FI117376B

FI117376B - Hainrustouutteiden käyttö valmistettaessa lääkettä kollagenolyysi- tai tulehdustekijän sisältävän sairauden hoitamiseksi

Info

Publication number: FI117376B
Application number: FI973195A
Authority: FI
Inventors: Eric Dupont; Paul Brazeau; Christina Juneau; Daniel H Meas; Kenneth Marenus
Original assignee: Aeterna Zentaris Inc
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2006-09-29
Also published as: HU222088B1; BG101870A; EP0806960A1; KR100347880B1; RO117590B1; CA2212010A1; CZ292627B6; JP2006290904A; AU3738895A; DE69529300T2; CZ245297A3; EP0806960B1; CN1177927A; DK0806960T3; FI973195A0; IS1963B; IS4537A; WO1996023512A1; PL188137B1; RU2157695C2

Description

117376

Hainrustouutteiden käyttö valmistettaessa lääkettä kollagenolyysi- tai tuleh-dustekijän sisältävän sairauden hoitamiseksi - Andvändning av hajbroskex-trakter vid framställningen av medicin för att behandla en sjukdom som innefattar en kollagenolys- eller en inflammationsfaktor 5

Keksinnön ala Tämä keksintö kohdistuu hain rustouutteen käyttöön valmistettaessa lääkettä kollagenolyysi- tai tulehdustekijän sisältävän sairauden tai -häiriön hoitamiseksi, sillä edellytyksellä, että mainittu sairaus tai häiriö ei ole syöpä, psoriasis, akne tai 10 niveltulehdus. Keksinnön mukainen rustouute on supematantin fraktio, joka on saatu sentrifugoimalla hainruston täysvesihomogenaatti, ja sillä on anti-kollageno-lyyttistä ja anti-inflammatorista aktiivisuutta.

Keksinnön tausta

Rusto on verisuonittumatonta kudosta ja sitä on tutkittu mahdollisena ehdokkaana, 15 joka voisi sisältää verisuonten uudismuodostusta estäviä tekijöitä. Se on myös kudosta, joka on suhteellisen vastustuskykyinen kasvainten muodostumisen suhteen. Rustoon liittyvä kasvain, kondrosarkooma, on vähiten verisuonittunut kiinteistä kasvaimista. Angiogeneesi on eräs tärkeä tekijä kasvaimen kehittymisessä. Erillisiä : kiinteitä kasvainmassoja ilmaantuu, mikäli kasvainsolut pystyvät aiheuttamaan sen t·· : 20 vieressä olevan verisuoniston laajenemisen täyttämään niiden ravintotarpeita. Sen vuoksi onkin tutkittu verisuonten muodostumista stimuloivien tekijöiden osuutta kasvaimen kehittymisessä ja antiangiogeenisiä tekijöitä sekä lääkkeitä, joilla olisi j‘\. verisuonten muodostumista estävä aktiivisuus, on myös tutkittu välineinä, joilla *': \ voitaisiin säädellä kasvainten kasvua tai saada niitä häviämään.

• * · 25 On keksitty, että vasikoiden lapaluurusto sisältää ainetta, joka estää kiinteiden kas-*·:.* vainten verisuonittumista (Langer et ai., 1976). Koska rustolla on lupaava potenti- aali toimia kasvaintenvastaisena aineena, on etsitty lähteitä, joista sitä saataisiin . suurempia määriä.

t*· ··· *·;·" Hait ovat eläimiä, jotka voisivat olla tällaisen angiogeneesinestäjän mahdollinen :*·*: 30 lähde, koska niiden sisäranka muodostuu kokonaan rustosta (6 % niiden ruumiinpai- ·;··· nosta, kun taas vasikoilla vain 0,6 %). Hailia on myös mielenkiintoisena piirteenä vähäinen taipumus kasvainten kehittymiseen. Tämän häiden vähäisen taipumuksen saada kasvaimia selittämiseksi on kehitelty monia hypoteeseja. Marchalonis et ai.

117376 2 (1990) ovat osoittaneet IgM-vasta-aineita, jotka pystyvät käymään minkä tahansa hyökkäävän aineen kimppuun. McKinney et ai. (1990) ovat osoittaneet, että hailia on makrofageja, jotka pystyvät erottamaan normaaleja soluja neoplastisoluista ja tuhoamaan viimeksi mainittuja. Rosen ja Woodhead (1980) ovat esittäneet, että 5 kasvainten harvinaisuus leveäsuisissa (ryhmä, johon kuuluvat hait ja varsinaiset rauskut) saattaisi johtua niiden kudosten suuresta ionivahvuudesta, joka vastaa korkeata ruumiinlämpötilaa. Nämä kirjoittajat uskovat, että sellaisissa olosuhteissa immuunijärjestelmä kykenee lähes 100-prosenttiseen immunologiseen valvontaan.

Moore et ai (1993) ovat keksineet, että hait tuottavat erästä aminosterolia, jolla on 10 bakteereja ja alkueläimiä tuhoavia ominaisuuksia. Lopuksi vielä Lee ja Langer (1983) ja Folkman ja Klagsbrun (1987) ovat osoittaneet, että hait tuottavat ainetta, joka estää verisuonten uudismuodostusta. Lee ja Langer (op. cit.) ovat eristäneet tämän aineen uuttamalla sitä hain rustosta denaturoivissa olosuhteissa (guanidiini- uutto). Tämä uuttoprosessi on kuitenkin erittäin pitkä (41 vuorokautta) ja se saattaa 15 tuottaa uutteita, joissa tekijät ovat denaturoituneet ja aktiivisten komponenttien saanto on kaukana erinomaisesta. Kun vasikoista eristetyn aktiivisen aineen mole- kyylipaino on noin 16 kilodaltonia (kD), mainittu tutkijaryhmä ei ole ilmoittanut haista löydetyn aineen täsmällistä molekyylipainoa. Tämän aineen molekyylipai- nosta sanotaan vain, että se on suurempi kuin 3500 daltonia. Oikawa et ai. (1990) 20 ovat käyttäneet samaa uuttomenetelmää, jonka Lee ja Langer ovat kuvanneet, mutta paljon lyhyempikestoisena (2 vuorokautta 41 vuorokauden sijasta). Verisuonten ! uudismuodostumista ehkäisevä aine, jonka Oikawa et ai. ovat eristäneet hain rus- ··· · tosta, rajoittuu molekyyliin, jonka molekyylipaino on alueelta 1 000 - 10 000 dalto- • nia. Schinitsky (US-patentti 4 473 551) on kuvannut raa'asta jauhetusta hain rustosta :v. 25 saadun vesiuutteen, jolla fraktiolla, jonka molekyylipaino on yli 100 000 daltonia, on anti-inflammatorinen vaikutus yksinään tai yhdessä glukosamiinin kanssa. Tässä patentissa ei esitetä, että millään tämän uutteen komponentilla olisi verisuonten muodostusta estävää tai kasvaimia ehkäisevää aktiivisuutta. Kuetner et ai. (US- patentti 4 746 729) ovat eristäneet erään polymorfonukleaarisen neutrofiilisen 30 (PMN) elastaasinestäjän naudan rustosta. Tämä estäjä on saatu ruston vesiuutteesta, josta on eristetty molekyylejä, joiden molekyylipaino on alle 50 000 daltonia. Frak- . tionointi Sephacryl S-200:lla on tuottanut lukemattomia fraktioita, joista 10-40 kD:n ,*··, fraktiot on koottu yhteen, kun niillä on osoitettu olevan anti-elastaasiaktiivisuutta.

* #

Aktiivisen komponentin isoelektrisyyspiste on 9,5 ja sen molekyylipaino saattaisi : 35 olla noin 15 000 daltonia. Kuetner et ai. (US-patentti 4 042 457) ovat myös osoittaneet, että naudan rusto sisältää komponentin, jonka molekyylipaino on alle 50 000 daltonia ja jolla on solujen proliferaatiota ehkäisevä vaikutus, mutta ei vaikutusta endoteelisolun kasvuun. Balassa et ai. (US-patentti 4 822 607) ovat vai- 117376 3 niistäneet vesipitoisessa liuoksessa rustouutteen, jolla on kasvaintenvastaista aktiivisuutta. Emme ole kuitenkaan todenneet minkäänlaista verisuonten muodostumista estävää vaikutusta uutteessa, jonka saimme toistamalla Balassan menetelmän. Spil-burg et ai, (US-patentti 4 243 582) ovat eristäneet naudan rustosta (guanidiiniuutto) 5 kaksi glykoproteiinia, joiden molekyylipaino on 65 kD ja isoelektrisyyspiste (pl) 3,8 ja jolla on trypsiininvastaista aktiivisuutta ja endoteelisolun kasvua estävää aktiivisuutta.

Vasikan ja hain rustot sisältävät monia biologisia aktiivisuuksia, kuten esimerkiksi tulehdusta edistävää aktiivisuutta, tulehdusta estävää aktiivisuutta, verisuonten uu-10 dismuodostusta ehkäisevää aktiivisuutta, lysotsyymiaktiivisuutta, solun kasvua edistävää aktiivisuutta, estävää aktiivisuutta tyypin I ja IV kollagenaasia, elastaasia ja muita proteaaseja, kuten trypsiiniä, kymotrypsiiniä ja plasmiinia, kohtaan. Kukaan ei ole kuitenkaan vielä saanut aikaan rustouutetta, joka sisältää kliinisesti arvokkaiden aktiivisuuksien poolin.

15 Hain ruston antiangiogeenistä komponenttia (komponentteja) on yleensä testattu kaniinin sarveiskalvopussikokeella tai kanan alkion korioallantoiskalvokokeessa (CAM). Tähän asti koko jauhettua rustoa on testattu suoraan kasvaimiin in vivo, ihmisen melanooman ksenograftiin, joka on istutettu immuunikyvyttömiin hiiriin (US-patentti 5 075 112), ja CAM-kokeissa on testattu myös sen antiangiogeenistä vaiku-20 tus ta. Vaikka rustouutteilla on osoitettu olevan kasvaintenvastaista vaikutusta, tämä : vaikutus on useimmiten katsottu antiangiogeenisen komponentin ansioksi, joka V · estää kasvaimelta veren saannin. Tähän asti ei ole osoitettu, että hain rustolla on ·:·*: suora vaikutus kasvainsolun proliferaatioon.

·· · • ♦ t * * j.’ Joitakin menetelmiä hainrustouutteiden ja -fraktioiden valmistamiseksi tunnetaan jo.

25 Eräät niistä tuottavat jauhetun raakaruston ilman uuttoa (US-patentti 5 075 112).

• * *

Toisissa käytetään denaturoivia aineita, kuten guanidiinia (US-patentti 4 243 582). Toisissa suoritetaan ruston esikäsittely entsymaattisella digestiolla rustoa ympäröisi.: vien mahdollisten lihas-, hermo- tai verisuonirakenteiden poistamiseksi, ja tämän • * * esikäsittelyvaiheen jälkeen poistetaan rasvat orgaanisissa liuotteissa ja sitten aktiivi-. |\ 30 set aineosat uutetaan vesifaasissa. (Balassa et ai, US-patentit 3 478 146, 4 350 682, 4 656 137 ja 4 822 607). Sellaisen esikäsittelyn vaikutusta biologisesti aktiivisten • · *V rustokomponenttien integriteetin säilymiseen ei tunneta. Jos entsyymidigestio vie- · · : dään liian pitkälle, se saattaa hydrolysoida aktiiviset proteiinikomponentit. Balassan menetelmässä ei ole fraktiointivaihetta, joka rikastaisi uutteen aktiivisia komponent-35 teja. Toisissa menetelmissä taas yksinkertaisesti tuotetaan vesiuutteita [ruston vesi-liuoksessa (US-4 473 551) tai suolaliuoksessa (US-4 746 729) eliminoimalla liuke- 117376 4 nematon materiaali]. Viimeksi mainituista tietyn molekyylipainon omaavia erityis-fraktioita on erityisesti otettu talteen lisätutkimuksia ja puhdistusta varten (katso edellä).

Edellä mainittuihin menetelmiin liittyy useita haittoja. Ne saattavat denaturoida joi-5 takin arvokkaita komponentteja. Jos niin ei tapahdukaan, niiden haittana on liiallinen kesto, jotta ne toimisivat käytännössä. Pitkäkestoiset menetelmät eivät lisäksi välttämättä tuota riittäviä määriä aktiivisia komponentteja ja talteenotetuista komponenteista joitakin ei saada talteen ollenkaan tai riittämättöminä saantoina, jotta niillä olisi osoitettavaa aktiivisuutta, tai sitten joitakin on heitetty pois keskittymällä 10 spesifisten aktiivisuuksien saamiseen.

Angiogeneesi ei ole mukana ainoastaan syövän kehittymisessä. Monet sairaudet tai tilat, jotka vaikuttavat eri fysiologisiin systeemeihin (mainittu sulkeissa), ovat angio-geneesistä riippuvaisia, joista seuraavat esimerkit: artriitti ja ateroskleroottiset plakit (luut ja nivelsiteet), diabetekseen liittyvä retinopatia, neovaskulaarinen glaukooma, 15 trakooma ja sarveiskalvosiirrännäisen verisuonien uudismuodostus (silmä), psoriasis, skleroderma, hemangiooma ja hypertrofinen arpeutuma (iho), verisuonien adheesio ja angiofibrooma (verenkierto). Niinpä uudella ja voimakkaalla antiangio-geenisellä "tekijällä" voisi olla käyttöä näiden tautien hoidossa samoin kuin syövän hoidossa. Lisäksi koska moniin edellä mainittuihin tauteihin ja tiloihin liittyy tuleh-20 duskomponentti, uudella ja tehokkaalla anti-inflammatorisella "tekijällä" voisi olla * käyttöä näiden tautien ja tilojen hoidossa samoin kuin minkä tahansa muun tuleh- :T: dussairauden tai -tilan hoidossa. Lisäksi koska proteaasit, kuten kollagenaasit, ovat *:··: mukana erilaisissa taudeissa ja tiloissa, kuten syövässä ja ennenaikaisessa vanhen- tuulisessa sen kollageenia tuhoavan vaikutuksen vuoksi, uudella ja tehokkaalla 25 antikollagenolyyttisellä "tekijällä" voisi olla käyttöä tautien ja tilojen, joihin liittyy !·:·. kollagenolyyttinen komponentti, hoidossa. Koska angiogeneesiin, tulehdukseen ja • * proteaaseihin, kuten kollagenaaseihin, törmätään joko yksinään tai yhdessä kovin monenlaisissa taudeissa tai tiloissa, tuote, joka pystyisi estämään ainakin kaikkia • · » mainittuja aktiivisuuksia vaikuttamatta kehon normaaleihin toimintoihin, olisi terä- * * * · - -' 30 peuttisesti erittäin arvokas.

* · t 111' Keksinnön määrittely ♦ ··

Esillä oleva keksintö koskee rustouutteiden, joiden etuna on se, että ne sisältävät monia terapeuttisesti arvokkaita vaikutuksia, käyttöä kollagenolyysi- tai tulehduste- * · kijän sisältävän sairauden tai häiriön hoitamiseksi tarkoitetun lääkkeen valmistami-35 seksi, sillä edellytyksellä että mainittu sairaus tai häiriö ei ole syöpä, psoriasis, akne 117376 5 tai niveltulehdus. Niistä antiangiogeeninen, anti-inflammatorinen, antikollagenolyyt-tinen, in vivo kasvaimen proliferaatiota estävä ja suora in vitro kasvaimen proli-feraatiota estävä aktiivisuus on vahvistettu sisältyvän tyydyttävinä pitoisuuksina hainrustouutteisiin. Muut aktiivisuudet odottavat vielä tunnistamistaan tai vahvista-5 mistään. Kasvainsolulinjoissa mitattu vaikutus osoitti, että kasvaimen proliferaatiota suoraan estävän aktiivisuuden ohella niissä ilmeni olevan sytotoksista aktiivisuutta. Näitä vaikutuksia saatiin esiin hain ruston nestemäisissä uutteissa ja joitan niistä saatiin esiin tai todennettiin sen kiinteässä ekstraktissa.

Käyttöön liittyen on tutkittu uutta menetelmää nestemäisen rustouutteen, jossa on 10 olennainen osa koskemattomassa rustossa läsnä olevista biologisesti aktiivisista vesiliukoisista komponenteista, aikaansaamiseksi ja menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) rusto homogenoidaan vesiliuoksessa olosuhteissa, jotka sopivat mainittujen biologisesti aktiivisten komponenttien integriteetin säilyttämiseen, kunnes rusto on 15 pienentynyt partikkeleiksi, joiden koko on pienempi tai yhtä kuin noin 500 /xm, jolloin saadaan partikkeleiden ja nestemäisen raakauutteen seos, joka sisältää mainittuja biologisesti aktiivisia komponentteja; b) mainittua homogenaattia sentrifugoidaan partikkeleiden erottamiseksi nestemäisestä raakauutteesta; ja • · « 4 f 20 c) nestemäinen raakauute erotetaan edelleen, jolloin saadaan lopullinen nestemäi- * * * *·“ | nen uute, joka sisältää rustomolekyylejä, joiden molekyylipaino on pienempi tai yhtä kuin noin 500 kilodaltonia.

• i · * · · • m Tämän uuden menetelmän etuna on, että se on helppo toteuttaa ja se on tehokas. Sillä on saatu suuria saantoja rustouutteesta, joka, erityisesti hain rustosta valmistet- • * · 25 tuna, sisältää vähintään kaikki edellä mainitut biologiset aktiivisuudet. Se toteute- . taan edullisesti kylmässä lämpötilassa (noin 0-10 °C:ssa), ei-denaturoivissa olo- • · · *l\l suhteissa (edullisesti puhtaassa vedessä) lähes neutraalissa pH:ssa (noin 6-8) sen *···* mahdollisuuden maksimoimiseksi, että saadaan talteen yhdisteitä, joilla on tunte- : mattomia fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia. Tämän menetelmän mukaan rusto- ····· 30 komponentit voidaan uuttaa vähäisessä liuostilavuudessa (niinkin pienessä kuin 1 # * · litra 1 rustokilogrammaa kohti) ja lyhyen homogenisointijakson (niinkin lyhyen kuin • · · : 10-15 minuuttia) jälkeen. Kiinteän ekstraktin saamiseksi käytetään samaa menetel- * : mää, paitsi että pelletti otetaan talteen ja lyoftlisoidaan ja supematantti heitetään pois.

117376 6 Tämä keksinnön mukainen käyttö lääkkeen valmistamiseksi koskee rustouutteita, erityisesti uutteita, jotka ovat peräisin jostakin leveäsuisten lajista, tarkemmin sanottuna haista. Kiinteä uute on osoittautunut aktiiviseksi. Se saattaa sisältää kollageenia ja ei-vesiliukoisia komponentteja. Sillä saattaa myös olla jäännös-5 aktiivisuutta, joka on peräisin nestemäisen kokonaisuutteen uutosta. Nestemäinen kokonaisuute on erittäin aktiivista. Sitä voidaan käyttää sellaisenaan tai se voidaan konsentroida. Ensisijainen on sellainen konsentrointivaihe, joka edistää biologisten vaikutusten säilymistä. Menetelmien, jotka saattaisivat heikentää aktiivisia komponentteja, käyttöä on varovaisuuden vuoksi vältetty. Tämän keksinnön mukaisen nes-10 temäisen uutteen väkevöimiseen käytettiin ultrasuodatusta kalvolla, jonka molekyy-lipainon cut-off-arvo on noin 1 kD. Tämän tuloksena saatiin konsentroitu uute, joka sisältää molekyylejä, joiden molekyylipaino on noin 1 - noin 500 kD, ja se testattiin. Nestemäinen kokonaisuute (0-500 kD) fraktioitiin edelleen sen aktiivisten komponenttien karakterisoimiseksi. Eri menetelmillä saatiin monia fraktioita. Eräät niistä, 15 joita kokeiltiin kasvainsolulinjoihin, karakterisoitiin karkeasti niiden molekyy-lipainolla ja isoelektrisellä pisteellä. Toisille osoitettiin jokin aktiivisuus, erityisesti antikollagenolyyttinen tai antiangiogeeninen aktiivisuus. Nämä fraktiot odottavat vielä täydellistä karakterisointiaan ja identifiointiaan. Kokonaisnesteuutteessa ja sen fraktioissa saadaan siis talteen arvokkaita aktiivisuuksia, joita voidaan käyttää 20 edullisesti. Sen sijaan, että potilaalle annettaisiin suuria määriä jauhettua rustoa, nyt voidaan antaa paremmin hyväksyttävää ja rikastettua uutetta.

* · :;j.: Esillä oleva keksintö koskee siis käyttöä valmistettaessa terapeuttista lääkettä, joka • · · v ' sisältää tehoaineena jotakin edellä esitellyistä rustouutteista. Eniten mielenkiintoa * “ ovat herättäneet paikallisesti käytettävät koostumukset, jotka ovat tarkoitetut käy- * * · : 25 tettäviksi dermatologiassa ja kosmetiikassa. Tämä mielenkiinto johtuu rustouuttei- ·· • *·· den todetuista aktiivisuuksista. Tässä suhteessa todettujen antikollagenolyyttisten ja :T: tulehduksen vastaisten vaikutusten ja solun differentioitumisen suhteen antago nistisen vaikutuksen, jonka aiheuttaa proteiinikinaasi-C:n indusointi kerasinosyy- : teissä, on katsottu avaavan mahdollisuuden käyttää hainrustouutteita koostu- * * · ,···. 30 muksissa ja menetelmissä tulehduksen vähentämiseksi, ryppyjen ja ihon atrofian ’ säätelemiseksi, ennenaikaisen vanhenemisen hidastamiseksi, aknen hillitsemiseksi, ihoesteen toiminnan parantamiseksi, tulehduksen ja ärsytyksen lieventämiseksi ja ihon rauhoittamiseksi. Sellaiset käytöt sisältyvät tähän keksintöön. Lisäksi koska * nestemäistä hainrustouutetta on kokeiltu menestyksekkäästi syöpä-, artriitti-, psoria- • + 35 sis- ja aknetapauksissa, koostumukset ja menetelmät sellaisten tautien tai tilojen hoitamiseksi, joihin liittyy yksi tai useampi komponenteista, jotka on valittu ryhmäs- 117376 7 tä, jonka muodostavat tuumorin proliferaatio, angiogeneesi, tulehdus ja kollageno-lyysi, sisältyvät keksinnön alaan.

Esillä olevan keksinnön kuvaus

Esillä oleva keksintö selviää paremmin seuraavista erityistoteutusmuodoista, jotka 5 on kuvattu liitteenä olevissa kuvioissa, joiden tarkoituksena on valaista keksintöä eikä rajoittaa sen suoja-alaa.

Lyhyt piirustusten kuvaus

Kuvio 1 kuvaa hainruston (kiinteän uutteen) suurenevien annosten estovaikutusta ZR75-1 ja MCF-7 -soluihin.

10 Kuvio 2 esittää MCF-7 -solujen määrän annosvastekäyriä mitattuna niiden DNA-si-sällöllä, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia estradiolia ilman kahta rustolyofilisaatti-konsentraatiota tai niiden läsnäollessa.

Kuvioissa 3a) ja 3b) verrataan rottien, joille on kehittynyt maitorauhassyöpä ja joille on annettu letkuruokintana rustolyofilisaatin ja supematantin yhdistelmää, ja 15 rottien, joille on annettu ainoastaan vettä, maksaleikkeitä.

Kuvioissa 4a) ja 4b) verrataan rottien, joille on kehittynyt maitorauhassyöpä ja joille on annettu letkuruokintana rustolyofilisaatin ja supematantin yhdistelmää, ja rottien, joille on annettu ainoastaan vettä, munuaisleikkeitä.

; , Kuvioissa 5a) ja 5b) verrataan rottien, joille on kehittynyt maitorauhassyöpä ja **;;/ 20 joille on annettu letkuruokintana rustolyofilisaatin ja supematantin yhdistelmää, ja * * * '·* * rottien, joille on annettu ainoastaan vettä, keuhkoleikkeitä.

Kuvioissa 6a) ja 6b) verrataan rottien, joille on kehittynyt maitorauhassyöpä ja · · i V joille on annettu letkuruokintana rustolyofilisaatin ja supematantin yhdistelmää, ja [ rottien, joille on annettu ainoastaan vettä, maitorauhaskasvainleikkeitä.

:T: 25 Kuvio 7 on kuvioista 6a) ja 6b) johdettu histogrammi, joka kuvaa rustouutteen vaikutusta verisuoniston pinta-alaan kasvaimissa.

. Kuvio 8 on elektroforeesiprofiili, joka saatiin Rotoforilla erotetuista nestemäisistä .···. fraktioista ei-denaturoivissa olosuhteissa; molekyylipainomarkkerit näkyvät vasem- maila ja niiden jälkeen näyte raakapermeaatista ennen fraktiointia, eristettyjen frak-:: 30 tioiden kanssa suoritettavaa vertailua varten.

• *4 : Kuviot 9a) ja 9b) kuvaavat kahden psoriasista sairastavan potilaan, joista toisella oli hyperkeratoosia 9a) ja toisella ei ollut hyperkeratoosia 9b), tilassa tapahtunutta mer-kittävää paranemista, kun heitä oli hoidettu paikallisesti käytettävällä koostumuksel- • « la, joka sisälsi tehokkaan määrän konsentroitua nestemäistä rustouutetta (alemmat 35 valokuvat) verrattuna heidän lähtötilanteeseensa (ylemmät valokuvat).

117376 8

Kuvio 10 esittää kolmen eri hainrustouutteen FPLC-migraatiomallia. Kuviossa 10A DUP tarkoittaa tämän keksinnön mukaista nestemäistä rustouutetta. Kuvioissa 10B ja 10C BAL ja OIK tarkoittavat tunnetun tekniikan, Balassan et ai. ja Oikawan et ai. mukaisia uutteita, vastaavassa järjestyksessä.

5 Kuvio 11 esittää kuviossa 10 määriteltyjen uutteiden HPLC-migraatiomallia.

Kuvio 12 esittää tuloksia CAM-kokeista, jotka suoritettiin käyttämällä erilaisia pro-tamiinin, erään antiangiogeenisen referenssiyhdisteen, pitoisuuksia verrattuna verrokkiin.

Kuvio 13 esittää tuloksia CAM-kokeista, jotka suoritettiin kahdella keksintömme 10 mukaisen nestemäisen kokonaishainrustouutteen (DUP) fraktiolla, joista toisen mo-lekyylipaino oli pienempi kuin 10 000 daltonia ja toisessa oli molekyylejä, joiden paino oli suurempi kuin 10 000 daltonia.

Kuvio 14 esittää tuloksia CAM-kokeista, jotka suoritettiin keksintömme mukaisella nestemäisellä kokonaisuutteella (DUP), verrattuna vastaavaan konsentraatioon tuo-15 tetta, joka oli valmistettu Balassan menetelmällä (BAL).

Kuvio 15 esittää tuloksia CAM-kokeista, joita suoritettiin keksintömme mukaisella nestemäisellä kokonaisuutteella (DUP), verrattuna näytteeseen, joka oli peräisin yhtä suuresta kuiva-ainepainomäärästä tuotetta, joka oli valmistettu Oikawan menetelmällä (OIK).

20 Kuvio 16 kuvaa TPA:n vaikutusta keratinosyytteihin verrattuna DMSO-verrokkiin, molempien ollessa mitatut esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmis- : .tetun nestemäisen kokonaishainrustouutteen läsnäollessa tai ilman sitä.

!5

Kuvio 17 kuvaa keksintömme mukaisen nestemäisen kokonaisuutteen tulehduksen- * * * , .: vastaista vaikutusta ihon ärsytysmalliin.

• * ... 25 Kuvio 18 esittää tämän keksinnön mukaisen nestemäisen kokonaisuutteen fraktion, • t » I. '* jonka molekyylipaino on pienempi kuin 10 000 daltonia ja joka on konsentroitu ja erotettu viideksi alafraktioksi, toista HPLC-migraatiomallia.

• · « *·* * Kuvio 19 kuvaa kunkin kuviossa 18 esitetyn alafraktion antikollagenolyyttistä vaikutusta eri koetilavuuksina.

i · · * *···. 30 Eräässä erityistoteutusmuodossa käytettävä rusto on saatu terveistä haista, jotka kuuluvat lajeihin musta piikkihai ja yleinen piikkihai. Mahdollinen lihas- ja side-:*i.: kudos poistettiin raaputtamalla etanolilla käsitellyillä skalpelleilla tai saksilla. Rusto :: tyhjiöpakattiin sitten muovipusseihin ja pakastettiin -20 °C:seen myöhempää käyttöä : v. varten. Keksinnön mukaisessa käytössä voidaan käyttää mitä tahansa ruston lähdet- 35 tä. Olemme valinneet hain ruston taustaa koskevassa kappaleessa mainituista syistä. Lähtemällä leveäsuisten (johon kuuluvat hait ja varsinaiset rauskut tämän ryhmän eläinlajeina) rustosta uskotaan saatavan lähes toisiaan vastaavia tuotteita. Tuotteet 117376 9 ovat hyvin todennäköisesti erilaisia, jos ruston lähteenä käytetään käytetään nisäkkäitä.

Mitä tahansa muunnelmia voidaan käyttää ruston valmistuksessa ennen sen uuttoa, kunhan ne eivät olennaisesti vaikuta kohdetuotteen (esimerkiksi nestemäisen koko-5 naisuutteen tai jonkin sen erityisfraktion) aktiivisuuteen. Eräät aktiiviset komponentit saattavat kestää proteolyyttistä digestiota, kuten Balassa et ai. (US-patentti 4 822 607) mainitsevat, mahdollisten ympäröivien kudosten poistamiseksi rustosta, kun toiset taas eivät kestä tällaista käsittelyä. Eräs aktiivisuus, joka ei näytä kestävän sellaista esikäsittelyä, on antiangiogeeninen aktiivisuus (kuvio 15). Niinpä mikäli 10 halutaan valmistaa nestemäinen uute, joka sisältää mahdollisimman paljon kaikista vesiliukoisista aktiivista komponenteista, joilla on erilaisia vaikutuksia, sellaista digestiovaihetta tulisi välttää tai tarkkailla sitä huolellisesti liiallisen hydrolyysin tai proteolyysin estämiseksi.

LyofUisoidun ruston valmistaminen 15 Puhdasta rustoa käytettiin tuoreena tai sulatettuna 4 °C:seen. Rusto jauhettiin sen jälkeen useita kertoja (tarkemmin sanoen enemmän kuin kolme kertaa) etanolilla käsitellyn lihamyllyn läpi yhdessä sopivan vesimäärän kanssa [vastaava määrä (pai-no/tilavuus) on suunnilleen minimimäärä, mutta sitä voidaan lisätä sen vaikuttamatta mitenkään arvokkaiden komponenttien talteensaantoon]. Pieni tilavuusmäärä on J .·. 20 edullinen, koska sitä on käytännön kannalta helpompi käsitellä kuin tarpeettoman

• M I

suuria määriä. Käytännössä vesi on puhdistettu käänteisosmoosilla ja suodattamalla 0,1 μιη:η suodattimella. Veden sijasta voitaisiin käyttää monenlaisia vesiliuoksia * · ... (jotka sisältävät esimerkiksi suoloja). Kun tarkoituksena on saada talteen paljon I. * vesiliukoisia aktiivisia komponentteja, on eduksi työskennellä lähes neutraalissa 25 pH:ssa ja ei-denaturoivissa olosuhteissa joidenkin ruston komponenttien liukene- • * * misen tai denaturoitumisen välttämiseksi. Tuntemattomien proteiinien käyttäytymistä vesipitoisissa liuotteissa ei voida ennakoida; jotkut saattavat "viihtyä parem- # min" happamassa pH:ssa, jotkut taas emäksisessä pH:ssa. Lisäksi joitakin proteiine- ja voidaan uuttaa lievästi denaturoivissa olosuhteissa, mikäli sellainen denaturoitu- . *·. 30 minen ei vaikuta palautumattomasti näiden proteiinien renaturoitumiseen vesipitoi- • · · IV.' sissa liuoksissa. Kaikki nämä tekijät huomioiden ruston aktiivisten komponenttien *:** uuttomenetelmän toteuttaminen puhtaassa vedessä onkin osoittautunut järkeväksi : V valinnaksi erittäin hyvän saannon saamiseksi, koska komponenttien rakennetta ja *:**: käyttäytymistä ei tunneta.

ίο 117376

Sitten rusto/vesiseos homogenoitiin sekoittamalla sitä mahdollisimman suurella nopeudella kotitaloussekoittimella noin 4 °C:ssa kymmenen minuuttia. Sekoitusnopeus samoin kuin vesiliuoksen tilavuus voivat tietysti vaikuttaa uuttoaikaan. Sen vuoksi järkevä homogenointiaika voisi olla jopa noin 10 minuutista aina 24 tuntiin saakka, 5 edullisesti noin 10-60 minuuttia. Lämpötila tulisi pitää alempana kuin noin 10 °C, jotta endogeeniset entsyymit eivät pääsisi heikentämään aktiivikomponentteja, kun ei käytetä mitään entsyymin estäjiä. Ihanteellista olisi pyrkiä lähelle 0 °C. Koska tällainen kokeilu tehdään tavallisesti kylmässä tilassa, jossa lämpötila voidaan pitää 4-10°C:ssa, tämä lämpötila-alue on hyväksyttävä keksinnön mukaisessa menetel-10 mässä. Selvyyden ja lyhyyden vuoksi termiä "noin 4 °C" käytetään alla tarkoittamassa tätä hyväksyttävää lämpötila-aluetta.

Tämä homogenaatti voidaan sitten nesteyttää käyttämällä sitä Polytron-hajoittimessa 10 minuuttia 4 °C:ssa, mikäli sekoitin ei tarpeeksi pienentänyt partikkelikokoa. Vaihtoehtoisesti seos voidaan yksinkertaisesti homogenoida jossakin suorituskykyi-15 semmässä sekoitin-hajoittimessa, jollainen säästi meidät 10 minuutin nesteytysvai-heelta. Loppuun suoritetun homogenointivaiheen päätyttyä jäännöspartikkelikoko on pienempi kuin noin 500 μιη. Samat hyväksyttävät aika- ja lämpötila-alueet, joita käsiteltiin ruston ensijauhatuksen yhteydessä, soveltuvat tietysti tähänkin. Partikkelien koon ei homogenoinnin jälkeen tarvitse olla hyvin pieni. Niinpä voidaan välttää 20 ruston jauhamisen tarve ennen uuttamista. Ruston jauhaminen jauheeksi ennen vesi-. . uuttoa saattaa denaturoida arvokkaita aktiivisuuksia, kun sellainen jauhaminen e;i.: toteutetaan ruston ollessa pakastekuivassa tilassa tai lämpökuivassa tilassa.

• * · ·:··: Homogenaattia sentrifugoitiin nopeudella 13 600 x g 15 minuuttia 4 °C:ssa, mikä on nopea ja tehokas tapa erottaa supematantti pelletistä. Alaan perehtynyt osaa muun- j\( 25 neliä ja säädellä näitä parametrejä pelkästään homogenaatin tilavuuden ja käytetyn * laitteiston perusteella.

* *

Saatua pellettiä lyofilisoitiin 24-48 tuntia. Tätä ensimmäistä fraktiota nimitetään \ i.: tästedes lyofilisaatiksi tai kiinteäksi uutteeksi.

··· • · • ^ φ *\ Supematantti voidaan suodattaa 24 μτη:η Whatman-suodattimella tarpeen vaatiessa • * * '·«* 30 partikkeleiden, jotka saattavat vaikuttaa ultrasuodatuskolonnin suorituskykyyn, pois- tamiseksi. Suodatettu materiaali ultrasuodatettiin sitten noin 4 °C:ssa tangentiaalivir- ;V: taussuodatuskolonnissa, jonka huokoisuus oli noin 500 000 daltonia, jolloin saatiin • · ensimmäinen raakapermeaatti, joka sisälsi vesiliukoisia molekyylejä, joiden mole-kyylipaino on 0 - noin 500 kD. Tämä raaka läpi mennyt uute steriloitiin suodatta-35 maila 0,22 μιη:η suodattimena ja alikvootteja pullotettiin steriileihin pulloihin myö- 117376 π hempää käyttöä varten. Tätä fraktiota nimitetään tästedes raakapermeaatiksi tai nestemäiseksi kokonaisuutteeksi.

Pelletin ja supematantin aikaansaamiseksi on kehitetty eräs vaihtoehto, voimakkaampi sentrifugointimenetelmä. 15 minuutin sentrifugointivaihe nopeudella 5 13 600 x g ja sitä seuraava karkeasuodatus Whatman-suodattimilla on korvattu sentrifugoinnilla CEPA-sentrifugissa, joka on varustettu nylonpussilla, jonka huokosten läpimitta on 30 μΜ, nopeudella 3 000 - 4 000 x g. 25 kg:n/25 litran valmiste voidaan sentrifugoida tällä tavalla 30 minuutissa, jolloin saadaan 29 litraa super-natanttia. Saatu vesipitoisen jakeen tilavuus on suurempi kuin veden lähtö tilavuus, 10 mikä johtaa ajattelemaan, että mukaan on tullut myös osa ruston itsensä vesipitoisuudesta. Lyofilisaatilla ja nestemäisellä kokonaisuutteella voi olla seuraava likimääräinen koostumus, jossa on karkeasti otettu huomioon erien väliset vaihtelut ja eri materiaalien käytöt:

Lyofilisaatti: 15 Lipidejä 7,35 %'

Proteiineja 46,2 %2

Kosteutta 20,4 %

Natriumia 4,16 mg/g3

Kaliumia 2,64 mg/g : 20 Kalsiumia 114 mg/g

Magnesiumia 1,49 mg/g

Sinkki- ja rautajäämiä 117376 12

Proteiinipitoisuus mitataan Kjeldahlin menetelmällä, jossa itse asiassa mitataan orgaaninen typpi (N). Orgaaninen typpi muutetaan vastaavaksi proteiiniksi seuraavan yhtälön avulla: % N x 6,25 5 Proteiinipitoisuus (mg/ml) =---- 100

Koska hiilihydraatteja ei voida osoittaa, voidaan olettaa, että niitä on jommassakum-massa uutteessa, mutta proteoglykaanien ja/tai mukopolysakkaridien muodossa. On mahdollista, että nämä yhdisteet sisältyvät mitattuun kosteustasoon. Lyofilisaatti si-10 sältää odottamattoman määrän kosteutta, joka mitattiin OH-ryhmien avulla. Koska 20 %:n vesipitoisuus on lähellä rustossa tavallisesti tavattua hiilihydraattien prosenttiosuutta, kun sen sijaan lyofilisaatin kosteuden tulisi olla lähellä 0 %, tämä olettamus jää todennettavaksi.

Steriiliys tarkastettiin seuraavissa laboratorioissa käyttäen US-patentteja koskevia 15 XXIII -ohjeita: 1) Laboratoire de genie sanitaire du Quebec Inc.

1090,1'Escarbot, Centre Industriel St-Malo, Quebec GIN 4J4; ja 2) Northview Laboratories Inc.

1880, Holste Road, Northbrook, IL, 60062, USA

• i t · « « « · *·♦ t 20 Aktiivisuuskokeet: • * · *:#ej Lyofilisaatti: >· ♦ » « · • « * ♦ :·. In vivo -kokeet:

• M

• ### v : Nämä kokeet suoritettiin hormoniriippuvaisilla syöpäsolulinjoilla MCF-7 ja ZR75-1 [ATCC (R) -numerot 22-HTB ja 1500-CRL, vastaavassa järjestyksessä].

• i i 25 ZR75-1 -solut: ··» : Perus-RPMI -liuos: ·«· • · **”* 52 g RPMI 1640:ä ilman fenolipunaa (Sigma R8755), 17,875 g Hepesiä (vapaa j* V happo; Sigma H0763), 0,55 g natriumpyruvaattia (Sigma P5280) ja 10 g NaHC03 ·:··: sekoitettiin 5 litraan puhdasta vettä ja pH säädettiin arvoon 7,40 NaOH:lla.

117376 13

Jos tätä liuosta ei käytetä välittömästi, se tulee suojata valolta fotolabiilien ainesten säilyttämiseksi. Tämä liuos suodatettiin, jaettiin 500 ml:n steriileihin pulloihin ja varastoitiin 4 °C:seen enintään kolmeksi kuukaudeksi.

Soluviljelyliuos: 5 Perus-RPMI-liuokseen lisättiin 10 % (v/v) FBS (vasikan sikiön seerumia), 100 U G-penisilliiniä/50 μg streptomysiinisulfaattia (Sigma P0906)/ml liuosta, 2 mM L-gluta-miinia (Sigma G1517) ja 1 nM I^ita (β-estradiolia Sigma E8875).

Koeliuos:

Perus-RPMI-liuokseen lisättiin 5 % FBSA:ta (vasikan sikiön seerumia adsorboituna 10 dekstraani-puuhiileen), 2 mM L-glutamiinia, 100 U G-penisilliiniä/50 /ig streptomy-siinisulfaattia/ml liuosta ja 50 ng/ml insuliinia (Sigma). Tähän liuokseen lisättiin kasvavia konsentraatioita edellä kuvattua lyofilisaattia sekä eri konsentraatioita est-radiolla (10'12‘5 M).

MCF-7 -solut 15 Perus-DME-F12-liuos DME-F12-liuos (ilman bikarbonaattia ja fenolipunaa; Sigma) rekonstituoitiin val-. mistajan ohjeiden mukaan puhtaaseen veteen. Yhtä litraa kohti lisättiin 1,2 g nat- riumbikarbonaattia ja pH säädettiin arvoon 7,40 NaOH/HCl:lla. Tämä liuos suoda- • « « v [ tettiin, jaettiin 500 ml:n steriileihin pulloihin ja varastoitiin 4 °C:seen enintään kol- * * 20 meksi kuukaudeksi.

n * • · » • « ♦ * ;‘.,t Soluviljelyliuos:

Hl

Perus-DME-F12-liuokseen lisättiin 10 % (v/v) FBS:ää (naudan sikiön seerumia), 100 yksikköä G-penisilliiniä/50 μg streptomysiinisulfaattia/ml liuosta, 2 mM L-glu-tamiinia (Sigma) ja 1 nM E2:ta (estradiolia).

• f « • · 25 Koeliuos: i · « • · ·

• M

:***: Perus-DME-F12-liuokseen lisättiin 5 % FBS A: ta (naudan sikiön seerumia adsorboi- *· « ;/·β tuna dekstraani-puuhiileen), 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä G-penisillii- : '1 niä/50 streptomysiinisulfaattia/ml liuosta ja 50 ng/ml insuliinia (Sigma). Kuten ZR75-1 -solujen kohdalla kuvattiin, lyofilisaattia ja estradiolia lisättiin samoina 30 konsentraatioina.

117376 14 FBSA:n valmistaminen

Vasikan sikiön seerumiin sekoitettiin 1 % (w/v) puuhiiltä (hiilestä värin poistavaa emästä). Puuhiili-seerumiliuokseen lisättiin dekstraani ΊΓ70 -liuos konsentraation säätämiseksi 0,1 %:iin (w/v). Seosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa. Kun seosta oli 5 sentrifugoitu 4 °C:ssa 30 minuuttia nopeudella 10 000 x g, seerumi dekantoitiin, sekoitettiin uudelleen samoihin määriin puuhiiltä ja dekstraania, sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tuntia ja sentrifugoitiin uudelleen. Sitten seerumi inaktivoitiin lämmön avulla pitämällä sitä 56 °C:ssa 20 minuuttia, se steriloitiin suodattamalla ja siitä pantiin alikvootteja steriileihin kartiomaisiin Falcon-putkiin.

10 ZR75-1 ja MCF-7 -soluja kasvatettiin populaatiotiheyteen 20 000 solua/kuoppa 24- kuoppaisilla levyillä tai 150 000 solua/kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla edellä valmistettua lyofilisaattia tai ilman sitä. Tätä varten lyofili-saatti lietetään uudelleen viljelyliuokseen ja steriloidaan suodattamalla, jolloin sen vesiliukoiset komponentit saadaan talteen ja testataan. Kaikki kokeet suoritettiin 15 triplikaatteina. Viljelyliuokset poistettiin ja korvattiin tuoreella liuoksella joka toinen päivä. Soluja kasvatettiin inkubaattorissa vakiokosteassa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % C02, 37 °C:ssa 17, 7, 3 tai 3 vuorokautta vastaten ensimmäistä, toista, kolmatta ja neljättä koetta, vastaavassa järjestyksessä. Solujen kasvun estyminen mitattiin laskemalla suoraan solut tai määrittämällä kuopan kokonais-DNA-sisältö.

20 • » • · · • < f M· ·

Lyofilisaatin pitoisuus Solun estyminen (%) MCF-7 ZR75-1 • * .. . 1. koe: 17 vuorokautta • i * i.‘ 1 mg/ml 1,5 2,00 :..7 5 mg/ml 14,33 33,6 ··· : 10 mg/ml 62,66 90,8 2. koe: 7 vuorokautta :..V 1 mg/ml 3,73 0,97 C: 5 mg/ml 15,7 29,00 . X 10 mg/ml 68,37 66,00 i" 3. koe: 3 vuorokautta 50 mg/ml 95,8 95,00 : 100 mg/ml 94,6 98,00 • 11«! • · 117376 15 4. koe: 3 vuorokautta 10 mg/ml 34,4 51,5 20 mg/ml 62,5 70,5 50 mg/ml 95,8 95 100 mg/ml 94,6 98

Edellä olevat solun kasvun estoprosentit osoittavat, että lyofilisaatti voi estää annoksesta riippuvalla tavalla näiden kahden solulinjan solujen kasvua.

Kuvio 1 osoittaa, että 50 mg:n ja 100 mg:n/ml annokset lyofilisaattia aikaansaavat 5 selvästi vajaakasvua näissä solulinjoissa kolmen vuorokauden käsittelyn jälkeen.

Kuvio 2 osoittaa, että kun läsnä on 10'12 - 10*9 M estradiolia, käsiteltyjen solujen vaste on samanlainen kuin verrokkisolujen eli ne eivät stimuloidu näiden hormoni-annosmäärien vaikutuksesta. Kuitenkin 1 nM:a suuremmilla annoksilla vertailusolut stimuloituvat voimakkaasti ja DNA-pitoisuus nousee 3,75 Jtg:aan, kun läsnä on 107 10 M estradiolia (versus 0,69 Mg verrokeissa ilman estradiolia). Soluissa, jotka on käsitelty 30 mg:lla ja 50 mg:lla/ml lyofilisaattia, maksimistimulaatiossa mitattu DNA-pi-toisuus on 1,9 Mg ja 1,8 Mg, vastaavassa järjestyksessä.

Kuvio 2 osoittaa, että käsiteltyjen solujen affiniteettikerroin (Km) on estradiolin osalta 3 ja 16 kertaa korkeampi (31,3 nM ja 174,0 nM) kuin verrokkisolujen Km- : 15 arvo (11,7 nM), kun lyofilisaattia on läsnä 30 mg/ml ja 50 mg/ml, vastaavassa jär- *·» · .·!·· jestyksessä. Tämä tarkoittaa, että tarvitaan suurempia pitoisuuksia estradiolia, jotta * saadaan samantasoinen solujen kasvu, kun ruston lyofilisoitua kiinteää uutetta on ··... läsnä. Tämä uute siis pienentää maksimi vastetta (90 % esto) ja nostaa käsiteltyjen • · solujen affiniteettikerrointa estradiolin suhteen.

• ·· :T: 20 In vivo -kokeet: m Neljääsataa 40 päivän ikäistä naaraspuolista Sprague-Dawley -rottaa (ostettiin

Hl Charles River Co:lta, St-Constant, Quebec) totutettiin ympäristöönsä 12 vuoro- kautta. Tällöin niille annettiin syöttöletkulla 20 mg DMBA:ta/l ml maissiöljyä (9,10-dimetyyli-l,2-bentsantraseeni; ostettiin Sigma Chemical Co:lta). Kolme kuu-:* *: 25 kautta tämän käsittelyn jälkeen valittiin 240 rottaa, joille oli kehittynyt maitorauhas- ..\e syöpä, ja ne jaettiin kahteen ryhmään. Ensimmäinen ryhmä muodostui viidestä ala- : \ ryhmästä rottia. Käsiteltyjen ryhmien rotille annettiin päivittäisannoksena kasvavia konsentraatioita lyofilisaattiuutetta 3 ml:ssa vettä kahdeksan viikon ajan, kun verrokkiryhmä sai saman määrän vettä. Toinen ryhmä muodostui neljästä alaryhmästä 117376 16 rottia. Käsiteltyjen ryhmien rotille annettiin myös päivittäisannos lyofilisaattia 3 ml:ssa vettä yhdistettynä supematanttiin tai ilman sitä, kymmenen viikon ajan, kun taas verrokkiryhmä sai saman määrän vettä. Ainoastaan yksi alaryhmä toisen ryhmän rotista, joita hoidettiin konsentraatiolla 3000 mg/kg/vuorokausi lyofilisaattia ja 5 3 ml:lla supematanttia, sai myös intraperitoneaalisena (i.p.) injektiona pienehkön annoksen supematanttia (noin 8 mg proteiinia 1 ml:ssa vettä).

Rotat painoivat 151-175 g näiden kahden kokeen alussa ja ne saivat ruokaa ja vettä ad libitum. Ensimmäisellä rottaryhmällä oli tuumoreita, joiden läpimitta oli 0,9 cm, kun toisen rottaryhmän tuumorien keskiläpimitta oli 0,6 cm.

10 Tulokset ovat yhteenkoottuina seuraavat:

Vuorokausiannokset rustouutetta Tuumorin kasvun esto- % syöttöletkulla annettuna (tuumorin läpimitan pieneneminen vs verrokki) 1. koe: kestoaika 8 viikkoa 500 mg/kg/vrk 2 % 1000 mg/kg/vrk 4 % 3000 mg/kg/vrk 14 % 5000 mg/kg/vrk 15 % : 2. koe: kestoaika 10 viikkoa 12 % • · · ♦ ·*·’: 3000 mg/kg/vrk 18% 3000 mg/kg/vrk + 3 ml supematanttia 20 % 3000 mg/kg/vrk + 3 ml supematanttia ··/ + 1 ml injektio i.p. supematanttia • ·* • « · ·* * Nämä tulokset osoittavat, että lyofilisaatti sisältää aktiivisen komponentin, joka ab sorboituu maha-suolikanavaan ja joka vaikuttaa tuumorin kokoon. Tämä vaikutus *·!.* saattaa kohdistua suoraan tuumorisoluihin tai kysymyksessä voi olla vaikutuksen 15 välittämä angiogeneesin estyminen.

i • * · Nämä tulokset osoittavat myös, että supematantilla on vaikutus, joka heijastuu kas-vainkoon lisäpienentymänä noin 5 %:11a.

»« « • · « * * * \ Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että lyofilisaatti saattaa sisältää aktiivisia komponentteja, jotka eivät ole vesiliukoisia ja/tai se saattaa sisältää vesiliukoisten 20 ainesten jäämiä. Sen vuoksi viimeisenä mahdollisuutena voitaisiin ajatella pelletin 17 117376 uuttamista uudelleen jossakin vesipitoisessa liuoksessa vesiliukoisten komponenttien saamiseksi mahdollisimman tarkkaan talteen, mikäli tällä voitaisiin yhä parantaa saantoa.

Histopatologia 5 Rustouutteen aktiivisten molekyylien myrkyttömyyden määrittämiseksi eläimet, joita käytettiin edellä selostetuissa in vivo -kokeissa, lopetettiin taittamalla niiden niska ja seuraavat kudokset otettiin talteen analyysiä varten: maksa, keuhko, munuaiset, sydän, aivot, lihasta ja maitorauhanen. Rasva poistettiin näistä kudoksista, minkä jälkeen niitä kiinnitettiin kaksi vuorokautta Bouin-nesteessä. Etanolissa de-10 hydratoinnin jälkeen kiinnitetyt kudokset upotettiin parafiiniin. Niistä otettiin leikkeitä ja se sijoitettiin mikroskooppilevyille, värjättiin hematoksyliinillä ja visualisoitiin mikroskoopilla.

Histologinen tutkimus osoitti, että mitään haitallista vaikutusta ei ollut havaittavissa, kun käytettiin suurimpia annoksia lyofilisaattia yksinään (tuloksia ei esitetty) tai kun 15 käytettiin lyofilisaattia yhdessä supematantin kanssa (katso kuvioita 3a ja 3b, 4a ja 4aja5aja5b), Tämä johtaa ajattelemaan, että lyofilisaatilla ja supematantilla on selektiivinen kasvaimen kokoa pienentävä vaikutus.

* » : Maitorauhasessa, jossa on syöpä (katso kuviot 6a ja 6b), todettiin verisuonialueen · 20 huomattava pieneneminen. Näiden aktiivisten molekyylien antiangiogeenisen vai- *:··: kutuksen vahvistavat sitten kuviossa 7 kuvatut ja yhteenkootut tulokset.

• · · « « • 1 I. ’ Kuvio 7 osoittaa, että kun käytettiin lyofilisaatin (p.o.) ja supematantin (p.o. + i.p.) yhdistelmää (kts. kuviot 6a ja 6b), kasvaimessa todettiin verisuonittuneen alueen *·1 : pieneneminen 55 %:lla.

; 25 Kasvaimen koon pieneneminen saattaisi johtua sen verisuonittumisen merkittävästä * 1 » .1·1. vähenemisestä, suorasta vaikutuksesta kasvainsoluihin tai näiden kahden ilmiön • · **] yhdistelmästä. Näiden uutteiden antiangiogeeninen vaikutus näkyy selvästi edellä *·:·: olevasta. Suora hypoplasiavaikutus todettiin in vitro hormonista riippuvaisissa so- luissa ja se jää vielä vahvistettavaksi in vivo.

«9 · • I 9 1 \ 30 Koska edellä esitetyt tulokset osoittivat, että supematantilla oli lyofilisaatin vaiku- ' tusta suurempi vaikutus ZR75-1 -soluihin, sen komponentteja tutkittiin edelleen.

117376 18

Aktiivisia molekyylejä sisältävien nestemäisten fraktioiden ottaminen talteen

Hainrustoa otettiin talteen ja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti heitettiin pois ja supematanttia käsiteltiin edelleen edellä kuvatulla tavalla suodatussterilointiin saakka 0,22 μιη suodattimena.

5 Supematanttia nimitetään tästedes raakapermeaatiksi, s.o. tuotteeksi, joka saadaan ultrasuodatuksen jälkeen.

Näin saadulle raakapermeaatille suoritettiin FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, nopea proteiininestekromatografia).

FPLC-olosuhteet: 10 Kolonni; Hiload 26 mm x 60 cm Sephacryl S-300 FPLC-systeemi: Pharmacialta.

Kaikki näytteet suodatettiin 0,22 μιη:η suodattimella ennen niiden pakkaamista kolonniin. Eluointipuskuri oli fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta (PBS), joka oli suodatettu ja josta oli poistettu kaasua 15 minuutin ajan. Pakatun näytteen tilavuus 15 oli yleensä 3,2 ml (voisi olla jopa 13 ml). Virtausnopeus oli 1 ml/minuutti. Otettiin talteen 10 ml:n fraktioita. Eluoituneet yhdisteet osoitettiin niiden UV-absorbanssilla . ^ (280 nm). Kahbraatiokaavio saatiin käyttämällä Sigman MW-GF-1000 -kalibrointi- :;j.: pakkausta, jossa kalibrointinäytteen tilavuus oli sama kuin analyysiä varten pakatun ♦ * · *·* * näytteen (3,2 ml). Näytteen eluaatiotilavuus johdettiin kalibrointipakkauksen yhdis- : ; 20 teiden molekyylipainon käyrästä vs niiden eluaatiotilavuus, josta vähennettiin kolon- : V nin välitilatilavuus. Välitilatilavuus saatiin injektoimalla dekstraanisinistä (MW = 2 j\. 000 000).

aa» • a ♦ • · ·

Fraktioiden aktiivisuutta testattiin ZR75-1 -soluihin. Kiinnostavat fraktiot tunnistettiin ja niiden ominaisuudet vahvistettiin lisätutkimuksella (alla).

• · · ··· 25 Permeaatin aktiivisten komponenttien lisäkarakterisointi suoritettiin Rotofor-. !\ (Biorad 170-2950; katso isoelektrinen fokalisointi alla) ja Amicon-suodattimilla, » » a IV.' joilla oli erilaiset cut-off -arvot sellaisten fraktioiden saamiseksi, joiden molekyyli- painot olivat 10-30kD, 30- 100 kD ja yli 100 kD.

• a a • * a • a • a • * * 117376 19

Isoelektrinen fokalisointi:

Hainrustovalmistetta (46 ml permeaattia 1 kg/1) dialysoitiin yön yli 4 litraa puhdasta vettä, joka sisälsi 5 % glyseriiniä, vastaan 4 °C:ssa käyttäen kalvoa Spectra pore #7 MWCO 3500 kD (Spectrum 132110). Dialysoitu liuos sekoitettiin 2,75 ml:aan am-5 folyyttejä (Pharmacia #80-1125-87), pH 3,5 - 10,0 ja 0,5 g:aan CHAPS:ä (Sigma C3023; 3-[(3-kolamidopropyyli)-dimetyyliammonio]-1 -propaanisulfonaatti). Määrä täydennettiin 55 ml:ksi puhtaalla vedellä. Liuos syötettiin Rotoforille. Isoelektrinen fokalisointi suoritettiin 4 °C:ssa, 12 watin tasavirralla (3000 xi virransyöttö Biorad 165-0554), kierrättämällä vettä vakionopeudella lämpötilan säilyttämiseksi. Erotuk-10 sen alussa jännite oli 380 volttia ja ampeeriluku 31 mA. Kun ampeeriluku oli stabi-lisoitunut (14 mAiksi), jännite oli 870 volttia. Isoelektrinen fokalisointi keskeytettiin ja talteen otettiin 20 fraktiota.

Fraktio Tilavuus (ml) pH

1 3,7 3,56 2 2,1 4,01 3 2,2 4,18 4 2,3 4,31 5 2,2 4,63 6 2,1 5,03 7 2,5 5,30 li: 8 2,1 5,50 :T: 9 2,4 5,81 10 2,5 6,26 Γ·;: 11 2,3 7,00 12 2,4 7,29 !·:·! 13 2,4 7,64 14 2,5 7,94 15 2,3 8,32 ie 2,5 8,62 17 2,4 8,94 18 2,9 9,30 19 3,1 9,88 .Λ 20 3,6 10,71 • · · * ♦ • » Nämä proteiinit identifioitiin määrittämällä niiden molekyylipaino elektroforeesi-15 geelillä [Laemmli, U.K. (1970) Nature (Lond.) 227: 680].

117376 20 Nämä fraktiot laimennettiin nelinkertaisiksi ajopuskurilla (katso Laemmli) ja 8 μ1:η alikvooteille suoritettiin elektroforeesi ei-pelkistävissä olosuhteissa. Kuviossa 8 esitetään elektroforeesiprofiili kustakin fraktiosta ja materiaalista ennen isoelektristä fokalisointia.

5 Kaikki fraktiot pullotettiin steriileihin pulloihin laminaarivirtauskuvun alla ohjaamalla ne steriilin Millipack-60-suodattimen läpi, jonka huokoisuus oli 0,22 μπι.

Fraktioiden proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn annosmittausmenetelmällä. Liuoksia, joiden pitoisuus oli 1 kg/2 1 (ilmoitettu raakaruston painona per litra per-meaattia) testattiin ZR75-1 -soluihin eri konsentraatioina viljelyliuoksessa. Yhteen-10 veto tuloksista on seuraava: 1. koe:

Permeaatti lyofilisoitiin, lietettiin uudelleen PBS:ään ja ajettiin FPLC.lla. Minkäänlaista hypoplasia-aktiivisuutta ei ollut osoitettavissa (tuloksia ei ole esitetty).

2. koe: 15 Kokeet suoritettiin Rotofor-fraktioilla (permeaatti konsentroitiin haihduttamalla): Proteiinin identifiointi ij*: Identifioidut Isoelektrinen Keski- Molekyylini': fraktiot piste arvo paino

7-8-9-10 5,30-6,26 5,78 29±lkD

7-8-9 5,30-6,26 5,68 60+lkD

y.' 12-13-14 7,29-7,94 7,62 48±lkD

;..7 13-14 7,64-7,94 7,79 35 ± 1 kD

# « « 3. koe suoritettiin FPLC-fraktioilla (permeaatti konsentroitiin haihduttamalla): * * · * ♦ ♦ »·#

Fraktiot Molekyylipaino

\ 6 ja 7 1 - 2,5 kD

» » t ·»· «·· • · 20 • · t t » • « 117376 21 4. koe suoritettiin 100 μ\:η fraktioilla, jotka saatiin Amicon-molekvvlisuodattimista:

Testattu Molekyylipaino ZR75-1-soluviljelmien konsentraatio esto lOOMg/ml MW > 100 kD 64% 100 Mg/ml 30 kD < MW < 100 kD 114 % 100 /ig/ml 10 kD < MW < 30 kD 127 % 400 Mg/ml MW < 10 kD 149 % FPLC-fraktiot 6 ja 7 sisältävät aktiivisia komponentteja, joiden molekyylipaino on erittäin pieni: 1 - 2,5 kD.

5 Fraktioiden hypoplasiavaikutus voi olla jopa 33 000 kertaa suurempi kuin mikä todettiin lyofilisaatilla. Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että lyofilisointi näyttää aiheuttavan jonkin verran hävikkiä eluaatin sisältämien proteiinien suorassa kasvain-tenvastaisessa aktiivisuudessa, kun sen sijaan mitään tällaista hävikkiä ei esiintynyt kiinteää uutetta lyofilisoitaessa. Tämä johtaa ajattelemaan, että rustopartikkeleihin 10 sisältyvät aktiiviset komponentit näyttävät olevan sellaisessa ympäristössä, jossa ne ovat vähemmän herkkiä lyofilisoinnin denaturoivalle vaikutukselle. Koska hypoplasiavaikutus on herkkä lyofilisoinnille, kun se toteutetaan vedessä, on luultavaa, että stabilaattorien tai suoja-aineiden lisääminen kokonaisuutteeseen tai johonkin erityis-fraktioon, joka sisältää tämän aktiivisuuden, ennen lyofilisointia säilyttäisi olennai- • 1 : 15 sesti aktiivisuuden.

Il1 « I « • · ·

Eluaatin aktiivisten komponenttien identifioiminen edelleen: • 1 : Aktiiviset fraktiot (testattu ZR75-1 -soluilla) saadaan esille seuraavalla molekyyli- : ’·· painoalueella, määritettynä toisentyyppisellä puhdistuksella, mutta lähtien samasta :T: permeaatista (1 kg/1) Superose-12 -kolonnissa, jonka läpimitta oli 10 mm ja pituus 20 30 cm, käyttäen edellä kuvattuja FPLC- ja Rotofor-menetelmiä. Virtausnopeudeksi . valittiin 1 ml/minuutti. Talteen saatiin 45 1 ml:n fraktiota.

• · « · « ♦ ·

Fraktiot 20-21 aktiivisuus fraktioissa, joiden molekyylipaino on

: f: 70 -120 kD

117376 22

Fraktiot 34 - 35 aktiivisuus fraktioissa* joiden molekyylipaino on

29 kD

Fraktiot 38 - 39 aktiivisuus fraktioissa, joiden molekyylipaino on 1

- 2,5 kD

Spesifisyys

Aktiivisuuden spesifisyyden määrittämiseksi kasvainsolujen suhteen ultrasuodatuk-sen jälkeen saatu permeaatti testattiin muilla mesenkyymisoluilla, ihmisen TENON-5 fibroblasteilla (HTF), jotka ovat tavallisia fibroblasteja.

B. In vitro a. Potilaat

Kahdelta potilaalta, joista toisella oli neovaskulaarinen glaukooma, NVG, ja toisella primaarinen avokulmaglaukooma (POAG) käytettiin vain HTF-soluja.

10 b. HTF-solujen alaviljely ja ylläpitäminen

Kutakin yhteenkasvavaa viljelmää pestiin ja erotettiin käyttäen 0,5 ml 0,05 % tryp- siiniä/0,5 mM EDTA:a (Gibco 610-5300 AG) 5-10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitten lisättiin 1,5 ml DME/F-12-liuosta, joka sisälsi 15 % vasikan sikiön seerumia (FBS), : trypsiini/EDTA:n neutralointi seksi.

**« ·

IM

J J » ^ '* \ 15 Solujen yhteenliittäminen suoritettiin jauhentamalla ja siirtämällä 25 cm“ T-kolvei- I * hin, joihin lisättiin vielä liuosta, joka sisälsi 10 % FBS:ä. Kun HTF-solut olivat kas- : .* vaneet yhteen, ne siirrettiin 75 cm2 T-kolveihin ja mahdollisesti 180 cm2 T-kolvei- t* : *·· hin. Kun soluja oli saatu tarpeeksi, jotkut solut käytettiin alla kuvattuihin kokeisiin V : ja toiset pakastettiin samanaikaisesti samalla tavalla käsiteltyjen solujen säilyttämi- 20 seksi myöhempiä kokeita varten.

* · · c. Koeprotokollat • · • ^ · . Kun solupesäkkeet olivat kasvaneet yhteen, toisen potilaan soluja, jotka kas voivat kahdessa tai kolmessa samanlaisessa 180 cm2 T-kolvissa, erotettiin toisistaan edellä • · kuvatulla menettelyllä. Lyhyen pienellä nopeudella suoritetun sentrifugoinnin jäi-: 25 keen ne laskettiin ZMI Coulter Counter 216013 -laskimella, joka oli varustettu 256- •: · *: Channelyzerillä.

23 117376

Kaikkia seuraavia in vitro -kokeita varten noin 50 000 solua ympättiin 1 ml:ssa DME/F-12 -liuosta, joka sisälsi 1 % FBS, kuhunkin 16 mm maljaan ja 12-kuoppai-selle levylle. Seitsemäntoista tuntia ymppäyksen jälkeen lisättiin 1 ml tuoretta samanlaista liuosta, johon oli lisätty 1 % FBS ("absoluuttiset" verrokit). Kokeen tyy-5 pistä riippuen (katso edellä ja alla) 1 % FBS-liuokseen joko lisättiin tai ei lisätty KT:tä (kasvutekijöitä) tai permeaattia 1 kg/2 1 (ruston paino/vesitilavuus) -liuoksena ja steriloitiin suodattamalla. Mainittuna päivänä (päivä 0) laskettiin myös muutamia solunäytteitä siirrostustehon määrittämiseksi (jonka pitäisi olla suurempi tai yhtä kuin 95 %).

10 Neljäkymmentäkahdeksan tuntia kokeiden aloittamisen jälkeen solut huuhdottiin ja erotettiin toisistaan edellä kuvatulla menetelmällä ja laskettiin taas. Solujen lukumäärä ilmoitettiin prosentteina "absoluuttisissa" verrokeissa saadusta lukumäärästä

Kukin "absoluuttinen" eli positiivinen verrokki, joka sisälsi 1 % tai 5 % FBS:ä, vastaavassa järjestyksessä, ja kukin koeryhmä, johon oli lisätty 1 % FBS:ä ja joka 15 sisälsi joko jotakin yksittäistä kasvutekijää tai rustopermeaattia, muodostui kolmes-tanäytteestä.

Jokainen koe tehtiin yhden tai kahden potilaan soluilla kerrallaan ja toistettiin vähintään kaksi kertaa.

. . Fibroblastien proliferaation stimulaatiota kasvutekijöiden tai rustopermeaatin vai- 20 kutuksesta verrattiin fibroblastien stimulaatioon 5 % FBS:n vaikutuksesta.

i i « * « · ·;**; Näissä kokeissa kasvutekijöitä, sian verihiutaleista johdettu kasvutekijä (pPDGF) ja ihmisen rekombinantti perusfibroblastikasvutekijä (hr bFGF) (lahjoitus tri P. Brazeaulle Farmitalia Carlo Erbalta, Milano, Italia) lisättiin 10 - 100 ng/ml pitoi-suuksina 1-prosenttisessa FBS:ssä, vastaavassa järjestyksessä. Neljänkymmenen-25 kahdeksan tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta solut dispergoitiin trypsiini-. EDTA:lla ja laskettiin Coulter-laskimella. Kaikki alla esitetyt triplikaattiarvot (ko- kumit 1, 2 ja 3) koskevat yhtä kahdettakymmenettäosaa kunkin kuopan lukemasta.

• · • « « • * « * t i o» ·* « * ♦ « » 9 «* * « · i • · * i 9 4 # 117376 24

Potilas B: Glaukooma Sukupuoli: mies Ikä: 53

HTF

Päivä -1: solujen lukumäärä/kuoppa: 46170 DME/F12 - 1 % FBS - 1 % Pen. Strep.

Päivä 0: solujen lukumäärä/kuoppa: 65214 DME/F12 - 1 % FBS - 1 % Pen. Strep.

Päivä 1: solujen lukumäärä/kuoppa: 62548 DME/F12 - 1 % FBS - 1 % Pen. Strep.

Päivä 2; solujen lukumäärä/kuoppa: DME/F12 - 1 % FBS - 1 % Pen. Strep. lukum. soluja/lukema Näyte/ 1 2 3 Keskim. SEM % verr.

levy kasvusta DME/F12

Levy nro 1 1 Päivä 0 3,0 2,8 2,8 65 214 71 FBS 1 % FBS 19 62 53 2 Päivä+1 2,7 2,9 2,6 62 548 1 655 1 % FBS 11 73 93 3 Päivä+2 2,2 2,4 2, 1 51 333 1 655 100 1% FBS 84 00 91 : e.e 4 Päivä+2 3,0 2,8 3,1 67 446 1627 131 :;i.: 5% FBS 84 34 15 ΫΫ « 1 · * ' Levy nro 2 DME/F12

: PDGF

** · : V 5 Verrokki 2,5 2,1 2,2 51 931 2,19 100 f1 : 1·· (1% FBS) 58 81 16 9 v 1 6 lng/ml 2,4 2,5 56 056 1 228 108 1 % FBS 25 80 : 7 I0ng/ml 4,0 3,9 4,2 92 116 1 648 117 • ·1 .···. 1 % FBS 80 75 82 ΫΥΥ *. 8 100ng/ml 4,6 4,3 4,4 100 285 1442 193 *···: 1 %FBS 25 56 50 ΫΫΫ «·· • · ♦ 1 * *« « • · ♦ • ♦ • 1 117376 25 Näyte/ 12 3 Keskim. SEM % verr.

levy kasvusta

Levy nro 3 DME/F12 b-FGF 9 Verrokki 2,91 2,5 2,5 59 360 2 429 100 (1% FBS) 5 33 02 10 1 ng/ml 2,74 2,5 2,7 60174 1213 101 1 % FBS 4 54 61 11 10 ng/ml 3,60 3,1 3,1 74 234 2 683 125 1 % FBS 6 43 93 12 100 ng/ml 4,06 3,0 3,0 75 585 6 307 127 1 % FBS 4 33 26

Levy nro 4 DME/F12 RUSTO 13 Verrokki 2,82 2,5 2,4 58 822 1 877 100 (lkg/21) (1%FBS) 6 66 86 (suodatettu) 14 1 μΐ/ml 2,72 2,5 2,5 58 837 936 100 1 % FBS 9 76 75 15 10/il/ml 2,64 2,4 2,5 57 643 798 98 1 % FBS 3 93 84 16 100 μΐ/ml 2,91 2,8 2,7 58 483 2 461 99 1 % FBS 8 83 66 • * • · * ΫΫ p < o,o2 t t · * ΫΫΫ P < 0,01 Määritetty Student-Fisher -kokeella

• I

*'·*. 5 Vaikka sellaisilla kasvutekijöillä kuten PDGF ja bFGF on stimuloiva vaikutus HTF- soluihin, minkäänlaista vaikutusta, sen enempää positiivista kuin negatiivistakaan, ei ]·;·. todettu, kun näitä soluja kasvatettiin rustopermeaatin läsnäollessa (1 kg/2 1). Mitään • < · hypoplasiavaikutusta ei voitu todeta. Tämä johtaa ajattelemaan, että permeaatilla on . hypoplasia- tai sytotoksinen vaikutus, joka on spesifinen kasvainsolujen suhteen il- • · · 10 man että niillä olisi osoitettavaa vaikutusta normaaleihin soluihin. Samalla rustouut- *···* teella ei ollut myöskään vaikutusta toisentyyppisiin fibroblastisoluihin, HFS (Human : Skin Fibroblasts, ihmisen ihon fibroblastit; tuloksia ei ole esitetty). Vaikka tätä ei ··· .···. olekaan tutkittu, oletetaan, että lyofilisaatilla ei myöskään ole vaikutusta • ft normaaleihin soluihin.

t · • · » 9 9 · 117376 26

Vertailu tunnetun tekniikan mukaisiin tuotteisiin

Koska me emme ole ensimmäisiä rustouutteista kovin kiinnostuneita, olemme todentaneet esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun nestemäisen hainrustouutteen ainutlaatuisuuden rinnakkaisilla vertailukokeilla käyttäen kahta 5 tuotetta, jotka on kuvattu tunnetussa tekniikassa tai johdettu siitä, nimittäin tuotteita, jotka on valmistettu Balassan (US-patentti 4 822 607) ja Oikawan et ai. (op. cit.) menetelmillä.

Oikawa et ai. kuvaavat menetelmän, jolla saadaan kaksi pääfraktiota, joista toisen molekyylien molekyylipaino on 1 - 10 kD, toisen komponenttien ollessa painavam-10 pia kuin 10 kD. He mainitsevat vain ensimmäisellä fraktiolla olevan antiangiogee-nisiä ominaisuuksia, toisella ei taas sanota olevan minkäänlaista antiangiogeenistä vaikutusta CAM-kokeessa. Oikawan tuotteiden vertailemiseksi asianmukaisesti fraktioimme nestemäisen kokonaisuutteemme kahdeksi vastaavaksi fraktioksi ja pidimme fraktion, jossa molekyylipaino oli 1-10 kD. Koska Balassa kuvaa menetel-15 mää nestemäisen kokonaisuutteen uuttamiseksi, vertasimme nestemäistä kokonais-rustouutettamme (1-500 kD) tuotteeseen, joka valmistettiin toistamalla Balassan menetelmä, jossa käytimme lähtöaineena vasikan ruston sijasta hain rustoa. Oletamme, että mikäli Balassa ja Oikawa kuvaavat vastaavanlaatuisia menetelmiä, FPLC:llä ja HPLC:llä saatujen mallien tulisi mennä olennaisesti päällekkäin ja että 20 tuotteilla olisi CAM-kokeessa samanlainen aktiivisuus kuin meidän tuotteellamme.

• * : Kaikki näytteet säädettiin lopulliseen konsentraatioon 12 pg/μΐ (kuivapaino/liuos- v * tilavuus) ennen FPLC- ja HPLC-kromatografiaa. Oikawan tuote sentrifugoitiin ja 'f*: suodatettiin ennen kromatografiaa, koska se sisälsi liukenematonta materiaalia.

«i · ♦ · t • · I. * A) FPLC-olosuhteet: Superose 12 (Pharmacia); geelipermeaatiokolonni, 25 B) HPLC-olosuhteet: CS-S-heksyyli kolonni 5 jttm, 25 x 0,94 cm, CSC nro 059-' * * * 085; käänteisf aasikolonni.

: ·*· Mainitulla kolmella menetelmällä uutetut hainrustonäytteet nimiöitiin seuraavasti ··· .···. (arvioitu kui vapaino/liuoksen tilavuus): ««« • 1) DUP on esillä olevan keksinnön mukainen valmiste, joka fraktioitiin niin, että 30 se sisälsi molekyylejä, joiden molekyylipaino on 1 - 500 kD (12 /tg/fri); .Λ 2) BAL on Balassan et ai. reseptin mukainen valmiste (12 /xg//il); : \ 3) OIK on Oikawan et ai. mukainen fraktio 3 -valmiste (270 ^g/μΐ).

• *

Kaikkien näytteiden lopulliseksi konsentraatioksi säädettiin 12 μg/μl (kuivapaino/-tilavuus) ennen analyysejä. OIK-näyte sisälsi suuren määrän liukenematonta mate- 117376 27 naalia, joka voitiin pelletoida helposti sentrifugoimalla nopeudella 13 200 rpm tai suodattamalla 0,2 μπκη kalvon läpi. Liukenemattoman materiaalin suodattaminen tai konsentroiminen oli välttämätöntä ennen FPLC:tä ja HPLC:tä (A, B).

A) Yhteenveto FPLC-tuloksista 5 Näytteet ajettiin Superose 12 (10/30) -geelipermeaatiokolonnissa käyttäen eluenttina fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta (PBS) virtausnopeudella 0,5 ml/min (piirto-nopeus 0,25 cm/min). Konsentraatioltaan säädetyistä näytteistä suodatettiin 100 μ1:η alikvootti 0,2 μιη kalvon läpi ennen injektoimista. OD280 tarkkailtiin.

Kolonni kalibroitiin seuraa villa standardeilla (MW daltoneina): katalaasi (232 000) 10 aldolaasi (158 000), albumiini (56 000), ovalbumiini (44 000), kymotrypsiini (25 700), ribonukleaasi (13 700), insuliini (5 700), insuliini B-ketju (3 500), insuliini A-ketju (2 500), basitrasiini (1 450), vitamiini B12 (1 355). Voimakkaimpien piikkien molekyylipainot laskettiin seuraavan yhtälön avulla: Log10MW = 7,52 - 0,212 x RT, jossa RT = eluaatiotilavuus ml:ina . R = 0,976. Kolonnin kokonaistilavuus (Vx) 15 oli 23,93 ml, joka määritettiin käyttäen sytidiiniä (246 D). Välisijatilavuus (V0) määritettiin 8,38 ml:ksi dekstraanisinellä (2 x 106 D).

Kuviossa 10a meidän näytteessämme DUP esiintyi ensimmäinen suuri piikki (1), joka eluoitui 18,76 ml:n kohdalla, jolloin molekyylipainoksi saatiin 3 500 D. Seu-. . raavat piikit 22,7 ml:n kohdalla (2) ja 27,3 ml:n kohdalla (3) olivat kokonaiskolon- \\Y 20 nitilavuuden (21,93 ml sytidiinillä määritettynä) ulkopuolella. Näillä piikeillä näyt- *·’ | täisi olevan jonkinlaista affiniteettia kolonnimatriisin suhteen.

«««•S ♦ » Γ·*: Kuviossa 10b Balassan näytteessä BAL esiintyi pieni piikki (1), joka eluoitui lähellä • * kolonnin välisijatilavuutta V0 (8,4 ml), piikki (2) 18,5 ml:n kohdalla (4 000 D) ja kaksi piikkiä, jotka eluoituivat Vt:n jälkeen (3) 22,6 min ja (4) 28,2 ml.

25 Kuviossa 10c Oikawan näytteessä OIK esiintyi myös pieni piikki (1) V0:n kohdalla, piikki (2) 18,9 ml:n kohdalla (3 300 D), piikki (3) 21,5 ml:n kohdalla (1 000 D) ja ί,γ pieni piikki (4) 27,3 ml:n kohdalla.

* **··* Näytteitä vertailtaessa on huomattava, että lukuunottamatta 3 300 D:n piikkiä DUP- !...: näytteen tärkeimmät juovat eivät olleet todettavissa samalla intensiteetillä muissa 30 näytteissä. OIK-näytteessä osoittautui esiintyvän pieni määrä 27,3 ml:n piikkiä.

• · BAL-näytteessä esiintyi piikki, joka migratoitui 28,2 ml:n kohdalla ja joka saattaisi korreloida yhden DUP-näytteen pienemmän piikin kanssa.

117376 28 B) Yhteenveto HPLC-tuloksista HPLC:ssä, joka suoritettiin heksyyli-käänteisfaasikolonnissa, tarkkailtiin samanaikaisesti OD210 ja OD280. 50 μΐ alikvootteja sentrifugoiduista näytteistä (kaikki konsentraatioina 12 jttg/μΐ) pakattiin kolonniin ja eluoitiin 100-prosenttisen H20:n 5 kanssa. Piikit kustakin kromatogranunista on merkitty OD210:n mukaan (eg. 1) ja OD280:tä vastaavat piikit on merkitty '(eg. 1)'. Tämän kolonnin V0 oli 5,5 ml (1,4 min).

Kuviossa 1 la DUP:ssa esiintyi 3 merkittävämpää piikkiä, jotka havaittiin OD210:llä (1, 2, 3) ja 2 pienempää piikkiä (4, 5). Kaksi sivupiikkiä todettiin piikin 1 ulkopuo-10 lella ja ne nimettiin la:ksi ja lb:ksi. Piikkeihin 1, la, Ib ja 3 liittyi merkittävää OD280 absorbanssia. Vertailussa vastaava OD280 absorptio piikin 2 kohdalla on paljon pienempi kuin OD210:ssä.

Kuviossa 1 Ib BAL:ssa esiintyi enemmän OD210-piikkejä, mutta intensiteetit olivat heikompia DUP:n piikkeihin verrattaessa. Sikäli kuin piikkien päällekkäin meno 15 voisi antaa viitettä molekyylien samankaltaisuudesta, ainoastaan piikit 3 ja 7 Balas-sa-näytteessä osoittautuivat korreloivan DUP-näytteen piikkien retentioaikojen kanssa (piikki la tai Ib ja piikki 4, vastaavassa järjestyksessä).

Kuviossa 11c OIK-uutteessa todettiin vain kolme suurempaa piikkiä (1, 2, 3). Piikit . . 1 ja 3 voisivat korreloida DUP-näytteen piikkien 1 ja 3 kanssa, mutta OIK-kromato- 20 grammissa ei todettu yhtään sivupiikkiä. Piikkien korkeudet OIK-näytteessä olivat • · “·'* | pienemmät kuin DUP:n piikkien. Vaikka FPLC- ja HPLC-kuviot ovat karakteristisia * * edustaville tuotteille, todensimme näiden kolmen tuotteen antiangiogeeniset vaiku- l V tukset CAM-kokeissa.

n « I • ·· CAM-koe: ♦ ♦ * 25 CAM-kokeet suoritettiin ensiksi käyttämällä erilaisia protamiinin konsentraatioita (37, 75 ja 150 jtg). Vettä sisältävä metyyliselluloosakiekko ja toinen protamiinia si-sältävä kiekko positiivisena verrokkina asetettiin kanan alkion korioallantoiskalvoile . (n = analysoitujen alkioiden lukumäärä). Kullekin kiekolle asetettiin O-rengas nii- !!! den paikallistamisen helpottamiseksi. Seuraavana päivänä verisuonittumisen tason T* 30 kussakin O-renkaassa arvioi kaksi tutkijaa käyttäen tavallista sokkomenetelmää. • V CAM-kokeen arviointiasteikko perustui pisteytykseen 1-2-3: (3 pistettä) normaali ·:·*: verisuonittuminen verrattuna vertailualkion vastakkaiseen horisontaaliseen neljän nekseen tai vastaavaan neljännekseen; (2 pistettä) verisuonet ulottuvat O-renkaan toiselle puolelle, mutta katoavat keskelle mentäessä. Suuria verisuonia ulottuu O- 29 1 1 7376 renkaan toiselle puolen, mutta niiden reitti on selvästi vioittunut. O-renkaan läheisyydessä olevan neljänneksen vähäisempää haaroittumista, vähäisempi verisuoni ttu-nut pinta-ala; (1 piste) ei verisuonia eikä poikkeavia verisuonia O-renkaan sisäpuolella. Verisuonia ei kasva O-renkaan toiselle puolelle paitsi jos ne kasvavat sen ohi 5 ja menevät sen toiselle puolelle. Neljänneksen verisuonittunut alue vähenee selvästi O-renkaan lähellä. Kuviossa 12 kunkin pylvään yläpuolella oleva arvo osoittaa kunkin näytteen loppupisteet. Samalle alkiolle asetetun kahden kiekon välisten erojen merkittävyyden vertailemiseen käytettiin Wilcoxonin tilastotestiä. Odotetusti todettiin annoksesta riippuva vastesuhde.

10 DUP-uutteen fraktiot, joiden molekyylipainot olivat alle 10 kD tai yli 10 kD, tutkittiin samoissa olosuhteissa. Niiden osoitettiin estävän yhtä tehokkaasti (kuvio 13) verisuonien uudiskasvua.

Meidän kokonaisuutettamme DUP verrattiin Balassan menetelmällä valmistettuun tuotteeseen BAL. Balassan tuotteessa ei havaittu merkittävää antiangiogeenistä ak-15 tiivisuutta (kuvio 14).

DUP-raakauutetta verrattiin Oikawan tuotteen OIK fraktioon 3. DUP ja OIK olivat lähes samankaltaisia (kuvio 15). Oikawa et ai. poikkesivat kuitenkin esillä olevasta keksinnöstä, sillä he mainitsivat, että fraktiossa, jossa molekyylipaino oli suurempi kuin 10 kD, ei ollut todettavissa mitään aktiivisuutta, mikä on ristiriidassa meidän : . 20 tulostemme kanssa, jotka esitetään kuviossa 13.

**« * • · · *** \ Sen vuoksi huolimatta Balassan ja meidän menetelmän samankaltaisuuksista mo- * * lemmilla menetelmillä saadut tuotteet eivät selvästikään ole samoja.

• * * · ;‘*it Nämä kaksi tunnetun tekniikan mukaista tuotetta, joita olemme verranneet omiim- me, katsotaan yhä klassisiksi menetelmiksi rustouutteiden valmistuksessa. Edellä 25 kuvatut tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan tuot- i e teitä, joilla on odottamattoman hyvä aktiivisuus koskien antiangiogeenistä aktiivini; suutta. Koska muut vaikutukset todennetaan tuonnempana, voimme olettaa, että • · keksinnön mukaisessa menetelmässä on todellakin onnistuttu ottamaan talteen pal- :βΓ: jon vesiliukoisia aktiivisia komponentteja yhdessä ja samassa uutteessa.

·* « % * 'V 30 Kliiniset kokeet ·· e • « · • 4 • 4

Ennen ryhtymistä alustaviin kliinisiin kokeisiin ultrasuodatuksesta saatu raakaper-meaatti väkevöitiin 2-20 -kertaiseksi, jolloin saatiin rikastettu aktiivinen permeaatti. Nämä väkevyystasot saatiin aikaan tangentiaalivirtaussuodatuskolonnissa, jonka 117376 30 huokoisuus oli 1 000 daltonia, mikä pienensi eluaatin tilavuuden puoleen - kahdeskymmenesosaan. Väkevöity permeaatti suodatettiin milliporesuodattimella, jonka huokoskoko oli 0,22 /im. Kun rusto prosessoitiin vaihtoehtoisella sentrifugointi-menetelmällä (käyttäen CEPA-sentrifugia, jossa kalvon huokoisuus oli 30 μΜ), 5 kymmenkertaiseksi väkevöimällä saatiin konsentroitu uute, jossa proteiinitaso oli lähes sama kuin yli 20-kertaiseksi väkevöidyssä uutteessa, esimerkiksi noin 8-12 mg/ml (laboratoriomittakaava). Steriili 10 x väkevöity permeaatti jaettiin 7 ml:n alikvootteina (noin 85 mg proteiineja) steriileihin pulloihin, pakastettiin -80 °C:ssa yön yli ja varastoitiin sitten -20 °C:seen käyttöön asti. Suurin ero raakapermeaatin ja 10 konsentroidun permeaatin välillä on niiden proteiinipitoisuudessa. Huomattakoon, että menetelmä, jota käytetään proteiinipitoisuuden mittaamiseen, mittaa kokonais-typpiyhdisteet eikä ainoastaan proteiineja (Kjeldalhin menetelmä). Tämä saattaa selittää sen, miksi proteiinipitoisuus ei kasva suhteessa tilavuuden konsentraatiota-son kanssa, kuten tavallisesti tapahtuu, kun proteiinipitoisuus määritetään Lowryn 15 menetelmällä. Konsentraatiovaiheessa arvellaankin mukaan pääsevän vettä ja pienen molekyylipainon omaavia typpiyhdisteitä.

Antiangiogeemnen vaikutus

Konsentroitua permeaattia käytettiin angiogeneesistä riippuvaisten tautien hoitamiseen. Permeaattia kokeiltiin kolmentyyppisiin angiogeneesistä riippuvaisiin tauteihin 20 käytännössä ihmisissä; ensimmäinen tyyppi oli syöpä (eturauhassyöpä), toisena : tyyppinä olivat ihotaudit (psoriasis) ja kolmantena tyyppinä artriitti. Alla esitettävät M* : esimerkit kuvaavat ja osoittavat ainakin nestemäisen uutteen antiangiogeenisen ak- *:*·: tii visuuden.

• t i • « « * · ' Ihotaudeista valittiin psoriasistapauksia. Testatuista psoriasistapauksista kannattaa 25 panna merkille psoriasistapauksien, joihin liittyy komplikaatioina hyperkeratoosia, ‘ ja tapauksien, joissa ei ole komplikaatioita, eroavuudet. Keratoosikomponentti tar koittaa sarveisvaipan muodostumista plakkien muodossa. Sellainen plakki on fyysi-nen sulku, joka hankaloittaa aktiivisten aineosien tehokasta tunkeutumista verisuon- ·#· ien suhteen.

t « i I”* 30 Eräs potilas, joka sairasti eturauhasyöpää, kokeili vapaaehtoisesti 10-kertaiseksi vä- *···’ kevöityä rustopermeaattia. Tämä potilas kävi läpi sarjan peräkkäisiä konventionaa- lisiä hoitoja, jotka auttoivat väliaikaisesti. Hän ryhtyi äskettäin nauttimaan rustouu-•...: tetta sen jälkeen kun hänen syöpänsä osoitti uusiutumisen merkkejä.

31

Toiset vapaaehtoiset sairastivat artriittia ja olivat aikaisemmin saaneet lääkitystä (prednisonia) tai eivät olleet vielä aloittaneet väkevöidyn rustouutteen nauttimista. Heidän tilanteensa parani, minkä osoitti nivelten kivun ja jäykkyyden väheneminen.

Tässä tuonnempana esitetyt tulokset ovat erittäin rohkaisevia ja niiden katsotaan en-5 nustavan raakapermeaatin ja sen fraktioiden käyttökelpoisuutta kaikkien angioge-neesistä riippuvien tautien eikä ainoastaan erityisesti kokeiltujen tautien hoidossa. Mikäli tautiin liittyy angiogeeninen komponentti, esillä olevan keksinnön mukaisen rustouutteen katsotaan olevan tehokas tässä suhteessa edellyttäen, että se sisältyy koostumukseen, joka on sopivassa muodossa oikeata antoa varten. Onkin selvää, 10 että esillä oleva keksintö ei rajoitu seuraaviin erityiskoostumuksiin, jotka ovat tarkoitetut käytettäviksi angiogeenisten sairauksien hoidossa, koska alaan perehtynyt pystyisi helposti johtamaan lukuisia koostumuksia, joiden valintaa ohjaa koostumuksen antotapa ja kohteena oleva sairas kudos. Koostumuksia voidaan antaa eri tavoin, esimerkiksi paikallisesti, suun kautta, kielen alle, rektaalisesti, laskimonsisäi-15 sesti, lihaksen sisään, infuusiona, jne.

Koska rustouute maistuu ja tuoksuu kalalta, koostumuksiin voidaan lisätä maunpa-rannusaineita tai hajunparannusaineita potilasmyöntyvyyden lisäämiseksi.

Psoriasis ; Valmistettiin seuraava dermatologinen koostumus ja sen tehokkuus yritettiin toden- • · · [II,* 20 taa psoriasista sairastavissa potilaissa: • · · « ·ί,βϊ - EMULGADE™ CLB 29 % (w/w) V\: - 20 x raakapermeaatti 69,5 % (w/w) - GERMABEN™II 1% (w/w) ja - Lavandula Angustifolia 0,5 % (w/w).

25 EMULGADE™ CLB:tä, stearaattiestereiden, rasva-alkoholien ja ei-ionisten emul oi.* gaattoreiden seosta (ostettiin Henkel Canada Ltd:ltä) kuumennettiin 65-70 °C:ssa ··· sekoittaen. Kuumennus lopetettiin, mutta seosta sekoitettiin edelleen. Kun seoksen * * .·. lämpötila oli laskenut 45 °C:seen, siihen lisättiin eteeristä öljyä Lavandula Augusti- ··· .···. folia ja säilöntäaineita GERMABEN™II (diatsonidyyliurea 30 %, metyyliparabeeni 30 11%, propyyliparabeeni 3 % ja propyleeniglykoli 56 %; ostettiin Sutton Laborato- ϊ V liesiltä, NJ, USA). Kun seoksen lämpötila oli laskenut 30 °C:seen, lisättiin rusto- *·'*· uute. Näin valmistettu koostumus oli sileä ei-rasvainen emulsiovoide; vaihtelemalla EMULGADE™ :n prosenttiosuutta voidaan valmistaa muunlaisia viskositeetiltaan vaihtelevia dermatologisia koostumuksia valmistajan ohjeita noudattaen (maito, 117376 32 liuos, voide). Pastan, geelin ja minkä tahansa muun muotoisen transdermaalisesti käytettävän valmisteen aikaansaamiseksi voidaan käyttää muita kantaja-aineita tai täyteaineita.

Edellä kuvattua valmistetta annettiin kaksi kertaa päivässä kahdentoista viikon ajan 5 9 potilaan ryhmälle (levitettiin paikallisesti), joka sairasti psoriasista, johon kokeillut konventionaaliset hoidot olivat tehonneet, mutta joka oli käynyt jonkin ajan kuluttua vaikeasti käsiteltäväksi. Tähän tutkimukseen valittiin potilaita, joilla esiintyi psoriasista samassa laajuudesssa ja symmetrisesti molemman puolen jäsenissä. Nämä kokeet suoritettiin kaksoissokkotutkimuksina, jolloin sen enempää ihotautilääkäri kuin 10 potilaatkaan eivät tienneet, kumpaa puolta hoidettiin rastouutetta sisältävällä seoksella ja kumpaa vertailuseoksella. Huomattavaa paranemista todettiin viidellä potilaalla, joiden psoriasikseen ei liittynyt hyperkeratoosia; niillä, joilla esiintyi hyper-keratoosia, tulokset olivat kohtalaisen hyviä. Kuviot 9a ja 9b ovat valokuvia kahden potilaan kehon osista. Kuviosta 9a nähdään, että potilaalla, joka sairasti psoriasista, 15 johon liittyi hyperkeratoosia, ihottuma väheni kuitenkin erittäin merkittävästi eikä siihen liittynyt kutinaa, pelkästään yhden kuukauden hoidon jälkeen. Hyperkeera-toosi pysyi kuitenkin huomattavana. Valokuvat toisesta potilaasta, joka sairasti psoriasista, johon ei liittynyt hyperkeratoosia (kuvio 9b), osoittavat paljon huomattavampaa paranemista kolmen kuukauden hoidon jälkeen. Koska psoriasis näyttää 20 olevan monitekijäinen sairaus, oletetaan, että potilaiden vaste riippuu sellaisten : komponenttien kuten angiogeneesin mukanaolon voimakkuudesta tämän taudin * » · vakiintumisessa ja jatkumisessa. Antiangiogeeninen aktiivisuus on todellakin läsnä • · · ·' [ meidän uutteessamme, kuten osoittavat DMBArlla hoidetut rotat ja CAM-kokeet.

' ' Tulehduksenvastainen vaikutus todennettiin myös (käsitellään tuonnempana). On i .* 25 luultavaa, että parempia tuloksia voitaisiin saada, jos tällaista valmistetta täydennet- : ’·· täisiin muilla terapeuttisilla aineilla, jotka kohdistuvat muihin tautiin liittyviin teki- v : joihin (keratolyyttisiä aineita, muita anti-inflammatorisia aineita, antihistamiineja, immunosuppressoreja, jne.).

• · · Tämä täydentäminen voidaan toteuttaa muuttamalla formulaatiota niin, että se sisäl- • * ·;·* 30 tää esimerkiksi tehokkaan määrän jotakin keratolyyttistä ainetta. Se voitaisiin toteut- taa myös antamalla erikseen jotakin sellaista täydentävää terapeuttista ainetta, sa-manaikaisesti tai vuorotellen keksinnön mukaisen paikallisesti käytettävän valmis-teen kanssa. Täydentävää lääkitystä ei tarvitse myöskään käyttää samaa antotapaa * \ noudattaen. Edellä kuvatulla formulaatiolla ei ole minkäänlaista systeemistä vaiku- 35 tusta (vaikutus rajoittuu hoidetulle alueelle) eikä sivuvaikutuksia rustouutteen suurista määristä huolimatta.

33 117376

Syöpä

Eräs eturauhassyöpää sairastava potilas kokeili 10-kertaiseksi väkevöityä permeaat-tia. Adenokarsinooma diagnosoitiin vuonna 1986.Tuolloin aloitettiin sädehoito. Vuonna 1991 PSA-taso (Prostatic serum antigen; eturauhasen seerumin antigeeni) 5 oli 138 jug/1, kun normaalin hyväksyttävän arvon yläraja on 4 /tg/1. Tällöin potilasta hoidettiin aivan eri tavalla suorittamalla kastraatio, johon liitettiin antiandrogeeni-hoito (EUFLEX™). Tämä hoito tehosi kolme vuotta, minkä jälkeen PSA-taso alkoi taas nousta. Kesäkuusta 1994 lähtien tämä potilas on nauttinut 10X permeaattia (vuorokausiannos kielen alle noin 75 mg proteiineja/7 ml uutetta, mikä vastaa noin 10 1-1,5 mg/painokilo/vrk). Vaikka tästä annoksesta merkittävä määrä tulee niellyksi, se luultavasti absorboituu maha-suolikanavassa huomattavina määrinä, mikäli luotetaan tuloksiin, jotka saatiin DMBA-käsitellyistä eläimistä (katso edellä). PSA-taso aleni vähitellen 12 /ig:sta 0,9 /tg:aan/l, eli reilusti normaalin PSA-tason rajoihin (viimeiset tulokset saatu toukokuussa 1995). Tätä annostelua voidaan myös muuttaa 15 halun mukaan antotavasta, aktiivisten aineosien biologisesta hyötyosuudesta ja toivotusta aggressiivisuudesta, jolla tautia on määrä hallita, riippuen. Tähän mennessä myrkyttömyys on todennettu rotissa (katso edellä olevat esimerkit) ja ihmisissä (tuloksia ei esitetty).

Toisessa in vivo -kokeessa, joka suoritettiin DMBA:lla käsitellyillä rotilla, nestemäi- 20 sen uutteen annos oli noin 190-220 mg proteiineja/painokilo, mikä oletettavasti auttoi kovasti syövän verisuonialueen pienenemisessä (55 %, kun siihen yhdistettiin :T; paljon suuremmat määrät lyofilisaatin proteiineja). Sen vuoksi oletetaan, että annos •: · · * noin 0,1-200 mg/painokilo/vuorokausi on jokseenkin järkevä keskimääräinen annos (ED50) hoidettaessa syöpää, sen vähentäessä ainakin osaksi verisuonten uudis- :·/ 25 muodostusta tai estäessä sen.

» ·· : Artriitti . Artriittia sairastavat potilaat ovat kokeilleet vapaaehtoisesti yhtä tai kahta yksikköä 7 ml:n nestemäistä kokonaisuutetta per päivä useiden kuukausien ajan. Nämä poti- m · *" laat totesivat tilansa parantuneen vähitellen, minkä osoitti niveltoimintojen palau- 30 Uiminen, kivun ja tulehduksen väheneminen (jopa noin 60 %). Koska artriittiin si- • · ♦ 5.„5 sältyy angiogeenisiä ja tulehduksellisia komponentteja, edellä mainittu vaikutus ;·’/. voidaan katsoa rustouutteen antiangiogeenisen ja anti-inflammatorisen aktiivisuuden ansioksi.

• i 117376 34

Ei-antiangiogeeninen vaikutus Akne:

Vaikka akne ei keksijöiden tiedon mukaan kuulukaan sairauksiin tai tiloihin, joihin sisältyy angiogeeninen komponentti, oli kuitenkin houkuttelevaa testata nestemäistä 5 rustouutetta tätä tautia sairastaviin potilaisiin. Rustouutteen kokeilemiseksi aknea sairastaviin potilaisiin valmistettiin seuraava geelivalmiste: CARBOPOL™ 1,2 %

Puhdistettua vettä 77,2 %

NaOH 0,3 % 10 PHENOXETOL™ 0,3 % TWEEN 80™ 0,3 % 2 X rustouutetta 20,0 % 40 X aaloeuutetta 0,5 %.

2 X rustouute sisältää proteiineja 9-12 mg/ml. Tämä valmiste näyttää parantavan 15 huomattavasti ihon ulkonäköä potilailla, jotka sairastavat enemmän tai vähemmän vakavia aknen muotoja (inflammatorinen akne ja kystinen akne; tuloksia ei esitetty).

Nämä tulokset saattavat johtua antiangiogeenisestä vaikutuksesta (osoittaen siten angiogeenisen komponentin olevan mukana aknessa) tai sitten ne saattavat johtua * * : aktiivisista aineosista, joilla on jokin muu kuin antiangiogeeninen vaikutus (esimer- : T: 20 kiksi tulehduksenvastainen vaikutus, katso edellä).

9 :.e.e Kaikki nämä edellä esitellyissä kliinisissä kokeissa saadut tulokset osoittavat neste- * maisen rustouutteen suuren potentiaalin angiogeneesistä riippuvaisten ja/tai tuleh- dussairauksien hoidossa. Rustouutteen määrää samoin kuin sitä sisältävää formulaa- 9 9 9 *·* * tiota voidaan muutella halun mukaan kysymyksessä olevien tarpeiden tyydyttämi- 25 seksi.

9 9 9 9 9 9 9 9 99 .**·. Huomattakoon, että proteiinipitoisuuden pohjalta paikallisesti käytettävät ja muut seokset voivat sisältää kovin erilaisia annoksia rustouutetta. Kolmessa testatussa erityistapausryhmässä käytettiin kovin erilaisia annoksia ja/tai formulaatioita. Kaik- * * * kien mahdollisten sovellusten osalta (silmätipoista ihotauti- ja syöpälääkeformulaa-:v. 30 tioihin) oletetaan, että nestemäisen kokonaisuutteen pienin lopullinen proteiinikon- sentraatio voisi olla hyvin pieni (alkaen noin 0,1 mg:sta/ml). Tämä pieni annostaso riippuu aktiivisten aineosien pääsystä ja permeaatiosta vaikutuskohtaan samoin kuin näiden aineosien tehokkaasta sieppauksesta ja kudoksen herkkyydestä tai vasteesta Λ 117376 35 angiogeneesin estäjiä kohtaan. Eräisiin sovelluksiin tarkoitettujen valmisteiden lopullisen proteiinipitoisuuden ylärajaa ei tällä hetkellä tunneta. Suurimmat kokeillut loppukonsentraatiot olivat proteiinien osalta noin 9 mg/ml psoriasiksen hoitoon tarkoitetuissa valmisteissa ja noin 12 mg/ml 7 ml:n yksikköannoksessa, joka annet-5 tiin eturauhassyöpätapauksessa.

Kuten edellä mainittiin, nestemäinen hainrustouute saattaa menettää jonkin verran aktiivisuudestaan, kun se lyofilisoidaan vesiliuoksessa. Alalla tunnettujen stabilaat-torien tai suoja-aineiden lisääminen ennen lyofilisointia saattaa kuitenkin säilyttää herkkiä aktiivisuuksia ja tehdä mahdolliseksi suurempien rustouuteannosten anta-10 misen kuivassa muodossa.

Rustouute proteiinikinaasi-C (PKC)-välitteisten tapahtumien antagonistina

Viimeaikaiset julkaisut ovat osoittaneet, että PKC:n aktivoituminen saa normaalit keratinosyytit tuottamaan suurempia määriä interleukiini-8:a (IL-8), erästä tulehduksen välittäjää [Chabot-Fletcher et ai (1994) J. Invest. Dermatol. 103:509-515]. Li-15 säksi psoriaattiset keratinosyytit tuottavat hyvin suuria määriä IL-8:a, joka edelleen lisää verisuonien uudelleenmuodostumista psoriasisplakeissa [Nickoloff et aL (1994) Am. J. Pathol. 144: 820-828]. Koska rustouute on osoittautunut erittäin lu-paavaksi psoriasiksen hoidossa, sen vaikutusta on testattu keratinosyyteissä, joissa PKC on aktivoitu triforboliasetaatilla (TPA), eräällä tunnetulla tämän solutransduk- f 20 tioreitin agonistilla.

• 1« · ··· *·1 | Kuvio 16 osoittaa, että TPA lisäsi 5-kertaisesti keratinosyyttien erilaistumistasoa.

] ' Hainrustolla itsellään ei ollut mitään vaikutusta sarveiskuorettuman muodostukseen.

: / Kuitenkin hainrustouutteen lisääminen esti TPA-indusoitua sarveiskuorettuman : 1·· muodostumista yli 60 %:lla. Emme tiedä, matkiiko TPA-induktio psoriaattisia kera- v : 25 tinosyyttejä. Jos näin on, nämä tulokset johtavat ajattelemaan, että rustolla ei ehkä ole mitään vaikutusta normaaleihin keratinosyytteihin in vivo, mutta sen sijaan se : saattaa vaikuttaa psoriaattisiin (tai aktivoituihin) keratinosyytteihin. IL-8:n tuotan- ·"·. non estäminen TPA-aktivoiduissa keratinosyyteissä samoin kuin psoriaattisissa pla- \ keissa tai keratinosyyteissä rustouutteella jää todennettavaksi. Alentunut IL-8 -taso • · » 30 olisi arvokas vahvistus tämän uutteen anti-inflammatorisista ja antiangiogeenisistä \: vaikutuksista.

·· 1 ♦ « · ♦ » * · 117376 36

Anti-inflammatorinen aktiivisuus on erillään antiangiogeenisestä aktiivisuudesta hainrustouutteessa

Koska angiogeneesiin liittyy usein tulehdus monissa sairauksissa, saattaisi olla mielenkiintoista osoittaa kukin aktiivisuus erikseen rustouutteessa. Tässä tarkoituksessa 5 valittiin ihonärsytysmalli, jossa angiogeneesiä ei epäilty esiintyvän, uutteen anti-inflammatorisen ja lievittävän vaikutuksen testaamiseksi. Tutkimukseen valittiin yhdeksän henkilöä, joiden iho oli herkkä Perunbalsamille. Koeyhdisteet olivat seu-raavat: 1. IX hainrusto 50 % D-MEM-liuoksessa 10 2. IX hainrusto 20 % D-MEM-liuoksessa 3. IX hainrusto 10 % D-MEM-liuoksessa 4. Cola nitida (Indena) 10 % vesi:alkoholi 1:1.

Neljää koeyhdistettä levitettiin koehenkilöiden kyynärvarren sisäsivulle. Aineen annettiin absorboitua kaksikymmentä minuuttia ja sitten Perunbalsamia, erästä ärsyttä-15 vää ainetta, levitettiin koekohtiin. Ihoärsytys mitattiin ihon punoituksen lisääntymisenä. Punoitusaste mitattiin Minolta Chromameter -laitteella ja sitä verrattiin positiivisiin ja negatiivisiin verrokkeihin. Positiivisena verrokkina oli pelkästään Perun-balsamilla käsitellyn ihon väri ja negatiivisena verrokkina oli ihon kohta, joka käsiteltiin Cola-liuoksella ja testattiin kuten koetuotteet. Tilastollinen merkittävyys las- ; 20 kettiin kaksisuuntaisella T-testillä. Kuvio 17 osoittaa, että Cola nitidalla 10-prosent- * * * tisena oli 70 %:n aktiivisuus. Hainruston vaikutus ärsytystä lieventävänä oli 58 % ja ! 60 % 20 %:n ja 10 %:n konsentraatioina, vastaavassa järjestyksessä. Annosvastevai- e‘ kutusta ei ollut. Nämä tulokset johtavat ajattelemaan, että rustouutteella on anti-in- ·* flammatorinen ja lievittävä vaikutus, joka on erillään antiangiogeenisestä vaikutuk- : "·· 25 sesta.

♦ · · 9 9 9 9 9 9 9

Antikollagenolyyttinen aktiivisuus * HPLC-kromatografia • · · • ♦ ♦ * * *. 980 ml:n näyte nestemäisestä uutteesta (DUP) suodatettiin kalvon, jonka cut-off-ar- vo oli 10 kD, läpi tangentiaalivirtausultrasuodatusyksikössä (PELLICON™, Milli-*···* 30 pore). Yksikkö huuhdottiin ensiksi 1 litralla H20:ta. Lopulliset saannot olivat 480 ΓΛ ml >10 kD fraktiota ja 1,8 1 <10 kD fraktiota. <10 kD fraktio konsentroitiin haihdut- ·;··· tamalla sormijäähdyttimellä 180 ml:ksi (<10-10X). Kahdeksan kertaa 100 μ1:η ali- kvoottia fraktiosta <10-10X syötettiin CDC-S heksyyli, 5μπι HPLC-kolonniin (25 x 0,95 cm) ja eluoitiin ensin 100-prosenttisella H20:lla nopeudella 4 ml/min; sitten 117376 37 virtausnopeudella 8,5 ml/min 100-prosenttisella MeOH:lla. OD214-piikkiä vastaavat fraktiot otettiin talteen.

Koottiin viisi fraktiota (kuvio 18): Fri, Fr2, Fr3, Fr4 ja Fr5. Kolme ensimmäistä fraktiota sisältävät vähintään yhden merkittävän piikin.

5 Kollaeenaasikokeet

Kollagenaasikokeet suoritettiin näillä näytteillä käyttäen rekombinaatiotekniikalla valmistettua ihmisen ihokollagenaasia, tyyppiä 1(MMP1) ja fluorogeenista peptidi-substraattia (koe 1) ja kollageenisubstraattia (koe 2).

Koe 1 10 Tätä koetta kuvaavat Knight et ai. (1992) julkaisussa FEBS Let. 296, 263-266. Menetelmässä käytetään fluorogeenista peptidisubstraattia (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH2), joka matkii metalloproteinaasien aktiivista kohtaa. Tässä substraatissa on fluoresoiva ryhmä (Mca) toisessa päässä ja fluoresenssin sammuttava ryhmä (Dpa) toisessa päässä. Koskemattomassa substraatissa sammuttava ryhmä peittää te-15 hokkaasti fluoresenssin. Substraatin entsyymillä pilkkomisen jälkeen fluoresenssi lisääntyy koeputkessa.

Kollagenaasiaktivointia kuvaavat Weingarten et ai. (1985) julkaisussa Biochemistry : 24, 6730. 1 ^g laimennettiin 100 plrksi käyttäen 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, *·· · pH 7,5, 1 μΐ trypsiinin liuosta, jonka konsentraatio oli 10 mg/ml (1 mM:ssa HC1) li- * 20 sättiin ja seosta inkuboitiin 15 minuuttia 20 °C:ssa. Aktivointi lopetettiin lisäämällä V. 10 μΐ soijapaputrypsiini-inhibiittoria (SBTI), 5 mg/ml). Kuhunkin mikrokyvettiin !. ‘ lisättiin: * · • «* • V ·* - 25 tai 50 μΐ inhibiittoria (täydennettiin 50 ^l:ksi H2:lla); - 40 μΐ 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,5; : 25 - 8 μΐ aktivoitua kollagenaasia (lopullinen määrä 67 ng); ja ·**·. - 2 μΐ substraattia (1 mM varastoliuosta DMSO:ssa, lopullinen 20μΜ).

:jj: Fluoresenssin rekisteröinti λ6Χ = 328 nm, Xem = 393 nm.

•

Tulokset osoittavat, että Fri on aktiivisin fraktio kollagenaasin estämisessä (kuvio : V 19). Kaikissa muissa fraktioissa aktiivisuus on heikompaa. Kun hainrustouutetta 30 (EC50 noin 10 - 20 μg/ml) testattiin sammakonpoikasen selkärankakollagenaasiin, se inhiboi merkittävästi tätä entsyymiä.

117376 38

Koe 2 Tätä koetta kuvaavat Welgus et ai. (1979) julkaisussa JBC 256, 9511-9516. Menetelmässä käytetään SDS-PAGE:tä tyypin 1 kollagenaasilla (MMP1) pilkkomisen tutkimiseen. Kollagenaasi tyyppi 1 leikkaa natiivikollageenimolekyylin yhdestä 5 kohdasta, jolloin muodostuu kaksi fraktiota, joiden koot ovat 75 % ja 25 % lähtö-kollageenista. Usean tunnin pilkkomisen jälkeen reaktiota tarkkaillaan erottamalla tuotteet substraatista SDS-PAGE:llä. Pilkkoutuneen ja pilkkoutumattoman kollageenin suhde määritetään silmämääräisesti, kun geelit on värjätty Coomassie-sinellä (tai hopeavärillä).

10 21 ng aktivoitua kollagenaasia (katso koe 1) lisättiin 5 jig:aan vasikan ihon kolla geenia (Worthington) +/- inhibiittori lopulliseen 20 μΐ tilavuuteen. Reaktioseoksia inkuboitiin 16 tuntia 35 °C:ssa, sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä SDS-PAGE -näyte ja 40 mM EDTA:a, keitettiin ja pantiin 8-prosenttiselle geelille.

Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

Näyte Kollageenin Kollageenipalasten värjäytyminen värjäytyminen

Pelkkä kollageeni (K) ++++ K + ents. + +++ • * K + ents. + EDTA ++++

• > I

K + ents. + DUP + ++ • 1 » *·* 1 K + ents. + Fri ++++ K + ents, + Fr2 +++ + ·· · : K + ents. + Fr3 +++ + S *** K + ents. + Fr4 +++ + :T: K + ents. + Fr5 +++ + K + ents. + >10 kD + +++ . 15 • « · ^ «·« ;*·*. EDTA 40 mM:isena inhiboi kollagenaasia. Nestemäisellä kokonaisuutteella DUP oli • · » ·, heikko antikollagenolyyttinen aktiivisuus. Fraktiot 1-5 olivat aktiivisia; aktiivisin « · « '··1 oli fraktio 1. Fraktio, jonka molekyylipaino oli suurempi kuin 10 kD, ei osoittanut :: merkittävää estoaktii visuutta.

»» · * * i : \ 20 Kosmeettisia sovelluksia ja koostumuksia • *

Edellä kuvatut testit ja kokeilut ovat osoittaneet, että tämän keksinnön mukaista rustouutetta voidaan käyttää moniin lääketieteellisiin sovelluksiin. Tässä uutteessa 117376 39 todetuista erilaisista aktiivisuuksista antikollagenolyyttinen, anti-inflammatorinen ja estävä vaikutus PKC-indusoituun differentioitumiseen ovat erityisen suotavia kosmetiikan sovelluksissa. Koska esillä olevan keksinnön mukaisella rustouutteella on osoittautunut olevan antagonistinen vaikutus PKC-välitteisiin solutapahtumiin ja 5 koska sellaista antagonistista vaikutusta ehdotetaan tunnetussa tekniikassa ihoesteen korjausfunktiota parantavaksi vaikutukseksi, keksinnön alaan sisältyy menetelmä ihoesteen korjaustoiminnan parantamiseksi nisäkkäiden ihossa, jossa menetelmässä ihoon levitetään koostumusta, joka sisältää rustouutetta ja jotakin farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa, sekä tällainen koostumus. Muunlaisia tai samanlaisia koos-10 tumuksia voidaan myös ajatella käytettäväksi menetelmässä ihon lievittämiseen tai tulehduksen vähentämiseen nisäkkään ihossa. Tulehdusta voivat aiheuttaa eri aineet, kuten esimerkiksi kemiallisesti ärsyttävät aineet, fyysinen hankaus ja altistuminen ultraviolettisäteilylle. Keksintö koskee myös koostumuksia ja menetelmiä kollage-naasin estämiseksi ihossa. Kollagenaasi ja tulehdus liittyvät ihon ennenaikaiseen 15 vanhenemiseen (kollageeni hajoaa) ja sen vuoksi rustouutteessa todetut antagonistiset vaikutukset voisivat olla mukana koostumuksissa ja menetelmissä ennenaikaisen vanhenemisen hidastamiseksi ja ryppyjen tai atrofian säätelemiseksi nisäkkäiden ihossa. Ryppyjen ja atrofian aiheuttajiksi luetellaan esimerkiksi ikä, altistuminen ultraviolettisäteille tai ympäristön saasteille. Paikallisesti käytettävät koostumukset 20 voivat sisältää tehokkaan määrän hainrustoa, joka määritetään kunkin sovelluksen mukaan. Yleensä nämä koostumukset voivat sisältää noin 0,1 - noin 75 painopro-: senttiä nestemäistä IX - 2X rustouutetta ja noin 50 - 99,9 painoprosenttia jotakin farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa. Nämä koostumukset voivat sisältää jotakin • · « antioksidanttia, kuten esimerkiksi ainetta, joka estää lipidiperoksidien muodostumi- ... 25 sen ihossa. Esimerkkejä sellaisista andoksidanteista ovat tokoferoli, tokoferolijoh- « « · 1 dokset, askorbiinihappo, askorbiinihappojohdokset ja BHT. Koostumuksia voidaan • * 2 I* täydentää anti-inflammatorisilla aineilla, kuten fosfolipaasi A2:n estäjillä, tai kas- ν’ : veistä johdetuilla ärsytystä lieventävillä cola- ja vihreä tee -uutteilla. Paikallisesti käytettävät koostumukset voivat olla eri muodoissa, kuten liuoksina, suspensioina, 30 vesinä, tinktuuroina, geeleinä, emulsiovoiteina, suihkeina, emulsioina, puikkoina, voiteina tai liposomeina (ainakin osa nestemäisestä rustouutteesta on läsnä liposo-\ meissä).

i « « ' 1 « « »«« * * · !,„! Loppupäätelmä • φ · * * « 2 ·* Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on osoitettu sellaiseksi, että sillä voi- : : 35 daan tuottaa lääkettä valmistettaessa käytettäväksi rustouutteita, joilla on suuri kliininen arvo. Tällä menetelmällä tuotetuilla hainrustouutteilla on monia vaiku- 117376 40 tuksia, jotka saadaan talteen hyvinä saantoina, Rustouutteet, erityisesti nestemäinen uute ja sen fraktiot, ovat erittäin tehokkaita, koska ne eivät ole myrkyllisiä normaaleille soluille, mutta tehoavat monenlaisissa taudeissa tai tiloissa.

Tarvittava materiaali 5 - Jäähdyttimiä - Kirurgisia välineitä - Lihamylly - Muovipusseja - Teollisuussekoitin (Fisher Scientificilta ostettu kolminopeuksinen Waring-sekoi-10 tin) - Vedenpuhdistusjärjestelmä (käänteisosmoosi ja 0,1 μιη suodatus; Continental Water System, malli PRE 2202, sarjanumero 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing System, joka ostettiin Fisher Scientificilta, Montreal, Quebec). Tällä systeemillä saadaan korkealaatuista pyrogeenitonta vettä.

15 - Tarkkuus vaaka Mettler, sarja AE, joka ostettiin Fisher Scientificilta.

- Sentrifugi Sorvali RC-285, joka ostettiin DuPontilta, Kanada

- Sentrifugi CEPA

- Nylonpussi, jonka huokoisuus on 30 μΜ - Autoklaavi (automaattinen veden sterilointilaite Sanyo, malli MAC 350P) 20 - Nalgene 500 ml säiliöitä, steriloidaan 132 °C:ssa 10 minuuttia ja kuivataan 35 mi- : nuuttia V : - Kartiomaisia suodattimia, huokoisuus 24 μην, Whatman Reeve Angel ·"·: - Ultrasuodatuskolonni (molekyylipainon cut-off -arvo: 500 kD ja 1 kD tarvittaessa: ΓΛ pinta-ala: 25 neliöjalkaa (2,3 m2 ): virtaus: 130 1/min; syöttöpaine: 30 psi (206,8 25 kPa); ulostulopaine: 5 psi (34,5 kPa); ostettiin firmalta Koch Membrane Systems Inc., Wilmington, Ma, USA) - Saniteettisentrifugipumppu (Monarch Industries, malli ACE-S100, tyyppi A) . 130 l:n/min virtauksen aikaansaamiseksi • · V.l - Steriili kupu (laminaarivirtauskupu NuAire, ostettu Ingram & Selliltä) "···* 30 - Millipack-60 0,22 μm steriilejä suodattimia - Steriilejä kirkkaita tai kullanruskeita lasipulloja s **': - Konsentraattori DC-10 Amicon ··’. - Rotofor Biorad 170-2950 -laite f · i I" ] - Amicon-suodattimia SIOY10, SIOY130 ja SIOY100, joiden cut-off -arvot ovat 35 10, 30 ja 100 kD, vastaavassa jäijestyksessä - FPLC Pharmacia 216007 (tietokone Pharmacia 216014) 117376 41 - Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia) - Superase S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia) - Lyofilisointilaite Labconco 10273 A.

Keksintö on kuvattu edellä ja on selvää, että alaan perehtynyt kykenee tekemään sii-5 hen muutoksia keksinnön alasta poikkeamatta korvaamalla joitakin tämän keksinnön osia käyttämällä niitä vastaavia osia, joilla päästään samaan tulokseen. Tällaisten it-sestäänselvien muutosten katsotaan sisältyvän keksinnön suoja-alaan.

« · · • « * «»· · ··» • * » • * * « • * ♦ # * * · « « « • · 99 • 9 t ·· 999 • · * • * i » • « · • 9 · *·· ··» • 9 • 9 • 9 9 9 9 9 9 9 999 999 9 9 9 9 999 9 99 « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 f

Claims

117376 42

1. Hain rustouutteen käyttö valmistettaessa lääkettä kollagenolyysi- tai tulehdus-tekijän sisältävän sairauden tai -häiriön hoitamiseksi, sillä edellytyksellä, että mainittu sairaus tai häiriö ei ole syöpä, psoriasis, akne tai niveltulehdus, tunnettu 5 siitä, että mainittu rustouute on supematantin fraktio, joka on saatu sentrifugoimalla hainruston täysvesihomogenaatti, mainitun supematantin ollessa fraktioitu suodatus-pylväässä, jonka huokoisuus on noin 500 kilodaltonia (kDa) tämän fraktion molekyylien molekyylipainon ollessa noin 0 noin 500 kDa, jolla mainitulla uutteella on anti-kollagenolyyttistä ja anti-inflammatorista aktiivisuutta.

2. Hain rustouutteen käyttö valmistettaessa lääkettä kollagenolyysi- tai tulehdus- tekijän sisältävän sairauden tai -häiriön hoitamiseksi, sillä edellytyksellä, että mainittu sairaus tai häiriö ei ole syöpä, psoriasis, akne tai niveltulehdus, tunnettu siitä, että mainittu rustouute on supematantin fraktio, joka on saatu sentrifugoimalla hainruston täysvesihomogenaatti, mainitun supematantin ollessa konsentroitu 15 suodatuspylväässä, jonka molekyylipainojen cut-off -arvo on 1 kilodaltonia (kDa), jolloin saadaan molekyylipainoltaan 1 - 500 kDa molekyylien konsentroitu uute.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu lääke on paikallisesti käytettävä lääke.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu 20 lääke käsittää lisäksi jonkin antioksidantin. Il· I I f * •f: 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että antioksidantti on valittu ryhmästä, jonka muodostavat tokoferoli, tokoferolijohdokset, askorbiini- ♦ · happo, askorbiinihappojohdokset ja BHT. m • · ·

6. Jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu 25 lääke sisältää lisäksi jonkin anti-inflammatorisen aineen. • · · « · · • n •e,\ 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu anti-in- •\ flammatorinen aine on jokin kasveista johdettu ärsytystä lievittävä aine. ; ·*· * · * ·*·

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu anti-inflammatorinen aine on valittu ryhmästä, jonka muodostavat cola- ja vihreä tee - : ·’ 30 uute. m • ϊ

9. Jonkin patenttivaatimuksen mukainen käyttö, tunnettu siitä, että anti-inflam-matorinen aine on jokin fosfolipaasi A2 -estäjä. 43

10. Jonkin patenttivaatimuksen 3-9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja on valittu ryhmästä, jonka muodostavat liuokset, suspensiot, lotionit, tinktuurat, geelit, emulsiovoiteet, suihkeet, emulsiot, puikot ja voiteet.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 3-10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että ainakin osa rustouutteesta on läsnä liposomeissa.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu sairaus on ihon tulehdus.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitun ihon tu-10 lehduksen on aiheuttanut fyysinen hankaus.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitun tulehduksen on aiheuttanut jokin ärsyttävä kemikaali.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitun tulehduksen on aiheuttanut altistuminen ultraviolettisäteilylle.

15 Patentkrav