘍のうちで血管化 が最も少ないものである。血管形成は、腫瘍の発生において重要な因子の１つの である。腫瘍細胞が隣接血管網状組織を誘発して拡張させて、それらの栄養要求 物を供給できる場合、離散した充実腫瘍の塊が現れる。したがって、血管形成に 関係する因子は腫瘍および抗血管形成因子の発生における役割について研究され てきており、さらに、血管形成阻害活性を有する薬剤は、また、腫瘍の増殖を抑 制するか、または腫瘍を退行させるツールとして研究されてきている。 仔ウシの肩甲骨の軟骨は、充実腫瘍の血管化を阻害する物質を含有することが 発見された（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９７６）。それは抗腫瘍剤として の可能性を促進するために、軟骨のより大きい供給源が探索されてきている。 サメはこの種類の血管形成インヒビターの潜在的源である。なぜなら、サメの 体内骨格は完全に軟骨から形成されているからである（サメの体重の６％／仔ウ シにおいて０．６％）。また、興味ある特性として、サメは腫瘍を発生する性向 が少ない。サメにおける腫瘍発生の確率が少ないことを説明するために、多数の 仮説が苦心して作られて来ている。Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１ ９９０）は、ＩｇＭ抗体が攻撃性因子を容易に攻撃できることを示 した。ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）は、サメが正常細胞を新形 成細胞と区別し、新形成細胞を破壊できるマクロファージを有することを示した 。ＲｏｓｅｎおよびＷｏｏｄｈｅａｄ（１９８０）は、軟骨魚網（ｅｌａｓｍｏ ｂｒａｎｃｈｓ）（サメおよびエイが属するグループ）において腫瘍がほとんど 存在しないのは、それらの組織中のイオン強度が高いためであり、これは高い体 温に相当することを仮定した。これらの条件において、これらの著者らは免疫系 が１００％近い免疫学的監視機構を発揮すると考えている。Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）は、サメは抗菌性および抗原生動物性を有するアミノステロ ールを産生することを発見した。最後に、ＬｅｅおよびＬａｎｇｅｒ（１９８３ ）およびＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ（１９８７）は、サメが血管 新生化を阻害する物質を産生することを示した。ＬｅｅおよびＬａｎｇｅｒ（前 掲）は、変性条件においてサメ軟骨からこの物質を抽出すること（グアニジン抽 出）によって、この物質を単離した。しかしながら、この抽出法は非常に長く（ ４１日）、変性された因子を有する抽出物を発生することがあり、そして活性成 分の収率は低い。仔ウシから分離された活性物質は約１６キロダルトン（ｋｄ） の分子量を有するが、同一グループの研究者らはサメにおいて取り出されたもの に正確な分子量を与えなかった。この物質は、３５００ダルトンより高い分子量 を有するとして定義されるだけである。Ｏｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９０ ）は、期間を短くした（４１日の代わりに２日）以外、ＬｅｅおよびＬａｎｇｅ ｒが記載する方法と同一の抽出法を適用した。Ｏｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．がサ メから単離した抗血管形成物質は、１０００〜１０，０００ダルトンの範囲の分 子量を有する分子に制限される。Ｓｃｈｉｎｉｔｓｋｙ（米国特許第４，４７３ ，５５１号）は、粗製粉末状サメ軟骨の 水抽出物を記載し、その１００，０００ダルトンより大きい画分は単独で、また はグルコサミンと組み合わせて抗炎症活性を有する。この抽出物の抗血管形成活 性または抗腫瘍活性を有する成分は、この特許において示唆されてない。Ｋｕｅ ｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，７４６，７２９号）は、ウシ軟骨から の多形核好中球（ＰＭＮ）エラスターゼインヒビターを単離した。このインヒビ ターは軟骨の水性抽出物から得られ、それから５０，０００ダルトンより小さい 分子量の分子が保持された。セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００上 の分画において、多数の画分が得られ、これらの画分が抗エラスターゼ活性を示 した後、これらから１０〜４０ｋＤの画分をプールした。活性成分は９．５の等 電点を有し、そして約１５，０００ダルトンの分子量を有することがある。Ｋｕ ｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，０４２，４５７号）は、また、ウシ 軟骨が５０，０００より小さい分子量の成分を有し、この成分が細胞増殖阻害活 性を有し、内皮細胞増殖に対する活性をもたないことを示した。Ｂａｌａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，８２２，６０７号）は、水溶液中の軟骨抽出物 を獲得し、この抽出物は抗腫瘍活性を有する。しかしながら、我々はＢａｌａｓ ｓａの方法を再現することによって得られた抽出物において抗腫瘍活性を観測し なかった。Ｓｐｉｌｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，２４３，５８２号 ）は、ウシ軟骨から６５ｋＤの分子量および３．８のｐｌを有する２つの糖タン パク質を単離し（グアニジン抽出）た。これは抗トリプシン活性および内皮細胞 増殖阻害活性を示す。 仔ウシおよびサメの軟骨は、多数の生物学的活性、例えば、前炎症活性、抗炎 症活性、抗血管形成活性、リゾチーム活性、細胞増殖活性、コラゲナーゼＩおよ びＩＶ型、エラスターゼ、および他のプ ロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシンおよびプラスミンに対する阻 害活性を含有する。しかしながら、臨床的に価値ある活性のプールを含んでなる 軟骨抽出物は、まだ、得られていない。 サメ軟骨の１または２以上の抗血管形成成分は、一般に、ウサギ角膜ポケット のアッセイまたはヒヨコ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおいて試験された。今日ま で、全粉末状軟骨は直接ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍上で、ヌードマウスに移植 されたヒト黒色腫異種移植片上で試験され（米国特許第５，０７５，１１２号） 、また、ＣＡＭ試験において抗血管形成作用について試験された。抗腫瘍作用は 軟骨抽出物にに帰属されたが、この作用は血液供給から腫瘍を除去する抗血管形 成成分に最もしばしば帰属された。現在まで、サメ軟骨が腫瘍細胞の増殖に対し て直接の作用を有するという証拠は存在しない。 サメ軟骨抽出物および画分を得るわずかの方法が既に知られている。それらの いくつかは、抽出を使用しないで粉末状粗製軟骨を製造する（米国特許第５，０ ７５，１１２号）。他の方法は、グアニジンのような変性剤を使用する（米国特 許第４，２４３，５８２号）。他の方法は、酵素消化により軟骨を前処理して、 軟骨を取り囲む筋肉、神経または血管構造物を除去し、この前処理工程に引き続 いて有機溶媒中で脂肪を排除し、次いで活性成分を水性相中で抽出する。（Ｂａ ｌａｓｓａ ｅｔ ａｌ．、米国特許第３，４７８，１４６号、同第４，３５０ ，６８２号、同第４，６５６，１３７号および同第４，８２２，６０７号）。生 物学的に活性な軟骨成分の完全性の保存に対する、このような前処理の効果は知 られていない。酵素消化は、度である場合、活性タンパク質成分加水分解するこ とがある。Ｂａｌａｓｓａの方法は、抽出物中の活性成分を濃縮する分画工程を 含まない。他の方法は、単に、非可溶化物質を排除す ることによって、軟骨の水性抽出物（水中において（米国特許第４，４７３，５ ５１号）または塩溶液（米国特許第４，７４６，７２９号））を製造する。後者 方法において、それ以上の研究および精製のために、特定の分子量の特定の画分 が特に保持された（上記説明を参照のこと）。 上に引用した方法は、いくつかの欠点を有する。それらの方法は、いくつかの 価値ある成分を変性することがある。そうでない場合、それらの方法は実際的目 的に時間がかかり過ぎるという欠点を有する。そのうえ、時間を要する方法は必 然的に十分な量の活性成分を生成せず、そして回収された成分の間で、あるもの は全く回収されないか、または検出可能活性を示すためには不十分な収量で回収 されるか、または特定の活性を得ることに集中することによって、いくつかの方 法は無視されてきている。 血管形成は癌の発生にのみ関係しない。異なる生理学的系（括弧内に示す）に 影響を与える、多数の疾患または症状は、血管形成依存性であり、それらの例は 下記の通りである：関節炎およびアテローム性動脈硬化症の班（骨および靱帯） 、糖尿病性網膜炎、血管新生緑内障、トラコーマおよび角膜移植血管新生化（眼 ）、乾癬、硬皮症、血管腫および過形成性瘢痕（皮膚）、血管付着および血管線 維腫（血液系）。したがって、新規な、有効な抗血管形成「因子」は、これらの 疾患の治療ならびに癌治療において使用することができる。そのうえ、前述の疾 患または症状の多数は炎症成分をも有するので、新規な、有効な抗炎症性「因子 」は、これらの疾患の治療ならびに他の炎症性疾患または症状の治療において使 用することができる。さらに、コラゲナーゼのようなプロテアーゼは、コラーゲ ン分解活性を有するために、多様な疾患および症状、例えば、癌および早期の老 化に関係するので、新規な、有効な抗膠原溶解「因子 」は、膠原溶解成分を有する疾患または症状の治療において使用することができ る。血管形成、炎症およびプロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼは、非常に種々 の疾患または症状において、単独で、または組合わせで直面することがあるので 、正常の身体機能に影響を与えないで少なくともすべてのこれらの活性を中和す ることができる生成物は大きい治療上の価値を有するであろう。 発明の説明 本発明は、多数の治療上価値ある活性を含有するという利点を有する、軟骨抽 出物を製造する新規な方法を提供する。これらのうちで、抗血管形成活性、抗炎 症活性、抗膠原溶解活性、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍増殖活性および直接ｉｎ ｖｉ ｔｒｏ抗腫瘍増殖活性は、サメ軟骨抽出物の中に満足すべき濃度において存在す ることが確証された。他の活性は同定または確証されてない。腫瘍細胞系におい て測定された作用は、直接抗腫瘍増殖活性の外に、細胞障害活性が存在するよう に思われることを示してである。すべての活性はサメ軟骨の液状抽出物において 得られ、そしてそれらのいくつかはサメ軟骨の固体状抽出物において得られるか 、または証明された。 本発明は、無傷の軟骨中に存在する生物学的活性な水溶性成分の実質的な部分 を有する液状抽出物を得る方法に関して、この方法は下記の工程を含んでなる： ａ）軟骨が約５００μｍより小さいか、またはそれに等しい大きさを有する粒 子に小さくなるまで、前記生物学的に活性な成分の完全性の保存に適合する条件 において、軟骨を水溶液中で均質化して、粒子と前記生物学的に活性な成分を有 する粗製の液状抽出物との混合物を形成し、 ｂ）前記ホモジネートを遠心して粒子を粗製の液状抽出物から分 離し、そして ｃ）約５００キロダルトンより小さいか、またはそれに等しい分子量を有する 軟骨分子を含有する最終の液状抽出物を得るために、粗製の液状抽出物をさらに 分離する。 この新規な方法は、実施が容易でありかつ効率よいという利点を有する。高い 収量の軟骨抽出物はが得られ、この抽出物は、特にサメ軟骨から得られ、少なく ともすべての前述の生物学的活性を含有する。好ましくは冷たい温度（約０〜１ ０℃）において、非変性条件において（好ましくは純粋な水）において、ほぼ中 性のｐＨ（約６〜８）において実施して、未知の物理化学的特性の化合物を回収 する確率を最大とする。この方法によれば、軟骨成分は小さい体積の溶液（軟骨 の１Ｋｇについて１リットル程度に少ない）で、短い期間の均質化（１０〜１５ 分まで程度に短い）後に抽出することができる。固体状抽出物を回収するために 、同一の方法を使用するが、ただしペレットを回収し、そして、上清を無視して 、凍結乾燥する。 本発明は、軟骨抽出物、特に軟骨魚網の種、より特にサメから供給される抽出 物に関する。固体状抽出物は活性を示した。それはコラーゲンおよび非加水分解 性成分を含有することがある。それは、また、全体の液状抽出物から抽出された 残留活性を含有することがある。全体の液状抽出物は、活性に非常に富んでいる 。それはそのままで使用するか、または濃縮することができる。生物学的活性の 維持を好適にする濃縮工程は可能であった。活性成分を劣化させる方法、例えば 、加熱蒸発方法に頼ることは、注意して回避された。約１ＫＤａの分子量カット オフ値を有する膜を使用する限外濾過を使用して、本発明の液状抽出物を濃縮し た。結局、約１〜５００ＫＤａの分子量の分子を含有する軟骨抽出物はが得られ 、試験した。 全体の液状抽出物（０〜５００ＫＤａ）をさらに分画して、その活性成分を特徴 づけた。多数の画分が異なる方法により得られた。腫瘍細胞系について試験した 画分のあるものは、分子量および等電点によりおおまかに特徴づけられた。他の 画分は活性、特に抗膠原溶解活性または抗血管形成活性を割り当てられた。これ らの画分は完全に特性決定および同定されてない。したがって、価値ある活性が 全体の液状抽出物および画分において回収され、これらは有利に使用することが できる。大きい量の粉末状軟骨を投与する代わりに、いっそう許容されかつ濃縮 された抽出物を今や投与することができる。 本発明は、また、活性成分として、前述の軟骨抽出物の１つを含んでなる治療 用または化粧用組成物に関する。最大の関心は、皮膚科学および化粧学において 使用するための局所用組成物に向けられた。この関心は軟骨抽出物の観察された 活性から来る。これに関して、観察された抗膠原溶解活性および抗炎症活性、お よび角質細胞におけるタンパク質キナーゼＣの誘導により仲介される細胞分化の 中和作用は、炎症の減少、しわまたは皮膚の萎縮の調節、早期の老化の遅延、ア クネの減少、皮膚バリヤー機能の改善、炎症または刺激の減少および皮膚平滑化 作用の組成物および方法において、サメ軟骨抽出物を使用するためのルートを開 くものと考えられた。このような方法は本発明の範囲内に入る。サメ軟骨の液状 抽出物は、癌、関節炎、乾癬およびアクネの症例において首尾よく試験され、腫 瘍の増殖、血管形成、炎症および膠原溶解から成る群より選択される１または２ 以上の成分を有する疾患または症状を治療する組成物および方法は本発明の範囲 内に入る。 本発明の説明 本発明は添付図面に示されている特定の態様によりいっそう容易に理解される であろう。添付図面の目的は本発明の範囲を制限するよりむしろ本発明を例示す ることである。図面の簡単な説明 第１図は、ＺＲ７５−１およびＭＣＦ−７細胞に対する、増加する投与量のサ メ軟骨（固体状抽出物）の阻害活性を示す。 第２図は、２つの濃度の軟骨の凍結乾燥物を使用するか、または使用しないで 、増加する濃度のエストラジオールの存在において、ＤＮＡ含量により測定した ＭＣＦ−７細胞の量の投与量−応答曲線を示す。 第３ａ図および第３ｂ図は、栄養により軟骨の凍結乾燥物と上清との組合わせ を投与した乳腺癌を発生したラット、および水のみを投与したもの、の肝臓切片 の比較を示す。 第４ａ図および第４ｂ図は、栄養により軟骨の凍結乾燥物と上清との組合わせ を投与した乳腺癌を発生したラット、および水のみを投与したもの、の腎臓切片 の比較を示す。 第５ａ図および第５ｂ図は、栄養により軟骨の凍結乾燥物と上清との組合わせ を投与した乳腺癌を発生したラット、および水のみを投与したもの、の肺切片の 比較を示す。 第６ａ図および第６ｂ図は、栄養により軟骨の凍結乾燥物と上清との組合わせ を投与した乳腺腫瘍を発生したラット、および水のみを投与したもの、の乳腺腫 瘍切片の比較を示す。 第７図は、第６ａ図および第６ｂ図から誘導されたヒストグラムであり、腫瘍 における血管面積に対する軟骨抽出物の効果を示す。 第８図は、ロトフォー（Ｒｏｔｏｆｏｒ）で分離された液状画分の非変性条件 における電気泳動プロフィルを表す；分子量マーカー は左に存在し、次いで分離された画分との比較のために、分画前の粗製透過物の 試料が存在する。 第９ａ図および第９ｂ図は、初期の症状（上の写真）と比較した、有効量の濃 縮された液状軟骨抽出物を含有する局所用組成物で治療したとき（下の写真）に おける、乾癬を有する２人の患者の症状の有意な改善を示し、一方は過角質化を もつ患者である（第９ａ図）、そして他方は過角質化をもたない患者である（第 ９ｂ図）。 第１０図は、サメ軟骨の３つの異なる抽出物のＦＰＬＣ移動パターンを示す。 パネルＡにおいて、本発明に従う軟骨液状抽出物についてのＤＵＰ標準。パネル ＢおよびＣにおいて、ＢＡＬおよびＯＩＫは先行技術、それぞれ、Ｂａｌａｓｓ ａ ｅｔ ａｌ．およびＯｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の抽出物を表す。 第１１図は、第１１図において規定した同一の抽出物のＨＰＬＣ移動パターン を示す。 第１２図は、対照と比較した、抗血管形成参照化合物であるプロタミンの異な る濃度を使用して実施したＣＡＭ試験の結果を示す。 第１３図は、本発明のサメ軟骨の本発明の全体の液状抽出物（ＤＵＰ）の２つ の画分を使用して実施したＣＡＭ試験の結果を示し、一方は１０，０００ダルト ンより小さい分子量を有し、他方は１０，０００ダルトンより大きい分子を有す る。 第１４図は、Ｂａｌａｓｓａの方法により製造された生成物（ＢＡＬ）の等し い濃度と比較したときにおける、本発明の全体の液状抽出物（ＤＵＰ）を使用し て実施したＣＡＭ試験の結果を示す。 第１５図は、Ｏｉｋａｗａの方法により製造された生成物（ＯＩＫ）の等しい 量の乾燥物質重量から得られる試料と比較したときにおける、本発明の全体の液 状抽出物（ＤＵＰ）を使用して実施したＣＡＭ試験の結果を示す。 第１６図は、本発明に従い調製された全体のサメ軟骨の液状抽出物の存在また は非存在において測定した、ＤＭＳＯ対照と比較した、ケラチノサイトに対する ＴＰＡの効果を示す。 第１７図は、皮膚の刺激のモデルに対する本発明の全体の液状抽出物の抗炎症 効果を示す。 第１８図は、１０，０００ダルトンより小さい分子量を有する本発明の全体の 液状抽出物の画分の他のＨＰＬＣ移動パターンを示し、前記画分は濃縮し、５つ のサブ画分に分離された。 第１９図は、異なる被験体積における第１８図に示した各サブ画分の抗膠原溶 解作用を示す。 特定の態様において、サメのブラック・スパイニイ・ドッグ・フィッシュ（Ｂ ｌａｃｋ Ｓｐｉｎｙ Ｄｏｇ Ｆｉｓｈ）およびコモン・スパイニイ・ドッグ ・フィッシュ（Ｃｏｍｍｏｎｎ Ｓｐｉｎｙ Ｄｏｇ Ｆｉｓｈ）から、軟骨を 得た。エタノール処理したメスおよびハサミで引っ掻くことによって、筋肉およ び結合組織を除去した。次いで、軟骨をプラスチックバッグの中に真空包装し、 それ以上の使用のために−２０℃において凍結した。本発明の方法において、任 意の軟骨源を使用することができる。「背景」の節において明確に述べた理由で 、我々はサメの軟骨を選択した。軟骨魚網（これはこのグループの動物源として サメおよびエイを包含する）の軟骨から出発して、ほぼ等しい生成物が得られる と考えられる。軟骨の哺乳動物源を使用する場合、生成物は異なる可能性が最も 強い。 抽出前の軟骨の調製の変更は、それが問題の生成物（例えば、全体の液状抽出 物またはその特定の画分）の活性に実質的に影響を与えないかぎり、使用するこ とができる。いくつかの活性成分はＢａｌａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（米国特許第 ４，８２２，６０７号）が 教示するようにタンパク質分解消化に耐性であって、軟骨から取り囲む組織を除 去することができるが、他のものはこのような処理に耐えることができない。こ のような前処理に耐性であると思われない活性の１つは、抗血管形成活性である （第１５図）。したがって、別々の活性が割り当てられた水溶性活性成分のすべ てのできるだけ多くを含有する液状抽出物を製造しようと望む場合、このような 消化工程は回避するか、または広範な加水分解またはタンパク質分解を防止する ように注意して監視すべきである。 凍結乾燥された軟骨の調製 きれいな軟骨を新鮮な状態で使用するか、または４℃において融解した。次い で軟骨をエタノール処理した肉細断機の孔を適切な体積水（等しい量（重量／体 積）はほぼ最小体積であるが、価値ある成分の回収の収率に影響を与えないで増 加することができる）と一緒に多数回（特に３回以上）させた。小さい体積は、 実際的観点から、不必要に大きい体積よりも操作が便利であるので、好ましい。 実際に、水を逆浸透および０．１μｍのフィルター上の濾過により精製した。多 数の水溶液（例えば、塩を含有する）を水の代わりに使用できるであろう。複数 の水溶性活性の反応を考えるとき、ほぼ中性のｐＨおよび非変性条件における作 業は、軟骨成分のあるものの溶解または変性を回避するために好ましい。水溶液 中の未知のタンパク質の挙動は予測不可能である；あるものは酸性加水分解にお いて、あるものは塩基性ｐＨにおいて、いっそう「快適」であることがある。さ らに、あるタンパク質は適度の変性条件において抽出可能である。ただし、この ような変性は水溶液中でこれらのタンパク質の復元に不可逆的に影響を与えない ことを条件する。したがって、これらの因子のすべてを考慮して、純粋な水中で 軟骨の活性成 分を抽出する方法は、非常にすぐれた収率で、未知の構造および挙動を有する成 分を回収するための賢明な選択であることが示された。 次いで、約４℃において台所用ブレンダー中で最大速度において撹拌すること によって、軟骨／水のブレンドを均質化した。もちろん、撹拌の速度ならびに水 溶液の体積は抽出時間に影響を及ぼすことがある。したがって、均質化時間の合 理的な範囲は約１０分程度に短く、２４時間程度に長く、好ましくは約１０〜６ ０分であることができる。温度は約１０℃程度に低く維持して、酵素インヒビタ ーを使用するとき、内因性酵素による活性化合物の分解を回避すべきである。理 想的には、０℃に近い温度が探求されるべきである。通常このような実験は、温 度を４〜１０℃に維持できる、低い室温において実施されるので、この温度範囲 は本発明の方法において許容される。明瞭および簡潔を目的として、以後この許 容温度範囲を表示するために、用語「約４℃」を使用する。 ブレンダーが粒子の大きさを十分に減少しなかった場合、このホモジネートを ４℃において１０分間ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ディスインテグレーター にかけることによって、このホモジネートをさらに液化することができる。また 、ブレンドはブレンダー−ディスインテグレーターにおいて単に均質化すること ができ、これは、我々の手において、１０分の液化工程を節約する。均質化工程 が完結したとき、残留粒子の大きさは約５００μｍより小さい。もちろん、最初 の軟骨の粉砕について説明した時間および温度の同一の許容範囲が等しく適用さ れる。均質化後の粒子の大きさは非常に小さくある必要はない。したがって、抽 出前に軟骨を微粉砕する必要性を回避することができる。事実、水性抽出前の粉 末の形態の軟骨の微粉砕は、このような微粉砕を凍結乾燥状態または加熱乾燥状 態で実施するとき、価値ある活性を変性することがある。 ホモジネートを４℃、１３，０００×ｇにおいて１５分間遠心分離する。この 工程はペレットから上清を急速にかつ効率よく分離する１つの方法である。これ らのパラメーターの変動および調節は、当業者の知識の範囲内であり、ホモジネ ートの体積および使用する装置の体積に依存するであろう。 生ずるペレットを２４〜４８時間凍結乾燥する。この最初の画分を、以後にお いて、凍結乾燥物または固体状抽出物と定義する。 必要に応じて、上清を２４μｍのワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）フィルターで 濾過して、限外濾過カラムの性能に影響を与えやすい粒子を除去することができ る。次いで、濾過した材料を、約４℃において、約５００，０００ダルトンの多 孔度を有する接線方向流の濾過カラム上で限外濾過する。このカラムは、０〜約 ５００ＫＤａの分子量の水溶性分子を含んでなる、最初の粗製透過物を与える。 この粗製透過抽出物を０．２２μｍのフィルターで滅菌濾過し、それ以上の使用 のために、アリコートを無菌のびんに入れた。この画分を、以後において、粗製 透過物または全体の液状抽出物と呼ぶ。 また、ペレットおよび上清を得るために、より高い性能の遠心分離手順が開発 された。１３，６００×ｇにおける１５分の遠心分離および引き続くワットマン （Ｗｈａｔｍａｎ）フィルター上の全体の濾過の工程を、３０μｍの多孔度のナ イロンポケットを装備したＣＥＰＡ遠心分離機による３０００〜４０００×ｇの 遠心分離と置換した。２５ｋｇ／２５リットルの調製物を、その方法において、 ３０分以内の間遠心分離し、２９リットルの上清を得ることができる。得られる 水性体積は水の出発体積よりも大きく、軟骨それ自体の水分が収穫されたことを 示唆する。凍結乾燥物および全体の液状抽出物は、下記の近似組成を有すること があり、この組成はバッチ 毎に、異なる材料を使用すとき、観測される変動をおおよそ考慮している： 凍結乾燥物： 脂質 ７．３５％¹ タンパク質 ４６．２％² 湿度 ２０．４％ ナトリウム ４．１６ｍｇ／ｇ³ カリウム ２．６４ｍｇ／ｇ カルシウム １１４ｍｇ／ｇ マグネシウム １．４９ｍｇ／ｇ 亜鉛および鉄微量物 全体の液状抽出物： 脂質 ０．１０〜０．２０％¹ タンパク質 ８〜２５ｍｇ／ｍｌ² 湿度 ９７〜９９％ ナトリウム ３０〜２２０ｍｇ／１００ｇ³ カリウム ３０〜４０ｍｇ／１００ｇ カルシウム ２．０ｍｇ／１００ｇ マグネシウム １．１ｍｇ／１００ｇ 亜鉛および鉄微量物¹ 、²それぞれ、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ（１９８４）節１．６．２１９〜２ ２０および２．００５に発表されている指示に従い測定された。³ ＳＡＡ手順に従い測定された。 タンパク質含量は、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法により評価し、この方法 は事実有機窒素（Ｎ）を測定する。有機窒素は、下記の方程式を使用して、タン パク質当量に変換される： タンパク質含量（ｍｇ／ｍｌ）＝（Ｎ％×６．２５）／１００ 炭水化物は検出不可能であり、炭水化物は１つまたは他の抽出物の中に存在す るが、プロテオグリカンおよび／またはムコポリサッカリドの形態にあると推定 することができる。これらの化合物は測定されたレベルの湿度において含めるこ とができる。凍結乾燥物は予期しないレベルの湿度を含有し、これはＯＨ基によ り測定された。２０％の水分は軟骨において通常回収される炭水化物の百分率に 近いが、凍結乾燥物の湿度は０％に近くあるべきであるので、この仮説は証明さ れるべき状態にある。 下記によりＵＳＰ ＸＸＩＩＩを適用して、無菌はコントロールされた： １０９０、１’Ｅｓｃａｒｂｏｔ、Ｃｅｎｔｒｅ Ｉｎｄ ４Ｊ４、および ２） Ｎｏｒｔｈｖｉｅｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ ． １８８０、Ｈｏｌｓｔｅ Ｒｏａｄ、Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏ ｋ、ＩＬ、６００６２ Ｕ．Ｓ．Ａ．ＦＤＡ ｒｅｓｉｔ ｒａｔｉｏｎ ｎｏ．１４−１８０２８。活性のアッセイ ： 凍結乾燥物： ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ： これらのアッセイは、ホルモン依存性癌細胞系ＭＣＦ−７およびＺＲ７５−１ （それぞれ、ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｏ．２２−ＨＴＢおよび１５００−ＣＲＬ）につ いて実施された。ＺＲ７５−１細胞 ： 基本ＲＰＭＩ培地： ５２ｇのＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドを含まない）（Ｓｉｇｍａ Ｒ ８７５５）、１７．８７５ｇのＨｅｐｅｓ（酸を含まない；Ｓｉｇｍａ Ｈ０７ ６３）、０．５５ｇのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｐ５２８０）および １０ｇのＮａＨＣＯ₃を５リットルの純粋な水中で混合し、ＮａＯＨでｐＨ７． ４０とした。 直ちに使用しない場合、この溶液を光から保護して光不安定性物質を保存しな くてはならない。この溶液を濾過し、５００ｍｌの無菌のびんの中に分配し、４ ℃において最大３カ月間貯蔵した。 細胞培養維持培地： 基本ＲＰＭＩ培地に、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（胎仔ウシ血清）、１００Ｕ のペニシリンＧ／５０μｇの硫酸ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ０９０６ ）／ｍｌの培地、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｇ１５１７）および１ ｎＭのＥ₂（β−エストラジオール Ｓｉｇｍａ Ｅ８８７５）を補充した。 実験培地： 基本ＲＰＭＩ培地に、５％のＦＢＳＡ（デキストラン−炭上に吸着された胎仔 ウシ血清）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＵのペニシリンＧ／５０μｇの硫 酸ストレプトマイシン／ｍｌの培地および５０ｎｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇ ｍａ）を補充した。この培地に、増加する濃度の前述の凍結乾燥物ならびに異な る濃度のエストラジオール（１０^{12 〜5}Ｍ）を添加した。 ＭＣＦ−７細胞： 基本ＤＭＥ−Ｆ１２培地： ＤＭＥ−Ｆ１２培地（重炭酸塩およびフェノールレッドを含まない；Ｓｉｇｍ ａ）を、純粋な水中で製造業者の指示に従い再構成した。１リットルについて、 １．２ｇの重炭酸ナトリウムを添加し、ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣｌで７．４０にし た。この溶液を濾過し、５００ｍｌの無菌のびんに分配し、４℃において最大３ カ月間貯蔵した。 細胞培養維持培地： 基本ＤＭＥ−Ｆ１２培地に、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（胎仔ウシ血清）、１ ００ＵのペニシリンＧ／５０μｇの硫酸ストレプトマイシン／ｍｌの培地、２ｍ ＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１ｎＭのＥ₂（エストラジオール）を 補充した。 実験培地： 基本ＤＭＥ−Ｆ１２培地に、５％のＦＢＳＡ（デキストラン−炭上に吸着され た胎仔ウシ血清）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＵのペニシリンＧ／５０μ ｇの硫酸ストレプトマイシン／ｍｌの培地および５０ｎｇ／ｍｌのインスリン（ Ｓｉｇｍａ）を補充した。ＺＲ７５−１細胞について記載したように、凍結乾燥 し、エストラジオールを同一濃度で添加した。ＦＢＳＡの調製 ： 胎仔ウシ血清を１％（ｗ／ｖ）の炭（アルカリ性物質を脱色する炭）と混合し た。デキストランＴ７０の溶液を炭−血清溶液に添加して、０．１％（ｗ／ｖ） の濃度とした。この混合物を４℃において一夜撹拌した。４℃、１０，０００× ｇにおいて３０分間遠心分離した後、血清をデカンテーションし、再び同一比率 の炭およびデキストランと混合し、室温において３時間撹拌し、遠心分離した。 次いで血清を５６℃において２０分間加熱不活性化し、滅菌濾過し、無菌のコニ カル・ファルコン管の中にアリコートを入れた。 ＺＲ７５−１およびＭＣＦ−７細胞を、２４ウェルのプラーク上で２０，００ ０細胞／ウェルまたは６ウェルのプラーク上で１５，０００細胞／ウェルの集団 の密度に到達するまで、増殖させ、異なる濃度の前述のように調製した凍結乾燥 物の存在または非存在において処理した。これを行うために、凍結乾燥物を培地 の中に再懸濁させ、滅菌濾過して、その水溶性成分を回収し、試験した。すべて の実験は三重反復実験において実施した。２日毎に、培地を抜き出し、新鮮な培 地と交換した。３７℃において５％のＣＯ₂を含有する、一定に加湿された雰囲 気下に、細胞を１７、７、３または３日間インキュベーター中で増殖させ、それ らは、それぞれ、第１、第２、第３または第４実験に相当した。細胞を直接計数 するか、またはウェルのＤＮＡ含量を測定することによって、細胞増殖の阻害を 測定した。 細胞増殖の上記の阻害百分率が証明するように、凍結乾燥物は投与量依存的方 法において、これらの２つの細胞系の細胞の増殖を阻害することができる。 第１図は、５０および１００ｍｇ／ｍｌの凍結乾燥物が、３日間の処理後、こ れらの細胞系上の減形成を明瞭に誘発する。 第２図は、１０^-12〜１０^-9Ｍのエストラジオールの存在において、処理され た細胞はこれらのホルモン投与割合により非刺激とされることによって対照細胞 のように応答することを示す。しかしながら、１ｎＭより上において、対照細胞 は強く刺激され、そしてＤＮＡ濃度は１０⁷Ｍのエストラジオールの存在におい て３．７５μｇに到達する（これに対して、エストラジオールの非存在において ０．６９μｇ）。３０および５０ｍｇ／ｍｌの凍結乾燥物で処理された細胞にお いて、最大刺激において測定されたＤＮＡは、それぞれ、１．９および１．８μ ｇである。 第２図は、エストラジオールに対する処理された細胞の親和性定数（Ｋｍ）が 、それぞれ、３０および５０ｍｇ／ｍｌの存在において、対照細胞のＫｍ値（１ １．７ｎＭ）より３〜１６倍高い（３１．３ｎＭおよび１７４．０ｎＭ）ことを 示す。これが意味するように、軟骨の凍結乾燥された固体状抽出物が存在すると き、細胞の同 一の増殖を達成するために、より高い濃度のエストラジオールが必要とされる。 したがって、この抽出物は最大応答を減少し（その９０％阻害）そしてエストラ ジオールに対する処理された細胞の親和性定数を増加する。 ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ： ４００匹の日齢４０の雌のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌ ｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃｏ．、Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ させた。その時において、２０ｍｇのＤＭＢＡ／１ｍｌのトウモロコシ油（９， １０−ジメチル−１，２−ベンズアントラセン；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した）を栄養により投与した。この処置後３カ月において、２ ４０匹の乳癌を有するラットを選択し、２つのグループに分けた。第１グループ は５つのサブグループのラットから成っていた。処置したグループのラットに３ ｍｌの水中の増加する濃度の凍結乾燥物の抽出物の１日量を８週間与えたが、対 照グループには同一体積の水を与えた。第２グループは４つのサブグループのラ ットから成っていた。処置したグループのラットに、また、上清と組合わせるか 、または組合わせせない、３ｍｌの水中の凍結乾燥物の抽出物の１日量を１０週 間与えたが、対照グループには同一体積の水を与えた。３０００ｍｇ／Ｋｇ／日 の濃度の凍結乾燥物および３ｍｌの上清で処置されたラットの第２グループのた だ１つのサブグループに、また、より少ない投与量の上清（１ｍｌの水中の約８ ｍｇのタンパク質）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 ラットは２つの実験の開始において１５１〜１７５ｇの体重であり、食物およ び水を任意に与えた。ラットの第１グループは平均直径０．９ｃｍの腫瘍を有し たが、ラットの第２グループは平均直径 ０．６ｃｍの腫瘍を有した。 結果は下記のように要約される： 栄養により投与された 腫瘍増殖阻害％ 軟骨抽出物の１日量 （対照に対する腫瘍直径の減少）第１実験：８週間 ５００ｍｇ／ｋｇ／日 ２％ １０００ｍｇ／ｋｇ／日 ４％ ３０００ｍｇ／ｋｇ／日 １４％ ５０００ｍｇ／ｋｇ／日 １５％第２実験：１０週間 ３０００ｍｇ／ｋｇ／日 １２％ ３０００ｍｇ／ｋｇ／日＋３ｍｌ上清 １８％ ３０００ｍｇ／ｋｇ／日＋３ｍｌ上清 ２０％ ＋１ｍｌ上清の腹腔内注射 これらの結果が証明するように、凍結乾燥物は活性成分を含有し、この活性成 分は胃腸管の中に吸収され、そして腫瘍大きさに対する作用を有する。この作用 は腫瘍細胞に対する直接の作用であるか、または抗血管形成仲介作用であろう。 また、これらの結果が示すように、上清は約５％の腫瘍大きさの補助的減少に より反映される活性を有する。 これらの結果が、また、示すように、凍結乾燥物は活性成分を含有し、この活 性成分は水溶性ではなく、および／または残留の水溶性を含有できる。したがっ て、究極的に、収率をなお改良できる場合、ペレットを水溶液中で再抽出して水 溶性成分を最大に回収することができる。組織病理学 軟骨抽出物の活性分子の無毒を評価するために、前述のｉｎ ｖｉｖｏ実験に おいて使用した動物を断頭により殺し、分析のために下記の組織を採った：肝臓 、肺、腎臓、心臓、脳、筋肉および乳腺。これらの組織から脂肪を除去し、次い でそれらをブワン液中で２日間固定した。エタノール中で脱水した後、固定した 組織をパラフィンの中に埋めた。それらの切片を形成し、ガラススライド上に取 付け、ヘモトキシリンで着色し、顕微鏡下に可視化した。 組織学的実験において、最大の投与量の凍結乾燥物を単独で使用したとき（デ ータは示されていない）、または上清と組み合わせて凍結乾燥物を使用したとき （参照、第３ａ図および第３ｂ図、第４ａ図および第４ｂ図、および第５ａ図お よび第５ｂ図）、有害作用は視ることはできないことが明らかにされた。 これが示唆するように、凍結乾燥物および上清は選択的腫瘍大きさ応答活性を 有する。 癌性乳腺において（参照、第６ａ図および第６ｂ図）、血管の面積の重要な減 少が観測された。次いで、これらの活性分子の抗血管形成作用は、第７図に例示 しかつ要約されている結果により確証される。 第７図は、凍結乾燥物（ｐ．ｏ．）−上清（ｐ．ｏ．＋ｉ．ｐ．）の組合わせ を使用したとき（参照、第６ａ図および第６ｂ図）、血管面積の５５％の減少が 腫瘍において観察された。 腫瘍大きさの減少は、その血管化の重要な減少、腫瘍細胞に対する直接作用、 または双方の現象の組合わせのためであろう。これらの抽出物の抗血管形成作用 は、上記においてよく描写されている。直接の減形成作用はホルモン依存性細胞 に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ において観察されたが、これはｉｎ ｖｉｖｏにおいて確証されてない。 上清がＺＲ７５−１細胞に対して凍結乾燥物の作用を越えた増加した作用を示 すことを前述の結果が示したので、その成分をさらに研究した。 活性分子を含む液体分画の調製方法 サメの軟骨を採取し、前記のように処理した。遠心分離後、ペレットを廃棄し 、上澄み液を前記と同じ方法で処理して、０．２２μｍのフィルターで無菌濾過 を行なった。 上澄み液は、以後、例えば限外濾過後の生成物のように、粗透過物と呼ぶもの とする。 このようにして得られた粗透過物を、ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマト グラフィ）に通す。 ＦＰＬＣ条件： カラム：Ｈｉｌｏａｄ ２６ｍｍ×６０ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３０ ０ ＦＰＬＣ系：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のもの サンプルはすべて、カラムに充填する前に、０．２２μｍのフィルターで濾過 した。溶離緩衝液は、１５分脱ガスされた濾過済みホスフェート緩衝塩液（ＰＢ Ｓ）であった。充填されたサンプルの容積は、通常３．２ｍｌであり（１３ｍｌ までであってもよい）、流量は、ｍｌ／分であった。１０ｍｌの分画を回収した 。溶離化合物を、紫外線吸収（２８０ｎｍ）で検出した。検量線図は、Ｓｉｇｍ ａ社のＭＷ−ＧＦ−１０００検量キットを用いて得られた。この検量サンプルは 、分析のために充填されたサンプルと同じ容積であっ た（３．２ｍｌ）。サンプルの溶離容積は、カラムの空隙容積が差引かれた溶離 容積に対して、検量キットの化合物の分子量をプロットすることによって導き出 した。空隙容積は、デキストランブルーを注入して得られた（分子量＝２，００ ０，０００）。 これらの分画の活性テストを、ＺＲ７５−１細胞に対して行なった。興味深い 分画が同定されたが、これらの特徴をさらなる調査によって確認した（下記）。 透過物の活性成分のこのほかの特性決定は、Ｒｏｔｏｆｏｒ（Ｂｉｏｒａｄ １７０−２９５０：下記の等電集束（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃａｌｉｚａｔ ｉｏｎ）参照）、および分子量が１０〜３０ＫＤ、３０〜１００ＫＤ、１００Ｋ Ｄ以上の分画を得るための種々のカットオフ値のＡｍｉｃｏｎフィルターで実施 した。 等電集束 サメ軟骨の標本（４６ｍｌ透過物１ｋｇ／ｌ）を、５％グリセリン含有純水４ リットルに対して、４℃で、スペクトル細孔＃７ＭＷＣＯ ３５００ ＫＤ膜（ スペクトル１３２１１０）を用いて一晩透析した。透析溶液を、ｐＨ３．５〜１ ０．０の両性電解質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の３８０−１１２５−８７）２．７ ５ｍｌ、およびＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ社のＣ３０２３；３−［（３−コラミド プロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルフォネート）０．５ｇ と混合した。容積が５５ｍｌになるまで純水を補充した。溶液をＲｏｔｏｆｏｒ に充填した。等電集束を、４℃で１２ワットの定電力で（３０００ｘｉ電力供給 Ｂｉｏｒａｄ１６５−０５５４）、温度の維持を確保するために一定水循環下に 実施した。分離の当初は、電圧が３８０ボルト、アンペア数は３１ｍＡであった 。アンペア数が（１４ｍＡで）安定した時、電力は８７０ボルトであった。等電 集束を停止した。２０分画が回収された。 これらのタンパク質の同定は、電気泳動ゲルで分子量を測定して実施した（Ｌ ａｅｍｍｌｉ、米国、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）２２７号：６８ ０頁）。 これらの分画を、充填緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ参照）で４倍希釈 した。非還元条件下に８μｌアリコートを電気泳動に付した。 図８は、各分画および等電集束前の材料の電気泳動曲線を示す。 すべての分画を、層流フード下、細孔度０．２２μｍの無菌Ｍｉｌｌｉｐａｃ ｋ−６０フィルターに通して、無菌瓶詰めにした。 分画のタンパク質含量を、Ｌｏｗｒｙ計量法で評価した。１ｋｇ／２リットル の溶液（透過物１リットルあたりの粗軟骨重量として表わしたもの）について、 培地中の種々の濃度で、ＺＲ７５−１に対してテストを実施した。結果を下記に まとめた。 第一テスト： 透過物を凍結乾燥し、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＰＬＧを行なった。形成不全活 性は検出できなかった（データは示されていない）。 第二テスト： Ｒｏｔｏｆｏｒ分画でテストを実施した（透過物を蒸発によって濃縮させた） ：タンパク質の同定 第三テストは、ＦＰＬＣ分画に対して実施された（透過物を蒸発によって濃縮さ せた）： 分画 分子量 ６と７ １〜２．５ＫＤ 第四テストは、Ａｍｉｃｏｎ分子フィルターで得られた１００μｌ分画に対して 実施された。 ＦＰＬＣ分画６および７は、非常に低い分子量すなわち１〜２．５ＫＤの活性 成分を含んでいる。 この分画の形成不全作用は、凍結乾燥物の場合に見られた作用より、３３，０ ００倍までも高いことがある。前記結果は、凍結乾燥によって、溶離液に含まれ ているタンパク質の直接的な抗腫瘍活性のなんらかの損失が引起こされるらしい ということを示している。一方、固体抽出物の凍結乾燥では、このような損失は 生じなかった。このことは、軟骨粒子に含まれている活性成分が、凍結乾燥の変 性作用に対してあまり敏感でない環境にあるようであるということを示唆してい る。形成不全活性は、凍結乾燥に対して敏感であるので、水に戻された時、おそ らくは、安定剤または保護剤を、抽出物全体、または凍結乾燥前にこの活性を含 んでいる特別な分画へ添加することによって、実質的にこの活性を保持できるの であろう。 溶離物の活性成分のもう１つの同定 活性分画（ＺＲ７５−１細胞でテストされたもの）を、下記分子量の範囲にお いて回収し、別の型の精製によって測定した。測定は、まず同じ透過物（１ｋｇ ／ｌ）から開始し、前記のＦＰＬＣおよびＲｏｔｏｆｏｒ手順を用いて、直径１ ０ｍｍ×長さ３０ｃｍのＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムで実施した。流量は１ｍ ｌ／分にした。１ｍｌの４５分画を回収した。 分画２０〜２１ 分子量７０〜１２０ＫＤ に相当する分画の活性 分画２２ 分子量６０〜７０ＫＤ に相当する分画の活性 分画２９〜３２ 分子量３５〜４６ＫＤ に相当する一部重複する分画の活性 分画３４〜３５ 分子量２９ＫＤ に相当する分画の活性 分画３８〜３９ 分子量１〜２．５ＫＤ に相当する分画の活性 特異性 腫瘍細胞への活性の特異性を評価するために、限外濾過後に得られた透過物に ついて、他の間葉織から発生する細胞、すなわちヒトテノン線維芽細胞（ＨＴＦ ｓ）（これは正常な線維芽細胞である）に対してテストを実施した。 Ｂ．試験管内 ａ．患者 二人の患者（一人は血管新生性緑内障（ＮＶＧ）患者、もう一人は原発開放角 緑内障（ＰＯＡＧ）患者である）からのＨＴＦｓだけを用いた。 ｂ．ＨＴＦｓの植継ぎ培養および保管 各融合性培養物に、０．０５％トリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃ ｏ６１０−５３００ＡＧ）０．５ｍｌで、５〜１０分間３７℃の洗浄および分離 を行なった。ついで１５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥ／Ｆ−１２培地 １．５ｍｌを添加して、トリプシン／ＥＤＴＡを中和した。 粉砕および２５ｃｍ²Ｔ−フラスコへの移し替えによって、細胞の会合を行な った。このフラスコへ、１０％（ＦＢＳ）を含む追加の培地を添加した。融合に 達した後、ＨＴＦｓを７５ｃｍ²Ｔ−フラスコ、場合によっては１８０ｃｍ²Ｔ− フラスコに移した。十分な細胞が得られたら、このうちのいくつかの細胞を下記 実験に用い、他の細胞は、同時に、将来の実験のための同様の処理を行なうため に冷凍した。 ｃ．実験記録 融合に達したら、２〜３個の同じ１８０ｃｍ²Ｔ−フラスコで成長している、 一人の患者から採取された細胞を、前記手順によって解離させた。短時間の低速 遠心分離後、２５６−チャネライザーを備えたＺＭＩ Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器２ １６０１３で、細胞の数を数えた。 以下の試験管内実験のすべてについて、約５万個の細胞を、１％ＦＢＳを含む ＤＭＥ／Ｆ−１２培地１ｍｌ中において、各々１６ｍｍ皿と１２個の穴付プレー トに植え付けた。接種から１７時間（ｈｒｓ）後、１％ＦＢＳが補われた新しい 同じ培地１ｍｌ（「絶対」 対照）を加えた。実験の設計（上記および下記参照）に依って、１％ＦＢＳ培地 には、ＧＦｓ（成長因子）または透過物１ｋｇ／２Ｌ（軟骨重量／水容積）溶液 を補うか、あるいは補わず、無菌濾過を行なった。この日（０日目）、培養効率 を測定するため、いくつかの細胞サンプルの細胞数をも数えた（この効率は９５ ％あるいはそれ以上であるべきである）。 実験の着手から４８時間後、細胞を洗い、前記手順で解離させ、再び計数した 。細胞数は、「絶対」対照において得られた数の百分率として表わされた。 各々１％または５％ＦＢＳを含む、各「絶対対照」すなわち決定的な対照、お よび各実験群には、１％ＦＢＳ、および個別のＧＦ、あるいは３つのサンプルか ら成る軟骨透過物が補足された。 各実験は、一人または二人の患者の細胞に対して同時に実施し、少なくとも２ 度繰り返した。 成長因子（ＧＦｓ）または軟骨透過物による線維芽細胞の増殖への刺激を、同 じものの５％ＦＢＳによる刺激と比較した。 これらの実験において、ブタ血小板に由来する成長因子（ｐＰＤＧＦ）および ヒト組み換え型基本線維芽細胞成長因子（ｈｒ ｂＦＧＦ）（イタリア国ミラノ 市のＦａｒｍｉｔａｌｉａ Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社からＤｒ．Ｐ．Ｂｒａｚｅ ａｕへ寄贈されたもの）を、各々、１％ＦＢＳ中１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度 で添加した。実験の開始から４８時間後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで分散し 、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器で細胞数を数えた。 下記に示された３つの値（カラム１、２、３）のすべては、１つの穴あたりの 総数の１／２０に等しい。 血小板に由来する成長因子（ＰＤＧＦ）および基本線維芽細胞成長因子（ｂＦ ＧＦ）のような成長因子は、ヒトテノン線維芽細胞（ＨＴＦｓ）に対して刺激活 性を示したが、これらの細胞が軟骨透過物の存在下（１ｋｇ／２リットル）に成 長が行なわれた場合には、プラス作用もマイナス作用も観察されなかった。形成 不全作用も見られなかった。このことは、この透過物が腫瘍細胞に固有の形成不 全作用あるいは細胞毒性作用を有するが、正常な細胞には検知可能な作用は有し ないことを示唆している。同じ軟骨抽出物は、別の型の線維芽細胞であるＨＳＦ （ヒト皮膚線維芽細胞：データが示されていない）にも影響を与えなかった。試 験は行なわなかったが、凍結乾燥物も正常な細胞には影響を与えないと考えられ る。 従来技術の生成物との比較 軟骨エキスに大きな関心を抱いたのは我々が最初ではないため、従来技術に記 載の、あるいは従来技術から導き出せる二種類の生成物、すなわちＢａｌａｓｓ ａ（米国特許第４，８２２，６０７号）と及川ら（前出）の方法による生成物と の並列比較試験で本法で抽出した鮫軟骨流エキスの独特の性質を検証した。及川 らが記載した方法によると、主な画分が二つ得られ、一つは分子量が１〜１０キ ロダルトンの間の分子を有し、二つ目は１０キロダルトンより大きい成分を有す る。及川らは抗血管形成特性を一つ目の画分だけに起因すると考え、二つ目には ＣＡＭ試験で活性が全くないと述べている。及川の生成物を適切に比較すること によって、我々は総流エキスを二つの対応する画分に分画し、１〜１０キロダル トンを有する方を取っておいた。Ｂａｌａｓｓａは総流エキスを抽出する方法を 記載しているので、我々は我々の総軟骨流エキス（１〜５００キロダルトン）を 、子ウシ軟骨を鮫軟骨に置き換えたＢａｌａｓｓａの方法によって再度調製した 生成物と比較した。Ｂａｌａｓｓａと及川が等価な方法を記載していれば、ＦＰ ＬＣとＨＰＬＣで得られるパターンがほぼ重なり、ＣＡＭ試験で検査すると、こ の生成物は我々のものと類似の活性を示すはずだと仮定する。ＦＰＬＣとＨＰＬ Ｃクロマトグラフィーの前にすべての試料の最終濃度を１２μｇ／μＬ（乾燥重 量／溶液の体積）とした。及川の生成物は不溶性の物質を含むため、クロマトグ ラフィーの前に遠心分離、ろ過した。 Ａ）ＦＰＬＣ条件：スーパーローズ１２（ファルマシア）、ゲルろ過カラム Ｂ）ＨＰＬＣ条件：ＣＳ−Ｓ−ヘキシルカラム５μｍ、２５×０ ．９４ｃｍ、ＣＳＣ＃０５９−０８５、逆相カラム。 ３種類の方法で抽出した鮫軟骨試料を（推定乾燥重量／溶液の体積で）以下の ように標識した。 １）ＤＵＰは、１〜５００キロダルトンの分子を含むように分画した本発明の 調製物である（１２μｇ／μｌ）。 ２）ＢＡＬは、Ｂａｌａｓｓａらの処方による調製物である（１２μｇ／μｌ ）。 ３）ＯＩＫは、及川らによる画分３の調製物である（２７０μｇ／μｌ）。あ らゆるの分析に先立ち、すべての試料を最終濃度１２μｇ／μｌ（乾燥重量／体 積）とした。ＯＩＫ試料には多量の不溶物質が入っていたが、１３，２００ＲＰ Ｍの遠心分離または０．２μｍメンブランによるろ過によって容易にペレット化 できた。不溶物質のろ過や濃縮は、ＨＰＬＣおよびＨＰＬＣの前に不可欠である （Ａ、Ｂ）。 Ａ）ＦＰＬＣ測定結果のまとめ リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を溶出液として毎分０．５ｍｌの流速で試料をスーパ ーローズ１２（１０／３０）ゲルろ過カラムに流した（チャート速度＝毎分０． ２５ｃｍ）。濃度を調整した試料の部分標本１００μｌを注入前に０．２μｍメ ンブランでろ過した。ＯＤ２８０をモニターした。 カラムは以下の標準品で較正した（分子量、単位：ダルトン）。カタラーゼ（ ２３２，０００）、アルドラーゼ（１５８，０００）、アルブミン（５６，００ ０）、卵白アルブミン（４４，０００）、キモトリプシン（２５，７００）、リ ボヌクレアーゼ（１３，７００）、インシュリン（５，７００）、インシュリン Ｂ鎖（３５００）、インシュリンＡ鎖（２５００）、バシトラシン（１４５０） 、ビタミンＢ−１２（１３５５）。主ピークの分子量は下式に従っ て計算した。Ｌｏｇ₁₀ＭＷ＝７．５２−０．２１２×ＲＴ、ここでＲＴ＝溶出体 積（単位：ｍＬ）、Ｒ²＝０．９７６である。シチジン（２４６ダルトン）を用 いて決定したところ全カラム体積（Ｖ_T）は２１．９３ｍＬであった。ボイド体 積（Ｖ₀）はブルー・デキストラン（２×１０⁶ダルトン）によって８．３８ｍＬ と決定された。 第１０ａ図では、我々の試料ＤＵＰは最初の主ピーク（１）が１８．７６ｍＬ に溶出し、分子量３５００ダルトンを示した。続いて溶出した２２．７ｍＬのピ ーク（２）と２３．７ｍＬのピーク（３）は全カラム体積（シチジンによる決定 で２１．９３ｍＬ）を超えていた。これらのピークにはカラム・マトリックスに 対する親和性があると思われる。 第１０ｂ図では、Ｂａｌａｓｓａの試料ＢＡＬはカラムのＶ₀（８．４ｍＬ） 付近に溶出する小ピーク（１）、１８，５ｍＬ（４０００ダルトン）のピーク（ ２）、さらにＶ₁、以降の２２．６ｍＬと２８．２ｍＬに溶出する２本のピーク を示す。 第１０ｃ図では、及川の試料ＯＩＫもＶ₀に小ピーク（１）、１８．９ｍＬ（ ３３００ダルトン）にピーク（２）、２１．５ｍＬ（１０００ダルトン）にピー ク（３）および２７．３ｍＬにピーク（４）を示す。 試料を比較すると、３３００ダルトンは別として、ＤＵＰ試料の主バンドはそ の他の試料の同じ強度には見られないことが分かる。ＯＩＫ試料にはまさに少量 の２７．３ｍＬピークがあると思われた。ＢＡＬ試料には２８．２ｍＬに移動す るピークがあり、ＤＵＰ試料中の小ピークと対応させることができた。 ヘキシル逆相カラムによるＨＰＬＣのため、ＯＤ２１０とＯＤ２８０を同時に モニターした。遠心分離した試料（すべて１２μｇ／ μｌ）の部分標本５０μｌを負荷し、１００％Ｈ₂Ｏで溶出した。ＯＤ２１０（ 実施例１）およびＯＤ２８０によって標識した各クロマトグラムのピークは「実 施例１」に記す。このカラムのＶ₀は５．５ｍＬであった（１．４分）。 第１１ａ）図では、ＤＵＰにＯＤ２１０を介して観察される３本の主ピーク（ １、２、３）と２本の小ピーク（４，５）があった。ピーク１から離れて２本の 側ピークが観察され、１ａおよび１ｂと名付けた。ピーク１、１ａ、１ｂおよび ３にはかなりのＯＤ２８０吸収があった。対照的に、ピーク２に対応するＯＤ２ ８０はＯＤ２１０よりずっと低かった。 第１１ｂ）図では、ＢＡＬはもっと多くのＯＤ２１０ピークを示したが、強度 はＤＵＰピークと比較して弱かった。ピークの重なりによって分子の同一性を示 すことができた限りでは、Ｂａｌａｓｓａ試料のピーク３とピーク７だけがＤＵ Ｐ試料中のピークの保持時間と相関があるように思われる（それぞれピーク１ａ または１ｂおよびピーク４）。 第１１ｃ）図では、ＯＩＫエキス中に３本のピーク（１、２、３）だけが観察 された。ピーク１とピーク３はＤＵＰ試料のピーク１とピーク３と相関があった が、ＯＩＫのクロマトグラムにはピーク１の側ピークは見られなかった。ＯＩＫ 試料中のピーク高さはＤＵＰよりも低かった。ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣのパター ンは識別した生成物について特徴的であったが、我々はＣＡＭ試験でこの３種類 の生成物の抗血管形成活性を検証した。 ＣＡＭ試験 まず、異なる濃度（３７、７５および１５０μｇ）のプロタミンを用いてＣＡ Ｍ試験を行った。水を含むメチルセルロース・ディス クと、陽性対照としてプロタミンを含む別のディスクをニワトリ胚の絨毛尿膜上 に置いた（ｎ＝分析した胚の数）。その位置限定を簡単にするため各ディスク上 にＯリングを配置した。翌日、通常の仕方で一組の科学者が各Ｏリング中の血管 新生のレベルを点数化した。ＣＡＭ試験用の評価尺度は１−２−３点数によった 。（点数＝３）対照胚の縦に対向する四分円または対応する四分円と比較したと きの正常な血管新生。（点数＝２）血管がＯリングに入り込むが、途中で消滅す る。主な血管がＯリングを横断するが、その軌跡は明らかに影響を受けている。 Ｏリングのせいで分枝形成は少ない。（点数＝１）Ｏリング内に血管が全くない かそれた血管がない。血管はＯリングを迂回してそれを超えていかない限り、Ｏ リングを超えて成長しない。四分円の血管領域はＯリングのせいで明らかに縮小 されている。第１２図では、各カラム上の数値が各試料の最終点数を示す。同一 卵上に置いた２枚のディスク間の差の有意性を比較するためウィルコクソン統計 検定を使用した。期待した通り、用量−反応関係が観察された。 ＤＵＰエキスの１０キロダルトンより低い画分と高い画分を同一条件で試験し た。血管新生阻害において両者は強さが等しいことが示された（第１３図）。 我々の総抽出ＤＵＰをＢａｌａｓｓａの生成物ＢＡＬと比較した。Ｂａｌａｓ ｓａの生成物に有意な抗血管形成活性は再現されなかった（第１４図）。 粗ＤＵＰエキスを及川ＯＩＫの画分３と比較した。ＤＵＰとＯＩＫは両方とも ほぼ同等であった（第１５図）。それにもかかわらず、及川らは分子量が１０キ ロダルトンより高い画分には活性が検出 できなかったと述べたため本発明とかけ離れた教示を行ったが、第１３図の我々 の結果と矛盾している。 従って、Ｂａｌａｓｓａの方法と我々の方法の類似性にもかかわらず、これら 二つの方法によって得られた生成物は明らかに同じではない。 我々の生成物と比較した二種類の従来技術の生成物は、それでも軟骨エキスを 調製する古典的な方法と考えられる。上記の結果によると、本発明の方法は抗血 管形成活性に関する限り意外に良好な活性のある生成物を生成する。その他の活 性は本明細書中で後に検証するので、本発明の方法が単一のエキス中に多様な水 溶活性を再発見することに成功したと仮定することが可能である。 臨床試験 予備臨床試験を進める前に、超遠心分離後に得られた粗透過物を２倍および２ ０倍濃縮して濃縮活性透過物を調製した。これらの濃縮度は孔隙１０００ダルト ンの横流ろ過カラムによって得られ、溶出液の体積は２倍および２０倍となった 。濃縮した透過物を孔隙０．２２μｍのミリポア・フィルターでろ過した。軟骨 を代替の遠心分離法（孔隙３０μｍのメンブラン・フィルターを備えたＣＥＰＡ 遠心機を使用）で処理したところ、１０倍濃縮によって上記の２０倍濃縮エキス とほぼ同じタンパク質濃度を有する濃縮エキスが得られ、例えば約８〜１２ｍｇ ／ｍＬ（実験室規模の方法）のかわりに約１２〜２５ｍｇ／ｍＬ（改良法）が得 られた。無菌１０倍濃縮透過物を無菌フラスコに部分標本７ｍＬ（タンパク質約 ８５ｍｇ）ずつ分注し、−８０℃で一夜凍結し、使用するまでさらに−２０℃に 保存した。粗透過物と濃縮透過物の主な相違はタンパク質濃度である。タンパク 質含量の決定に使用した方法では全窒素化合物であっ てタンパク質だけではない（ケルダール法）ことは注意されるであろう。通常ロ ーリー法でタンパク質含量を決定する場合はタンパク質濃度が体積濃縮度に比例 するのに、比例しない理由がこれによって説明できる。このように、この濃縮段 階では低分子窒素化合物と同様に水も透過できると考える。 抗血管形成効果 濃縮した透過物を血管形成−依存性疾患の治療に使用した。３種類の代表的な 血管形成−依存性疾患についてヒトの診療で試験を行った。１番目の病型は癌（ 前立腺癌）、２番目の病型は皮膚障害（乾癬）、３番目の病型は関節炎であった 。下記実施例を見れば、この流エキス剤の少なくとも抗血管形成活性が説明され 、示されるであろう。 複数の皮膚疾患から乾癬症例を選択した。試験を行った乾癬症例中、角化症を 併発した乾癬と併発しないものとの差異に注目することは有意義である。角化症 では、プラークの形態で角化外皮が形成される。このようなプラークは活性成分 が効率よく血管に入り込むのを妨げる物理的障壁となる。 前立腺癌を患う患者は１０倍濃縮軟骨透過物を自発的に試した。 この患者は一連の従来の連続治療を受けたが、その成功は一時的であった。癌が 常習性を示した後に、この患者は本軟骨エキスの使用を開始した。 他のボランティアで、関節炎を患い、以前に薬物治療（プレドニゾン）を受け たことがある者またはそれを受けていない者が濃縮軟骨エキスの使用を開始した 。関節の疼痛と硬直の軽減によって検証したところ、その病状が改善していたこ とが立証された。 本明細書で後に示す結果は極めて有望であり、これによると、粗透過物とその 画分が有用なのはすべての血管形成−依存性疾患の治 療に対してであって、試験を行った特定の疾患だけではないことが予測されると 考えられる。疾患に血管形成が含まれる限り、本発明の軟骨エキスは、その有効 量を含む組成物中に入っていて、この組成物が適切な形態や正しい投薬であれば 、その疾患については効果があると考えられる。従って、当業者なら非常に多く の組成物を導き出すことができ、その選択はその投与方法と対照の病組織によっ て導かれるので、本発明が血管形成疾患の治療に使用する以下の特定の組成物に 限定されないことが理解されるであろう。組成物は様々な経路で投与され、例え ば局所、経口、舌下、直腸、静脈内、筋肉内、拡散法等がある。 軟骨エキスは魚のような味とにおいがあるので、患者の服薬遵守を促進するた めに、この組成物に調味料や香料を添加することができる。 乾癬 乾癬を患う患者でその有効性を検証するために、以下の外皮用組成物を作成し 、試験を行った。 ○ＥＭＵＬＧＡＤＥ^TMＣＬＢ ２９％（ｗ／ｗ） ○２０倍粗透過物 ６９．５％（ｗ／ｗ） ○ＧＥＲＭＡＢＥＮ^TMＩＩ １％（ｗ／ｗ） ○ラバンデューラ・アングスチフォリア ０．５％（ｗ／ｗ） ステアリン酸エステル、脂肪族アルコール、非イオン性乳化剤の混合物である ＥＭＵＬＧＡＤＥ↑ＴＭ↑ＣＬＢ（ヘンケル・カナダ社から購入）を撹拌しなが ら６５〜７０℃で加熱した。混合物の撹拌を続けながら加熱を停止した。混合物 の温度が４５℃に達したときに、精油のラバンデューラ・アングスチフォリアと 防腐剤のＧＥＲＭＡＢＥＮ^TM ＩＩ（ジアゾニジル尿素３０％、メチルパラベン１１％、プロピルパラベン３ ％、プロピレンパラベン５６％、サットン・ラボラトリーズ、米国、ニュージャ ージー州）を添加した。この混合物の温度が３０℃に達したときに、軟骨エキス を加えた。こうして得た組成物は、滑らかな非油脂性のクリームであった。製造 指針によれば、ＥＭＵＬＧＡＤＥ^TMの割合を変更することによって他の形態の種 々の粘度の外皮用組成物（乳剤、ローション剤、軟膏剤）が得られる。ペースト 剤、ゲル剤その他あらゆる形態の経皮吸収製剤を得るためにその他のビヒクルや 賦形剤を使用することができる。 上記の製剤を２週間の期間中、試みられた従来の治療に応答性であったがしば らくすると治療抵抗性となった乾癬を患う９名の患者のパネル（局所投与）に１ 日２回投与した。この試験のために四肢の両側に同じくらい対称的な程度に乾癬 がある患者を選択した。これらの試験は二重盲検方式で行い、いずれの患側が軟 骨エキスを含む組成物で治療され、いずれが対照組成物で治療されたかは皮膚科 医も患者も知らなかった。乾癬が角化症を併発していない５名の患者で顕著な改 善が見られた。角化症のある患者についての結果は中度良好であった。患者２名 の身体部分の写真を第９ａ）図と第９ｂ）図に示す。第９ａ）図では、角化症を 併発した乾癬に冒された患者は、それにもかかわらず、１ヶ月間の治療後には紅 斑がかなり軽減し、心因性掻痒を随伴していなかった。しかしながら、角化症は 依然重要である。角化症を併発していない乾癬を患う２番目の患者の写真（第９ ｂ図）には３ヶ月間治療後のずっと良好な改善が示されている。乾癬は多因子性 疾患と思われるので、患者の応答は、定着やこの状態の永続化における血管形成 や炎症などの構成要素の波及の重要性に依存すると仮定される。我々のエキスに は、抗血管形成活性が本当に存在し、それはＤＭＢＡ処理ラットとＣＡＭ試験で 示されている通りである。また、抗炎症活性も検証した（下記考察）。この種の 処方を関連他因子に向けられた他の治療剤（角質溶解剤、他の抗炎症剤、抗ヒス タミン剤、免疫抑制剤等）で補えば、より良好な結果が得られそうである。 この補完は、例えば有効量の角質溶解剤を含むように処方を修正するという形 にすることができる。また、このような相補性の治療剤を同時に、あるいは現在 の局所処方の代わりに、別に投与することによっても達成できる。さらに、この 相補的な薬剤を同じ経路で投与する必要はない。 軟骨エキスの割合が高いのにもかかわらず、上記の処方は全身効果を示さず（ 効果が治療した領域に限定される）、二次効果も示さない。 癌 前立腺癌を患う患者１名が１０倍濃縮透過物を試みた。１９８６年に腺癌が診断 された。そのとき、放射線治療が行われた。１９９１年に、ＰＳＡ（前立腺血清 抗原）濃度が正常値の上限４μｇ／Ｌに対して１３８μｇ／Ｌであった。次いで この患者は抗アンドロゲン治療（ＥＵＦＬＥＸ^TM）を併用した性腺摘除によって 完全に異なる治療を受けた。この治療は３年の間効果があったが、その後ＰＳＡ 濃度が再び上昇し始めた。１９９４年以来、この患者は１０倍透過物（舌下１日 投与量約７５ｍｇタンパク質／７ｍｌエキス、約１〜１．５ｍｇ／ｋｇ体重／日 に相当する）を使用している。ＤＭＢＡ処理動物で得られた結果（上記参照）に よれば、かなりの投薬量を服用していても、おそらくかなりの割合で胃腸管で吸 収されているはずである。ＰＳＡ濃度は１２から０．９μｇ／Ｌにゆっくりと低 下し、これは例えば充分にＰＳＡの正常濃度の範囲内である（最終結果は１９９ ５年５月に得られた）。また、この調薬養生法は、病 理を制御するべく、投与経路、活性成分の生物学的利用能、所望の積極性に従っ て意のままに修正できる。このとき、無毒性ラット（上記実施例参照）およびヒ ト（データは示していない）で検証した。 ＤＭＢＡ処理ラットで行ったもう一方の生体内実験では、流エキスの体重当た りの投与量は約１９０〜２２０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重であり、癌血管領域の 縮退に貢献したと推定される（タンパク質量がずっと多量の凍結乾燥品を併用し たとき５５％）。従って、約０．１から約２００ｍｇ／ｋｇ体重／日は、血管形 成を軽減または完全に破壊することによって、少なくとも部分的には、癌の治療 にとって正確に近い妥当な範囲の５０％有効量（ＥＤ₅₀）であると仮定される。 関節炎 関節炎を患う患者が自発的に総流エキス７ｍｌを１日につき１から２単位数ヶ 月間試した。これらの患者は関節の機能回復、疼痛および炎症の減退によって容 態がゆっくりと改善するのが見られた（約６０％に及ぶまで）。関節炎は血管形 成および炎症の構成要素を有するので、上記の効果は軟骨エキスの抗血管形成活 性および抗炎症活性に帰属される。 非抗血管形成効果 座瘡 発明者らが知る限りでは、座瘡は血管形成の構成要素を有する疾患や障害では ないが、それにも関わらず、軟骨エキスを座瘡に冒された患者で試験することに 心がそそそられた。座瘡に冒された患者で軟骨エキスの実験を行うため、以下の ゲル製剤を作成した。 ＣＡＲＢＯＰＯＬ^TM １．２％ 精製水 ７７．２％ ＮａＯＨ ０．３％ ＰＨＥＮＯＸＥＴＯＬ^TM ０．３％ ＴＷＥＥＮ ８０^TM ０３．％ ２倍軟骨エキス ２０．０％ ４０倍アロエ・エキス ０．５％ ２倍軟骨エキスには９〜１２ｍｇ／ｍＬのタンパク質が含まれる。この製剤に よると、多少とも重症の形態の座瘡（炎症性座瘡とｋｙｓｔｉｃ座瘡、データは 示さない）に冒された患者の皮膚の様相が顕著に改善される。 この結果は抗血管形成効果によるか（従って座瘡中の血管形成構成要素が明ら かにされる）、あるいは血管形成以外の効果を有する活性成分による（例えば抗 炎症効果、下記考察参照）。 上記の臨床試験で得られるすべての結果によると、血管形成依存性または炎症 性疾患、あるいはその両方の治療における軟骨エキスの大きな潜在能力が示され る。軟骨エキスの量並びにその処方は、特定の必要を満たすために意のままに変 更できる。 局所その他のすべての組成物は、タンパク質含量に基づいて、広範な用量の軟 骨エキスを含むことができる。試験を行った３種類の特定カテゴリーの症例中、 極めて多様な薬用量または処方、あるいはその両方を使用した。予測されるすべ ての適用に対し（点眼剤から皮膚科および抗癌剤の製剤まで）、総流エキスの最 低最終タンパク質濃度は極めて低いと推定される（約０．１ｍｇ／ｍＬから）。 この濃度範囲が比較的低いのは、活性成分が作用部位に達するときの到達能と浸 透性、並びにこの活性成分が効果的に捕捉され、組織 が血管形成抑制因子に対して感受性であること、すなわち応答することに依存し ている。ある適用の処方の最終タンパク質濃度の上限は今のところ未知である。 試験したなかで最高の最終濃度は乾癬症例用初訪中の約９ｍｇ／ｍＬタンパク質 と、前立腺癌症例で投与した７ｍＬの薬用量単位の約１２ｍｇ／ｍＬである。 上で述べたように、鮫軟骨流エキスの活性は水溶液中で凍結乾燥するといくら か失われる。しかしながら、凍結乾燥の前に当業界で公知の安定剤や保護剤を添 加すれば、感受性ある活性が保たれ、比較的高用量の軟骨エキスを乾燥状態で投 与することが可能となる。 プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）媒介事象の拮抗剤としての軟骨エキス 最近の発表によると、ＰＫＣ活性によって正常表皮細胞が炎症の媒体であるイ ンターロイキン−８（ＩＬ−８）の産生量が増えた（Ｃｈａｂｏｔ−Ｆｌｅｔｃ ｈｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０３：５０９− ５０５）。さらに、乾癬表皮細胞が極めて多量のＩＬ−８を産生し、それによっ て乾癬プラークにおける血管新生がさらに促進された（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら（ １９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４：８２０−８２８）。軟骨エキスが 乾癬の治療に大変有望であることが示されたので、この細胞形質導入路の公知の 拮抗剤であるトリホルボールアセテート（ＴＰＡ）でＰＫＣを活性化した表皮細 胞でその効果を試験した。 第１６図に表皮細胞の分化度がＴＰＡによって５倍に上昇していることを示す 。鮫軟骨自体には角化外皮の形成に何の効果もなかった。しかし、鮫軟骨エキス を添加すると、ＴＰＡによって誘発され た角化外皮形成が約６０％を超えて阻害された。ＴＰＡ誘発が乾癬表皮細胞によ く似ているかどうか我々は知らない。もしよく似ていれば、この結果は軟骨が生 体内で正常表皮細胞には何も効果がなく、その一方で乾癬（すなわち活性化）表 皮細胞には効果があることを示している。ＴＰＡによって活性化された表皮細胞 、並びに乾癬プラークまたは表皮細胞におけるＩＬ−８産生の軟骨エキスによる 阻害の検証が残っている。ＩＬ−８濃度の減少は本エキスの抗炎症効果と抗血管 形成効果の確認として価値がある。 鮫軟骨エキスでは抗炎症活性と抗血管形成活性とは別種である 血管形成は多くの疾患で炎症に随伴することが多いため、鮫軟骨エキス中で各 活性の原因を個別に特定することが望ましい。これに関して、血管形成の疑いの ない皮膚刺激モデルを選択してエキスの抗炎症活性および鎮静活性の試験を行っ た。試験のためにペルーバルサムに対する皮膚感受性の病歴のある９名のボラン ティアが選ばれた。試験化合物は次の通りであった。 １．１倍鮫軟骨５０％／Ｄ−ＭＥＭ培地 ２．１倍鮫軟骨２０％／Ｄ−ＭＥＭ培地 ３．１倍鮫軟骨１０％／Ｄ−ＭＥＭ培地 ４．コーラ・ニチダ（インデナ）１０％／水−アルコール １：１ この４種類の試験化合物をボランティアの腹側前腕に塗布した。この物質を２ ０分間吸収させた後、刺激物であるペルーバルサムを試験部位に塗布した。皮膚 刺激は皮膚発赤の強さによって測定した。発赤度はミノルタ・クロマメータで測 定し、陽性対照および陰性対照と比較した。陽性対照は、ペルーバルサムだけで 処理した皮膚の色であり、陰性対照はコーラ溶液で処理して試験製品と同様に誘 発した皮膚の部位とした。統計的有意差は両側確立ｔ検定を介して計算した。第 １７図に１０％のコーラが７０％活性であることを示す。鮫軟骨は、濃度２０％ および１０％の抗刺激剤としてそれぞれ５８％および６０％であった。用量−応 答効果はなかった。これらの結果より、本軟骨エキスが抗血管形成効果とは別種 の抗炎症活性および鎮静効果を有することが示唆される。 抗コラーゲン溶解活性 ＨＰＬＣクロマトグラフィー 流エキス（ＤＵＰ）の試料９８０ｍＬを横流限外ろ過装置（ペリコン^TM、ミリ ポア）内の１０キロダルトンのカットオフ・メンブランでろ過した。装置をまず １Ｌの水で洗浄した。最終回収量は１０キロダルトンを超える画分４８０ｍＬと １０キロダルトン未満の画分１．８Ｌであった。１０キロダルトン未満の画分を 冷フィンガ蒸発によって１８０ｍＬに濃縮した（＜１０−１０Ｘ）。＜１０−１ ０Ｘの部分標本８×１００μｌをＣＤＣ−Ｓヘキシル５μｍＨＰＬＣカラム（２ ５×０．９４ｃｍ）に負荷し、まず４ｍＬ／分の１００％Ｈ₂Ｏで、次いで８． ５ｍＬ／分の１００％メタノールで溶出した。ＯＤ₂₁₄のピークに対応する画分 を分取した。 ５つの画分、すなわちＦｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３、Ｆｒ４およびＦｒ５を分取し た（第１８図）。最初の３つの画分には少なくとも主ピークが含まれる。 コラゲナーゼ活性測定 組換えヒト皮膚コラゲナーゼタイプ１（ＭＭＰ１）を用い、蛍光ペプチド基質 （活性測定１）とコラーゲン基質（活性測定２）を使用してコラゲナーゼ活性測 定を行った。 活性測定１ この活性測定はＫｎｉｇｈｔら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２９６，２６ ３−２６６に記載されている。この方法にはメタロプロテイナーゼの活性部位を 模擬した蛍光ペプチド基質（Ｍｃａ−ｐｒｏ−ｌｅｕ−ｇｌｕ−ｌｅｕ−Ｄｐａ −ａｌａ−ａｒｇ−ＮＨ₂）が利用される。この基質は蛍光基（Ｍｃａ）を一端 に有し蛍光消光部位（Ｄｐａ）を他端に有する。無損傷の基質では、消光基が効 果的に蛍光をマスキングする。基質が酵素切断されると、試験管中の蛍光が増量 する。 コラゲナーゼ活性化はＷｅｉｎｇａｒｔｅｎら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ２４，６７３０に記載されている。５０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭＣａ Ｃｌ₂、ｐＨ７．５で１μｇを１００μｇに希釈し、１０ｍｇ／ｍｌのトリプシ ン溶液（１ｍＭＨＣｌ溶液）１μｌを添加し、２０℃で１５分間インキュベート した。大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ、５ｍｇ／ｍｌ）を加えることに よって活性化を終結させた。各々にミクロキュベットを添加した。 インヒビター２５μｌまたは５０μｌ（Ｈ₂で５０μｌに調製する）、 ５０ｍＭトリス塩酸４０μｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、ｐ Ｈ７．５、 活性化コラゲナーゼ８μｌ（最終６７ｎｇ）、 基質２μｌ（１ｍＭ原液／ＤＭＳＯ、最終２０μＭ）。 蛍光はλ_ex＝３２８ｎｍ、λ_em＝３９３ｎｍで記録した。 この結果によると、Ｆｒ１が最もコラゲナーゼ阻害活性の高い画分であった（ 第１９図）。すべての画分により低い水準の活性があった。オタマジャクシ脊椎 動物コラゲナーゼについて試験した場合、この酵素は鮫軟骨エキスによってかな り阻害された（ＥＣ５０約 １０〜２０μｇ／ｍＬ）。 本活性測定はＷｅｌｇｕｓら（１９７９）ＪＢＣ２５６、９５１１−９５１６ に記載されている。この方法ではＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してコラゲナーゼ・タ イプ１（ＭＭＰ１）による切断を試験する。コラゲナーゼ・タイプ１は天然コラ ーゲン分子を一ヶ所で切断して元のコラーゲンの７５％と２５％の２個のフラグ メントにする。数時間切断後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって基質から生成物を分離 することによって反応を監視する。切断コラーゲンの非切断コラーゲンに対する 比は、ゲルをクーマジー・ブルー（または銀染色）で染色することによって視覚 化される。 活性化コラゲナーゼ２１ｎｇ（活性測定１参照）を最終体積２０μｌのウシ皮 膚コラーゲン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）５μｌ＋／−インヒビターに添加した 。反応を３５℃で１６時間インキュベートした後、４０ｍＭＥＤＴＡを含むＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ試料を添加することによって停止させ、煮沸し、８％ゲル上に負荷 した。 結果を以下の表にまとめる。 ４０ｍＭＥＤＴＡはコラゲナーゼを阻害した。総流エキスＤＵＰによると、抵 抗コラゲナーゼ活性が示された。画分１から５には活性があった。最も活性が高 かったのは画分１であった。１０キロダルトンより高い分子量では有意な阻害活 性が示されなかった。 化粧品応用および組成物 上記の試験によると、本発明の軟骨エキスが非常に多くの医学的応用があること が分かる。本エキスに回収された多様な活性、すなわち抗コラーゲン溶解活性、 抗炎症活性およびＰＫＣ誘発分化に対する阻害活性は、特に化粧品応用において 望ましい。本発明の軟骨エキスはＰＫＣを媒体とする細胞事象の拮抗効果を示し たことと、このような拮抗効果が当業界で皮膚障壁修復機能を改善するものであ ることが示唆されていることから、ほ乳類の皮膚に軟骨エキスおよび製剤学的に 許容できる運搬体を含む組成物を塗布する段階からなるほ乳類の皮膚の皮膚障壁 修復機能を改善する方法、そしてこのような組成物は本発明の範囲内にある。ま た、その他または類似の組成物も、皮膚の鎮静化、すなわちほ乳類の皮膚におけ る炎症の鎮静化に使用できると理解される。炎症は化学的刺激物、物理的剥離、 および紫外線照射に曝されることなどの種々の作用因によって引き起こされる。 また、皮膚中のコラゲナーゼを阻害する組成物と方法も企図される。コラゲナー ゼと炎症は早期老化（コラーゲンの分解）と関連づけられ、従って軟骨エキス中 に回収された拮抗活性も早 期老化を遅らせ、ほ乳類のしわと萎縮を調節する組成物と方法に寄与させること ができる。しわや萎縮の原因としては、年齢、紫外線照射や環境汚染物質に曝さ れること等が挙げられる。局所組成物にはそれぞれの特定の応用によって決定さ れる有効量の鮫軟骨を含ませることができる。一般には、これらの組成物には約 ０．１から約７５重量％の１倍から２０倍の流エキスと、約５０から９９．９重 量％の製剤学的に許容できる賦形剤を含ませることができる。これらの組成物に は皮膚中の過酸化脂質の形成を予防する作用物質などの抗酸化剤を含ませること ができる。このような抗酸化剤の例としては、トコフェロール、トコフェロール 誘導体、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、およびＢＨＴがある。この組 成物にはホスホリパーゼＡ２インヒビターや植物由来の抗刺激物質であるコーラ および緑茶のエキスなどの抗炎症剤を補うことができる。局所組成物は液剤、懸 濁剤、ローション剤、チンキ剤、ゲル剤、クリーム剤、噴霧剤、乳剤、展着剤、 軟膏剤、リポソーム（少なくとも少量の軟骨流エキスがリポソーム中に存在する ）などの多様な形態とすることができる。 結論 本発明の方法は臨床価値の大きい軟骨エキスの製造を提供するものとして示した 。この新規の方法によって製造される鮫軟骨エキスは、良好な収率で回収される 複数の活性を含む。軟骨エキス、特に流エキスとその画分は、正常細胞に対して は無毒である一方で多種多様な疾患や状態に効果があるため、きわだった潜在能 力を有する。 必要な材料 ○冷却器 ○手術器具 ○肉細断機 ○プラスチック製の袋 ○工業用ブレンダー（フィッシャー・サイエンティフィクから購入した３速ブレ ンダー使用） ○水精製装置（逆浸透圧および０．１μｍろ過、コンチネンタル・ウォーター・ システム、ＰＲＥ２２０２型、製造番号９１０８９、フィッシャー・サイエンテ ィフィク（ケベック州モントリオール）から購入したモデュラブ・バイオサイエ ンスＲＱ／研磨装置）。この装置は発熱性］物質のない高水質の水を供給する。 ○フィッシャー・サイエンティフィクから購入した精密天秤メトラーＡＥシリー ズ ○デュポン・カナダから購入した遠心機Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−２８５ ○遠心機ＣＥＰＡ ○孔隙率３０μＭのナイロン・ポケット ○オートクレーブ（自動蒸気滅菌機サンヨーＭＡＣ３５０Ｐ型） ○１３２℃で１０分間滅菌し３５分間乾燥したナルゲン５００ｍＬ容器 ○孔隙率２４μｍのワットマン・リーブ・エンジェル円錐形ろ紙 ○限外ろ過カラム（分子量カットオフ：適切な場合５００キロダルトンおよび１ キロダルトン、表面積：２５平方フィート、流速：１３０Ｌ／分、吸込圧力：３ ０ｐｓｉ、吐出し圧力：５ｐｓｉ、米国マサチューセッツ州ウイルミントンのコ ッホ・メンブラン・システムズ社から購入） ○１３０Ｌ／分の流速を提供するための衛生遠心ポンプ（モナーク・インダスト リーズ、ＡＣＥ−Ｓ１００モデルＡ型） ○無菌箱（イングラム＆ベルから購入した層流箱ＮｕＡｉｒ） ○ミリパック−６０ ０．２２μｍ滅菌フィルター ○無菌透明または褐色ガラス瓶 ○ＤＣ−１０アミコン濃縮器 ○Ｒｏｔｏｆｏｒバイオラッド１７０−２９５０ ○カットオフ値各１０、３０、１００キロダルトンのアミコン・フィルターＳＩ ＯＹ１０、ＳＩＯＹ３０、ＳＩＯＹ１００ ○ＦＰＬＣファルマシア２１６００７（コンピュータ ファルマシア２１６０１ ４） ○ミルスタンドＳ−３００ ２６ｍｍ／６０ｃｍ（ファルマシア） ○スーパーローズＳ−１２ １０ｍｍ／３０ｃｍ（ファルマシア） ○凍結乾燥機ラブコンコ１０２７３Ａ 本発明は本明細書上記に記載され、本開示から逸脱することなく、本発明の要 素を同じ目的を達成するであろうその等価物によって実現する取り替えによって 修正をもたらすことは、当業者の能力と知識で十分可能であると理解すべきであ る。これらの明瞭な変型は本適用によって包含されると思量される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブラゾー，ポール カナダ国，ケベック エイチ４ジェイ ９ ゼット７，モントリオール，オデット オ リグニー 12460 (72)発明者 ジュノー，クリスティーナ カナダ国，ケベック ジー１エックス ３ ティー５，ステ−フォイ，ジングラス ス トリート 787，アパートメント 203 (72)発明者 マエス，ダニエル エイチ. アメリカ合衆国，ニューヨーク 11743, ハンティントン，レイクビュー コート ５ (72)発明者 マレナス，ケネス アメリカ合衆国，ニューヨーク 11746, ディックス ヒルズ，マックローチ ドラ イブ 62

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．全サメ軟骨の水性ホモジネートの遠心分離後に得られる凍結乾燥ペレット から本質的に成る固体状抽出物であって、前記抽出物はｉｎ ｖｉｖｏ抗抗原活 性、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍増殖活性および直接ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を有 する、前記固体状抽出物。 ２．下記の組成： 脂質 ７．３５％ 湿度 ２０．４％ タンパク質 ４６．２％ ナトリウム ４．１６ｍｇ／ｇ カリウム ２．６４ｍｇ／ｇ カルシウム １１４ｍｇ／ｇ マグネシウム １．４９ｍｇ／ｇ 亜鉛および鉄微量物 を有する、請求項１に記載の固体状抽出物。 ３．全サメ軟骨の水性ホモジネートの遠心分離後に得られる上清の画分から本 質的に成る液状抽出物であって、この画分は約０〜約５００キロダルトン（ＫＤ ａ）の分子量の分子を有し、前記抽出物は抗血管形成活性、抗腫瘍増殖活性、直 接抗腫瘍活性、抗膠原溶解活性および抗炎症活性を有する、前記液状抽出物。 ４．全サメ軟骨の水性ホモジネートの遠心分離後に得られる上清の画分から本 質的に成る液状抽出物であって、この画分は約１〜約５００キロダルトン（ＫＤ ａ）の分子量の分子を有し、前記抽出物は抗血管形成活性、抗腫瘍増殖活性、直 接抗腫瘍活性、抗膠原溶解活性および抗炎症活性を有する、前記液状抽出物。 ５．下記の組成： 脂質 ０〜０．２０％ タンパク質 ８〜２５ｍｇ／ｍｌ 湿度 ９７〜９９％ ナトリウム ３０〜２２０ｍｇ／１００ｇ カリウム ３０〜４０ｍｇ／１００ｇ カルシウム ２．０ｍｇ／１００ｇ マグネシウム １．１ｍｇ／１００ｇ 亜鉛および鉄微量物 を有する、請求項３に記載の液状抽出物。 ６．タンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により測定して約１ 〜２．５ＫＤａの分子量を有する、請求項３に記載の液状抽出物の液状画分。 ７．ロトフォー分離（Ｒｏｔｏｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）と電気泳動と の組合わせにより測定して、約２９ＫＤａの分子量および約５．３〜６．２６Ｋ Ｄａの等電点を有する、請求項３に記載の液状抽出物の液状画分。 ８．ロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより測定して、約３５ＫＤａの 分子量および約７．６４〜７．９４ＫＤａの等電点を有する、請求項３に記載の 液状抽出物の液状画分。 ９．ロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより測定して、約４８ＫＤａの 分子量および約７．２９〜７．９４ＫＤａの等電点を有する、請求項３に記載の 液状抽出物の液状画分。 １０．ロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより測定して、約６０ＫＤａ の分子量および約５．３０〜６．２６ＫＤａの等電点を有する、請求項３に記載 の液状抽出物の液状画分。 １１．ロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ） との組合わせにより測定して約７０〜１２０ＫＤａの 分子量を有する、請求項３に記載の液状抽出物の液状画分。 １２．ロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ） との組合わせにより測定して約６０〜７０ＫＤａの分子量を有する、請求項３に 記載の液状抽出物の液状画分。 １３．ロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ） との組合わせにより測定して約３５〜４６ＫＤａの分子量を有する、請求項３に 記載の液状抽出物の液状画分。 １４．ロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ） との組合わせにより測定して約２９ＫＤａの分子量を有する、請求項３に記載の 液状抽出物の液状画分。 １５．ロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ） との組合わせにより測定して約１〜２．５ＫＤａの分子量を有する、請求項３に 記載の液状抽出物の液状画分。 １６．ＦＰＬＣを精製カラムのセファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ）Ｓ−３０ ０^TMまたはスペロース（ＳＵＰＥＲＯＳＥ）Ｓ−１２^TM上で実施する、請求項６ 、１１、１２、１３、１４または１５に記載の液状画分。 １７．抗血管形成活性、直接抗腫瘍作用活性および抗腫瘍増殖活性を有するサ メ軟骨の固体状抽出物を得る方法であって、下記の工程： ａ）サメ軟骨が約５００μｍより小さいか、またはそれに等しい大きさを有す る粒子に小さくなるまで、前記活性の保存に適合する条件において、サメ軟骨を 水溶液中で均質化して、粒子と前記活性を有する粗製の液状抽出物との混合物を 形成し、 ｂ）前記ホモジネートを遠心して粒子を粗製の液状抽出物から分離し、そして ｃ）前記粒子を回収し、次いで凍結乾燥し、これにより前記固体 状抽出物を収穫する、 を含んでなる前記方法。 １８．無傷の軟骨中に存在する生物学的活性な水溶性成分の実質的な部分を有 する液状抽出物を得る方法であって、下記の工程： ａ）前記軟骨が約５００μｍより小さいか、またはそれに等しい大きさを有す る粒子に小さくなるまで、前記生物学的に活性な成分の完全性の保存に適合する 条件において、前記軟骨を水溶液中で均質化して、粒子と前記生物学的に活性な 成分を有する粗製の液状抽出物との混合物を形成し、 ｂ）前記ホモジネートを遠心して粒子を粗製の液状抽出物から分離し、そして ｃ）約５００キロダルトン（ＫＤａ）より小さいか、またはそれに等しい分子 量を有する軟骨分子を含有する最終の液状抽出物を得るために、前記粗製の液状 抽出物をさらに分離する、 を含んでなる前記方法。 １９．前記条件が約０〜１０℃の使用温度を含む、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記条件が前記水溶液について約６〜約８の使用ｐＨ範囲を含む、請求 項１８に記載の方法。 ２１．前記水溶液は非変性溶液である、請求項１８に記載の方法。 ２２．前記水溶液は実質的に純粋な水である、請求項１８に記載の方法。 ２３．工程ａ）を１５分〜２４時間の間実施する、請求項１８に記載の方法。 ２４．工程ａ）を１５分〜１時間の間実施する、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記軟骨および水溶液が少なくとも約１リットルについて１ｇの比率で ある、請求項１８に記載の方法。 ２６．約１ＫＤａの分子量カットオフを有する膜上で前記最終の液状抽出物を 濾過することによって、前記最終の液状抽出物を濃縮する工程ｄ）をさらに含ん でなる、請求項１８に記載の方法。 ２７．請求項１９に記載の工程を再現することから成り、そして前記生物学的 に活性な成分の完全性を保存するために十分な量で添加された安定剤または保存 剤の存在において、前記最終の液状抽出物を凍結乾燥する工程ｄ）をさらに付加 する、乾燥状態において軟骨抽出物を得る方法。 ２８．前記最終の液状抽出物を分画して、前記液状抽出物の液状画分を得る工 程ｄ）をさらに含んでなる、請求項１８に記載の方法。 ２９．前記軟骨を軟骨魚網の種から供給する、請求項１８に記載の方法。 ３０．前記軟骨魚網の種がサメである、請求項２９に記載の方法。 ３１．前記軟骨をサメから供給する、請求項２８に記載の方法。 ３２．前記全体の液状抽出物が、抗膠原溶解活性、抗炎症活性、抗血管形成活 性、直接抗腫瘍活性および抗腫瘍増殖活性を有する、請求項３１に記載の方法。 ３３．前記軟骨をサメから供給する、請求項２７に記載の方法。 ３４．前記分画工程をタンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に より実施し、そして前記液状画分は約１〜約２．５ＫＤａの分子量を有する分子 を含有する、請求項３１に記載の方法。 ３５．前記分画工程をロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより実施し、 そして前記液状画分は約２９ＫＤａの分子量および約 ５．３〜約６．２６の等電点を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法 。 ３６．前記分画工程をロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより実施し、 そして前記液状画分は約３５ＫＤａの分子量および約７．６４〜約７．９４の等 電点を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ３７．前記分画工程をロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより実施し、 そして前記液状画分は約４８ＫＤａの分子量および約７．２９〜約７．９４の等 電点を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ３８．前記分画工程をロトフォー分離と電気泳動との組合わせにより実施し、 そして前記液状画分は約６０ＫＤａの分子量および約５．３０〜約６．２６の等 電点を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ３９．前記分画工程をロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィ ー（ＦＰＬＣ）との組合わせにより実施し、そして前記液状画分は約７０〜約１ ２０ＫＤａの分子量を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ４０．前記分画工程をロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィ ー（ＦＰＬＣ）との組合わせにより実施し、そして前記液状画分は約６０〜約７ ０ＫＤａの分子量を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ４１．前記分画工程をロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィ ー（ＦＰＬＣ）との組合わせにより実施し、そして前記液状画分は約３５〜約４ ６ＫＤａの分子量を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ４２．前記分画工程をロトフォー分離とタンパク質高速液体クロ マトグラフィー（ＦＰＬＣ）との組合わせにより実施し、そして前記液状画分は 約２９ＫＤａの分子量を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ４３．前記分画工程をロトフォー分離とタンパク質高速液体クロマトグラフィ ー（ＦＰＬＣ）との組合わせにより実施し、そして前記液状画分は約１〜約２． ５ＫＤａの分子量を有する分子を含有する、請求項３１に記載の方法。 ４４．ＦＰＬＣをセファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ）Ｓ−３００^TMまたはス ペロース（ＳＵＰＥＲＯＳＥ）Ｓ−１２^TMを含有する精製カラム上で実施する、 請求項３４、３９、４０、４１、４２または４３に記載の方法。 ４５．請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の方法により製造された軟骨抽 出物。 ４６．請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の方法により製造された軟骨抽 出物。 ４７．請求項３２に記載の方法により製造された軟骨抽出物。 ４８．請求項３３に記載の方法により製造された軟骨抽出物。 ４９．有効量の請求項３に記載の軟骨抽出物と、薬学上許容されるビヒクルと を含んでなる、腫瘍増殖、血管形成、炎症および膠原溶解から成る群より選択さ れる１または２以上の成分を有する疾患または症状を治療する組成物。 ５０．有効量の請求項４に記載の軟骨抽出物と、薬学上許容されるビヒクルと を含んでなる、腫瘍増殖、血管形成、炎症および膠原溶解から成る群より選択さ れる１または２以上の成分を有する疾患または症状を治療する組成物。 ５１．有効量の請求項４７に記載の軟骨抽出物と、薬学上許容されるビヒクル とを含んでなる、腫瘍増殖、血管形成、炎症および膠 原溶解から成る群より選択される１または２以上の成分を有する疾患または症状 を治療する組成物。 ５２．有効量の請求項４８に記載の軟骨抽出物と、薬学上許容されるビヒクル とを含んでなる、腫瘍増殖、血管形成、炎症および膠原溶解から成る群より選択 される１または２以上の成分を有する疾患または症状を治療する組成物。 ５３．局所用組成物である、請求項４９、５０、５１または５２に記載の組成 物。 ５４．酸化防止剤をさらに含んでなる、請求項５３に記載の組成物。 ５５．酸化防止剤が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、アスコルビン 酸、アスコルビン酸誘導およびＢＨＴから成る群より選択される、請求項５４に 記載の組成物。 ５６．抗炎症剤をさらに含んでなる、請求項５３に記載の組成物。 ５７．抗炎症剤が植物誘導抗刺激剤である、請求項５６に記載の組成物。 ５８．抗炎症剤がコラおよび緑茶の抽出物から成る群より選択される、請求項 ５７に記載の組成物。 ５９．抗炎症剤がホスホリパーゼＡ２インヒビターである、請求項５６に記載 の組成物。 ６０．薬学上許容されるビヒクルが、溶液、懸濁液、ローション、チンキ、ゲ ル、クリーム、スプレー、乳濁液、スティックおよび軟膏から成る群より選択さ れる、請求項５３に記載の組成物。 ６１．軟骨抽出物の少なくとも一部分がリポソームの中に存在する、請求項５ ３に記載の組成物。 ６２．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んで なる、哺乳動物の皮膚における皮膚バリヤー機能を改善する方法。 ６３．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んでなる、哺乳動 物の皮膚を平滑化するする方法。 ６４．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んでなる、哺乳動 物の皮膚における炎症を減少するする方法。 ６５．前記炎症が物理的擦過傷により引き起こされる、請求項６４に記載の方 法。 ６６．前記炎症が化学的刺激により引き起こされる、請求項６４に記載の方法 。 ６７．前記炎症が紫外線により引き起こされる、請求項６４に記載の方法。 ６８．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んでなる、哺乳動 物の皮膚におけるコラゲナーゼ活性を阻害する方法。 ６９．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んでなる、哺乳動 物の皮膚におけるしわまたは萎縮を調節する方法。 ７０．前記しわまたは萎縮が紫外線により引き起こされたものである、請求項 ６９に記載の方法。 ７１．前記しわまたは萎縮が環境の汚染物質への暴露により引き起こされたも のである、請求項６９に記載の方法。 ７２．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んでなる、哺乳動 物の皮膚におけるアクネを減少する方法。 ７３．請求項５３に記載の組成物を皮膚に適用する工程を含んでなる、哺乳動 物の皮膚における早期の老化を遅延する方法。 ７４．治療を必要とする患者に、有効量の請求項４７に記載の軟骨抽出物と、 薬学上許容されるビヒクルとを投与することを含んでなる、腫瘍増殖、血管形成 、炎症および膠原溶解から成る群より選択される１または２以上の成分を有する 疾患または症状を治療する 方法。 ７５．前記疾患または症状が、癌、乾癬、関節炎およびアクネから成る群より 選択される、請求項７４記載の方法。