HU222088B1

HU222088B1 - Cápaporc extraktumok alkalmazása gyógyszerkészítmények előállítására

Info

Publication number: HU222088B1
Application number: HU9800065A
Authority: HU
Inventors: Paul Brazeau; Eric Dupont; Christina Juneau; Daniel H. Maes; Kenneth Marenus
Original assignee: Les Laboratoires Aeterna Inc.
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 2003-04-28
Also published as: AU3738895A; EP0806960B1; CN1177927A; CA2212010C; PL188137B1; EP0806960A1; CZ245297A3; HUT77488A; CZ292627B6; WO1996023512A1; AU717978B2; IS1963B; BG101870A; ES2188672T3; MX9705894A; FI973195A0; BR9510540A; PL321678A1; FI973195A; ATE230272T1

Abstract

A találmány tárgya cápaporc-extraktum alkalmazása kollagenolízis vagygyulladáskomponenst magában foglaló betegség vagy rendellenességkezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal amegkötéssel, hogy a betegség vagy rendellenesség ráktól,pszoriázistól, aknétól vagy artritisztől eltérő, amely porcextraktumteljes cápaporc vizes homogenizátumának centrifugálásával előállítottfelülúszó 500 kDa névleges molekulatömeg-határértékű szűrőn végzettfrakcionálásával van előállítva, és az extraktum molekuláinakmolekulatömege 500 kDa-nál kisebb, továbbá az extraktumantikollagenolitikus és gyulladásgátló hatást mutat. ŕ

Description

A találmány tárgya cápaporc-extraktum alkalmazása betegségek és rendellenességek kezelésre alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

A porcok nem erezett szövetek, ezért felmerült a kérdés, hogy tartalmaznak-e érképződést gátló faktorokat. A porcszövetek a tumomövekedéssel szemben is viszonylag ellenállóak. A porcokban jelentkező tumor, a porcszarkóma a legkevésbé erezett szilárd tumor. Az érképződés a tumorfejlődés egyik fontos tényezője. Elhatárolt szilárd tumoros csomók ott fejlődnek ki, ahol a tumorsejtek hatására a közeli érhálózat kiterjed, és ellátja táplálkozási igényeiket. Megvizsgálták az érképződést serkentő tényezők tumorfejlődésre gyakorolt hatását, és az érképződést gátló hatású tényezőket és anyagokat, amelyekkel szabályozható a tumomövekedés, illetve melyek tumorcsökkentő hatásúak.

Langer és munkatársai [„Isolation of a Cartilage Factor That Inhibits Tumor Neovascularisation”, Science, 193, 70-72 (1976)] felfedezték, hogy a borjúlapockaporc olyan anyagot tartalmaz, amely a szilárd tumorokban gátolja az érképződést. Mivel vizsgálataik sikeresnek bizonyultak, nagyobb mennyiségű porcforrást kerestek.

Az eresedést gátló anyagok potenciális forrásai lehetnek a cápák, mivel teljes csontvázuk porcból épül fel (testtömegük 6%-a porc, ezzel szemben a borjaké 0,6%). A cápák figyelemre méltó tulajdonsága, hogy kevéssé hajlamosak tumorképzésre. Számos elméletet dolgoztak ki annak magyarázatára, hogy miért ilyen kicsi a cápáknál a tumorfejlődés valószínűsége. Marchalonis és munkatársai (1990) kimutatták, hogy az IgM-antitestek azonnal megtámadnak bármilyen ellenséges anyagot. McKinney és munkatársai (1990) kimutatták, hogy a cápák makrofágjai képesek megkülönböztetni a normális sejteket a daganatos sejtektől, és az utóbbiakat megsemmisítik. Rosen és Woodhead [„High lőnie Strength: Its Significance in Immunosurveillance against Tumor Cells in Sharks and Rays (Elasmobranchs)” Medical Hypotheses. 6, 441-446 (1980)] feltételezték, hogy a cápákhoz és a rájákhoz hasonló állatoknál azért fordul elő ritkán tumoros megbetegedés, mert szöveteik ionerőssége olyan nagy, mintha magas testhőmérsékletűek lennének. A szerzők szerint ilyen feltételek között az immunrendszer immunológiai hatása közel 100%-os. Moore és munkatársai (1993) felfedezték, hogy a cápák antibakteriális és protozoaellenes tulajdonságú aminoszterolt termelnek. Végül Lee és Langer [„Shark Cartilage Contains Inhibitors of Tumor Angiogenesis”, Science 221, 1185-1187 (1983)], valamint Folkman és Klagsbrun [„Angiogenic Factors”, Science 235, 442-447 (1987)] kimutatták, hogy a cápák újraereződést gátló anyagot termelnek. Lee és Langer ezt az anyagot denaturálókörülmények között extrakcióval izolálták cápaporcból (guanidinextrakció), azonban ez az eljárás nagyon hosszú (41 nap) és denaturált elemeket tartalmazó extraktumokat eredményezhet, melyek hatóanyag-tartalma messze elmarad az elfogadhatótól. A borjakból izolált hatóanyagot körülbelül 16 kilodalton (kDa) molekulatömegűnek találták, de a cápákból kinyert anyagokra nem adtak meg pontos molekulatömeg-értéket. Erről az anyagról csak azt írták le, hogy molekulatömege több mint 3500 dalton (Da). Oikawa és munkatársai [„A Növel Angiogenic Inhibibotor Derived from Japanese Shark Cartilage (I) Extraction and Estimation of Inhibitory Activities Toward Tumor and Embryonic Angiogesis”, Cancer Letters 51, 181—186 (1990)] a Lee és Langeréhez hasonló extrakciós eljárást alkalmaztak, de sokkal rövidebb időtartammal (2 nap 41 nap helyett). Az Oikawa és munkatársai által cápaporcból izolált antiangiogén hatású anyag molekulatömege 1000-10 000 Da tartományra korlátozódik. Schinitsky (4 473 551 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) durva porítású cápaporc vizes kivonatát vizsgálta, és a 100 000 Da-nál magasabb molekulatömegű frakciót önmagában vagy glukóz-aminnal kombinálva gyulladásgátló hatásúnak találta. A szabadalmi leírásban az extraktum egyik komponensével kapcsolatban sem írtak le érképződést gátló vagy tumorellenes hatást. Kuetner és munkatársai (4 746 729 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) polimorfonukleáris neutrofil (PMN) elasztázinhibitort izoláltak szarvasmarhaporcból. Ezt az inhibitort a poreextraktum 50 000 Da-nál nagyobb molekulatömegű frakciójából nyerték ki. A frakcionálást Sephacryl S-200-οη végezték, a kapott számos frakció közül az antielasztázhatású 10-40 kDa közötti frakciókat összegyűjtötték. A hatásos komponens izoelektromos pontja 9,5, molekulatömege körülbelül 15 000 Da. Kuetner és munkatársai (4 042 457 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) kimutatták, hogy a szarvasmarhaporc 50 000 Da-nál kisebb molekulatömegű komponense sejtburjánzást gátló hatású, de nem gyakorol hatást belhámsejtek növekedésére. Balassa és munkatársai (4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), tumorellenes hatású poreextraktumot állítottak elő vizes oldatban. A Balassa-féle eljárással nyert extraktum nem mutat antiangiogén hatást. Spilburg és munkatársai (4 243 582 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) kétféle 65 kDa molekulatömegű (pl 3,8) glikoproteint izoláltak szarvasmarhaporcból (guanidinextrakcióval), melyeket antitripszinhatásúnak és belhámsejt-növekedést gátló hatásúnak találtak.

A borjúporc és a cápaporc sokféle biológiai hatása ismert, például gyulladást okozó hatás, gyulladásellenes hatás, antiangiogén hatás, lizozimre gyakorolt hatás, sejtnövekedést serkentő hatás, I és IV típusú kollagenáz, elasztáz és proteáz - mint például tripszin-, kimotripszin- és plazmingátló hatás.

Oikawa guanidinextrakcióját és japán cápa porcának molekulatömeg-alapon történő ultraszűréssel végzett nyers frakcionálását ismertette, és az antiangiogénaktivitást tumoros és embrióangiogenezis gátlása alapján vizsgálta [Cancer Letters, 51, 181-186 (1990)]. Jelentős angiogenezisgátló hatást talált. Azonban ebben a dokumentumban nincs szó antikollagenolitikus és gyulladásgátló hatás elkülönítéséről. Ezen túlmenően az Oikawa-féle termék nem a felülúszó 0 és 500 kDa közötti frakcióját tartalmazza.

HU 222 088 Β1

Lee és Langer bemutatták, hogy a cápaporcok tumoros angiogenezisinhibitorokat tartalmaznak [Sciene, 221, 1185-1187(1983)].

Luer cápaporcból származó angiogenezisinhibitorokat ismertetett [Fed. Proc. 45, 949 (1986)]. A Luer-féle extraktum 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakciói antiproteázkomponenseket tartalmaztak. Azonban Luer az eljárást röviden ismertette, és abban olyan kevés információt adott meg, hogy a Luer-féle extraktumot majdnem lehetetlen pontosan reprodukálni. Nincs feltüntetve, hogy Luemek sikerült volna olyan extraktumot előállítani, amely a találmány szerinti extraktum összes antikollagenolitikus és gyulladásgátló hatású molekuláját tartalmazza.

Az US A-4 473 551 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Schinitsky gyulladásgátló készítményeket ismertetett. Az első készítmény cápaporcot tartalmazott. A második készítmény ezen por vizes extraktumát tartalmazta. A harmadik készítmény cápaporc-extraktum és glükóz-amin kombinációja. Schinitsky megfelelő szintű aktivitást mutatott ki, de csak glükóz-amin jelenlétében. Schinitsky a porc gyulladásgátló hatását csak porított porc esetében mutatta ki, azonban a porcpor pusztán egy kiindulási anyag, aminek alkalmazása nyersporc alkalmazásával ekvivalens.

Mind a négy, fent említett dokumentumban olyan eljárást ismertettek, amelyből meghatározott frakciókat nyertek ki. Nincs kitanítás olyan porcextraktumok alkalmazására, amely több frakciót, és így több cápaporceredetú alkotórészt tartalmaz.

A WO-A-95/32722 számú nemzetközi közzétételi iratban bemutatott porcextraktumok azonosak a jelen találmány szerinti megoldásban alkalmazottakkal, ezeket rák, pszoriázis, akne és artritisz kezelésére használták. Ezek a betegségek és rendellenességek ki vannak zárva találmányunk oltalmi köréből.

A cápaporc antiangiogénkomponenseit általában nyúlszaruhártyatasak-vizsgálattal vagy csirkekorioallantois-membrán (CAM)-vizsgálattal vizsgálták. Meztelen egerekbe közvetlenül beültetett humán melanomaxenografton vizsgálták a teljes porított porcok tumorra gyakorolt in vivő hatását (5 075 112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint CAM-teszttel antiangiogén hatását. Habár a porcextraktumnak tulajdonítottak tumorellenes hatást, ezt a hatást leggyakrabban az antioangiogénkomponensnek tudták be, amely a tumort megfosztja a vérellátástól. Mostanáig nem bizonyították, hogy a cápaporc közvetlenül hat a tumoros sejtburjánzásra.

A cápaporc-extraktumok és -frakciók előállítására vonatkozóan néhány eljárás már ismert. Ezek egy részénél porított nyersporcot állítottak elő extrakció nélkül (5 075 112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), más esetben denaturálóanyagot alkalmaztak, mint a guanidin (4 243 582 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Mások a porc előkezelését úgy végezték el, hogy enzimatikus kezeléssel eltávolították a porcot körülvevő izom-, ideg- és érszerkezeteket, az előkezelési lépést a zsír szerves oldószerben való eltávolítása követte, és a hatóanyagot vizes fázisban extrahálták [Balassa és munkatársai 3 478 146, 4 350 682, 4 656 137 és 4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások). A fenti előkezelés hatása a biológiailag aktív porckomponensek épségének megőrzésére nem ismert. Ha az enzimes kezelés nagyon kimerítő, az aktív fehéqekomponensek hidrolizálhatnak. A Balassa-féle eljárás nem foglalja magában az aktív komponens dúsítását elősegítő frakcionálási lépést. Mások egyszerűen vizes extraktumot állítottak elő a porcból a nem oldható anyag eltávolításával (vizes oldatban a 4 473 551 számú, vagy sóoldatban a 4 746 729 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban). Molekulatömeg-specifikus frakciókat állítottak elő, tisztították és további vizsgálatokat végeztek ereken (lásd a fenti ismertetést).

A fent idézett eljárásoknak számos hátrányuk van. Bizonyos értékes komponensek denaturálódhatnak. Ha ez nem is következik be közös hátrányuk, hogy gyakorlati szempontból túl hosszadalmasak. Ezen túlmenően a hosszadalmas eljárások nem szükségképpen vezetnek megfelelő mennyiségű hatóanyag előállításához, és a kinyert komponensek egy része egyáltalán nem vagy nem elegendő detektálható aktivitást mutat, más komponensek figyelmen kívül hagyhatók a specifikus hatás elérése szempontjából.

Erképződés nem csak rákos növekedésnél fordul elő. Számos fiziológiai rendszerre ható betegség vagy körülmény áll kapcsolatban az érképződéssel (az érintett fiziológiai rendszert a betegség után zárójelben adjuk meg), például ízületi gyulladás és ateroszklerózisos folt (csont és ínszalagok), retinopátia-diabetika, neovaszkuláris glaukóma, trachoma és szaruhártya-átültetéssel kapcsolatos újraereződés (szem), pszoriázis, szkleroderma, hemangióma és hipertrófiás hegesedés (bőr), vaszkuláris adhézió és angiofibróma (vérrendszer). A betegségek kezelésére a rákterápiához hasonlóan bármilyen új, érképződést gátló faktor alkalmazható. Ezen túlmenően, mivel a fent említett betegségek nagy része gyulladásos tünetekkel jár, ezért ezek a betegségek és tünetek bármilyen új és hatásos gyulladásgátló „faktor” segítségével kezelhetők, akárcsak egyéb gyulladásos betegségek vagy tünetek. Mivel a proteázok, mint a kollagenázok, kollagéndegradáló hatásúak, ezért a rák és az idő előtti öregedés és hasonló betegségek és tünetek kialakulásában részt vesznek. Egy új és hatásos antikollagenolitikus „faktor” jól alkalmazható kollagenolitikus komponenssel járó betegségek és tünetek kezelésére. Mivel az angiogenezis, gyulladás és proteázok, mint a kollagenázok önmagukban is és számos más betegséggel vagy tünettel együtt is előfordulhatnak, nagy terápiás értéke van annak a terméknek, amely ezeket a hatásokat legalább antagonizálni képes a normális testfimkciók zavarása nélkül.

A találmányunk szerinti új eljárással sokoldalú terápiás hatású porcextraktumok állíthatók elő. A cápaporc-extraktumban megfelelő koncentrációban vannak jelen többek között antiangiogén, gyulladásgátló, antikollagenolitikus, in vivő tumoros sejtbuijánzás-ellenes és közvetlenül in vitro tumoros sejtbuijánzás-elle3

HU 222 088 Β1 nes hatású anyagok. Más hatások még nem azonosítottak vagy nem bizonyítottak. Tumoros sejtvonalakra gyakorolt hatásuk azt mutatja, hogy a közvetlen tumoros sejtbuqánzás-ellenes hatás mellett citotoxikus hatással is rendelkeznek. A fenti hatások mindegyikét megfigyeltük cápaporc-folyadékextraktumban, és ezek egy részét megfigyeltük vagy igazoltuk a szilárd extraktumban is.

Találmányunk tárgya új eljárás az ép porcban jelen lévő, biológiailag aktív vízoldható komponensek jelentős részét tartalmazó porc-folyadékextraktum előállítására, mely a következő lépésekből áll·.

a) a cápaporcot vizes oldatban homogenizáljuk a fent megadott hatású komponensek épségének megőrzéséhez megfelelő körülmények között, körülbelül 500 pm vagy ennél kisebb részecskeméret eléréséig, a fent megadott hatású részecskék és nyers folyadékextraktum keverékének előállítására;

b) a homogenátum centrifugálásával elválasztjuk a részecskéket a nyers folyadékextraktumtól; és

c) a nyers folyadékextraktumot elválasztjuk és liofilizáljuk, ezáltal legfeljebb 500 kDa molekulatömegű porcmolekulákat tartalmazó végső folyadékextraktumot kapunk.

Új eljárásunk nagy előnye, hogy könnyen és hatásosan elvégezhető. Segítségével nagy kitermeléssel állítható elő legalább a fent említett biológiai hatásokat mutató, különösen cápaporcot tartalmazó extraktum. A porcextraktumot előnyösen hidegben állítjuk elő (kb. 0 °C és 10 °C közötti hőmérséklet-tartományban), nem denaturálókörülmények között (előnyösen tiszta vízben) semleges körüli kémhatású közegben (körülbelül pH 6-8), ezzel növelve az ismeretlen fizikai, kémiai tulajdonságú anyag kinyerésének valószínűségét. Az eljárás szerint a porckomponens rövid ideig tartó homogenizálással (mindössze 10 perc és 15 perc közötti időtartam) kis térfogatú oldat formájában extrahálható (1 kg porcból csupán 1 liter). A szilárd extraktum kinyerésére hasonló módon járunk el, kivéve, hogy a kinyert szemcsés anyagot elválasztjuk, és a felülúszóra tekintet nélkül liofilizáljuk.

Találmányunk porcextraktumokra, különösen porcos halakból készült extraktumokra, még előnyösebben cápaporc-extraktumokra vonatkozik. A szilárd extraktum aktivitást mutat.

Feltehetőleg kollagén- és nem vízoldható komponenseket tartalmaz. Tartalmazhat továbbá a teljes folyadékextraktumból extrahálásakor visszamaradó hatóanyagot. A teljes folyadékextraktum hatóanyagban nagyon gazdag. Felhasználható közvetlenül vagy koncentrálás után. Olyan koncentrálási lépést részesítünk előnyben, amelynek végrehajtása után a biológiai aktivitás megmarad. A hatóanyagokat károsító eljárások, mint a hővel történő bepárlás, óvatosságból kerülendők. A találmányunk szerinti folyadékextraktum koncentrálását ultraszűréssel végezzük, körülbelül 1 kDa résméretnél elválasztó membránon. Ennek eredményeképpen kapott koncentrált extraktum, vizsgálataink szerint, körülbelül 1 kDa és körülbelül 500 kDa közötti molekulákat tartalmaz. A teljes folyadékextraktumot (0 és

500 kDa közötti molekulatömeg) tovább frakcionáljuk a hatóanyag jellemzésére. Különböző eljárásokkal számos frakciót nyerünk. Ezek egy részét tumorsejtvonalakon vizsgáljuk, és nagy vonalakban molekulatömeg- és izoelektromospont-meghatározással jellemezzük. Más frakciókat hatásukkal, különösen antikollagenolitikus vagy antiangiogén hatásukkal jellemzőnk. A frakciók teljes jellemzését és azonosítását még nem végeztük el. A teljes folyadékextraktum és a frakciók - előnyösen az utóbbiakat használjuk - jelentős aktivitást mutatnak. A nagy mennyiségű porított porc beadása helyett sokkal elfogadhatóbb a dúsított extraktum beadása.

Találmányunk kiterjed a fenti porcextraktumok egyikét hatóanyagként tartalmazó gyógyászati vagy kozmetikai készítményekre is. Legnagyobb jelentőségűek a helyileg alkalmazható bőrgyógyászati és kozmetológiai készítmények. Ezek jelentősége a porcextraktumok megfigyelt hatásában rejlik. A megfigyelt antikollagenolitikus és gyulladásgátló hatás és a keratinocitákban proteinkináz C-indukció által közvetített sejtdifferenciálódás antagonista hatása lehetővé teszi a cápaporc-extraktumok alkalmazását gyulladáscsökkentő, bőrráncosodás és sorvadást szabályzó, korai öregedést megállító, aknecsökkentő, bőrvédő szerepet javító gyulladás- vagy irritációcsökkentés és bőrnyugtató hatású készítményekben és eljárásokban. Ezek az eljárások is a találmány tárgyát képezik. Ezen túlmenően, mivel' a cápaporc-folyadékextraktumot sikeresen alkalmazzuk rák, artritisz, pszoriázis és akne esetén, találmányunk kiteljed a tumoros sejtburjánzás, angiogenezis,, gyulladás és kollagenolizis közül egy vagy több tünettel járó betegség vagy állapot kezelésére alkalmas készítményekre és eljárásokra is.

Találmányunk néhány megvalósítási módját az alábbiakban ismertetjük közelebbről, és az alábbi ábrákkal illusztráljuk, melyeknek célja a találmány szemléltetése, azonban az oltalmi kör nem korlátozódik ezekre.

Az 1. ábrán a növekedő cápaporcdózis (szilárd extraktum) ZR75-1 és MCF-7 sejtekre gyakorolt gátlóhatása látható;

a 2. ábrán MCF-7 sejtek DNS-tartalom alapján meghatározott mennyiségének dózisválasz görbéje látható növekedő esztradiolkoncentráció jelenlétében két különböző porcliofilizátum-koncentrációnál és anélkül;

a 3a. és 3b. ábrákon előrehaladott állapotú emlőmirigyrákos patkányok májmetszetének összehasonlítása látható, melyeket porcliofilizátum és felülúszó kombinációjával mesterségesen tápláltunk, illetve amelyeknek csak vizet adtunk;

a 4a. és 4b. ábrákon előrehaladott állapotú emlőmirigyrákos patkányok vesemetszetének összehasonlítása látható, melyeket porcliofilizátum és felülúszó kombinációjával mesterségesen tápláltunk, illetve melyeknek csak vizet adtunk;

az 5a. és 5b. ábrákon előrehaladott állapotú emlőmirigyrákos patkányok tüdőmetszetének

HU 222 088 Bl összehasonlítása látható, melyeket porcliofilizátum és felülúszó kombinációjával mesterségesen tápláltunk, illetve melyeknek csak vizet adtunk;

a 6a. és 6b. ábrákon előrehaladott állapotú emlőmirigyrákos patkányok rákos sejtjeinek összehasonlítása látható, amelyeket porcliofilizátum és felülúszó kombinációjával mesterségesen tápláltunk, illetve melyeknek csak vizet adtunk;

a 7. ábrán a 6a. és 6b. ábrákból származó hisztogram látható, amely a porcextraktumnak a tumorban lévő véredényekre gyakorolt hatását mutatja be;

a 8. ábrán nem denaturálókörülmények között rotoforral elválasztott folyadékfrakciók elektroforézisprofilja látható. A molekulatömeg-markerek a bal oldalon jelennek meg, mellette egy frakcionálás előtti nyers permeátumminta látható az izolált frakciókkal való összehasonlítás céljából;

a 9a. és 9b. ábrákon két pszoriázisban szenvedő betegről készült felvételek láthatók, akit folyékony porcextraktum hatásos mennyiségét tartalmazó helyileg alkalmazott készítménnyel kezeltünk (alsó fotó) kezdeti állapotukkal összehasonlítva (felső fotó), a 9a. ábrán egy hiperkeratózisos és a 9b. egy nem hiperkeratózisos beteg felvétele látható;

a 10. ábrán három különböző cápaporc-extraktum FPLC-migrációs görbéje látható. Az A panelen DUP jelentése a találmányunk szerinti porc-folyadékextraktum. A B panelen a BAL és ÓIK jelentése Ballassa és munkatársai, illetve Oikawa és munkatársai szerinti extraktumok;

all. ábrán a 10. ábrán meghatározott extraktum HPLC-migrációs görbéi láthatók, a 12. ábrán CAM-tesztek eredménye látható kontrollként különböző koncentrációjú protaminoldatot használtunk, amely antiangiogén referenciaanyag;

a 13. ábrán a találmányunk szerinti cápaporc teljes folyadékextraktum (DUP) két frakciójának CAM-teszt-eredménye látható, az egyik frakció molekulatömege 10 000 daltonnál kevesebb, a másiké 10 000 daltonnál nagyobb;

a 14. ábrán a találmányunk szerinti teljes folyadékextraktum (DUP) CAM-tesztjének eredménye látható összehasonlítva a Balassa-féle eljárással előállított termék (BAL) ekvivalens koncentrációjú termékre kapott eredménnyel;

a 15. ábrán a találmány szerinti teljes folyadékextraktum (DUP) CAM-tesztjének eredménye látható, összehasonlítva az Oikawa-féle eljárással előállított termék (ÓIK) szárazanyag-tömegére számítva azonos mennyiségű anyagot tartalmazó mintára kapott eredménnyel; a 16. ábrán a TPA keratinocitákra gyakorolt hatása látható, összehasonlítva egy

DMSO-kontrollal, mindkettőt a találmány szerint előállított cápaporc-folyadékextraktum jelenlétében vagy távollétében meghatároztuk meg;

a 17. ábrán a találmány szerinti teljes folyadékextraktum gyulladásgátló hatása látható bőrirritáció-modellen;

a 18. ábrán a találmány szerinti teljes folyadékextraktum 10 000 daltonnál kisebb molekulatömegű frakciójának újabb HPLC-migrációs görbéje látható, a frakciót koncentráltuk és 5 alfrakcióra választottuk szét;

a 19. ábrán a 18. ábrán bemutatott alfrakciók antikollagenolitikus hatása látható különböző teszttérfogatoknál.

A találmány egy speciális megvalósítási módja szerint a porcot egészséges fekete tüskés cápákból és közönséges tüskés cápákból nyerjük ki. Izom- és kötőszöveteiket etanollal megtisztított szikével és ollóval távolítjuk el. Ezután a porcot későbbi felhasználás céljából műanyag zsákokban, vákuumcsomagolásban -20 °Cra fagyasztjuk. A találmány szerinti eljárásban bármilyen forrásból származó porc alkalmazható. Választásunk a korábban megadott okokból esett a cápaporcra. Azt találtuk, hogy más porcos halak családjába tartozó egyedekből kiindulva is közel egyenértékű termék nyerhető. Emlősök porcából származó termékek valószínűleg ettől eltérnek.

Az extrakciót megelőzően a porcok bármilyen módon preparálhatok, ha ez nem befolyásolja lényegesen a kívánt termék aktivitását (például a teljes folyadékextraktum vagy egy bizonyos frakciója). Balassa és munkatársai (4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) megállapítása szerint bizonyos hatóanyag-komponensek képesek ellenállni a porcot körülvevő szövetek eltávolítására szolgáló proteolitikus kezelésnek, más anyagok ilyen kezeléssel szemben nem ellenállók. Az antiangiogén hatás azon hatások közé tartozik, amelyek ilyen kezelésnek nem képesek ellenállni (15. ábra). Ezért amennyiben olyan folyadékextraktumot kívánunk előállítani, amely a lehető legtöbb különböző hatású vízoldható hatóanyagot tartalmaz, akkor ezt a kezelési lépést el kell kerülni vagy gondosan kell végezni a nagymértékű hidrolízis vagy proteolízis elkerülésére.

A tiszta porcot frissen használjuk fel vagy 4 °C-ra felolvasztjuk. Ezután a porcot egy etanollal megtisztított húsdaráló pórusain többször (leggyakrabban háromszor) ledaráljuk megfelelő mennyiségű víz hozzáadása mellett [a minimális térfogatmennyiség az egyenlő mennyiség (tömeg/térfogat)], de ez a térfogat növelhető anélkül, hogy az értékes komponensek kinyerésének

HU 222 088 Β1 hatékonyságára hatást gyakorolna. A kis térfogat előnyös, mivel gyakorlati szempontból kényelmesebb ezzel dolgozni, mint szükségtelenül nagy térfogatokkal. A gyakorlatban a vizet inverz ozmózissal és 0,1 pm-es szűrőn való szűréssel tisztítjuk. Víz helyett sokféle vizes oldat alkalmazható (például sóoldatok). Ha sokféle vízoldható hatóanyagot kívánunk kinyerni, akkor közel semleges pH-η és nem denaturálókörülmények között előnyös dolgozni, a víz és bizonyos porckomponensek denaturálódásának elkerülésére. A nem ismert fehérjék viselkedése vizes oldatban nem számítható ki. Egyeseknek kedvezőbb a savas pH, másoknak a bázisos pH. Ezen túlmenően bizonyos fehérjék kíméletes denaturálókörülmények között extrahálhatók, ha a denaturálódás nem teszi megfordíthatatlanná ezeknek a fehérjéknek vizes oldatban való renaturálódását. Ezeket a tényezőket figyelembe véve megfontolt választásnak látszik ismeretlen szerkezetű és tulajdonságú komponensek jó kitermeléssel való előállítására olyan eljárást alkalmazni, ahol a porc hatóanyagainak extrakcióját tiszta vízben végezzük.

A porc/víz keveréket ezután egy konyhai keverőgépben maximális sebességgel homogenizáljuk körülbelül 4 °C-on 10 percig. Természetesen az extrakció ideje fiigg a kevertetés sebességétől és a vizes oldat térfogatától. Ezért a homogenizációs idő 10 perc és 24 óra között, előnyösen 10 perc és 60 perc között változhat. A hőmérsékletet 10 °C alatt tartjuk, a hatóanyag endogén enzimek hatására történő degradációjának elkerülésére, ha nem használunk enziminhibitort. Ideális esetben a hőmérséklet közel 0 °C. Mivel a kísérletet általában hideg szobában végezzük, ahol a hőmérséklet 4 °C és 10 °C között tartható, ez a hőmérséklet-tartomány elfogadható az eljárásban. A továbbiakban a fent megadott elfogadható hőmérséklet-tartomány helyett a tömörség kedvéért a .körülbelül 4 °C” kifejezést használjuk.

A homogenizátum folyadékfrakciója Polytron diszintegrátorral is előállítható 10 perc alatt 4 °C-on, ha a keverőben nem csökken megfelelően a részecskék mérete. Más módon, a keverék egyszerűen homogenizálható egy megfelelően kialakított dezintegrátorban, amellyel megtakarítható a 10 perces folyadékfrakcionálási lépés. A teljes homogenizációs lépés végén visszamaradó részecskék mérete kisebb mint 500 pm. Természetesen az első darált por kinyerésénél megadott időés hőmérséklet-tartományok is alkalmazhatók. A homogenizálás utáni részecskeméret nem szükséges, hogy nagyon kicsi legyen. Ezért az extrakció előtt a porc porítására nincs szükség. Ezzel szemben, ha a porcot porítjuk a vizes extrakció előtt, akkor a porc értékes hatóanyagai denaturálódhatnak, különösen ha ezt fagyasztással vagy hővel történő szárítással végezzük.

A homogenátumot 4 °C-on 13 600 g-vel 15 percig centrifugáljuk, ezzel az egyetlen lépéssel gyorsan és hatékonyan elválasztjuk a felülúszót a szemcsés anyagtól. A szakember számára ismertek ennek az eljárásnak a körülményei és változatai, melyek az adott készülékben a homogenátum térfogatától is függenek.

A kapott szemcsés anyagot 24 óra és 48 óra közötti időtartamig liofilizáljuk. Ezt az első frakciót a továbbiakban liofilizátumnak vagy szilárd extraktumnak nevezzük.

A felülúszót, amennyiben szükséges, egy 24 pm-es Whatman-szűrőn szűrjük, az ultraszűrő oszlopon való szűrést zavaró részecskék eltávolítására. A szűrt anyagot ezután körülbelül 4 °C-on egy tangenciális áramlású szűrőoszlopon ultraszűijük, melynek porozitása körülbelül 500 kDa, így kapjuk a 0 és körülbelül 500 kDa közötti molekulatömegű vízoldható molekulákat tartalmazó első nyerspermeátumot. Ezt a szűrt nyersextraktumot 0,22 pm-es szűrőn sterilen szűrjük, és steril üvegekbe töltjük felhasználásig. Ezt a frakciót a továbbiakban nyerspermeátumnak vagy teljes folyadékextraktumnak nevezzük.

Alternatív módon, a szemcsés anyag és a felülúszó elválasztására nagyobb teljesítményű centrifugálási eljárást is kifejlesztettünk. Eszerint a 13 600 g-vel 15 percig végzett centrifugálás és ezt követő Whatman-szűrőn végzett előszűrés egy 30 pm porozitású nejlontasakkal felszerelt CEPA centrifugálóberendezéssel 3000-4000 g-n végzett centrifálással helyettesítjük. A 25 kg/25 liter készítményt ezzel az eljárással 30 perc alatt centrifugáljuk, és 29 liter felülúszót kapunk. A kapott vizes oldat térfogata nagyobb, mint a kiindulási víztérfogat, ez arra utal, hogy a porc saját víztartalma növeli a térfogatot. A liofilizátum és a teljes folyadékextraktum összetételének meghatározásakor nagy vonalakban figyelembe vettük a különböző sarasokra és különböző kiindulási anyagokra kapott eredményeket.

Liofilizátum

Zsírok 7,35%¹

Fehéqék 46,2%²

Nedvességtartalom 20,4%

Nátrium 4,16 mg/g³

Kálium 2,64 mg/g

Kalcium 114 mg/g

Magnézium 1,49 mg/g

Cink és vas nyomokban

Felülúszó

Zsírok 0,10-0,20%i

Fehérjék 8-25 mg/ml²

Nedvességtartalom 97-99%

Nátrium 30-220 mg/100 g³

Kálium 30-40 mg/100 g

Kalcium 2,0 mg/100 g

Magnézium 1,1 mg/100 g

Cink és vas nyomokban !’² A méréseket az AOAC Official (1984) publikált utasításai 16,219-220 és a 2,055 szakasza szerint végezzük.

³ A méréseket az SAA-eljárás szerint végezzük.

A fehérjetartalmat Kjeldahl-módszerrel határozzuk meg, amely valójában a szerves nitrogéntartalom (N) mérésén alapul. A szerves nitrogéntartalomból az ekvivalens fehérjetartalom a következő egyenlet alapján határozható meg:

Fehérjetartalom (mg/ml)=%N χ 6,25/100

A szénhidrátok nem detektálhatok, de feltételezhető, hogy egyik-másik extraktumban előfordulnak proteoglikánok és/vagy mukopoliszacharidok formájában.

HU 222 088 Bl

Lehetséges, hogy ezeket a vegyületeket a mért nedvességtartalom foglalja magában, ugyanis a liofilizátumnak a hidroxicsoportok alapján meghatározott nedvességtartalma váratlanul magas. A mért 20%-os nedvességtartalom közel azonos a porcból kinyerhető százalékos szénhidráttartalommal, míg a liofilizátum nedvességtartalmának a 0%-hoz kellene közel állnia, azonban ez a feltételezés még nem bizonyított.

A sterilitást az USP XXIII előírás alkalmazásával biztosítjuk.

1. Laboratoire de génié sanitaire du Québec Inc.

1090, l’Escarbot, Centre Industriel St-Malo, Québec GIN 4J4; és

2. Northview Laboratories Inc.

1880, Holste Road, Northbrook, IL, 60062 U.S.A. FDA registration no. 14-18028

Hatástani vizsgálatok

Liofilizátum

In vitro vizsgálat

A vizsgálatokat hormonfüggő MCF-7 és ZR751 rákos sejtvonalakon végezzük [a megfelelő ATCC (R)-számok és letétbe helyezési időpontok rendre 22HTB, 1982. április 5. és 1500-CRL, 1979. június 19.]

ZR75-1 sejtek

BASAL RPMI táptalaj g fenolvöröst nem tartalmazó RPMI 1640-et (Sigma R8755), 17,875 g Hepest (szabad sav; Sigma HO763), 0,55 g nátrium-piruvátot (Sigma P5280) és 10 g NaHCO₃-ot 5 1 tiszta vízben oldunk, és az oldat pH-ját 7,40-re állítjuk be NaOH-dal.

A fel nem használt oldatot fénytől védve tároljuk, mert fényérzékeny anyagokat tartalmaz.

Az oldatot szűrjük, 500 ml-es steril üvegekbe töltjük, és 4 °C-on maximum három hónapig tároljuk.

Sejttenyészet fenntartására szolgáló táptalaj

A Basal RPMI táptalajt a következő anyagokkal egészítjük ki: 10 térfogat% FBS (szarvasmarha-magzatiszérum), 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát (Sigma P0906)/ml táptalaj, 2 mM L-glutamin (Sigma G1517) és 1 nM E₂ (β-esztradiol Sigma E8875).

Kísérleti táptalaj

A Basal RPMI táptalajt a következő anyagokkal egészítjük ki: 5% FBSA/faszénen adszorbeált szarvasmarha-magzatiszérum), 2 mM L-glutamin, 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát (Sigma P0906)/ml táptalaj és 50 ng/ml inzulin (Sigma). Ehhez a táptalajhoz növekvő koncentrációban adjuk a fent ismertetett liofilizátumot és az esztradiolt (ΙΟ*^12-5 M).

MCF- 7 sejtek

BASAL DME-F12 táptalaj

DME-12 táptalajt (bikarbonátot és fenolvöröst nem tartalmaz; Sigma) a gyártó utasításai szerint állítjuk elő tiszta vízben. Egy literhez 1,2 g nátrium-bikarbonátot adunk és kémhatását pH 7,40-re állítjuk be NaOH/HCldal. Az oldatot szűrtük, 500 ml-es steril üvegekbe töltjük, és 4 °C-on tároljuk maximum három hónapig.

Sejttenyészet-táptalaj

A Basal DME-F12 táptalajt a következőkkel egészítjük ki: 10% (térfogat/térfogat) FBS (szarvasmarha-magzatiszérum), 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicinszulfát/ml táptalaj, 2 mM L-glutamin (Sigma) és 1 nM E₂ (esztradiol).

Kísérleti táptalaj

A Basal DME-F12 táptalajt a következőkkel egészítjük ki: 5% FBSA (dextrán-faszénen abszorbeált szarvasmarha-magzatiszérum), 2 mM L-glutamin, 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát/ml táptalaj és 50 ng/ml inzulin (Sigma). A liofilizátumot és az esztradiolt a ZR75-1 sejteknél megadott koncentrációban alkalmazzuk.

Az FBSA előállítása

Szarvasmarha-magzatiszérumot 1% (tömeg/térfogat) faszénnel (szénnel színtelenített lúg) keverünk. A faszénszérum oldatához T70 dextránoldatot adunk 0,1% koncentráció (tömeg/térfogat) eléréséig. Az elegyet egy éjszakán át keverjük 4 °C-on. Ezután 4 °C-on 30 percig 10 000 g-n centrifugáljuk, majd a szérumot dekantáljuk, és ismételten azonos arányú faszénnel és dextránnal keverjük össze. Ezután szobahőmérsékleten három órán át kevertettük, és újra centrifugáljuk. A szérumot 56 °C-on hőkezeléssel 20 percig inaktiváltuk, majd sterilen szűrjük, és steril kónuszos Falkon-csőbe adagoljuk.

ZR75-1 és MCF-7 sejteket a 24 mérőhelyes tálcákon 20 000 sejt/mérőhely sűrűségig vagy a 6 mérőhelyes tálcákon 150 000 sejt/mérőhely sűrűségig szaporítjuk, és a fent ismertetett eljárással előállított liofilizátum különböző mennyiségével vagy anélkül kezeljük. Ehhez a hatáshoz a liofilizátumot sejtkultúraközegben reszuszpendáljuk és sterilen szűrjük a vízoldható komponensek kinyerésére és vizsgálatára. Minden kísérletet háromszor ismételünk meg. A sejttenyészet-táptalajt minden második nap friss táptalajjal helyettesítjük. A sejteket állandó nedvességtartalmú, 5% CO₂-t tartalmazó atmoszférában, 37 °C-os inkubátorban tenyésztjük az első, második, harmadik vagy negyedik kísérletnek megfelelően, rendre 17, 7, 3 vagy 3 napig. A sejtszaporodás gátlását a sejtek direkt megszámolásával vagy a mérőhely teljes DNS-tartalmának mérésével határozzuk meg.

I Liofilizátumkoncentráció	Sejtgátlás (%)
	MCF-7	ZR75-1
1. kísérlet: 17 nap
1 mg/ml	1,5	2,00
5 mg/ml	14,33	33,6
\| 10 mg/ml	62,66	90,8

HU 222 088 Bl

Táblázat (folytatás)

Liofilizátumkoncentráció	Sejtgátlás (%)
MCF-7	ZR75-1
2. kísérlet: 7 nap
1 mg/ml	3,73	0,97
5 mg/ml	15,7	29,00
10 mg/ml	68,37	66,00
3. kísérlet: 3 nap
50 mg/ml	95,8	95,00
100 mg/ml	94,6	98,00
4. kísérlet: 3 nap
10 mg/ml	34,4	51,5
20 mg/ml	62,5	70,5
50 mg/ml	95,8	95
100 mg/ml	94,6	98

A sejtszaporodás gátlásának fentiekben bemutatott százalékos értékeiből látható, hogy a liofilizátum a dózistól függő mértékben gátolja a mindkét sejtvonal sejtjeinek szaporodását.

Az 1. ábrán jól látható, hogy a liofilizátum 50 és 100 mg/ml dózisnál három nap kezelés után egyértelműen gátolja a sejtvonalakon a hipopláziát.

A 2. ábrán látható, hogy 10^_12-10 ⁹ M esztradiol jelenlétében a kezelt sejtek a kontrolisejtekhez hasonlóan viselkednek, azaz nem hatnak rájuk ezek a hormondózisarányok. Ezzel szemben 1 nM érték felett a kontrollsejtek erősen reagálnak, és a DNS-koncentráció 10“⁷ M esztradiol jelenlétében eléri a 3,75 pg értéket (szemben az esztradiol nélküli 0,69 pg kontrollértékkel). A 30 és 50 mg/ml liofilizátummal kezelt sejtekben mért DNS-érték maximuma sorrendben 1,9 és 1,8 Mg·

A 2. ábrán látható, hogy a kezelt sejtek affinitási konstansa (Km) esztradiolra 3-16-szor nagyobb (31,3 nM és 174,0 nM), mint a kontrollsejtek Km-értéke 30 és 50 mg/ml koncentrációnál. Ez azt jelenti, hogy liofilizált szilárd porcextraktum jelenlétében azonos sejtszaporulat eléréséhez nagyobb esztradiolkoncentráció szükséges. Következésképpen az extraktum csökkenti a kezelt sejtek esztradiolra adott maximális válaszát (90%-os gátlás) és növeli ezek affinitásikonstansértékét.

In vivő vizsgálatok

Négyszáz darab 40 napos nőstény Sprague-Dawley-patkányt (Charles River Co. St-Constant, Québec) 12 napig szoktattunk környezetükhöz. Ezután 20 mg DMBA-t (9,10-dimetil-l,2-benzantracén, Sigma Chemical Co.) kapnak 1 ml gabonaolajban mesterséges táplálással. Három hónap múlva kiválasztunk 240 patkányt, melyeknél emlőrák fejlődött ki, és ezeket két csoportra osztjuk. Az első csoportot öt alcsoportra osztjuk. A kezelt csoportokban lévő patkányoknak nyolc héten át napi dózisban növekvő mennyiségű liofilizátumextraktumot adunk 3 ml vízben, míg a kontrollcsoport azonos mennyiségű vizet kap. A második csoportot négy alcsoportra osztjuk. A kezelt csoportokba tartozó patkányoknak tíz héten át szintén napi dózisban 3 ml vízben adunk liofilizátumot felülúszóval kombinálva vagy anélkül, és a kontrollcsoport ugyanennyi vizet kap. A második csoportba tartozó patkányok közül egy alcsoportot 3000 mg/kg/nap koncentrációban kezelünk a liofilizátummal, és emellett intraperitoneális (ip.) injekcióban 3 ml felülúszót adagolunk, amely a felülúszó kisebb dózisát tartalmazta (körülbelül 8 mg fehérjetartalom 1 ml vízben).

A patkányok testtömege a kéthetes kísérlet kezdetén 151-175 g, ad libitum táplálkoznak és vizet isznak. Az első csoportba tartozó patkányok átlagos tumormérete 0,9 cm átmérőjű volt, a második csoportba tartozó patkányoké 0,6 cm.

Az eredmények összefoglalása

Porcextraktum napi dózisa mesterséges táplálással	Tumornövekedés gátlása %-ban (tumorátmérő csökkenése a kontrolihoz képest)
1. kísérlet: 8 hét időtartam
500 mg/kg/nap	2%
1000 mg/kg/nap	4%
3000 mg/kg/nap	14%
5000 mg/kg/nap	15%
2. kísérlet : 10 hét időtartam
3000 mg/kg/nap	12%
3000 mg/kg/nap+3 ml felülúszó	18%
3000 mg/kg/nap+3 ml felülúszó	20%
+ 1 ml inj.
ip. felülúszó

Az eredmények azt mutatják, hogy a liofilizátum olyan hatóanyagot tartalmaz, mely a gyomor-bél traktusban abszorbeálódik, és a tumor méretére hat. Ez a hatás lehet közvetlenül a tumoros sejtekre gyakorolt hatás vagy az érképződés gátlása útján kifejtett hatás.

Az eredményekből az is látható, hogy a felülúszó a tumorméretet körülbelül további 5%-kal csökkenti.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a liofilizátum nem vízoldható hatóanyagot és/vagy maradék vízoldható anyagot is tartalmaz. Ezért megfontolandó lehet a szemcsés anyag újraextrahálása vizes oldatban, amellyel a vízoldható komponensek tökéletesebben kinyerhetők, amennyiben a kitermelés még növelhető.

Kórszövettani vizsgálatok

Annak bizonyítására, hogy a porcextraktum hatásos molekulái nem toxikusak, a fenti in vivő kísérletben használt állatokat dekapitálással leöljük, és a következő szöveteiken végzünk analízist: máj, tüdő, vese, szív, agy, izom, és emlőmirigy. A felsorolt szöveteket két napig Bouin-folyadékban fixáltuk, majd zsírtartalmukat eltávolítjuk. Az etanolos víztelenítés után a fixált szöve8

HU 222 088 Bl teket parafmba ágyazzuk. Az így készült metszeteket üveglemezekre helyezzük, haematoxilinnal megfestjük és mikroszkóp alatt vizsgáljuk.

A szövettani vizsgálat a legnagyobb liofílizátumdózis alkalmazása esetén (nincs bemutatva adat) sem mutat észlelhető káros hatást, felülúszóval kombinált vizsgálat esetén sem (lásd a 3a., 3b., 4a., 4b., 5a. és 5b. ábrákat).

A vizsgálatok azt mutatják, hogy a liofilizátum és a felülúszó egymástól függetlenül tumorméret-csökkentő hatású.

A rákos emlőmirigyekben (6a. és 6b. ábrák) a véredények területének jelentős csökkenése figyelhető meg. Az aktív molekulák érképződést gátló hatását megerősítik a 7. ábrán bemutatott eredmények.

A 7. ábrából látható, hogy liofilizátum (po.) - felülúszó (po.+ip.) kombináció alkalmazása esetén (6a. és 6b. ábrák) a véredények területe 55%-kal csökken.

A tumorméret csökkenése az erezettség jelentős csökkenésére, a tumoros sejtekre gyakorolt közvetlen hatásra vagy a két jelenség kombinációjára vezethető vissza. Az extraktumok érképződést gátló hatását a fentiekben részletesen bemutattuk. A közvetlen hipopláziás hatást hormonfüggő sejteken in vitro tanulmányozzuk, melynek in vivő megerősítése még hátra van.

Mivel a fent ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a felülúszó megnöveli a liofilizátumnak a ZR75-1 sejtekre gyakorolt hatását, ezért ennek komponenseit további vizsgálatoknak vetjük alá.

Az aktív molekulákat tartalmazó folyadékfrakciók előállítása

A cápaporcot a fentiekben leírtak szerint gyűjtjük be és kezeljük. Centrifugálás után az üledéket félretesszük, és a felülúszót a fent leírtakkal azonos módon kezeljük, a 0,22 pm-es szűrőn történő steril szűrésig bezárólag.

A felülúszó a továbbiakban a nyersszűrletet jelenti, például az ultraszűréssel kapott terméket.

Az így kapott nyersszűrletet FPLC-vel (Gyors fehéijefolyadék-kromatográfia) választjuk el.

FPLC-körülmények

Oszlop: Hiload26mmx60 cm Sephacryl S-300

Pharmacia FPLC-rendszer

Minden mintát 0,22 pm-es szűrőn szűrünk, mielőtt az oszlopra visszük. Eluálópufferként foszfátsópuffert (PBS) alkalmazunk, melyet szűrünk és 15 percig gáztalanítunk. Az oszlopra vitt minta térfogata általában 3,2 ml (maximum 13 ml), és az áramlási sebesség 1 ml/perc. 10 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk össze. Az eluált vegyületeket UV-abszorbancia alapján detektáljuk (280 nm). A kalibrációs diagram elkészítéséhez Sigma MW-GF-1000 kalibrációs készletet alkalmazunk, a kalibrálóminta térfogata azonos az analizált minták térfogatával (3,2 ml). A minta eluciós térfogatát úgy határozzuk meg, hogy a kalibrációs készlet vegyületeinek molekulatömegét ábrázoljuk az elúciós térfogat függvényében, melyből levonjuk az üres oszloptérfogatot. Az üres térfogatot dextránkék injektálásával határozzuk meg (MT=2 000 000).

A frakciók hatását ZR75-1 sejteken vizsgáljuk. A hasznos frakciókat azonosítjuk, tulajdonságaikat további vizsgálatokkal igazoljuk (lásd az alábbiakat).

A szűrlet hatásos komponenseinek kiegészítő jellemzését rotoforon (Biorad 170-2950; lásd alább az izoelektrofokuszálásnál) és különböző mérethatárú Amicon szűrőkön végezzük, melyekkel 10-30 kDa közötti, 30-100 kDa közötti és 100 kDa fölötti molekulatömegű frakciókat választjuk el.

Izoelektrofokuszálás

A cápaporckészítményt (1 Kg/l-es szűrletből 46 ml) egy éjszakán át 4 °C-on 4 liter 5% glicerintartalmú tiszta vízzel dializáljuk, melyhez #7 MWCO 3500 kDa pórusú Spectra membránt alkalmazunk (Spectrum 132110). A dializált oldatot 2,75 ml pH 3,5-10,0 amfolitoldattal (Pharmacia #80-1125-87) és 0,5 g 3-[(kolamido-propil)dimetil-ammonio]-l-propán-szulfonáttal (Sigma C3023) keveijük. A térfogatot tiszta vízzel 55 ml-re egészítjük ki. Az oldatot rotoforba helyezzük. Az izoelektrofokuszálást 4 °C-on, 12 watt állandó teljesítményen végezzük (3000 χ i Biorad 165-0554 áramforrás), az állandó hőmérsékletet folyamatos víz ciikuláltatásával biztosítjuk. Az elválasztás kezdetén a feszültség 380 V, az áramerősség 31 mA. Az áramerősség stabilizálódása után (14 mA) a feszültség 870 V-ra emelkedik. Ekkor az izoelektrofokuszálást megállítjuk, és 20 frakciót gyűjtünk össze.

Frakció	Térfogat (ml)	PH
1	3,7	3,56
²	2,1	4,01
3	2,2	4,18
4	2,3	4,31
5	2,2	4,63
6	2,1	5,03
7	2,5	5,30
8	2,1	5,50
9	2,4	5,81
10	2,5	6,26
11	2,3	7,00
12	2,4	7,29
13	2,4	7,64
¹⁴	2,5	7,94
¹⁵	2,3	8,32
¹⁶	2,5	8,62
¹⁷	2,4	8,94
18	2,9	9,30
19	3,1	9,88
	3,6	10,71

A fehérjék azonosítása elektroforézisgélen meghatározott molekulatömegük alapján történik (Laemmli, U. K. (1970) Natúré (Lond.) 227; 680).

A frakciókat puffénál négyszeresére hígítjuk (lásd Laemmli) és ebből 8 pl aliquot mennyiségeket veszünk ki, és nemredukáló körülmények között elektroforézis9

HU 222 088 Bl sel vizsgáljuk. Az izoelektrofokuszálás előtti anyag és a frakciók elektroforézis profilja a 8. ábrán látható.

A frakciókat lamináris áramlású fülkében, 0,22 pm porozitású Millipack-60 steril szűrőn szüljük, és steril körülmények között palackoztuk.

A frakciók fehéijetartalmát Lowry-féle dóziseljárással határozzuk meg. Az 1 kg/21 koncentrációjú oldatok (nyers porctömeg per liter szűrlet hányadosban kifejezve) ZR75-1 sejtekre gyakorolt hatását különböző koncentrációjú sejttenyészet-táptalajban vizsgáljuk.

Az eredmények összefoglalása

1. teszt:

A szűrletet liofilizáljuk, PBS-sel reszuszpendáljuk és FPLC-vel vizsgáljuk. Hipopláziás aktivitás nem mérhető (nincs adat).

2. teszt:

A rotoforfrakciók vizsgálata (a szűrletet bepárlással koncentráljuk)

Fehérjemeghatározás

Azonosított frakciók	Izoelektromos pont	Középérték	Molekula- tömeg
7-8-9-10	5,30-6,26	5,78	29±lkDa
7-8-9	5,30-6,26	5,68	60±lkDa
12-13-14	7,29-7,94	7,62	48±lkDa
13-14	7,64-7,94	7,79	35±lkDa

3. teszt:

FPLC-frakciók vizsgálata (a szűrletet bepárlással koncentráljuk)

Frakciók	Molekulatömeg
6 és 7	1-2,5 kDa

4. teszt:

Amincon molekulaszűrőn elválasztott 100 pl-es frakciók vizsgálata

Mért koncentráció	Molekulatömeg	Gátlás ZR75-1 sejtkultúrákon
100 pg/ml	MT>100kDa	64%
100 pg/ml	30 kDa<MT<100 kDa	114%
100 pg/ml	10 kDa<MT<30 kDa	127%
400 pg/ml	MTclOkDa	149%

A 6. és 7. FPLC-frakciók nagyon kicsi molekulatömegű hatásos komponenseket tartalmaznak: 1-2,5 kDa.

A frakciók hipopláziás hatása akár 33 000-szorosa lehet a liofilizátum esetében meghatározottnak. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a liofilizálás az eluátum fehérjetartalmának közvetlen tumorellenes hatását bizonyos mértékig rontja, azonban a szilárd extraktum liofilizálásánál ilyen abolició nem figyelhető meg. Ez arra utal, hogy a porcrészecskékben lévő hatóanyagok olyan környezetben vannak, melyben kevésbé érzékenyek a liofilizálás denaturálóhatására, mivel a hipopláziás hatású komponens érzékeny a liofilizálásra, ezért a víz elvonásakor valószínűleg a liofilizálást megelőzően a teljes extraktumhoz vagy a hatóanyagot tartalmazó adott frakcióhoz stabilizátort vagy védőanyagot hozzáadva a hatás lényegében megőrizhető.

Az eluátum hatásos komponenseinek további azonosítása

Ugyanebből a szűrletből (1 kg/1), más típusú tisztítási eljárással egy 10 mm átmérőjű és 30 cm hosszú Superose-12 oszlopon, a fent leírt FPLC- és rotoforeljárást alkalmazva, 1 ml/perc áramlási sebességgel az alábbi molekulatömegű hatásos frakciókat szedjük (ZR751 sejteken tesztelve) (45 darab 1 ml-es frakció):

20-21 frakciók a frakciók aktivitása 70-120 kDa molekulatömegnek felel meg frakció a frakciók aktivitása 60-70 kDa molekulatömegnek felel meg

29-32 frakciók az egymással átlapolt frakciók aktivitása 35-46 kDa molekulatömegnek felel meg

34-35 frakciók a frakciók aktivitása 29 kDa molekulatömegnek felel meg

38-39 frakciók a frakciók aktivitása 1 -2,5 kDa molekulatömegnek felel meg

A specificitás vizsgálata

A tumoros sejtekre gyakorolt specifikus hatás vizsgálata céljából a szűrletet ultraszűrtük, majd más alapsejt-eredetű sejteken, nevezetesen emberi TENON kötőszöveti sejteken (HTF) teszteljük, melyek szabályos kötőszöveti sejtek.

B) In vitro

a) Betegek

Csupán két betegből származó (egyik neovaszkuláris glaukómás, NVG, és egy elsődleges nyitott szemzugglaukómás POAG) HTF-t alkalmazunk.

b) A HTF-ek másodlagos tenyésztése és fenntartása

Mindkét konfluens tenyészetet mossuk és elválasztjuk 0,5 ml 0,05% tripszin/0,5 mM EDTA (Gibco 6105300 AG) oldattal 5-10 percig 37 °C-on. A tripszin/EDTA semlegesítésére 1,5 ml DME/F-12 táptalajt adunk, amely 15% FBS-t tartalmaz.

A sejtek asszociációját úgy végezzük, hogy szétmorzsoljuk és 25 cm²-es T lombikba tesszük át, melyhez 10% FBS-t tartalmazó kiegészítő táptalajt adunk. Miután a tenyészet a konfluenciát elérte, a HTF-et 75 cm²es és végül 180 cm²-es T lombikba helyezzük. Mikor elegendő sejt keletkezik, ezek egy részét felhasználjuk a fent leírt kísérletekben, a többit lefagyasztjuk, hogy azonos sejteket őrizzünk meg további kísérletekhez.

c) Kísérleti előírások

Az egyik beteg sejtjeit a konfluencia elérése után két vagy három azonos 180 cm²-es T lombikban tenyésztjük, majd a fent leírt eljárással osztjuk szét. Rövid ideig, kis sebességen végzett centrifugálás után a sejteket 256-Channelyzerrel ellátott ZMI Coulter 216 013 számolóval megszámoljuk.

Az alábbi in vivő kísérleteknél mindegyik 16 mmes tálon és a 12 mérőhelyes tálcán körülbelül ötvenezer sejtet oltunk be az 1% FBS-t tartalmazó 1 ml DME/F -12 táptalajba. A beoltás után tizenhét órával azonosan 1 ml 1% FBS-t tartalmazó („abszolút” kontroll) friss táptalajt adunk hozzá. A kísérlet megtervezé10

HU 222 088 BI sétől függően (lásd fent és alább) az 1%-os FBS táptalajhoz GF-et (szaporodási faktort) vagy 1 kg/2 1 (porctömeg/víztérfogat) szűrletoldatot adunk vagy nem adunk, és steril körülmények között szüljük. Ezen a napon (0. nap) megszámolunk néhány sejtmintát, a lemezre helyezés hatékonyságának meghatározására (mely egyenlő vagy nagyobb mint 95%).

A kísérlet kezdetétől számított negyvennyolc óra után a sejteket leöblítjük, a fent ismertetett eljárással szétosztjuk, majd ismét megszámoljuk. A sejtek számát az „abszolút” kontrolinál meghatározott értékek százalékában fejezzük ki.

Az 1% vagy 5% FBS-t tartalmazó „abszolút” vagy pozitív kontrollcsoportok és az 1% FBS-t, és adott mennyiségű GF-et vagy porcszűrletet tartalmazó kísér- 15 leti csoportok három-három mintából állnak.

Mindegyik kísérletet az egyik vagy egyidejűleg mindkét beteg sejtjein elvégezzük, és legalább kétszer megismételjük.

A növekedési faktorok (GF) és a porcszűrlet fibroblaszt szaporodására gyakorolt hatását összehasonlítjuk az 5% FBS ugyanilyen hatásával.

A kísérletek során 10-100 ng/ml koncentrációban rendre GF-et, sertésvérlemezke-eredetű növekedési faktort és emberi rekombináns bázis fibroblaszt növekedési faktort (hr bFGF) [Farmitalia Carlo Erba (Milánó, 5 Olaszország) ajándékozta Dr. P. Brazeau-nak] adunk 1% FBS-hez. A kísérlet megkezdése után negyvennyolc órával a sejteket Trypsin-EDTA-val szétoszlatjuk, és Coulter-számlálón megszámoljuk. Az alábbi táblázatban látható értékhármasok (1, 2 és 3 oszlop) az 10 egyes mérőhelyeken meghatározott értékek huszadrészével egyenlőek.

B páciens: glaukóma; Neme: férfi; Életkor: 53

HTF —1. nap: Sejtek száma mérőhelyenként: 46 170 DME/F12-1% FBS-1% Pen. Strep

0. nap: Sejtek száma mérőhelyenként: 65 214 DME/F12-1% FBS-1% Pen. Strep

1. nap: Sejtek száma mérőhelyenként: 62 548 DME/F12-1% FBS-1% Pen. Strep 20 2. nap: Sejtek száma mérőhelyenként:

DME/F12-1% FBS-1% Pen. Strep

		Minta/lemez	1	2	3	AVE	SEM	% kontrolinövekedés
Tálca #1		DME/F12
FBS	1	0. nap	3,019	2,862	2,853	65,214	71
		1% FBS
	2	+ 1. nap 1% FBS	2,711	2,973	2,693	62,548	1,655
	3	+ 2. nap 1%FBS	2,284	2,400	2,191	51,333	1,655	100
	4	+ 2. nap	3,084	2,834	3,115	67,446	1,627	131
		5% FBS						**
Tálca #2		DME/12
PDGF	5	Kontoroll	2,558	2,181	2,216	51,931	2,199	100
		(1% FBS)
	6	1 ng/ml 1% FBS	2,425	2,580		56,056	1,228	108
	7	10 ng/ml	4,080	3,975	4,282	92,116	1,648	177
		1% FBS						***
	8	100 Ng/ml	4,625	4,356	4,450	100,285	1,442	193
		1% FBS						***
Tálca #3		DME/F12
b-FGF	9	Kontroll	2,915	2,533	2,502	59,360	2,429	100
		(1% FBS)
	10	1 ng/ml 1% FBS	2,744	2,554	2,761	60,174	1,213	101
	11	10 ng/ml	3,606	3,143	3,193	74,234	2,683	125
		1% FBS
	12	100 ng/ml	4,064	3,033	3,026	75,585	6,307	127
		1%FBS

HU 222 088 Β1

Táblázat (folytatás)

		Minta/lemez	1	2	3	AVE	SEM	% kontrolinövekedés
Tálca #4		DME/F12
PORC	13	Kontroll	2,826	2,566	2,486	58,822	1,877	100
(lkg/21) szűrt		(1%FBS)
	14	1 pl/ml 1%FBS	2,729	2,576	2,575	58,837	936	100
	15	10 pl/ml 1%FBS	2,643	2,493	2,584	57,643	798	98
	16	100 pl/ml	2,918	2,883	2,766	58,483	2,461	99
		1%FBS

** P<0,02 *** P<0,01 meghatározva a Student-Fisher-teszttel

A növekedési faktorok, mint a PDGF (vérlemezkeeredetű növekedési faktor) és bFGF (alapfibroblaszt növekedési faktor) serkentőhatást gyakorolnak a HTF-re, ezzel szemben a porcszűrlet jelenlétében (1 kg/2 1) szaporított sejteknél sem pozitív sem negatív hatás nem észlelhető. Hipopláziás hatás sem figyelhető meg. Ez arra utal, hogy a szűrlet hipopláziás vagy citotoxikus hatása tumoros sejtspecifikus és a normális sejtekre nem gyakorol mérhető hatást. Ugyanez a porcextraktum más típusú fibroblasztsejtekre sem fejt ki hatást HSF (humán bőrfibroblaszt-sejtek; adat nélkül). Bár nem vizsgáltuk, feltételezzük, hogy a liofilizátum a normális sejtekre sem fejt ki hatást.

Mivel előttünk már mások is nagy érdeklődést mutattak a porcextraktumok iránt, a találmány szerinti eljárással előállított cápaporc-folyadékextraktumok egyedülálló tulajdonságainak bizonyítására összehasonlító vizsgálatokat végeztünk a szakirodalomból ismert vagy a következő termékekkel, nevezetesen Balassa (4 822 607 számú amerikai szabadalmi leírás) és Oikawa és munkatársai (olvadáspont cit.) eljárása szerint előállított termékekkel.

Az Oikawa és munkatársai szerinti eljárás két főfrakciót eredményez, az egyik 1 kDa és 10 kDa közötti molekulatömegű molekulákat tartalmaz, a másik 10 kDa-nál nagyobb komponenseket tartalmaz. Ezek a kutatók csak az első frakciónak tulajdonítottak antiangiogén tulajdonságokat, a másik, véleményük szerint, CAM-tesztben nem mutat antiangiogén hatást. Az Oikawa-féle termékkel való összehasonlítás céljából a találmány szerinti teljes folyadékextraktumot két frakcióra bontjuk, és az 1 kDa és 10 kDa közötti molekulatömegűt tartjuk meg. Mivel a Balassa-féle eljárás a teljes folyadékextraktumra vonatkozik, ezért a találmány szerinti teljes porcextraktumot (1 kDa és 500 kDa közötti molekulatömeg) hasonlítjuk össze a Balassa-féle eljárás reproduklásával kapott termékkel. Kiindulási anyagként borjúporc helyett cápaporcot használunk. Feltételezzük, hogy ha Balassa és Oikawa ekvivalens eljárásokat írtak le, akkor a kapott FPLC- és HPLC-görbék egymással lényegében átfednek, és a termékek CAM-teszttel vizsgálva a találmány szerintihez hasonló aktivitást mutatnak. Az FPLC- és HPLC-kromatográfiás vizsgálat előtt minden mintát 12 pg/pl (száraz tömeg/térfogat oldat) végső koncentrációra hozzuk. Az Oikawa-féle terméket a kromatográfiát megelőzően centrifugáljuk és szűrjük, mivel oldhatatlan anyagot tartalmaz.

A) FPLC-körülmények: Superose 12 (Pharmacia); gélpermeációs oszlop.

B) HPLC-körülmények: CS-S-hexil-oszlop 5 pm, 25 χ 0,94 cm, CSC#059-085, reverz fázisú oszlop.

A három különböző módszerrel extrahált cápaporcmintát a következőképpen jelöljük (száraz tömeg/oldat térfogat):

1. DUP a találmány szerinti eljárással előállított 1 kDa és 500 kDa közötti méretű molekulákat tartalmazó frakció (12 pg/pl);

2. BAL a Balassa és munkatársai szerinti eljárással előállított minta (12pg/pl);

3. ÓIK az Oikawa és munkatársai szerint előállított hármas frakció (270 pg/pl). Mindegyik mintát a 12 pg/pl (száraz tömeg/térfogat) végső koncentrációra hozzuk az analízis előtt. Az OIK-minta nagy mennyiségű oldhatatlan anyagot tartalmaz, amelyet 13 200 RPM-en centrifugálva vagy 0,2 pm-es membránon szűrve gyorsan eltávolítunk. Az oldhatatlan anyag szűrését vagy koncentrálását lényegében az FPLC- vagy HPLC- (A, B) eljárás előtt végezzük.

A) FPLC-eredmények összefoglalása

A mintákat Superose 12 (10/30) gélpermeációs oszlopra visszük fel foszfátpuffer oldateluenssel (PBS) 0,5 ml/perc áramlási sebességnél (diagrampapír sebessége 0,25 cm/perc). Az injektálás előtt a megfelelő koncentrációjú minták 100 pl aliquot mennyiségét egy 0,2 pm-es membránon szűrjük. OD₂₈o-értéken mérünk.

Az oszlopot a következő standardokkal kalibráljuk (molekulatömeg daltonban megadva): kataláz (232 000),

HU 222 088 Β1 aldoláz (158 000), albumin (56 000), ovalbumin (44 000), kimotripszin (25 700), ribonukleáz (13 700), inzulin (5 700), inzulin B lánc (3500), inzulin A lánc (2500), bacitracin (1450), B₁₂-vitamin (1355). A főcsúcs molekulatömegét a következő egyenlettel számítjuk ki: Logio móltömeg=7,52-0,212 xRT, ahol RT=elúciós térfogat (ml). R²=0,976. A teljes oszloptérfogat (V_T) 21,93 ml citidinnel meghatározva (246 Da). Az üres térfogat (V_o) 8,38 ml kék dextránnal meghatározva (2xlO⁶Da).

A 10a. ábrán látható, hogy a találmányunk szerinti DUP-minta első főcsúcsa (1) 18,76 ml-nél eluálódik, molekulatömege 3500 Da. További csúcsok jelennek meg 22,7 ml-nél (2) és 27,3 ml-nél (3), a teljes oszloptérfogaton túl (21,93 ml, citidinnel meghatározva). Ezek a csúcsok valószínűleg az oszlop anyagához kötődő anyagoktól származnak.

A 10b. ábrán látható, hogy a Balassa-féle BALmintának az oszlop V₀-értékéhez közel eluálódó kis csúcsa van (1) (8,4 ml), és 18,5 ml-nél jelenik meg a második csúcs (2) (4000 Da), a két csúcs a V_t után 22,6 percnél (3) és 28,2 ml-nél (4) eluálódik.

A 10c. ábrán látható, hogy az Oikawa-féle OIKmintának V₀-értékén kis csúcsa van (1) és 18,9 ml-nél jelenik meg egy csúcs (2) (3300 Da), továbbá 21,5 mlnél (3) (1000 Da) és egy kisebb csúcs 27,3 ml-nél (4) jelenik meg.

A minták összehasonlításánál megfigyelhető, hogy a 3300 daltonos csúcstól eltekintve a DUP-minta legfontosabb sávjai a másik két mintához képest nem azonos intenzitással jelentkeznek. Az OIK-minta kisméretű csúcsa 27,3 ml-nél, a BAL-minta csúcsa 28,2 ml-nél jelenik meg, és ezek a DUP-minták kisebb csúcsaival korrelálnak.

A HPLC-eredmények összefoglalása

A HPLC-vizsgálatokat hexil reverz fázisú oszlopon OD₂₁₀- és OD₂₈₀-értéknél szimultán végezzük. 50 μΐ aliquot mennyiségű centrifugált mintákat (mindegyik 12 pg/pl-es) viszünk fel és 100%-os vízzel eluálunk. A csúcsokat mindegyik kromatogramon az OD₂₁₀értéknek, (eg. 1), illetve az OD₂₈₀-értékeknek „(eg. 1)” megfelelően jelöljük. Az oszlop V_o térfogata 5,5 ml (1,4 perc).

A 11a. ábrán a DUP 3 főcsúcsot (1,2, 3 és 2 kis csúcsot (4, 5) mutat, amelyeket OD₂₁₀-nél határozunk meg. Az 1. számú csúcsnál megfigyelhető két oldalcsúcsot la.-val és lb.-vel jelöljük. Az 1., la., lb. és 3. csúcsokhoz jelentős OD₂₈₀-abszorbancia tartozik. Összehasonlítva a megfelelő OD₂₈₀-abszorpcióval a 2. számú csúcs sokkal kisebb az OD₂₁₀-hez képest.

A 11b. ábrán a BAL több OD₂₁₀-csúcsot mutat, de ezek intenzitása kisebb a DUP-csúcsokhoz képest. A csúcsok átlapolása jelzi a molekula azonosságát. A Balassaféle mintában csak a 3. és 7. számú csúcsok korrelálnak a DUP-minták csúcsainak retenciós idejével (rendre az la. vagy lb. és 4. számú csúcsokkal).

A 11c. ábrán az OIK-extraktumban csak három főcsúcs látható (1., 2., 3.). Az 1. és 3. számú csúcsok a DUP-minta 1. és 3. csúcsaival korrelálnak, de az OIKkromatogramon az 1. számú csúcs oldalcsúcsai nem jelennek meg. Az OIK-mintában a csúcsok magassága kisebb, mint az DUP-mintában. Habár az FPLC- és

HPLC-görbék alapján a különböző termékek tulajdonságai jól megkülönböztethetők, a három termék antiangiogén hatását CAM-teszttel is igazoljuk.

CAM-teszt

A CAM-tesztet először különböző koncentrációjú protaminnal (37, 75 és 150 pg) végezzük. Vizet tartalmazó metil-cellulóz-tálcát és pozitív kontrollként protamint tartalmazó másik tálcát, csirkeembrióchorloallantois-membránra helyezünk (n=az analizált embriók száma). Minden tálcára a rögzítés céljából egy-egy O gyűrűt helyezünk. A következő napon egy kutatópár a szokásos vakmódszerrel minden O gyűrűn bejelöli a vaszkularizáció szintjét. A CAM-teszt fejlődési skálája az 1., 2., 3. jelölésen alapul: (3. jelölés) normális eresedés, amikor hasonló a kontrollembrió ellentétes horizontális kvadránsához vagy illeszkedő kvadránsához; (2. jelölés) a véredények belépnek az O gyűrűbe, de középtájon eltűnnek, a fővéredények keresztezik az O gyűrűt, de útjuk határozottan befolyásolt, az O gyűrű szomszédságában az elágazások csökkennek, a kvadránsok eres területe csökken; (1. jelölés) az O gyűrűben nincs véredény vagy elváltozott véredény, az O gyűrűn kívül nem nőnek véredények, kivéve, ha kikerülik és túlnőnek rajta, a kvadráns eres területei határozottan eltűnnek az O gyűrű környékén. A 12. ábrán az oszlopok felett megadott értékek minden minta végső jelértékét mutatják. A két ugyanazon tojásra helyezett tálca közötti különbségek szignifikanciájának összehasonlítására Wilcoxon statisztikai tesztet alkalmazunk. Várakozásunknak megfelelő dózis-válasz összefüggés figyelhető meg.

Hasonló körülmények között vizsgáljuk a 10 kDanál alacsonyabb és magasabb DUP-extraktrum-frakciókat. Ezek egyformán hatásosan gátolják a neovaszkularizációt (13. ábra).

DUP teljes extraktumunkat összehasonlítjuk a Balassa-féle eljárással előállított BAL-termékkel. A Balassa-féle termék nem tartalmaz jelentős mennyiségű antiangiogén hatású anyagot (14. ábra).

A DUP nyersextraktumot összehasonlítjuk az Oikawa-féle ÓIK 3. frakcióval. A DUP és az ÓIK majdnem azonos (15. ábra). Mindazonáltal az Oikawa és munkatársai munkája távol esik találmányunktól, mivel ők megállapították, hogy a 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakció nem mutat mérhető hatást, amely ellentmondásban van a 13. ábrán bemutatott eredményeinkkel.

A Balassa-féle eljárás és a találmányunk szerinti eljárás hasonlósága ellenére a kétféle eljárással kapott termék nyilvánvalóan nem azonos.

A találmányunk szerinti eljárással összehasonlított két technika állása szerinti eljárás klasszikus porcextraktum-előállítási eljárásnak tekinthető. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a találmányunk szerinti eljárás terméke váratlanul nagy aktivitást mutat, különösen az antiangiogén hatás vonatkozásában. A továbbiakban egyéb hatásait is bemutatjuk és leszögezzük, hogy a találmányunk szerinti eljárással egyetlen extrak13

HU 222 088 Bl tumban egy sor vízoldható hatóanyagot sikerült visszanyerni.

Klinikai vizsgálatok

Az előzetes klinikai vizsgálatok lefolytatása előtt az ultraszűréssel nyert nyersszűrletet kétszeresére betöményítjük, ezáltal koncentrált aktív szűrletet kapunk. A koncentrátumokat 1000 Da porozitású tangenciális áramlású szűrőoszlopon állítjuk elő, mely a szűrlet térfogatát felére - huszadrészére csökkenti. A koncentrált szűrletet 0,22 pm pórusméretű millipórusos szűrőn szüljük. Ha a porcot az alternatív centrifugálásos módszernek vetjük alá (CEPA centrifugát alkalmazunk 30 μΜ porozitású membránnal) a koncentrált extraktumot tízszeres töménységben kapjuk meg, melyben a fehéije mennyisége majdnem azonos a fenti hússzoros koncentrált extraktuméval, azaz 12-25 mg/ml (javított eljárás) 8-12 mg/ml helyett (laboratóriumi skála eljárás). A steril tízszeresen koncentrált szűrletet steril üvegekben 7 ml-es aliquot térfogatokra osztottuk szét (körülbelül 85 mg fehéije), egy éjszakán át -80 °C-on tartjuk, és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A nyers- és koncentrált szűrletek közötti fő különbség ezek fehéijetartalmában van. Megjegyezzük, hogy a fehérjetartalom meghatározására alkalmazott eljárással az összes nitrogénvegyület-mennyiséget kapjuk meg, és nemcsak a fehéqéket (Kjeldahl-módszer). Ezzel magyarázható, hogy a fehérjekoncentráció a térfogati koncentrációval nem arányosan nő, szemben a Lowry-féle eljárással történő fehérjetartalom-meghatározással. Feltételezhető, hogy a koncentrálási lépésben a vízzel együtt a kis molekulatömegű nitrogénvegyületek is távoznak.

Antiangiogén hatás

A koncentrált szűrletet érképződéssel kapcsolatos betegségek kezelésére alkalmazzuk. Az érképződéssel kapcsolatos betegségek két különböző típusát vizsgáljuk a humán pácienseken; az első típus a rák (prosztatarák), a második típus a dermatológiai rendellenességek (pszoriázis) és a harmadik típus az artritisz. Az alábbi példában legalább a folyadékextraktum antiangiogén hatását illusztráljuk és mutatjuk be.

A dermatológiai betegségek közül a pszoriázist választjuk. A pszoriázisos esetek között hiperkeratózissal komplikált és nem komplikált eseteket is vizsgálunk. A keratóziskomponens az elszarusodott tasakok képződése lemezes formában. Ezek a lemezek fizikai akadályt képeznek, melyek meggátolják a hatóanyag hatásos behatolását a véredényekhez.

A prosztatarákban szenvedő páciens önként vállalta a tízszeresen koncentrált porcszűrlettel való kísérletet. Ez a páciens korábban egy sor hagyományos terápián ment keresztül, melyek sikere azonban időlegesnek bizonyult. A beteg röviddel visszaesése után kezdte fogyasztani a porcextraktumot.

Artritiszben szenvedő és korábban gyógyszert (Prednisone) szedett vagy nem szedett önkéntes betegeknek koncentrált porcextraktumot adunk. Állapotuk javult, ízületeikben a fájdalom és a merevség csökkent.

Az alább bemutatott eredmények nagyon bátorítóak, a nyersszűrlet és frakciói alkalmazhatósága nemcsak a vizsgált speciális betegségek, hanem minden érképződéssel kapcsolatos betegség kezelésére ígéretesnek látszik. Az érképződéssel járó betegségekkel szemben találmányunk szerinti porcextraktum hatásosnak bizonyult, ha a beadott készítmény hatásos mennyiséget a beadáshoz megfelelő formában tartalmaz. Találmányunk érthető módon nem korlátozódik a következő, angiogén betegségek kezelésére alkalmas egyedi készítményekre, mivel a szakterületen járatos személy a fentiek alapján sokféle készítményt állíthat össze a beadás módjától függően, és a beteg szövetre célzottan. A készítmények különféle úton adagolhatok be, például helyileg, szájon át, nyelv alatt, rektálisan, intravénásán, intramuszkulárisan, diffúzióval stb.

Mivel a porcextraktum halízű és -illatú a készítményekhez ízesítő- és illatosítóanyagok adhatók, hogy könnyebben bevehetők legyenek.

Pszoriázis

Pszoriázisban szenvedő betegnek a következő összetételű dermatológiai készítményt adjuk be, és bemutatjuk hatásosságát:

Emulgade™ CLB 29 tömeg%

20X nyersszűrlet 69,5 tömeg%

Germaben™II 1 tömeg% és

Lavandula Augustofolia 0,5 tömeg%.

Emulgade™ CLB-t, sztearát-észterek keverékét, zsíralkoholokat és nemionos emulgeátorokat (forgalmazza a Henkel Canada Ltd.) keverés közben 65-70 °C-ra melegítjük. A melegítés leállítása után a keverést tovább folytatjuk. Amikor a keverék 45 °C-ra hűl Lavandula Augustifolia-esszencia-olajat és Germaben™II tartósítóanyagot (diazonidil-karbamid 30%, metil-paraben 11%, propil-paraben 3% és propilénglikol 56%; Sutton Laboratories, NJ, USA) adunk hozzá. Amikor a keverék hőmérséklete 30 °C-ra csökken, hozzáadjuk a porcextraktumot. A kapott készítmény egyenletes, nem zsíros krém. Az Emulgade™-tartalom változtatásával más formájú, különböző viszkozitású dermatológiai készítmények is előállíthatok, a gyártó utasításainak megfelelően (tej, lotion, kenőcs). Más hordozóval vagy kötőanyaggal előállítható paszta, gél vagy más formájú transzdermális készítmény is.

A fenti készítményt 12 héten át naponta kétszer adjuk be egy 9 páciensből álló csoportnak (helyi alkalmazás), akik pszoriázisban szenvednek, és bár a korábban próbált szokásos terápiákra reagáltak, de egy idő után nehezen gyógyíthatóvá váltak. A vizsgálathoz olyan betegeket választunk ki, akiknek szimmetrikusan mindkét oldalra kiterjedt pszoriázisuk van. Dupla vak típusú kísérleteket végzünk oly módon, hogy sem a bőrgyógyász, sem a beteg nem tudja, hogy melyik oldalát kezeljük a porcextraktumot tartalmazó készítménnyel és melyiket a kontrollkészítménnyel. Figyelemre méltó javulást figyelhetünk meg 5 betegnél, akiknél a pszoriázist nem komplikálja hiperkeratózis; a hiperkeratózisos betegeknél az eredmények mérsékelten jók voltak. Két páciens testrészéről készült fényképek láthatók a 9a. és 9b. ábrákon. A 9a. ábrán hiperkeratózisos pszoriázisban szenvedő beteget mutatunk, akinek viszketéssel nem társuló eritémája egy hónap kezelés után jelentős mértékű csökkenést mutatott, azonban a hiperkeratózis jelentős maradt.

HU 222 088 Bl

A második beteg, akinek pszoriázisát hiperkeratózis nem komplikálta (9b. ábra) 3 hónapi kezelés után sokkal jelentősebb javulást mutatott. A pszoriázis sokfaktorú betegség, azonban feltételezhető, hogy a páciens reagálása attól is függ, hogy állapotának alakulásában és fenntartásában mekkora jelentősége van az eresedési és gyulladási faktornak. Extraktumunkban valóban jelen van antiangiogén hatású anyag, ahogy ez a DMBA-val kezelt patkányokon végzett vizsgálatokból és a CAMvizsgálatokból látható. A gyulladásgátló hatást is igazoljuk az alábbiakban. Valószínűleg jobb eredményeket kapnánk, ha a készítményt olyan terápiás anyagokkal egészítenénk ki, amelyek a betegséget befolyásoló más faktorokat céloznának meg (keratolitikus anyagok, gyulladásgátló anyagok, antihisztaminok, immunszuppresszorok stb.).

A készítményhez adható például keratolitikus anyag hatásos mennyisége is. A kiegészítő terápiás anyag beadható külön vagy a helyileg alkalmazott készítménnyel egyidejűleg, továbbá váltakozva. A kiegészítőkezelés nem feltétlenül történik hasonló terápiás úton.

A fenti készítmény semmilyen szisztémás hatást nem mutat (a hatás a kezelt részre korlátozódik), és a porcextraktum magas aránya ellenére semmilyen másodlagos hatást nem észlelünk.

Rák

Prosztatarákban szenvedő pácienst tízszeres koncentrációjú szűrlettel kezelünk. A betegnél 1986-ban adenokarcinómát diagnosztizáltak. Ebben az időben radioterápiát alkalmaztak nála. 1991-ben a beteg PSA (Prosztata Szérum Antigén)-szintje 138 pg/l volt, ezzel szemben a legmagasabb elfogadható normális határ 4 pg/l. Ezután a páciens teljesen eltérő terápián, nevezetesen antiandrogén terápiával kombinált kasztráción esett át (Euflex™). Ez a kezelés 3 évig volt hatásos, ezután a PSA-szint ismét emelkedni kezdett. 1994. júniusa óta a páciens napi tízszeres koncentrációjú szűrletet fogyaszt (szublingválisan, körülbelül 75 mg fehérje/7 ml extraktum mennyiségben, ez testtömegre vonatkoztatva körülbelül napi 1-1,5 mg/kg mennyiségnek felel meg). Ha a DMBA-val kezelt állatoknál kapott eredményekre támaszkodunk (lásd fent), akkor a beteg a dózis jelentős részét valószínűleg lenyeli, és a gasztrointesztinális traktusban abszorbeálódik. A PSA-szint 12ről fokozatosan 0,9 pg/ml-re csökken, például a normális PSA-szinten belül (az utolsó eredményeket 1995. májusában határoztuk meg). A beadott dózis módosítható a beadás útjának megfelelően, a hatóanyag biológiai hozzáférhetőségével összhangban és a terápiához szükséges erélyesség miatt. Egyidejűleg patkányokon (lásd a fenti mintát) és embereken (adat nincs megadva) igazoljuk, hogy az anyag nem toxikus.

DMBA-val kezelt patkányokon végrehajtott egyéb in vivő kísérletben a folyékony extraktum dózisaránya testtömegre vonatkoztatva körülbelül 190-220 mg/kg fehéqe, ez feltételezhetően nagymértékben hozzájárul a rákos területeken a véredények csökkenéséhez (55%, ha sokkal nagyobb fehéqetartalmú liofilizátummal kombináljuk). Ezért feltételezhető, hogy a rák kezelésében az eresedés legalább részben csökkenthető vagy megszüntethető testtömegre számítva körülbelül 0,1 mg/kg és 200 mg/kg közötti dózissal (ED₅o).

Artritisz

Artritiszben szenvedő önkéntes páciensek hónapokon át napi 7 ml teljes folyadékextraktumot vesznek be két egységre bontva. A páciensek állapota fokozatosan javul az ízületi funkció helyreáll, a fájdalom és a gyulladás csökken (körülbelül 60%-ig). Mivel az artritisznek angiogén és gyulladásos komponensei vannak, a fenti hatás a porcextraktum antiangiogén és gyulladásgátló hatásával hozható kapcsolatba.

Nem antiangiogén hatás

Akne

A szerzők ismeretei szerint az aknét nem sorolják a eresedéssel kapcsolatban álló betegségek vagy rendellenességek közé, ennek ellenére ilyen betegségben szenvedő betegek kezelését is megkíséreljük a folyékony porcextraktummal. Az aknéban szenvedő betegeket az vizsgálatát az alábbi összetételű gélformájú porcextraktummal kezeljük:

Carbopol™	1,2%
Tisztított víz	77,2%
NaOH 0,3%
Phenoxetol™	0,3%
Tween 80™	0,3%
2 χ porcextraktum	20,0%
40 χ aloéextraktum	0,5%.
A 9-12 mg/ml fehéqét	tartalmazó kétszeres porc-

extraktum figyelemreméltó javulást eredményez többékevésbé súlyos aknéban szenvedő páciensek állapotában (gyulladásos akne és kystikus akne; adat nincs).

A kapott kiváló eredmények vagy az eresedést gátló hatásnak tudhatok be (amely az akne esetében az eresedési komponens szerepére utal), vagy nem az eresedést gátló, hanem ettől eltérő hatású hatóanyagra utal (például gyulladásellenes hatás, lásd az alábbiakat).

Az eredmények azt mutatják, hogy a folyékony porcextraktum nagy lehetőségeket rejt az érképződéssel és/vagy gyulladással kapcsolatos megbetegedések kezelésében. A porcextraktum mennyisége és beadási útja a speciális szükségleteknek megfelelően változtatható.

Meg kell jegyeznünk, hogy a fehérjetartalmat tekintve, a bőrön helyileg alkalmazott, valamint az összes többi készítmény a porcextraktumot széles dózistartományban tartalmazhatja. Például a vizsgált esetek három speciális csoportjában ugyan különböző dózisok és/vagy készítmények alkalmazhatók. Bármelyik érképződéssel kapcsolatos megbetegedés kezelésében (szemcsepp, dermatológiai vagy rákellenes készítmények) a nyersszűrletben nagyon alacsony minimális fehéijekoncentrációt alkalmazhatunk (kevesebb, mint 0,1 mg/ml). A dózistartomány alsó határa függ a hozzáférhetőségtől, az aktív hatóanyag behatolásától a kezelni kívánt területre, a hatóanyag a felvételének hatékonyságától, a szövetek reagálásától, vagy attól, hogy mennyire érzékeny az eresedést gátló anyagokra. A proteinkoncentráció felső határa a különböző célokra alkalmazott készítményekben még nem ismert. Az általunk alkalmazott legmagasabb koncentráció a pszoriázisos eseteknél kö15

HU 222 088 Bl rülbelül 9 mg/ml fehéije, és a prosztatarákos esetben körülbelül 12 mg/ml a 7 ml beadott dózisegységben.

Ahogy ezt korábban említettük, a vizes oldatban történő liofilizáláskor a cápaporc-folyadékextraktum aktivitásának egy részét elveszítheti. Azonban, ahogy ez a szakirodalomból ismert, stabilizálóanyagok és védőanyagok hozzáadásával a liofilizálással megőrizhetők az érzékeny hatóanyagok, és ez lehetővé teszi nagyobb porcextraktumdózis beadását száraz állapotban.

Proteinkináz C (PKC) közvetítette folyamatok antagonizálása porcextraktummal

Az utóbbi időben ismertté vált, hogy normális keratinociták PKC-aktiválás hatására megnövekedett mennyiségű interleukin-8-at (IL-8) termelnek gyulladásközvetítőként [Chabot-Fletcher és munkatársai: J. Invest, Dermatol. 103: 509-515 (1994)]. Ezen túlmenően a pszoriázisos keratinociták nagyon nagy mennyiségű IL-8-at termelnek, amely a pszoriázisos lemezekben további neovaszkularizációhoz vezet [Nickoloff és munkatársai: Am. J. Pathol. 144 : 820-828 (1994)]. Mivel a porcextraktum nagyon ígéretesnek mutatkozik pszoriázis kezelésére, megvizsgáljuk hatását triphorbol-acetát (TPA) - ezen sejttranszdukciós út ismert antagonistája - által aktivált PKC-re keratinocitákban.

A 16. ábrán látható, hogy a keratinociták differenciálódása TPA hatására ötszörösére növekszik. A cápaporc önmaga nincs hatással az elszaiusodott-tasak-képződésre. Azonban a cápaporc-extraktum hozzáadásának hatására a TPA által indukált elszarusodott-tasak-képződés több mint 60%-kal gátolt. Elképzelhető, hogy a TPA-indukció a pszoriázisos keratinocitákat utánozza. Amennyiben erről van szó, akkor az eredmények arra utalnak, hogy a porc nem gyakorol in vivő hatást a normálkeratinocitákra, azonban hatást gyakorolhat a pszoriázisos (vagy aktivált) keratinocitákra. A porcextraktum IL-8-termelődésre gyakorolt gátlóhatásainak vizsgálata, a TPA által aktivált keratinocitákban, továbbá a pszoriázisos lemezkékben vagy keratinocitákban még hátra van. Az IL-8-szint csökkenésével igazolni lehetne az extraktum gyulladásgátló és antiangiogén hatását.

A cápaporc-extraktum gyulladásgátló hatása nincs kapcsolatban az antiangiogén hatással

Számos betegségnél a gyulladás következtében lép fel az angiogenezis, ezért a porcextraktumban a két hatást elkülönítve célszerű vizsgálni. Az extraktum gyulladásgátló és nyugtató hatását bőrirritációs modellen vizsgáljuk, ahol feltehetőleg nem lép fel angiogenezis. A vizsgálathoz 9 önkéntest választunk ki, akik bőre korábban Peru balzsamra érzékenynek bizonyult. A következő tesztanyagokat alkalmazzuk:

1.1- szeres cápaporc 50% D-MEM közegben

2.1- szeres cápaporc 20% D-MEM közegben

3.1- szeres cápaporc 10% D-MEM közegben

4. Cola nitida (Indena) 10% 1:1 vizes alkohololdatban.

A 4 tesztvegyületet a csoporttagok ventrális alkarján alkalmazzuk. Az anyagokat 20 percig hagyjuk abszorbeálódni, majd a vizsgálati helyen irritánsként Peru balzsamot alkalmazunk. A bőrirritációt a bőr vörösödésének növekedésével határozzuk meg. A vörösödés mértékét Minolta kromaméterrel mérjük, és összehasonlítjuk a pozitív és negatív kontrollal. Pozitív kontrollnak a kizárólag Peru balzsammal kezelt bőr színét és negatív kontrollnak a Cola-oldattal kezelt bőr színét tekintjük, melyet tesztanyaggal hasonló módon alkalmazunk. A statisztikai szignifikanciát kétvégú valószínűségi T-teszttel számítjuk ki. A 17. ábrán látható, hogy a 10%-os Cola-oldat 70%-os aktivitást mutat. A cápaporc 20%, illetve 10% koncentrációban alkalmazunk 58%-os és 60%-os antiirritáns hatást mutat. Dózisválasz hatást nem észlelünk. Az eredmények azt mutatják, hogy a porcextraktum gyulladásgátló és gyulladáscsillapító hatású, és ezek a hatások az antiangiogén hatástól elkülönülve jelentkeznek.

Antikollagenolitikus hatás

HPLC-kromatográfia

980 ml DUP folyadékextraktum-mintát átszűrünk egy tangenciális áramlású ultraszúrőegységen (PELLICON™ Millipore), 10 kDa-nál elválasztó résméretű membránon. Az egységet először 1 liter vízzel öblítjük. Végül 480 ml 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegú frakciót és 1,8 110 kDa-nál kisebb molekulatömegú frakciót nyerünk ki. A 10 kDa-nál kisebb frakciót „cold-finger” bepárlással 180 ml-re koncentráljuk (<10-10x). A <10-10 χ oldatból 100 pl aliquot mennyiségeket 8szor felvisszük CDC-S Hexyl, 5 pm HPLC-oszlopra (25x0,94 cm), és először 100%-os vízzel eluáljuk, 4 ml/perc áramlási sebességgel majd 100%-os metanollal eluáljuk 8,5 ml/perc áramlási sebességgel. A frakciókat az OD₂i4-nél mért csúcsok alapján gyűjtjük össze. Öt frakciót nyerünk (18. ábra): Frl, Fr2, Fr3, Fr4 és Fr5. Az első három frakció legalább egy fő csúcsot tartalmaz.

Kollagenázvizsgálat

A fenti módon kapott mintákon kollagenázvizsgálatot végzünk, melyhez 1 típusú (MMP1) humán bőrkollagenáz-rekombinánst használunk. A vizsgálatot fluorogén peptidszubsztrátummal (1. vizsgálat) és kollagénszubsztrátummal (2. vizsgálat) végezzük.

1. vizsgálat

A vizsgálatot Knight és munkatársai ismertették [FEBS Let. 296, 263-266 (1992)]. Az eljárásban fluorogén peptidszubsztrátumot (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpaala-arg-NH₂) alkalmazunk a fémproteinázok aktív helyének utánzására. A szubsztrátum egyik végén fluoreszcens csoport (Mca) van és a másik végén egy fluoreszcenciakioltó csoport van (Dpa). Az ép szubsztrátumban a kioltócsoport lefedi a fluoreszcenciát. A szubsztrátum enzimes hatásának következtében a kémcsőben növekszik a fluoreszcencia.

A kollagenáz aktivitásának meghatározását a Weingarten és munkatársai által ismertetett módon végezzük [Biochemistry 24, 6730 (1985)]. 1 pg-ot 100 pl-re hígítjuk 50 mmol-os trisz-HCL-lel és 10 mmol 7,5 pH-jú kalcium-kloriddal, 1 pl 10 mg/ml-es tripszinoldatot (1 mmol-os sósavban) adunk hozzá, és 15 percig 20 °C-on inkubáljuk. Az aktiválást 10 pl szójababtripszin-inhibitorral indítjuk be (SBTI, 5 mg/ml). Mindegyik mikroküvettába a következőket mérjük be:

vagy 50 pl inhibitort (50 pl-re feltöltve vízzel);

HU 222 088 Β1 μΐ 50 mmol-os trisz-HCl, 200 mmol nátrium-klorid, 10 mmol kalcium-klorid, pH 7,5;

μΐ aktivált kollagenáz (67 ng végső); és μΐ szubsztrátum (20 pmol teljes térfogatú 1 mmolos dimetil-szulfoxidos törzsoldat).

A fluoreszcenciát λ_βχ=328 nm, X_em=393 nm-en mérjük.

Az eredményekből látható, hogy az Frl frakció kollagenázgátló hatása a legerősebb (19. ábra). A többi frakció kisebb hatást mutat. Ebihalgerinc-koUagenázon végezve a vizsgálatot az enzimet szignifikánsan gátolja a cápaporc-extraktum (EC50 körülbelül 10-20 pg/ml-nél).

2. vizsgálat

A vizsgálatot Welgus és munkatársai által ismertetett módon végezzük [JBC 256, 9511-9516 (1979)]. Az eljárásban SDS-PAGE-t használunk az 1. típusú (MMP1) kollagenázzal történő hasítás vizsgálatára. Az

1. típusú kollagenáz a természetes kollagénmolekulát egyszer hasítja az eredeti kollagén méretére nézve egy 75%-os és egy 25%-os fragmensre bontva. Többórás hasítás után a reakció befejeződését úgy ellenőrizzük, hogy a terméket SDS-PAGE-vei választjuk el. A hasított és nem hasított kollagén aránya vizuálisan ellenőrizhető a gél Comassie kékkel (ezüstfesték) történő megfestésével.

ng aktivált kollagenázt (lásd 1. vizsgálat) adunk 5 pg boqúbőrkollagén- (Worthington) +/- inhibitorhoz és 20 μΐ teljes térfogatra töltjük fel. 16 órán át 35 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót SDS-PAGEminta és 40 mmol EDTA hozzáadásával állítjuk le, felforraljuk, majd 8%-os gélre visszük.

Az eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Minta	Kollagénfestés	Kollagén- fragmens-festés
Csak kollagén (C)	+ + + +	-
\| C+Enz	+	+ + +
C+Enz+EDTA	+ + + +	-
C+Enz+DUP	+	+ +
C+Enz+Frl	+ + + +	-
C+Enz+Fr2	+ + +	+
C+Enz+Fr3	+ + +	+
C+Enz+Fr4	+ + +	+
C+Enz+Fr5	+ + +	+
C+Enz+>10kDa	+	+ + +

A 40 mmol EDTA gátolja a kollagenázt. A DUP teljes folyadékextraktum kis antikollagenolitikus hatást mutat. Az 1-5. frakciók aktivitást mutatnak; az 1. frakció aktivitása a legnagyobb. A 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakció nem mutat jelentős inhibitoraktivitást.

Kozmetikai alkalmazás és ilyen célokra alkalmas készítmények

A fenti vizsgálatokból látható, hogy a találmány szerinti porcextraktum széleskörűen alkalmazható gyógyászati célokra. Az extraktum számos ismert hatása közül az antikollagenolitikus, a gyulladásellenes és a PKCindukált a differenciálódást gátló hatások különösen alkalmassá teszik kozmetikai célokra, mivel a találmány szerinti porcextraktum a PKC közvetítette sejtfolyamatokra nézve antagonista hatást mutatnak, és a szakirodalomból ismert, hogy a fenti antagonista hatások javítják a bőr védőfunkcióját, ezért találmányunk tárgyát képezik az emlősök bőrvédő funkcióját javító eljárások, melyekben a bőrön porcextraktumot és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítményeket alkalmazunk, a találmány tárgyát képezik továbbá ezek a készítmények is. Összeállíthatók az emlősök bőrének nyugtatására és gyulladásának csökkentésére alkalmas egyéb hasonló készítmények is. A gyulladást számos tényező okozhatja, például irritáló hatású vegyületek, fizikai behatás vagy ultraibolya-sugárzás. A bőrben a kollagenáz gátlására szolgáló készítmények és eljárások is megfontolandóak. A kollagenáz és a gyulladások korai öregedést (kollagéndegradációt) okoznak. A porcextraktumból kinyert antagonista hatású anyagok jól alkalmazhatók korai öregedést gátló és az emberi bőr ráncosodását és sorvadását gátló készítményekben és eljárásokban. A bőr ráncosodása és sorvadása egyrészt életkori jelenség, de okozhatja az ultraibolya-sugárzás vagy bizonyos környezeti ártalmak. A helyileg alkalmazott készítmények az adott alkalmazáshoz szükséges mennyiségű cápaporcot tartalmazhatnak. Ezek a készítmények általában körülbelül 0,1 tömeg% és körülbelül 75 tömeg% közötti mennyiségű egyszeres és húszszoros közötti töménységű porcfolyadék-extraktumot és körülbelül 50 tömeg% és 99,9 tömeg% közötti mennyiségű gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazhatnak. A készítmények tartalmazhatnak ezenkívül antioxidánst, amely megelőzi a bőrön lipid-peroxidok képződését. Az antioxidáns lehet például tokoferol, tokoferolszármazék, aszkorbinsav, aszkorbinsavszármazék vagy BHT. A készítmények kiegészíthetek gyulladásgátló hatású anyagokkal, például foszfolipáz A2 inhibitorral vagy növényi eredetű antiirritáns hatású Cola- vagy zöldtea-extraktummal. A helyileg alkalmazható készítmények különböző formájúak lehetnek, mint például oldat, szuszpenzió, lotion, tinktúra, gél, krém, spray, emulzió, szonda, kenőcs vagy liposzóma (a folyadék porcextraktum legalább egy része liposzómában van).

Értékelés

A találmány szerinti eljárással nagy gyógyászati értékű porcextraktumok állíthatók elő. A találmány szerinti új eljárással előállított cápaporc-extraktumok többféle hatást mutatnak és jó kitermeléssel nyerhetők ki. A porcextraktumok, különösen a folyadékextraktum és ennek frakciói igen nagy jelentőségűek, mivel a normális sejtekre nézve nem toxikusak, és igen hatásosnak bizonyultak egy sor betegség és tünet kezelésében.

Szükséges anyagok

- hűtők

- sebészeti berendezések

- húsdaráló

- műanyag zacskók

HU 222 088 Β1

- ipari keverő (Fischer Scientifictől vásárolt, Waring 3 fokozatú keverő)

- víztisztító rendszer (inverz ozmózis és 0,1 pm-es szűrés; 91089 szériaszámú Continental Water System, PRE 2202 model, Modulab Bioscience RQ/ Polishing System, Fischer scientific, Montreal Quebec). Ez a rendszer magas minőségű apirogén vizet biztosít.

- Mettler precíziós mérleg, AE sorozat, Fischer Scientific

- RC-285 Sorvall centrifuga, DuPont (Kanada)

- CEPA centrifuga

- 30 pmol porozitású nejlonzsák

- autokláv (Sanyo automatikus párasterilizáló, MAC 350P model)

- 500 ml-es Nalgene tartály 132 °C-on 10 percig sterilizálva és 35 percig szárítva

- 24 pm porizitású Whatman Reeve Angel kónikus szűrő

- ultraszűrőoszlop (molekulatömeg-határ 500 kDa (és 1 kDa, ha alkalmazható); felület 25 négyzetláb; áramlás 1301/perc; bemeneti nyomás 30 psi; kimeneti nyomás 5 psi; Koch Membráné System, Wilmington, MA, USA)

- egészségügyi centrifugaszivattyú (Monarch Industries ACE-S100 model, A típus) 130 1/perc áramlás biztosítására

- steril fülke (NuAire lamináris áramlású fülke, Ingram & Bell)

- Millipack-60 0,22 pm steril szűrő

- steril, átlátszó vagy borostyánüveg palackok

- DC-10 Amicon koncentrátor

- Rotofor Biorad 170-2950

- Amicon szűrők SIOY10, SIOY30 és SIOY100 10, 30 és 100 kDa határértékkel

- FPLC Pharmacia 216007 (Pharmacia 216014 számítógép)

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Labconco 10273 A liofilizátor.

Találmányunkat a fentiekben ismertettük, és le kívánjuk szögezni, hogy a találmány célján nem változtatnak a szakember számára nyilvánvaló módosítások, vagy a találmány egyes elemeinek olyan módon való helyettesítése, ami a szakember ismereteihez és tudásához tartozik, továbbá az ekvivalensek alkalmazása. Ezek a nyilvánvaló változatok szintén az oltalmi körhöz tartoznak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Cápaporc-extraktum alkalmazása kollagenolíziskomponenst vagy gyulladáskomponenst magában foglaló betegség vagy rendellenesség kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal a megkötéssel, hogy a betegség vagy rendellenesség ráktól, pszoriázistól, aknétól és artritisztől eltérő, amely porcextraktum teljes cápaporc vizes homogenizátumának centrifugálásával előállított felülúszó 500 kDa névleges molekulatömeg-határértékű szűrőn végzett frakcionálásával van előállítva, és az extraktum molekuláinak molekulatömege 500 kDa-nál kisebb, továbbá az extraktum antikollagenolitikus és gyulladásgátló hatású.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az extraktum 1 kDa molekulatömeg-határértékű szűrőn van koncentrálva, amely koncentrált extraktum molekulái 1 kDa és 500 kDa közötti molekulatömegűek.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás helyi kezelésre alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás egy antioxidánst is tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.
5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, antioxidánsként tokoferolt, tokoferolszármazékokat, aszkorbinsavat, aszkorbinsavszármazékokat vagy BHT-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.
6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás egy gyulladásgátló szert is tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.
7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás gyulladásgátló szerként botanikai eredetű antiirritánst tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.
8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás gyulladásgátló szerként Colát vagy zöldtea-extraktumot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.
9. A 6. igénypont szerinti alkalmazás gyulladásgátló szerként egy foszfolipáz A2 inhibitort tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.
10. A 3-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás oldat, szuszpenzió, lotion, tinktúra, gél, krém, spray, emulzió, stift vagy kenőcs formájú gyógyszerkészítmény előállítására.
11. A 3-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az extraktum liposzómákban van jelen.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás betegségként vagy rendellenességként bőrgyulladás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás fizikai eredetű horzsolás által okozott bőrgyulladás kezelésre alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
14. A 12. igénypont szerinti alkalmazás kémiai irritáns által okozott bőrgyulladás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
15. A 12. igénypont szerinti alkalmazás ultraibolyasugárzás által okozott bőrgyulladás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.