PL188137B1

PL188137B1 - Zastosowanie wyciągu z chrząstki rekina

Info

Publication number: PL188137B1
Application number: PL95321678A
Authority: PL
Inventors: Eric Dupont; Paul Brazeau; Christina Juneau; Daniel H. Maes; Kenneth Marenus
Original assignee: Aeterna Lab Inc
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 2004-12-31
Also published as: JP2006290904A; PL321678A1; CA2212010A1; EP0806960A1; IS4537A; CN1138550C; NO973564L; RO117590B1; NZ294553A; IS1963B; EP0806960B1; CZ292627B6; CA2212010C; BG63801B1; FI973195A; ATE230272T1; BR9510540A; HU222088B1; ES2188672T3; DE69529300T2

Abstract

1. Zastosowanie wyciagu z chrzastki rekina do wytwarzania leku do leczenia choroby lub zaburzenia pod warunkiem, ze ta choroba lub zaburzenie nie jest rakiem, luszczyca, tradzikiem lub artretyzmem, a wymieniony wyciag z chrzastki jest frakcja nadsaczu, otrzymanego po odwirowaniu wodnego homogenatu calej chrzastki rekina, który to wspo- mniany nadsacz jest frakcjonowany na kolumnie filtracyjnej o porowatosci okolo 500 kilo- daltonów (kD), po czym wyciag zawiera czasteczki o masie czasteczkowej nizszej niz oko- lo 500 kD, i posiada aktywnosc przeciw kolagenolizie i przeciwzapalna. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyciągu z chrząstki rekina. Jest ona zastosowana do wytwarzania leku do leczenia kolagenolitycznych i zapalnych chorób i zaburzeń.

Chrząstka jest nieunaczynioną tkanką i była badana jako potencjalny kandydat zawierający czynniki przeciwangiogenne. Jest też tkanką, która jest stosunkowo odporną na rozwój nowotworów. Nowotwór związany z chrząstką, chrzęstniakomięsak, jest najmniej unaczynionym guzem wśród guzów litych. Angiogeneza jest jednym z ważnych czynników w rozwoju

188 137 guza. Odrębne lite guzy pojawiają się jeśli komórki guza potrafią skłonić przylegającą sieć naczyń krwionośnych do rozprzestrzenienia się tak by zaspokoić wymagania pokarmowe nowotworu. Dlatego też czynniki związane ze stymulacją angiogenezy były badane ze względu na ich rolę w rozwoju guza, badano także leki mające działanie hamujące rozwój naczyń jako narzędzia do kontroli wzrostu guzów lub powodowania ich regresji.

Stwierdzono, ze chrząstka łopatki u cieląt zawiera substancję, która hamuje unaczynianie guzów litych (Langner i wsp. 1976). Ze względu na jej zachęcające działanie jako czynnika przeciwnowotworowego, szukano źródeł dających większe ilości chrząstki.

Rekiny to zwierzęta stanowiące potencjalne źródło tego rodzaju inhibitora angiogenezy ponieważ ich szkielet wewnętrzny złożony jest wyłącznie z chrząstki (6% masy ciała w porównaniu z 0,6% u cieląt). Interesującą cechą rekinów jest też ich niska podatność na nowotwory. Proponowano wiele hipotez tłumaczących to niskie prawdopodobieństwo rozwoju nowotworów u rekinów. Marchalonis i wsp. (1990) stwierdzili, obecność przeciwciał IgM zdolnych do atakowania dowolnego czynnika obcego. McKinnay i wsp. (1990) wykazali, że rekiny zawierają makrofagi zdolne do odróżniania normalnych komórek od komórek nowotworowych i do niszczenia tych ostatnich. Rosen i Woodhead (1980) postulowali, że rzadkość występowania nowotworów u Elasmobrancha (grupy do której należą rekiny i raje) może wynikać z wysokiej mocy jonowej ich tkanek, która jest odpowiednikiem wysokiej temperatury ciała. Autorzy ci uważają, że w tych warunkach układ odpornościowy prowadzi nadzór immunologiczny z wydajnością bliską 100%. Moore i wsp. (1993) wykryli, że rekiny wytwarzają aminosterol o właściwościach przeciwbakteryjnych i przeciwpierwotniaczych. I ostatecznie, Lee i Langer (1983) i Folkman i Klagsbrun (1987) wykazali, że rekiny wytwarzają substancję, która hamuje tworzenie nowych naczyń. Lee i Langer (op. cit.) wyizolowali tę substancję przez jej ekstrakcję z chrząstki rekina w warunkach denaturujących (ekstrakcja guanidyną). Ten proces ekstrakcji jest jednak bardzo długi (41 dni) i w efekcie mogą powstawać ekstrakty zawierające zdenaturowane czynniki. Substancja czynna izolowana z cieląt ma masę cząsteczkową 16 kilodaltonów (kd), ta sama grupa naukowców nie podała jednak dokładnej masy cząsteczkowej substancji izolowanej z rekinów. Definiowana jest ona tylko jako substancja 0 masie cząsteczkowej wyższej od 3500 daltonów. Oikawa i wsp. (1990) zastosowali tę samą procedurę ekstrakcji jak opisana przez Lee i Langnera, ale trwającą znacznie krócej (2 dni zamiast 41 dni). Substancja wyizolowana z chrząstki rekina przez Oikawa i wsp. ma masę cząsteczkową w zakresie od 1000 do 10 000 daltonów. Schinitsky (USP 4,473,551) opisał wodny wyciąg ze sproszkowanej chrząstki rekina którego frakcja o masie ponad 100 000 daltonów ma właściwości przeciwzapalne sama lub w połączeniu z glukozaminą. W patencie tym nie było żadnych sugestii by składnik tego ekstraktu miał właściwości przeciwangiogerme lub przeciwnowotworowe. Kuetner i wsp. (USP 4,746,729) wyizolowali inhibitor elastazy białych krwinek obojętnochłonnych o różnokształtnych jądrach komórkowych (PMN) z chrząstki wołu. Inhibitor ten uzyskano z wodnego wyciągu chrząstki, z którego usunięto cząsteczki o masie cząsteczkowej większej od 50 000 daltonów. Frakcjonowanie na Sephacryl

S-200 dało liczne frakcje, z których połączono frakcje 10-40 kD po wykazaniu przez nie aktywności przeciwelastazowej. Składnik czynny ma punkt izoelektryczny 9,5 i może mieć masę cząsteczkową około 15 000 daltonów. Kuetner i wsp. (USP 4,042,457) wykazali także, że chrząstka wołowa ma składnik o masie cząsteczkowej mniejszej od 50 000 daltonów mający aktywność hamującą proliferację komórek bez wpływu na wzrost komórek śródbłonka. Spilburg i wsp. (USP 4,242,582) wyizolowali dwie glikoproteiny o masie cząsteczkowej 65 kD i pl 3,8 z chrząstki wołowej (ekstrakcja guanidyną), które wykazują działanie przeciwtrypsynowe i zdolność do hamowania wzrostu komórek śródbłonka.

Chrząstka cielęca i z rekina wykazują wiele aktywności biologicznych takich jak aktywność prozapaleniowa, aktywność przeciwzapalna, aktywność antyangiogenna, aktywność lizozymu, aktywność stymulująca wzrost komórek, aktywność hamująca kolagenazy typu I i IV, ilastazę oraz proteazy takie jak trypsyna, chymotrypsyna i plazmina. Jednak nikt nie otrzymał jeszcze wyciągu z chrząstki, który zawierałby sumę klinicznie ważnych aktywności.

Składnik(i) przeciwangiogerme chrząstki rekina na ogół badano w teście kieszonki rogówki królika lub w teście kosmówki omoczniowej (CAM). Dotychczas całą sproszkowaną

188 137 chrząstkę badano na guzach in vitro, na kserografiach ludzkiego czerniaka przeszczepionego do myszy „nude” (USP 5,075,112) oraz w testach CAM pod kątem jej działania przeciwangiogennego. Choć przypisywano efekt przeciwnowotworowy wyciągom chrząstki, efekt ten na ogół przypisywano składnikowi przeciwangiogennemu, który pozbawia guz dopływu krwi. Dotychczas nie ma dowodów, że chrząstka rekina ma bezpośredni wpływ na proliferację komórek nowotworowych.

Znanych jest już szereg sposobów otrzymywania wyciągów i frakcji z chrząstki rekina. Niektóre z nich polegają na wytworzeniu sproszkowanej surowej chrząstki bez jakiejkolwiek ekstrakcji (USP 5,075,112). W innych stosowano czynniki denaturujące takie jak guanidyna (USP 4,243,582). Inne wykorzystują wstępne trawienie enzymami by pozbyć się struktur mięśniowych, nerwowych czy naczyniowych otaczających chrząstkę, po tym etapie stosuje się organiczne rozpuszczalniki by usunąć tłuszcze, a następnie aktywne składniki są ekstrahowane w fazie wodnej (Balassa i wsp. USPs 3,478,146, 4,350,682, 4,656,137 i 4,822,607). Wpływ takich wstępnych procedur na zachowanie biologicznej aktywności czynnych składników chrząstki nie jest znany. Jeśli trawienie enzymatyczne jest nadmierne, może hydrolizować czynne składniki białkowe. Metoda Balassy nie obejmuje etapu frakcjonowania, który wzbogaciłby wyciąg w składniki czynne. W innych metodach po prostu wytwarza się wyciągi wodne (w wodzie USP 4,473,551) lub w roztworach soli (USP 4,746,729)) z chrząstki przez usunięcie materiału, który nie uległ solubilizacji. Wśród tych ostatnich zachowano konkretne frakcje o konkretnych masach cząsteczkowych do dalszych badań i oczyszczania (p. dyskusja powyżej).

Wymienione powyżej metody mają szereg wad. Mogą denaturować cenne składniki. Jeśli to nie zachodzi, mają wadę trwania zbyt długo by mieć praktyczne znaczenie. Co więcej, długotrwałe metody niekoniecznie dają wystarczające ilości składników czynnych, a wśród odzyskanych składników, niektóre nie są wcale odzyskiwane lub też w ilościach niewystarczających by wykazywać wykrywalną aktywność lub też zostały pominięte przez skupianie się na wykazywaniu uzyskania konkretnych aktywności.

Angiogeneza jest nie tylko związana z rozwojem nowotworów. Wiele chorób lub stanów wpływających na różne układy fizjologiczne (pokazane w nawiasach) zależy od angiogenezy, m. in. artretyzm i płytki aterosklerotyczne (kości i więzadła), retynopatia cukrzycowa, jaskra neowaskulama, unaczynianie jaglicy i przeszczepów rogówki (oko), łuszczyca, twardzina skóry, naczyniaki krwionośne i blizny hipertroficzne (skóra), naczyniowe zrosty i naczyniakowłókniaki (układ krwionośny). Tak więc każdy nowy czynnik przeciwangiogenny mógłby znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób jak i w terapii nowotworów. Co więcej, ponieważ wiele z chorób i stanów wymienionych powyżej ma także składnik zapalny, każdy nowy i silny „czynnik” przeciwzapalny mógłby znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób i stanów jak i dowolnych innych chorób lub stanów zapalnych. Co więcej, ponieważ proteazopodobne kolagenazy są związane z różnorodnymi chorobami i stanami jak nowotwory i przedwczesne starzenie ze względu na swoją aktywność w rozkładaniu kolagenu, nowy i silny „czynnik” przeciwkolagenolityczny mógłby znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób lub stanów mających składnik kolagenolityczny. Ponieważ angiogeneza, zapalenia i kolagenazy proteazopodobne mogą być spotykane pojedynczo lub w kombinacjach w różnych chorobach i stanach, produkt zdolny do przeciwdziałania przynajmniej wszystkim tym aktywnościom bez wpływania na normalne funkcje organizmu miałby wielkie znaczenie terapeutyczne.

Podstawowym aspektem wynalazku jest nowe zastosowanie wyciągu z chrząstki rekina do wytwarzania leku do leczenia choroby lub zaburzenia pod warunkiem, że ta choroba lub zaburzenie nie jest rakiem, łuszczycą, trądzikiem lub artretyzmem, a wymieniony wyciąg z chrząstki jest frakcją nadsączu, otrzymanego po odwirowaniu wodnego homogenatu całej chrząstki rekina, który to wspomniany nadsącz jest frakcjonowany na kolumnie filtracyjnej o porowatości około 500 kilodaltonów (kD), po czym wyciąg zawiera cząsteczki o masie cząsteczkowej niższej niż około 500 kD, i posiada aktywność przeciw kolagenolizie i przeciwzapalną.

188 137

Zgodnie z nowym zastosowaniem wyciąg z chrząstki jest zatężany na membranie filtracyjnej o molekularnej wartości odcięcia około 1 kD, po czym otrzymany zatężony wyciąg wzbogacony jest cząsteczkami o masie cząsteczkowej od 1-500 kD.

Istnieją także pewne dodatkowe cechy związane z wspomnianym nowym zastosowaniem.

Według nowego zastosowania lek jest lekiem stosowanym domiejscowo i dodatkowo zawiera przeciwutleniacz. Przeciwutleniacz wybrany jest z grupy obejmującej tokoferol, pochodne tokoferolu, kwas askorbinowy, pochodne kwasu askorbinowego i BHT. Wymieniony lek zawiera dodatkowo środek przeciwzapalny i może być nim środek pochodzenia roślinnego przeciwko podrażnieniu. Wymieniony środek przeciwzapalny może być także wybrany z wyciągów cola i zielonej herbaty. Według nowego zastosowania wymieniony środek przeciwzapalny jest inhibitorem fosfolipazy A2. Wytworzony zgodnie z nowym zastosowaniem lek wybrany jest z grupy obejmującej roztwory, zawiesiny, lotiony, nalewki, żele, kremy, spraye, emulsje, sztyfty i maście, przy czym aktywny wyciąg może być zawarty w liposomach. Zgodnie z zastosowaniem według choroba lub zaburzenie jest stanem zapalnym skóry, który to stan zapalny jest spowodowany urazem fizycznym, podrażnieniem chemicznym lub ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe.

Zastosowanie według niniejszego wynalazku związane jest ze sposobem wytwarzania wyciągu z chrząstki który korzystnie zawiera mnogość terapeutycznie cennych aktywności. Wśród nich potwierdzono, że właściwości przeciwangiogenne, przeciwzapalne, przeciwkolagenolityczne, hamujące proliferacją guzów in vivo i bezpośrednio hamujących proliferację guzów in vitro występują w zadawalających stężeniach w wyciągu z chrząstki rekina. Inne aktywności oczekują na identyfikację lub potwierdzenie. Efekt mierzony na liniach komórek nowotworowych wskazywał, że oprócz bezpośrednich aktywności hamowania proliferacji występuje aktywność cytotoksyczna. Wszystkie aktywności zawarte są w płynnym wyciągu z chrząstki rekina, a niektóre z nich uzyskano lub sprawdzono dla stałego wyciągu z chrząstki rekina.

Zatem zastosowanie wg wynalazku związane jest z procesem otrzymywania płynnego wyciągu z chrząstki, wyciągu posiadającego znaczącą porcję biologicznie aktywnych rozpuszczalnych w wodzie składników zawartych w całej chrząstce. Proces ten składa się z następujących etapów:

a) homogenizacja chrząstki w wodnym roztworze w warunkach odpowiednich dla zachowania integralności wymienionych biologicznie czynnych składników aż do rozdrobnienia chrząstki do cząsteczek mniejszych lub równych około 500 pm, co daje mieszaninę cząsteczek i surowego płynnego wyciągu posiadającego wymienione biologicznie czynne związki;

b) wirowanie wymienionego homogenatu by oddzielić cząsteczki od płynnego wyciągu; i

c) dalsze rozdzielenie surowego płynnego wyciągu aby uzyskać końcowy płynny wyciąg zawierający cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej około 500 kilodaltonom.

Proces ten ma zaletę, że jest łatwy do wykonania i skuteczny. Uzyskano wysokie wydajności wyciągu z chrząstki, który to wyciąg, w szczególności uzyskany z chrząstki rekina, zawiera przynajmniej wszystkie z wyżej wymienionych aktywności biologicznych. Procedurę szczególnie korzystnie przeprowadza się w niskiej temperaturze (od około 0 do 10°C) w warunkach niedenaturujących (szczególnie korzystnie w czystej wodzie), w pH nieomal obojętnym (około 6 do 8) aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo odzyskania związków o nieznanych cechach fizykochemicznych. Według tego procesu można ekstrahować składniki chrząstki w małej objętości roztworu (tak małej jak 1 1 na 1 kg chrząstki) i po krótkim okresie homogenizacji (zaledwie 10 do 15 minut). Dla odzyskania wyciągu stałego stosuje się ten sam proces, z tym że odzyskuje się i liofilizuje osad, odrzucając nadsącz.

Niniejszy wynalazek ujawnia wyciągi z chrząstki, szczególnie wyciągi pochodzące od Elasmobranchia, a w szczególności od rekina. Wyciąg stały wykazał aktywność. Może on zawierać kolagen i składniki nierozpuszczalne w wodzie. Może też zawierać resztkową aktywność tego, co wyekstrahowano w wyciągu płynnym. Całkowity płynny wyciąg posiada bardzo dużo typów aktywności. Może być używany jako taki lub zatężany. Użyto etapu zatę6

188 137 żania, który sprzyja zachowaniu biologicznych aktywności. Przez ostrożność unikano stosowania metod, które mogłyby degradować czynne składniki jak odparowywanie przez ogrzewanie. Stosowano ultrafiltrację na błonie mającej punkt odcięcia masy cząsteczkowej około 1 kD do zatężanie płynnego wyciągu według wynalazku. W wyniku otrzymano i przebadano stężony wyciąg zawierający cząsteczki o masie cząsteczkowej zawartej między około 1 i około 500 kD. Całkowity wyciąg płynny (0 do 500 kD) dalej frakcjonowano aby scharakteryzować jego składniki czynne. Uzyskano liczne frakcje stosując różne sposoby. Niektóre z nich przetestowane na liniach komórek nowotworowych zgrubnie scharakteryzowano na podstawie ich masy cząsteczkowej i punktu izoelektrycznego. Innym przypisano aktywność, szczególnie aktywności anty-kolagenolityczne lub anty-angiogenne. Frakcje te oczekują na swoją całkowitą charakterystykę i identyfikację. Tak więc cenne aktywności odzyskuje się w całkowitym wyciągu płynnym i jego frakcjach, które można korzystnie zastosować. Zamiast podawania dużych ilości sproszkowanej chrząstki można obecnie podawać łatwiejszy do przyjmowania wzbogacony wyciąg.

Zastosowanie według wynalazku związane jest z wszelkimi kompozycjami terapeutycznymi czy kosmetycznymi zawierającymi jako składnik czynny jeden z wyżej wymienionych wyciągów chrząstki. W tym aspekcie obserwowane aktywności antykolagenolityczne i przeciwzapalne i antagonistyczne wpływy różnicowania komórkowego, w których pośredniczy indukcja kinazy białkowej C w keratynocytach uznano za otwierające nowe drogi stosowania wyciągów z chrząstki rekina w preparatach i metodach dla zmniejszania zapalenia, regulowania zmarszczek lub atrofii skóry, opóźniania przedwczesnego starzenia, zmniejszania trądziku, polepszania funkcji ochronnych skóry, zmniejszaniu zapalenia lub podrażnienia i efekt łagodzący skórę. Takie metody wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

Obecny wynalazek będzie łatwiejszy do zrozumienia na podstawie konkretnych przykładów, które są uzupełnione załączonymi rysunkami (fig), ich celem jest raczej zilustrowanie wynalazku niż ograniczenie jego zakresu:

Dane dotyczące raka, łuszczycy, trądziku i artretyzmu załączone są jedynie dla celów ilustracyjnych.

Figura 1 pokazuje hamującą aktywność wzrastających dawek chrząstki rekina (wyciąg stały) w stosunku do komórek ZR75-1 i MCF-7.

Figura 2 pokazuje krzywe odpowiedzi na dawkę ilości komórek MCF-7 mierzonych na podstawie ilości ich DNA w obecności wzrastających stężeń estradiolu w obecności dwóch stężeń liofilizatu chrząstki lub bez niego.

Figury 3a i 3b pokazują porównanie przekrojów przez wątrobę szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i nadsączu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Figury 4a i 4b pokazują porównanie przekrojów przez nerkę szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i nadsączu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Figury 5a i 5b pokazują porównanie przekrojów przez płuca szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i nadsączu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Figury 6a i 6b pokazują porównanie przekrojów przez gruczoł mleczny szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i nadsączu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Figura 7 jest histogramem sporządzonym na podstawie fig. 6a i 6b ilustrującym wpływ wyciągu z chrząstki na powierzchnię naczyń krwionośnych w guzie.

Figura 8 przedstawia profil elektroforetyczny w warunkach niedenaturujących frakcji płynnych rozdzielonych na Rotofor, standardy masy cząsteczkowej pokazane są z lewej, za nimi jest próbka surowego filtratu przed frakcjonowaniem dla porównania z wyizolowanymi frakcjami.

Figury 9a i 9b ilustrują znaczącą poprawę stanu dwóch pacjentów cierpiących na łuszczycę, jeden z nich z zrogowaceniem (9a), drugi bez (9b) leczonych lokalną aplikacją prepara188 137 tu zawierającego skuteczną ilość stężonego płynnego wyciągu z chrząstki (dolne zdjęcia) porównane z ich stanem wyjściowym (górne zdjęcia).

Figura 10 pokazuje migrację wFPLC trzech różnych wyciągów z chrząstki rekina. W ścieżce A DUP oznacza płynny wyciąg chrząstki uzyskany ujawnionym sposobem. W ścieżkach B i C, BAL i OIK to wyciągi uzyskane dawniejszymi metodami, odpowiednio Balassa i wsp. i Oikawa i wsp.

Figura 12 przedstawia wyniki testów CAM wykonanych przy zastosowaniu różnych stężeń protaminy, odnośnikowego związku przeciwangiogennego, w porównaniu z kontrolą.

Figura 13 przedstawia wyniki testów CAM wykonanych z dwiema frakcjami obecnego całkowitego płynnego wyciągu z chrząstki rekina (DUP), jeden posiada masę cząsteczkową niższą od 10000 Daltonów a drugi większą od 10000 Daltonów.

Figura 14 przedstawia wyniki testów CAM wykonanych za pomocą całkowitego płynnego wyciągu (DUP) w porównaniu z równoważnym stężeniem produktu sporządzonego według procedury Balsssy (BAL).

Figura 15 przedstawia wyniki testów CAM wykonanych przy zastosowaniu całkowicie płynnego wyciągu (DUP) w porównaniu z próbką z równej ilości suchej masy produktu zrobionej metodą Oikawy (OIK).

Figura 16 pokazuje wpływ TPA na keratynocyty w porównaniu z kontrolą DMSO, według wynalazku mierzone w obecności lub braku całkowitego płynnnego wyciągu.

Figura 17 pokazuje efekt przeciwzapalny według wynalazku całkowitego płynnego wyciągu na model podrażnienia skóry.

Figura 18 pokazuje inny wzór migracji wHPLC frakcji całkowitego płynnego ekstraktu według wynalazku o masie cząsteczkowej mniejszej od 10000 Daltonów, frakcja ta została zatężona i rozdzielona na pięć podfrakcji.

Figura 19 pokazuje efekt antykolagenolityczny każdej subfrakcji z rys. 18 w różnych badanych objętościach.

W konkretnym przykładzie, chrząstkę uzyskiwano ze zdrowych rekinów Black Spiny Dog Fish i Common Spiny Black Fish. Wszelką tkankę mięśniową i łączną usuwano przez drapanie nożyczkami i skalpelami sterylizowanymi etanolem. Następnie chrząstkę pakowano pod próżnią do torebek plastikowych i zamrażano w -20°C do dalszego stosowania. W obecnym procesie może być używane dowolne źródło chrząstki. Wybraliśmy chrząstkę z rekina z przyczyn podanych w stanie techniki. Uważa się, że wychodząc z chrząstki Elasmobranchia (grupa ta obejmuje rekiny i raje jako gatunki) uzyskuje się nieomal równoważne produkty. Produkty najprawdopodobniej będą inne przy zastosowania jako źródła chrząstki ssaków.

W przygotowywaniu chrząstki przed jej ekstrakcją może być stosowana dowolna zmiana o ile nie wpływa ona znacząco na aktywność interesującego produktu (na przykład całkowitego płynnego wyciągu lub jego frakcji). Pewne składniki czynne, jak wykazał Balassa i wsp. (USP 4,822,607) mogą być oporne na trawienie proteolityczne stosowane do usuwania otaczających tkanek podczas gdy inne mogą nie być oporne na takie procedury. Jedna z aktywności, która nie wydaje się być oporna na taką obróbkę wstępną jest aktywność przeciwangiogenna (fig. 15). Tak więc jeśli chce się wytworzyć płynny wyciąg zawierający jak najwięcej wszystkich rozpuszczalnych w wodzie czynników aktywnych, winno się unikać takiego etapu trawienia lub też proces powinien być starannie monitorowany aby zapobiec rozległej hydrolizie lub proteolizie.

PRZYGOTOWANIE LIOFILIZOWANEJ CHRZĄSTKI

Stosowano czystą chrząstkę świeżą lub rozmrażaną do 4°C. Następnie chrząstkę przepuszczano wielokrotnie (trzy razy) przez pory maszynki do siekania mięsa przemytej etanolem wraz z odpowiednią objętością wody (równa ilość (waga/objętość) jest mniej więcej objętością minimalną ale może być zwiększona bez wpływu na wydajność odzyskania cennych składników). Preferowana jest mała objętość ponieważ w praktyce łatwiej jest ją obrabiać niż zbędne duże objętości. W praktyce woda była oczyszczona poprzez odwrotną osmozę i filtrowanie przez filtr 0,1 pm. Zamiast wody można by stosować wiele roztworów wodnych (np. zawierających sole). Przy odzyskiwaniu mnogości rozpuszczalnych w wodzie czynników aktywności ważna jest praca przy nieomal obojętnym pH i warunkach niedenaturujących aby

188 137 uniknąć lizy i denaturacji pewnych składników chrząstki. Zachowanie nieznanych białek w wodnych rozpuszczalnikach nie jest przewidywalne, jedne mogą lepiej „czuć się” w kwaśnym, a inne w zasadowym pH. Co więcej, pewne białka można ekstrahować w łagodnych warunkach denaturujących, o ile taka denaturacja nie wpływa nieodwracalnie na renaturację tych białek w roztworach wodnych. Tak więc uwzględniając te wszystkie czynniki wykazano, że ekstrakcja czynnych składników chrząstki stosując czystą wodę jest właściwa dla odzyskania z dobrą wydajnością składników o nieznanej strukturze i zachowaniu.

Mieszaninę chrząstka/woda homogenizowano następnie poprzez mieszanie z maksymalną prędkością w kuchennym homogenizatorze w4°C przez 10 minut. Oczywiście, szybkość mieszania i objętość roztworu wodnego mogą wpływać na czas ekstrakcji. Tak więc racjonalny zakres czasu homogenizacji może wynosić od zaledwie 10 minut do aż 24 godzin, szczególnie korzystnie od 10 do 60 minut. Gdy nie stosuje się inhibitorów enzymów temperatura powinna być utrzymywana poniżej około 10°C aby uniknąć degradacji składników czynnych przez endogenne enzymy. Idealnie należy uzyskać temperaturę bliską 0°C. Ponieważ normalnie takie doświadczenia przeprowadza się w chłodni, w której temperatura może być utrzymana między 4 a 10°C, właśnie ten zakres temperatur jest zastosowany w obecnym procesie. Dla jasności i krótkości, określenie „około 4°C” jest poniżej stosowane dla określenia akceptowalnego zakresu temperatury.

Jeśli homogenizacja nie zmniejszyła dostatecznie wielkości cząsteczek można uzyskać dalsze upłynnienie tego homogenatu przez poddanie go działaniu dezintegratora Polytron przez 10 minut w4°C. Można też homogenizować dalej homogenat w bardziej skutecznym homogenizatorze, co pozwalało nam na uniknięcie 10-minutowej dezintegracji. Pod koniec etapu homogenizacji wielkość cząsteczek jest mniejsza od 500 pm. Oczywiście stosuje się te same akceptowalne zakresy czasu i temperatury omawiane przy otrzymywaniu pierwszego mielonego preparatu chrząstki. Wielkość cząsteczek po homogenizacji nie musi być bardzo mała. Tak więc można uniknąć konieczności proszkowania chrząstki przed ekstrakcją. Faktycznie, rozdrabnianie chrząstki w formie proszku przed ekstrakcją wodną może denaturować ważne czynniki aktywności, kiedy to chrząstka jest otrzymywana w stanie liofilizowanym lub po suszeniu przez ogrzewanie.

Homogenat wirowano przy 13600 x g przez 15 minut w4°C. Ten etap służy do szybkiego i skutecznego oddzielenia nadsączu od osadu. Zmiana i dopasowywanie tych parametrów są w granicach wiedzy eksperta, i zależą tylko od objętości homogenatu i stosowanej aparatury.

Powstający osad liofilizowano przez 24 do 48 godzin. Ta pierwsza frakcja będzie określana dalej jako liofilizat lub wyciąg stały.

Nadsącz można filtrować przez filtr Whatman 24 pm by pozbyć się cząsteczek mogących wpływać na zachowanie kolumny ultrafiltracyjnej. Przefiltrowany materiał poddawano następnie ultrasączeniu w 4°C na kolumnie o przepływie stycznym o porowatości 500000 daltonów, co pozwala na uzyskanie pierwszego surowego filtratu zawierającego cząsteczki rozpuszczalne w wodzie o masie cząsteczkowej zawartej między 0 i około 500 kD. Ten surowy nadsącz filtrowano w sposób sterylny na filtrze 0,22 pm, i rozdzielano do sterylnych butelek do dalszego używania. Ta frakcja będzie dalej nazywana surowym przesączem lub całkowitym wyciągiem płynnym.

Alternatywna procedura o większej sprawności z zastosowaniem wirowania została opracowana by otrzymywać osad i nadsącz. Etap wirowania przy 13600 x g przez 15 minut a następnie zgrubne sączenie na filtrach Whatman zostało zastąpione wirowaniem w wirówce CEPA wyposażonej w nylonową kieszeń o porowatości 30 pM, przy 3000-4000 x g. Preparat 25 kg/ 25 1 może być wirowany w ten sposób w ciągu 30 minut dostarczając 29 litrów nadsączu. Otrzymana objętość płynu jest jeszcze wyższa niż wyjściowa objętość wody, co oznacza, że zbiera się część zawartości wody z samej chrząstki. Liofilizat i całkowity płynny wyciąg mogą mieć następujący skład, który z grubsza uwzględnia zmiany obserwowane w poszczególnych partiach i przy stosowaniu różnego materiału:

188 137

LIOFILIZAT
Lipidy	7,35%’
Białka	46,2%2
Wilgoć	20,4%
Sód	4,16 mg/g3
Potas	2,64 mg/g
Wapń	114 mg/g
Magnez	1,49 mg/g
Cynk i żelazo - ślady
CAŁKOWITY PŁYNNY WYCIĄG
Lipidy	0,10-0,20%’
Białka	8-25 mg/ml2
Wilgoć	97-99%
Sód	30-220 mg/100 g3
Potas	30-40 mg/100 g
Wapń	2,0 mg/100 g
Magnez	1,1 mg/100 g
Cynk i żelazo - ślady

^1,2 Mierzone zgodnie z wytycznymi podanymi w AAOAC Official (1984) sekcje 16.219-220 i 2.055 odpowiednio.

³ Mierzone zgodnie z procedurą SAA.

Zawartość białka oznaczana jest metodą Kjeldahla, która w istocie mierzy azot organiczny (N). Organiczny azot jest przeliczany na odpowiadające białko przez zastosowanie następującego równania:

., . _n %Nx6.22

Zawartość białka (mg/ml) =100

Ponieważ węglowodany nie są wykrywalne, można założyć, że są obecne w ekstrakcie ale w formie proteoglikanów i/lub mukopolisacharydów. Jest możliwe, że związki te są wliczone do mierzony poziom wilgoci. Liofilizat zawiera nieoczekiwany poziom wilgoci, który był mierzony poprzez grupy OH. Ponieważ 20% zawartość wody jest zbliżona do procentu węglowodanów normalnie odzyskiwanych z chrząstki podczas gdy wilgotność lofilizatu powinna być zbliżona do 0%, hipoteza ta powinna zostać sprawdzona.

Sterylność była kontrolowana stosując specyfikacje USP XXII przez:

1) Laboratoire de genie sanitaire du Quebec Inc.

1090,1' Escarbot, Centre Industriel St. Malo, Quebec GIN 4J4; oraz

2) Northview Laboratories Inc.

1880 Holste Road, Northbrook, IL, 60062 USA Rejestracja FDA nr 14-18028.

Oznaczenie aktywności:

LIOFILIZAT:

Oznaczenia in vitro

Oznaczenia te przeprowadzono na zależnych od hormonów liniach komórkowych MCF7 i ZR75-1 (odpowiednio numery ATCC(R) 22-HTB i 1500-CRL).

188 137

Komórki ZR75-1:

Pożywka podstawowa RPMI:

g RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (Sigma R8755), 17.875 g HEPES (wolny kwas, Sigma H0763), 0.55 g pirogronianu sodowego (Sigma P5280) i 10 g NaHCO3 zmieszano w 5 litrach czystej wody i doprowadzono pH do 7,40 za pomocą NaOH.

Jeśli ten roztwór nie jest używany od razu, musi być chroniony od światła dla ochrony związków wrażliwych na światło. Roztwór przesączono, rozlano do sterylnych kolb 500 ml przechowywano w 4°C nie dłużej niż trzy miesiące.

Pożywka do utrzymywania hodowli komórkowych

Do pożywki podstawowej RPMI dodawano 10% (v/v FBS (bydlęca surowica płodowa), 100 U penicyliny G/50 pg siarczanu streptomycyny (Sigma P0906)/ml pożywki, 2 mM L-glutaminę (Sigma G1517) i 1 nm EiP-estradiol Sigma E8875).

Pożywka doświadczalna:

Podstawową pożywkę RPMI uzupełniano 5% FBSA (bydlęca surowica płodowa adsorbowana na dekstranie-węglu drzewnym), 2 mM L-glutaminą, 100 U penicyliny G/50 pg siarczanu streptomycyny/ml pożywki oraz 50 ng/ml insuliny (Sigma). Do tej β pożywki dodawano wzrastające stężenia opisanego powyżej liofilizatu oraz różne stężenia estradiolu (od 10^²do 10-5 M).

Komórki MCF-7:

Pożywka podstawowa DME-F12:

Pożywka DME-F12 (bez kwaśnego węglanu i czerwieni fenolowej, Sigma) była rekonstytuowana zgodnie z zaleceniami producenta w czystej wodzie. Na 1 litr dodawano 1.2 g kwaśnego węglanu sodu i doprowadzano pH do 7,40 przez dodanie NaOH/HCl. Roztwór sączono, rozlewano do sterylnych kolb 500 ml i przechowywano w 4°C nie dłużej niż trzy miesiące.

Pożywka do utrzymywania hodowli komórkowych:

Do pożywki podstawowej DME-F12 dodawano 10% (v/v) FBS (bydlęca surowica płodowa), 100 U penicyliny G i 50 pg siarczanu streptomycyny (Sigma P0906) na ml pożywki, mM L-glutaminę (Sigma G1517) i 1 nm E2 (estradiol).

Pożywka doświadczalna

Podstawową pożywkę DME-F12 uzupełniano 5% FBSA (bydlęca surowica płodowa adsorbowana na dekstranie-węglu drzewnym), 2 mM L-glutaminą. 100 U penicyliny G/50 pg siarczanu streptomycyny/ml pożywki oraz 50 ng/ml insuliny (Sigma). Do tej pożywki dodawano lifilizat i estradiol w stężeniu tak jak opisano dla komórek ZR75-1.

Przygotowanie FBSA

Bydlęcą surowicę płodową mieszano z 1% (w/v) węglem drzewnym (zasadowy węgiel do odbarwiania). Do roztworu surowicy-węgla drzewnego dodawano roztwór dekstranu T70 aby uzyskać stężenie 0,1% (v/v). Mieszaninę wytrząsano przez noc w4°C. Po odwirowaniu w4°C przez 30 minut przy 10000 x g surowicę dekantowano, ponownie mieszano z takimi samymi proporcjami węgla drzewnego i dekstranu, wytrząsano w temperaturze pokojowej przez trzy godziny i ponownie wirowano. Następnie surowicę inaktywowano termicznie w 56°C przez 20 minut, przesączano sterylnie i rozporcjowywano do sterylnych stożkowych probówek Falcona.

Komórki ZR75-1 i MCF-7 hodowano do osiągnięcia gęstości 20000 komórek na studzienkę w płytkach z 24 studzienkami lub 150000 komórek na studzienkę przy płytkach z 6 studzienkami, i badano w obecności lub nieobecności różnych stężeń liofilizatu przygotowanego jak opisano powyżej. Dla osiągnięcia tego skutku liofilizat ponownie zawieszono w pożywce, sterylnie sączono i tak otrzymane hydrorozpuszczalne składniki zostały odzyskane i zbadane. Wszystkie doświadczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Pożywki usuwano i wymieniano co dwa dni. Komórki hodowano w inkubatorze przy ciągle nawilżanej atmosferze zawierającej 5% CO2 w 37°C przez 17, 7, 3 lub 3 dni, co odpowiadało czterem kolejnym doświadczeniom. Mierzono zahamowanie wzrostu komórek przez bezpośrednie liczenie komórek lub mierzenie całkowitej zawartości DNA studzienki.

188 137

Stężenie liofilizatu	Hamowanie komórek (%)
	MCF-7	ZR75-1
1. eksperyment: 17 dni
1 mg/ml	1.5	2.00
5 mg/ml	14.33	33.6
10 mg/ml	62.66	90.8
2. eksperyment: 7 dni
1 mg/ml	3.73	0.97
5 mg/ml	15.7	29.0
10 mg/ml	68.37	66.0
3. eksperyment: 3 dni
50 mg/ml	95.8	95.00
100 mg/ml	94.6	98.00
4. eksperyment: 3 dni
10 mg/ml	34.4	51.5
20 mg/ml	62.5	70.5
50 mg/ml	95.8	95
100 mg/ml	94.6	98

Podane powyżej procenty zahamowania wzrostu komórkowego pokazują, że liofilizat może w sposób zależny od dawki hamować wzrost komórek tych dwóch linii komórkowych.

Figura 1 pokazuje, że dawki 50 i 100 mg/ml liofilizatu wyraźnie powodują hipoplazję w tych liniach komórkowych po trzech dniachpodawania.

Figura 2 pokazuje, że w obecności 10'^iydo 10'⁹ M estradiolu, komórki traktowane reagują tak jak komórki kontrolne ponieważ nie ulegają stymulacji przez te dawki hormonu. Jednak powyżej stężeń 1 nM komórki kontrolne są silnie stymulowane, a stężenia DNA osiągają 3,75 |ig w obecności 10'⁷ M estradiolu (w porównaniu 0,69 |ig w kontroli bez estradiolu). W komórkach traktowanych 30 i 50 mg/ml liofilizatu poziom DNA mierzony przy maksymalnej stymulacji wynosi odpowiednio 1,9 i 1,8 pg.

Figura 2 pokazuje, że stała powinowactwa (Km) komórek traktowanych estradiolem jest 3 do 16 razy wyższa (odpowiednio 31,3 nM i 174,0 nM) niż wartość Km komórek kontrolnych (11,7 nM), w obecności odpowiednio 30 i 50 mg/ml. Oznacza to, że są konieczne wyższe stężenia estradiolu dla uzyskania takiego samego wzrostu komórek jak w obecności liofilizowanego stałego wyciągu z chrząstki. Tak więc wyciąg ten obniża maksymalną odpowiedź (90% hamowania odpowiedzi) i zwiększa stałą powinowactwa traktowanych komórek w stosunku do estradiolu.

Oznaczenia in vivo

400 40-dniowych samic szczura rasy Sprague-Dawley (kupionych od Charles River Co., St. Constant, Quebec) adaptowano do ich otoczenia przez 12 dni. Po tym okresie podawano za pomocą zgłębnika 20 mg DMBA/ 1 ml oleju kukurydzianego (9,10 dimetylo-1,2-benzantracen, kupiony od Sigma Chemical Corporation). Trzy miesiące po tej procedurze u 240 szczurów rozwinął się rak sutka, i zostały one podzielone na dwie grupy. Pierwsza grupa składała się z 5 podgrup szczurów. Szczury z grup eksperymentalnych dostawały codziennie dawkę wzrastających stężeń liofilizatu w 3 ml wody przez osiem tygodni, podczas gdy grupa kontrolna dostawała taką samą objętość wody. Druga grupa była złożona z 4 podgrup szczurów. Szczury z grup poddawanych leczeniu otrzymywały codzienną dawkę liofilizatu w 3 ml wody (około 25 mg białka) z lub bez nadsączu, przez dziesięć tygodni, podczas gdy grupa kontrolna otrzymywała tę samą objętość wody. Tylko jedna podgrupa z drugiej grupy szczurów traktowanych stężeniem 3000 mg/kg/dzień liofilizatu i 3 ml supernatantu dostawała także śródotrzewnowy (i.p.) zastrzyk mniejszej dawki nadsączu (około 8 mg białka w 1 ml wody).

Szczury ważyły 151-175 g na początku obu eksperymentów i otrzymywały karmę i wodę do picia ad libitum. Pierwsza grupa szczurów miała guzy o przeciętnej średnicy 0,9 cm podczas gdy druga grupa szczurów miała guzy o przeciętnej średnicy 0,6 cm.

Wyniki można podsumować w następujący sposób:

Dzienne dawki wyciągu chrząstki podawanego przez zgłębnik	% zahamowania wzrostu guza (zmniejszenie średnicy guza w porównaniu z kontrolą)
1. doświadczenie: czas trwania 8 tygodni
500 mg/kg/dzień	2%
1000 mg/kg/dzień	4%
3000 mg/kg/dzień	14%
5000 mg/kg/dzień	15%
2. doświadczenie: czas trwania 10 tygodni
3000 mg/kg/dzień	12%
3000 mg/kg/dzień + 3 ml nadsączu	18%
3000 mg/kg/dzień + 3 ml nadsączu + 1 ml zastrzyku i. p. nadsączu	20%

Wyniki te wykazują, że liofilizat zawiera czynny składnik, który jest wchłaniany w przewodzie pokarmowym i który wpływa na wielkość guza. Efekt ten mógłby być bezpośrednim działaniem na komórki guza lub wynikiem działania przeciwangiogennego.

Wyniki te pokazują także, że nadsącz ma aktywność, która powoduje dodatkowe zmniejszenie guza o około 5%.

Wyniki te sugerują także, że liofilizat może zawierać składniki czynne, które nie są rozpuszczalne w wodzie i/lub zawiera resztki związków rozpuszczalnych w wodzie. W tym ostatnim przypadku można uznać, że osad można reekstrahować w roztworze wodnym w celu odzyskania maksymalnej ilości składników rozpuszczalnych w wodzie, o ile wydajność można nadal poprawić.

HISTOPATOLOGIA

Dla oceny toksyczności aktywnych cząsteczek wyciągu z chrząstki, zwierzęta użyte w opisanych powyżej doświadczeniach in vivo zostały zabite przez dekapitację i do analizy wzięto następujące tkanki: wątrobę, płuca, nerki, serce, mózg, mięśnie i gruczoł mleczny. Tkanki te pozbawiano tłuszczu a następnie utrwalano je dwa dni w płynie Bouina. Po odwodnieniu w etanolu, utrwalone tkanki zatapiano w parafinie. Otrzymywano przekroje tkanek, umieszczano na szkiełkach, barwiono hematoksyliną i obserwowano pod mikroskopem.

Badania histologiczne wykazały, że nie ma szkodliwych efektów przy stosowaniu najwyższych dawek samego liofilizatu (dane nie przedstawione) lub przy stosowaniu liofilizatu w połączeniu z nadsączem (p. fig. 3a i 3b, 4a i 4b, oraz 5a i 5b).

Sugeruje to, że liofilizat i nadsącz mają wybiórczą aktywność powodującą zmniejszenie wielkości guza.

W zrakowaciałym gruczole mlecznym (p. fig. 6a i 6b) zaobserwowano znaczne zmniejszenie powierzchni naczyń krwionośnych. Efekt przeciwnaczyniowy aktywnych cząsteczek jest więc potwierdzony przez uzyskane wyniki, które są podsumowane na następnym rysunku i histogramie:

188 137

Figura 7 pokazuje, że gdy stosowana była kombinacja liofilizatu (p.o.) z nadsączem (p.o. + i.p.) (p. fig. 6a i 6b) zaobserwowano zmniejszenie powierzchni naczyń krwionośnych guza o 55%.

Zmniejszenie wielkości nowotworu może być spowodowane poważnym zmniejszeniem jego unczynienia, bezpośrednim wpływem na komórki nowotworowe, lub przez kombinację obu tych zjawisk. Przeciwangiogenne działanie wyciągów przedstawiono powyżej. Bezpośredni wpływ może być związany z działaniem na komórki hormono-zależne, co wymaga jeszcze potwierdzenia in vivo.

Ponieważ wyżej wymienione wyniki pokazywały, że nadsącz wywiera dodatkowy efekt oprócz i poza działaniem liofilizatu na komórki ZR75-1, dalej badano jego składniki.

OTRZYMANIE PŁYNNYCH FRAKCJI ZAWIERAJĄCYCH CZYNNE CZĄSTECZKI

Zebrano chrząstkę rekina i preparowano jak opisano powyżej. Po odwirowaniu, odrzucono osad i nadsącz preparowano tak, jak opisano powyżej do etapu jałowego sączenia przez filtr 0,22 nm.

Nadsącz będzie dalej nazywany surowym przesączeni, tzn. produktem po ultrasączeniu.

Tak otrzymany surowy przesącz przepuszczano przez FPLC (Szybka Cieczowa Chromatografia Białek).

Warunki FPLC:

Kolumna: Hiload 26 mm x 60 cm Sephacryl S-300

System FPLC: od firmy Pharmacia

Wszystkie próbki sączono przez filtr 0,22 pm przed naładowaniem kolumny. Do elucji stosowano roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS) przesączony i odgazowany przez 15 minut. Objętość ładowanej próbki na ogół wynosiła 3,2 ml (do 13 ml). Tempo przepływu wynosiło 1 ml/minutę. Zbierano frakcje po 10 ml. Wyeluowane związki wykrywano badając absorpcję w ultrafiolecie (280 nm). Uzyskano krzywą kalibracji stosując zestaw do kalibracji MW-GF-1000 firmy Sigma, próba do kalibracji miała tę samą objętość co nałożona próbka do analizy (3,2 ml). Objętość elucji próbki dedukowano z wykresu masy cząsteczkowej związków z zestawu do kalibracji, w zależności od ich objętości elucji od której odejmowaną pustą objętość kolumny. Pustą objętość uzyskiwano przez wstrzyknięcie Dextran Blue (o m.cz. 2 000 000).

Aktywność frakcji testowano na komórkach ZR75-1. Interesujące frakcje identyfikowano i ich właściwości sprawdzano w dalszych badaniach (opisanych poniżej).

Dodatkową charakterystykę składników czynnych przesączu przeprowadzano na aparacie Rotofor (Biorad 170-2950; p. opis izoelektroogniskowania poniżej) i na filtrach Amicon o różnych wartościach odcięcia tak, by uzyskać frakcje o masie cząsteczkowej między 10-30 kD, 30-100 kD i ponad 100 kD.

Izoelektroogniskowanie:

Preparat z chrząstki rekina (46 ml przesączu 1 kg/l) dializowano przez noc wobec 4 litrów czystej wody zawierającej 5% glicerol w temperaturze 4°C stosując membranę Spectra pore #7 MWCO 3500 kD (Spectrum 132110). Dializowany roztwór zmieszano z 2,75 ml amfolitów (Pharmacia #80-1125-87) pH 3,5-10 i 0,5 g CHAPS (Sigma C3023;

3-[(cholamidopropylo)-dimetyloamonioJ-l-pi^opano-siarczan). Objętość uzupełniano do 55 ml czystą wodą. Roztwór nakładano na Rotofor. Izoelektroogniskowanie przeprowadzano w 4°C przy stałej mocy 12 watów (zasilacz 3000 XI firmy Biorad 165-0544) przy stałym krążeniu wody w celu zapewnienia utrzymania temperatury. Na początku rozdziału napięcie wynosiło 380 woltów a natężenie 31 mA. Po stabilizacji natężenia (na 14 mA) napięcie wynosiło 870 V. Izoelektroogniskowanie zakończono i zebrano 20 frakcji.

188 137

FRAKCJA	OBJĘTOŚĆ (ml)	pH
1.	3,7	3,56
2.	2,1	4,01
3.	2,2	4,18
4.	2,3	4,31
5.	2,2	4,63
6.	2,1	5,03
7.	2,5	5,30
8.	2,1	5,50
9.	2,4	5,81
10.	2,5	6,26
11.	2,3	7,00
12.	2,4	7,29
13.	2,4	7,64
14.	2,5	7,94
15.	2,3	8,32
16.	2,5	8,62
17.	2,4	8,94
18.	2,9	9,30
19.	3,1	9,88
20.	3,6	10,71

Identyfikacji tych białek dokonano przez określenie ich masy cząsteczkowej w elektroforezie na żelu (Laemmli, U.K. (1970) Naturę (Lond.) 227: 680).

Frakcje te rozcieńczono czterokrotnie buforem do nakładania próbek (p. Laemmli) i próbki 8 pl poddawano elektroforezie w warunkach nieredukujących. Figura 8 pokazuje profil elektroforetyczny każdej frakcji i materiału przed izoelektroogniskowaniem.

Wszystkie frakcje umieszczano w sposób sterylny wbutelekach stosując wyciąg typu laminar i przepuszczając je przez sterylny filtr Millipack-60 o porach 0,22 pm.

Zawartość białek we frakcjach oznaczano metodą Lowry'ego. Roztwory 1 kg/2 l (wyrażone jako waga surowej chrząstki na litr przesączu) testowano na komórkach ZR75-1 w różnych stężeniach w pożywce hodowlanej. Wyniki można streścić w następujący sposób:

1. test

Przesącz liofilizowano ponownie zawieszono w PBS i przepuszczano przez FPLC. Nie wykryto aktywności hipoplazyjnej (dane nie przestawione).

2. test

Testy przeprowadzone na frakcjach z Rotofora (przesącz był zatężany przez odparowanie). Identyfikacja białek.

Zidentyfikowane frakcje	Punkt izoelektryczny	Wartość środkowa	Masa cząsteczkowa
7-8-9-10	530-6,26	5,78	29 ± 1 kD
7-8-9	530-6,26	5,68	60 ± 1 kD
12-13-14	7,29 - 7,94	7,62	48 ± 1 kD
13-14	7,64 - 7,94	7,79	35 ± 1 kD

3. test przeprowadzony dla frakcji FPLC

Frakcje	Masa cząsteczkowa
6 i7	1-2,5 kD

4. test przeprowadzony na 1 00 u1 frakcjach uays karnych na s ącakach molekularnych

Amicon

Badane stężenie	Masa cząsteczkowa	Hamowanie hodowli komórek ZR75-1
100 pg/ml	MW > 100 kD	64%
100 pg/ml	30 kD < MW > 100 kD	114%
100 pg/ml	10 kD < MW < 30 kD	127%
400 pg/ml	MW < 10 kD	149%

Frakcje FPLC 6 i 7 zawierają czynne składniki o bardzo niskiej masie cząsteczkowej: 1 do 2,5 kD.

Efekt hipoplastyczny frakcji może być do 33000 razy wyższy od obserwowanego dla liofilizatu. Powyższe wyniki wykazują, że liofilizacja wydaje się wywoływać pewne straty bezpośredniej aktywności przeciwnzwotwzrzwej białek zawartych w eluacie podczas gdy takie straty nie zachodziły przy liofilizacji stałego wyciągu. Sugeruje to, że czynny składnik obecny w cząsteczkach chrząstki wydaje się być w środowisku takim, w którym jest mniej wrażliwy na denaturujący wpływ liofilizacji. Ponieważ efekt hipoplastyczna jest wrażliwy na liofilizację, gdy liofilizat jest zawieszony w wodzie, prawdopodobne jest, że dodatek stabilizatorów lub czynników ochronnych do całkowitego ekstraktu lub poszczególnej jego frakcji wykazującej tę aktywność przed liofilizacją w znacznym stopniu zachowałby tę aktywność.

Dalsza identyfikacja czynnych składników eluatu

Aktywne frakcje (badane na komórkach ZR75-1) są odzyskiwane w następujących zakresach mas cząsteczkowych, określonych przy innym typie oczyszczania wychodząc z tego samego przesączu (1 kg/l) na kolumnie Superose-12 o średnicy 10 mm i długości 30 cm stosując opisane powyżej procedury FPLC i Rotoforu. Wybrano tempo przepływu 1 ml/minutę. Zebrano 45 frakcji po 1 ml.

Frakcje 20-21	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 70 do 120 kD
Frakcja 22	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 60 do 70 kD
Frakcje 29-32	aktywność we zachodzących na siebie frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 70 do 120 kD
Frakcje 34-35	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 29 kD
Frakcje 38-39	aktywność odpowiadająca masie cząsteczkowej 1,5 do 2,5 kD

SPECYFICZNOŚĆ

Aby ocenić specyficzność działania na komórki guza, przesącz otrzymany po ultrafiltrowamu testowano na innych komórkach pochodzących z mezecchyma - ludzkich fibroblastach TENON (HTF), które są normalnymi fibroblastami.

B. In Vitro

a. Pacjenci

Stosowano tylko HTF od dwóch pacjentów (jeden z nich był chory na jaskrę neowaskulamą, NVG, a drugi na pierwotną jaskrą o otwartym kącie przesączania, POAG).

b. Przyrządzanie subkultur i hodowanie HTF

188 137

Każdą konfluentną hodowlę pasażowano przez płukanie i odczepianie 0,5 ml 0,05% trypsyny/0,5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) przez 5-10 minut w 37°C. Następnie dodawano 1,5 ml pożywki DME/F-12 zawierającej 15% FBS w celu unieczynnienia trypsyny/EDTA.

Asocjację komórek robiono przez sproszkowanie, mieszanie i przeniesienie do T-butelek 25 cm³ do których dodawano dodatkową pożywkę zawierającą 10% FBS. Po uzyskaniu konfluencji, HTF przenoszono do butelek T-75 cm3 i w końcu do butelek T-180 cm³. Po uzyskaniu dostatecznej ilości komórek niektóre komórki stosowano do doświadczeń opisanych poniżej, a inne zamrażano równocześnie, by zachować komórki z tego samego pasażu do kolejnych doświadczeń.

c. Protokoły doświadczalne

Po osiągnięciu konfluencji, komórki pochodzące od jednego pacjenta rosnące w dwóch lub trzech takich samych butelkach typu T o pojemności 180 cm³ dysocjowano według opisanej powyżej procedury. Po krótkim odwirowaniu przy niskiej prędkości liczono je stosując licznik ZMI Coulter 216013 wyposażony w 256-Channelyzer.

Dla wszystkich opisanych poniżej eksperymentów in vitro zaszczepiano około pięćdziesiąt tysięcy komórek do 1 ml pożywki DME/F-12 zawierającej 1% FBS do każdej płytki 16 mm i płytki z 12 studzienkami. Siedemnaście godzin po zaszczepieniu dodawano 1 ml świeżej takiej samej pożywki uzupełnionej 1% FBS (kontrole „absolutne”). Zależnie od protokołu doświadczalnego (p. powyżej i poniżej) do pożywki z 1% FBS dodawano - lub nie dodawano -czynniki wzrostowe (GF) lub przesącz 1 kg/2 l (masa chrząstki/objętość wody) i sączono w sposób jałowy. W tym dniu (dzień 0) liczono próbki komórek by określić wydajność wzrostu (powinna być równa lub większa od 95%).

Czterdzieści osiem godzin po rozpoczęciu doświadczeń komórki płukano i dysocjowano stosując powyżej opisaną procedurę i ponownie liczono. Liczbę komórek wyrażano jako procent uzyskanej liczby w kontrolach „absolutnych”.

Każda kontrola „absolutna” czyli pozytywna zawierająca odpowiednio 1% lub 5% FBS i odpowiednio każda grupa doświadczalna uzupełniona 1% FBS i poszczególnymi czynnikami wzrostowymi lub przesączem chrząstki składała się z trzech powtórzeń.

Każdy eksperyment przeprowadzano na komórkach jednego lub dwóch pacjentów równocześnie i powtarzano przynajmniej dwa razy.

Stymulację wzrostu fibroblastów przez czynniki wzrostowe (GF) lub przesącz chrząstki porównywano ze stymulacją przez 5% FBS.

W tych doświadczeniach GFy, PDGF (świński czynnik wzrostowy płytek krwi- pPDGF) i ludzki rekombinowany zasadowy czynnik wzrostowy fibroblastów-bFGF (hr bFGF - dar dla Dr P. Brazeau od Farmitalia Carlo Erba, Mediolan, Włochy) były dodawane w stężeniach 10 do 100 ng/ml w 1% FBS, odpowiednio. Czterdzieści osiem godzin po rozpoczęciu doświadczenia komórki dyspergowano Trypsyną-EDTA i liczono w liczniku Coultera.. Wszystkie wartości trzech powtórzeń (kolumny 1, 2 i 3) podane poniżej odpowiadają jednej dwudziestej zliczeń na studzienkę.

Pacjent B:	Jaskra	Płeć: męska	Wiek: 53 lata
HTF
Dzień -1:	liczba komórek na kieszonkę 46170 DME/F12 - 1% FBS - 1% Pen. Strep.
Dzień - 0:	liczba komórek na kieszonkę 65214 DME/F12 - 1% FBS - 1% Pen. Strep.
Dzień - 1:	liczba komórek na kieszonkę 62548 DME/F12 - 1% FBS -1% Pen. Strep.
Dzień - 2:	liczba komórek na kieszonkę: DME/F12 - 1% FBS - 1% Pen. Strep.	nb cell/count

188 137

	Próba/ płytka DME/F12	1	2	3	średnia	SEM	% wzrostu kontroli
Płytka #1		Dzień 0	3,0	2,8	2,8	65,214	71
FBS	1	1% FBS	19	62	53
	2	Dzień +1	2,7	2,9	2,6	62,548	1,655
		1% FBS	11	73	93
	3	Dzień +2	2,2	2,4	2,1	51,333	1,655	100
		1% FBS	84	00	91
	4	Dzień +2	3,0	2,8	3,1	67,446	1,627	131
		5% FBS	84	34	15			**
Płytka #2		DME/F12
FDGF	5	Kontrola	2,5	2,1	2,2	51,931	2,19	100
		(1% FBS)	58	81	16		9
	6	1 ng/ml	2,4	2,5		56,056	1,228	108
		1% FBS	25	80
	7	10 ng/ml	4,0	3,9	4,2	92,116	1,648	177
		1% FBS	80	75	82
	8	100 ng/ml	4,6	4,3	4,4	100,285	1,442	193
		1% FBS	25	56	50			***
Płytka #3		DME/F12
b-FGF	9	Kontrola	2,91	2,5	2,5	59,360	2,429	100
		(1% FBS)	5	33	02
	10	1 ng/ml	2,74	2,5	2,7	60,174	1,213	101
		1% FBS	4	54	61
	11	10 ng/ml	3,60	3,1	3,1	74,234	2,683	125
		1% FBS	6	43	93
	12	100 ng/ml	4,06	3,0	3,0	75,585	6,307	127
		1% FBS	4	33	26
Płytka #4		DME/F12
Chrząstka	13	Kontrola	2,82	2,5	2,4	58,822	1,877	100
1 Kg/2L		(1% FBS)	6	66	86
(przesączona)	14	1 ąl/ml	2,72	2,5	2,5	58,837	936	100
		1% FBS	9	76	75
	15	10 jul/ml	2,64	2,4	2,5	57,643	798	98
		1% FBS	3	93	84
	16	100 ąl/ml	2,91	2,8	2,7
		1% FBS	8	83	66	58,483	2,461	99

** Ρ < 0,02; “* Ρ < 0,01 Według testu Studenta-Fischera

Podczas gdy czynniki wzrostowe takie jak PDGF (czynnik wzrostowy płytek krwi) i bFGF (zasadowy czynnik wzrostowy fibroblastów) wykazują stymulujące działanie na HTF, nie stwierdzono żadnego efektu, negatywnego czy pozytywnego, gdy komórki te są hodowane w obecności przesączu chrząstki (1 kg/2 1). Sugeruje to, że przesącz daje efekt hipoplastyczny, który jest specyficzny w stosunku do komórek nowotworowych bez wykrywalnego wpływu na komórki normalne. Ten sam wyciąg z chrząstki nie miał także wpływu na inny typ fibroblastów ludzkich, HSF (ludzkie fibroblasty skóry - dane nie przedstawione). Choć nie było to badane, zakłada się, że liofilizat także nie wykazuje efektów w stosunku do normalnych komórek.

PORÓWNANIE Z JUŻ ZNANYMI PRODUKTAMI

Ponieważ nie my pierwsi wykazaliśmy wielkie zainteresowanie wyciągami chrząstki, sprawdziliśmy unikalny charakter płynnego wyciągu z chrząstki rekina przygotowanego wg ujawnionego procesu, w badaniach porównawczych z dwoma produktami opisanymi uprzednio lub wywiedzionymi z uprzedniego stanu wiedzy, to znaczy przygotowanymi metodą Balassy (USP 4,822,607) i Oikawa i wsp. (dzieło cytowane).

Oikawa i wsp. opisują metodę otrzymywania dwóch głównych frakcji, jedna zawiera cząsteczki o masach cząsteczkowych zawartych między 1 i 10 kD a druga cząsteczki cięższe

188 137 od 10 kD. Przypisują oni właściwości przeciwangiogenne tylko pierwszej frakcji, twierdząc, że druga jest pozbawiona jakiejkolwiek aktywności przeciwangiogennej w teście CAM. Aby odpowiednio porównać produkty Oikawy, frakcjonowaliśmy nasz całkowity płynny wyciąg na dwie odpowiadające frakcje, i zachowaliśmy frakcję mającą 1 do 10 kD. Ponieważ Balessa opisuje procedurę ekstrahowania całkowitego wyciągu płynnego, porównaliśmy nasz całkowity płynny wyciąg z chrząstki (1 do 500 kD) do produktu przygotowanego przez powtórzenie metody Balassy, zastępując chrząstkę cielęcą chrząstką rekina jako materiałem wyjściowym. Zakładamy, że jeśli Balassa i Oikawa opisują równoważny proces wzory otrzymane w FPLC i HPLC powinnym w znacznym stopniu być podobne, i produkty badane w teście CAM powinny wykazywać aktywność podobną do naszych. Wszystkie próbki doprowadzono do ostatecznego stężenia 12 pg/ul (sucha masa/objętość roztworu) przed chromatografią FPLC i HPLC. Produkt Oikawy wirowano i sączono przed chromatografią ponieważ zawierał materiał nierozpuszczalny.

A) Warunki FPLC: Superoza 12 (Pharmacia) kolumna do przepuszczania żelu.

B) Warunki HPLC: Kolumna CS_5-heksylowa, 5 pm, 25 x 0,94 cm, CSC#059-085, kolumna do fazy odwróconej.

Próbki chrząstki rekina wyekstrahowane trzema metodami oznaczano (z oszacowaną suchą masą na objętość roztworu) w sposób następujący:

1. DUP to preparat ujawniony w obecnym wynalazku frakcjonowany tak, by zawierał cząsteczki między 1 i 500 kD (12 pg/pl);

2. BAL to preparat według metody Balassy i wsp. (12 pg/pl).

3. OIK to preparat frakcji 3 według Oikawy i wsp. (270 pg/pl). Wszystkie próbki doprowadzano do końcowej objętości 12 pg/pl (sucha masa/objętość) przed analizą. Próbka OIK zawierała dużą ilość nierozpuszczalnego materiału, który mógł być łatwo osadzony przez wirowanie przy 13200 obr/min lub sączenie przez błonę 0,2 pm. Sączenie lub zatężanie nierozpuszczalnego materiału było niezbędne przed FPLC i HPLC (A,B).

A) Streszczenie wyników FPLC

Próbki nakładano na kolumnę do sączenia na żelu Superose 12 z roztworem soli buforowanej fosforanem (PBS) jako eluentem przy tempie przepływu 0,5 ml/min (szybkość wykresu 0,25 cm/min). Próbki 100 pl o odpowiednio dobranym stężeniu sączono przez błonę 0,2 pm przed wstrzyknięciem. Śledzono ÓD280.

Kolumnę kalibrowano następującymi standardami (MW w daltonach): katalaza (232,000), aldolaza (158,000), albumina (56,000), owoalbumina (44,000), chymotrypsyna (25,700), rybonukleaza (13,700), insulina (5,700), łańcuch B insuliny (3,500), łańcuch A insuliny (2,500), bacytracyna (1,450), witamina B-12 (1,355). Masy cząsteczkowe głównych szczytów wyliczano przy następującym równaniu logi()M.CZ.= 7,52 - 0,212 x RT, gdzie RT = objętość elucji w ml. R⁷ = 0,976. Całkowita objętość kolumny (Vt) wynosiła 21,93 ml co określono stosując cytydynę (246 Da). Ustalono, że objętość pusta (Vq) wynosi 8,38 stosując Blue Dextran (2x10⁶ Da).

Na fig. 10a nasza próbka DUP ma pierwszy główny pik (1) który eluuje przy 18,76 co odpowiada masie cząsteczkowej 3500 Da. Kolejne piki przy 22,7 (2) i 27,3 (3) ml były poza całkowitą objętością kolumny (21,93 ml, ustalone za pomocą cytydyny). Te piki wydają się mieć pewne powinowactwo dla nośnika kolumny.

Na fig. 10b próbka Balassy BAL ma mały pik (1) eluujący w pobliżu V0 kolumny (8,4 ml), pik (2) przy 18,5 ml (4000 Da) i dwa piki eluujące po Vt(3) przy 22,6 ml i (4) przy

28,2 ml.

Na fig. 10c próbka Oikawy OIK także ma mały pik (1) przy V0, pik (2) przy 18,9 ml (3300 Da), pik (3) przy 21,5 ml (1000 Da) i mały pik (4) przy 27,3 ml.

Przy porównywaniu próbek jest widoczne, że poza pikiem 3300 Da główne prążki próbki DUP nie były obserwowane z tą samą intensywnością w innych próbkach. Próbka OIK posiada małą ilość piku 27,3 ml. Próbka BAL ma pik migrujący przy 28,2 ml który może korelować z jednym z mniejszych pików w próbce DUP.

188 137

B) Streszczenie wyników HPLC

Dla HPLC na kolumnie heksylowej odwróconej fazy równocześnie monitorowano OD210 i OD280. 50 pl próbki odwirowanych próbek (wszystkich w stężeniu 12 pg/pl) nakładano i eluowano 100% H₂O. Szczyty dla każdego chromatogramu oznaczone zgodnie zOD210 (eg. 1) i odpowiednie piki OD280 zaznaczano '(eg. 1)'. V0 tej kolumny wyniosła

5,5 ml (1,4 min).

Na fig. 11 a, DUP ma 3 główne piki obserwowane przy OD210 (1,2,3) i 2 mniejsze piki (4,5). Dwa boczne piki przy piku 1 oznaczono la i 1b. Znacząca absorpcja przy OD280 była związana z pikami 1, 1a, 1b i 3. W porównaniu, odpowiedni ÓD280 dla piku 2 jest znacznie mniejszy w porównaniu z OD210.

Na fig. 11 b BAL wykazywał więcej pików przy OD210, ale intensywności były niższe w porównaniu do pików DUP. Ponieważ nakładanie się pików może tylko dać wskazówkę co do tożsamości cząsteczek, tylko piki 3 i 7 z próbki Balassy wydają się korelować z czasami retencji pików w próbce DUP (piki 1a lub 1b i pik 4, odpowiednio).

Na fig. 11c zaobserwowano tylko 3 główne piki w wyciągu OIK. Piki 1 i 3 mogą korelować z pikami 1 i 3 próbki DUP ale na chromatogramie OlK nie zaobserwowano bocznych pików w piku 1. Wysokości pików w próbce OIK były niższe niż w DUP. Choć wzory FPLC i HPLC są charakterystyczne dla odrębnych produktów, sprawdziliśmy aktywności przeciwangiogenne trzech produktów w testach CAM.

Test CAM:

Testy CAM wykonano najpierw stosując różne stężenia protaminy (37, 75 i 150 pg). Krążek metylocelulozy zawierający wodę i drugi krążek zawierający protaminę jako kontrolę pozytywną umieszczano na kosmówce omoczniowej zarodka kurczęcia (n=liczba analizowanych zarodków). Na każdym krążku umieszczano pierścień w kształcie litery O krążku by ułatwić ich znajdowanie. Następnego dnia poziom unaczynienia w każdym krążku O był określany przez parę naukowców w zwykły sposób tzw. ślepy. Skala ocen dla testu CAM oparta na wartościach 1 -2-3 : (wartość = 3) normalne unaczynienie w porównaniu z przeciwległą horyzontalną ćwiartką lub odpowiednią ćwiartką kontrolnego zarodka; (wartość = 2) naczynia krwionośne wnikają do pierścienia O ale znikają w połowie drogi. Główne naczynia krwionośne przechodzą przez pierścień O ale widać wyraźny wpływ na ich przebieg. Zmniejszona ilość odgałęzień, zmniejszony obszar naczyń ćwiartki w pobliżu pierścienia O; (wartość = 1) Brak naczyń krwionośnych lub odchylonych naczyń krwionośnych w obrębie pierścienia O. Naczynia krwionośne nie rosną poza pierścień O chyba, że go omijają i rosną poza nim. Obszar naczyń w ćwiartce wyraźnie zmniejszony w pobliżu pierścienia O. Na fig. 12 wartości powyżej każdej kolumny pokazują ostateczny wynik dla każdej próbki. Zastosowano test statystyczny Wilcoxona by porównać znaczenie różnic między dwoma krążkami umieszczonymi na tym samym jaju. Zgodnie z oczekiwaniem obserwuje się zależność między odpowiedzią i dawką.

W tych samych warunkach badano frakcje DUP niższe i wyższe od 10 kD. Okazały się równie skuteczne (fig. 13) w hamowaniu unaczyniania de novo.

Nasz całkowity wyciąg DUP został porównany z produktem przygotowanym metodą Balassy BAL. Nie wykryto znaczącej aktywności przeciwangiogennej w produkcie Balassy (fig. 14).

Surowy wyciąg DUP porównano z frakcją 3 w OIK Oikawy. DUP i OIK były nieomal równoważne (fig. 15). Oikawa i wsp. jednak w odróżnieniu od obecnego wynalazku stwierdzili, że nie wykrywa się żadnej aktywności we frakcji o masie cząsteczkowej większej od 10 kD, co jest sprzeczne z naszymi wynikami z fig. 13.

Tak więc mimo podobieństw między procesem naszym i Balassy, produkty uzyskiwane w obu procesach są ewidentnie nie takie same.

Dwa produkty według uprzedniego stanu wiedzy porównane z naszym są jednak oceniane jako klasyczne metody przygotowywania wyciągów z chrząstki. Powyższe wyniki pokazują, że obecny proces dostarcza produkty o nieoczekiwanie dobrej aktywności, o ile chodzi o aktywność przeciangiogenną. Ponieważ inne rodzaje aktywności zostaną sprawdzone jak

188 137 podano poniżej, możemy założyć, że obecnie ujawniony proces istotnie umożliwił odzyskanie wielu aktywności rozpuszczalnych w wodzie i zawartych w pojedynczym ekstrakcie.

PRÓBY KLINICZNE

Przed przystąpieniem do wstępnych prób klinicznych surowy przesącz uzyskany po ultrasączeniu został zatężony 2 i 20 razy dając wzbogacony czynny przesącz. Te poziomy stężeń uzyskano na kolumnie do sączenia o przepływie stycznym o porowatości 1000 daltonów, co obniżyło objętość eluatu 2 i 20 razy. Zatężony przesącz przepuszczono przez filtr millipore 0 wielkości porów 0,22 pm. Gdy chrząstkę obrabiano alternatywną metodą wirowania (stosując wirówkę CEPA z membraną o porach 30 pm) uzyskano dziesięciokrotne zatężenie, co dało stężony wyciąg mający prawie taki sam poziom białek jak powyższy wyciąg zatężony 20 razy,np. 12-25mg/ml (me pszona metoda) zamiast 8-12 mg/ml (metoda na ska!ę laboratoryjną). Jałowy 10x stężony przesącz rozporcjowywano po 7 ml (około 85 mg białka) do jałowych butelek, zamrażano w -80°C przez noc, a następnie przechowywano w -20°C do momentu wykorzystania. Główna różnica pomiędzy przesączem surowym i stężonym polega na stężeniu białek. Należy zauważyć, że metoda stosowana do oznaczenia stężenia białek mierzy związki azotowe, a nie tylko białka (metoda Κ)οΜ-Η1-). Może to tłumaczyć dlaczego stężenie białek nie wzrasta proporcjonalnie do poziomu zatężenia objętości, co na ogół stwierdza się, gdy stężenie białka jest oznaczane metodą Low-r/ego. Zakłada się, że etap zatężania pozwala na przenikanie wody jak i związków azotowych o niskiej masie cząsteczkowej.

EFEKT PRZECIWANGIOGENNY

Stężony przesącz stosowano do leczenia chorób zależących od angiogenezy. W praktyce przebadano trzy różne typy chorób reprezentujących choroby zależne od ang^e^zy: pierwsza to nowotwór (rak prostaty), druga - choroba dermatologiczna (łuszczyca), a trzecia to artretyzm. Przykłady poniżej ilustrują i wskazują aktywność nrzeciwanglogenną płynnego wyciągu.

Wśród chorób dermatologicznych wybrano przypadki łuszczycy. Wśród badanych przypadków łuszczycy należy zauważyć różnicę pomiędzy przypadkami z komplikacją hiperkeratozy i przypadkami bez komplikacji. Składnik kerotyczny tej choroby to wytwarzanie zrogowaciałej otoczki w formie płytki. Taka płytka tworzy barierę fizyczną, która hamuje skuteczne wnikanie czynnych składników do naczyń krwionośnych.

Pacjent cierpiący na raka prostaty dobrowolnie spróbował 10 razy stężony przesącz z chrząstki. Pacjent ten przeszedł serię kolejnych konwencjonalnych terapii, które przejściowo przyniosły poprawę. Niedawno rozpoczął pobieranie ekstraktu chrząstki po nawrocie jego nowotworu.

Inni ochotnicy cierpiący na artretyzm i uprzednio leczeni, lub nie leczeni (nredniznnem) rozpoczęli spożywanie stężonego wyciągu chrząstki. Ich stan uległ poprawie, co było widoczne jako zmniejszenie bólu i sztywności w stawach.

Zaprezentowane poniżej wyniki są bardzo zachęcające i uważane są za zapowiadające użyteczność surowego przesączu i jego frakcji wlaczaniu wszystkich chorób zależnych od ang^e^zy, a nie tylko dla specyficznych przebadanych przypadków. O ile choroba ma komponentę angiogenną, uważa się, że ekstrakt chrząstki według wynalazku będzie skuteczny w tym aspekcie o ile preparat zawiera jego skuteczną ilość i o ile ten preparat jest w odpowiedniej formie do właściwego podawania. Tak więc winno być właściwie ocenione, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do następujących specyficznych kompozycji do stosowania w leczeniu chorób angiogennych, ponieważ ekspert w tej dziedzinie byłby w stanie otrzymać liczne preparaty, w których wybór byłby sterowany przez sposób podawania i docelową chorą tkankę. Preparaty mogą być podawane różnymi drogami: np. miejscowo, doustnie, podjęzykowo, doodbytniczo, dożylnie, domięśniowo, przez dyfuzję itp.

Ze względu na rybi smak i zapach wyciągu z chrząstki, mogą być dodawane do tych kompozycji substancje smakowe lub zapachowe by zachęcić pacjenta do ich przyjmowania.

ŁUSZCZYCA

Sporządzono następujący preparat dermatologiczny i badano jego skuteczność u osób chorych na łuszczycę:

- Emulgade™ CLB 29% (w/w)

188 137

- 20x surowy przesącz 69,5% (w/w)

- Germaben™II 1% (w/w) i

- Lavandula angustifolia 0,5% (w/w)

Emulgade™ (mieszanina estrów stearynianowych, alkoholi tłuszczowych i niejonowych emulgatorów - kupiony od Henkel Canada Ltd.) podgrzano do 65-70° przy mieszaniu. Grzanie wyłączono nie przerywając mieszania. Gdy mieszanina osiągnęła temperaturę 45°C dodano olejek Lavandula angustifolia i środek konserwujący Germaben™ (diazzcidalomocznik 30%, metyloparaben 11%, propyloparaben 3% i glikol propylenowy 56% - kupiony od Sutton Laboratories, NJ, USA). Gdy temperatura mieszaniny osiągnęła 30°C dodano wyciąg z chrząstki. Tak otrzymana kompozycja była gładkim, nietłustym kremem; przez zmienianie procentu zawartości Emulgade™ można uzyskać inne formy kompozycji dermatologicznych 0 różnej lepkości, zgodnie zaleceniami producenta (mleczko, emulsja, maść). Inne nośniki lub zarobki mogą być stosowane, by uzyskać pasty, żele czy inne formy tracsdermalnych preparatów.

Powyższy preparat podawano dwa razy dziennie przez dwanaście tygodni grupie 9 pacjentów (aplikacja miejscowa) cierpiących na łuszczycę, którzy reagowali na stosowane terapie konwencjonalne, ale po pewnym czasie stali się na nie oporni. Do tych badań wybrano pacjentów z podobnym i symetrycznym rozwojem łuszczycy na obu kończynach bocznych. Próby prowadzono metodą podwójnej ślepej - ani dermatolog ani pacjenci nie wiedzieli, która chora strona była traktowana preparatem zawierającym wyciąg z chrząstki, a która preparatem kontrolnym. Uderzającą poprawę zaobserwowano u pięciu pacjentów, których łuszczyca nie miała komplikacji hiperkeratozy, fotografie części ciała dwóch pacjentów pokazano na fig. 9a 1 9b. Na fig. 9a pokazano, że pacjent chory na łuszczycę z hiperkeratozą jednak wykazuje bardzo znaczącą poprawę, zmniejszenie rumienią, bez świądu, po tylko jednym miesiącu leczenia. Jednak pozostała znaczna hiperkeratoza. Zdjęcia drugiego pacjenta chorego na łuszczycę bez komplikacji hiperkeratozy (fig. 9b) pokazują znacznie lepszą poprawę po leczeniu przez 3 miesiące. Ponieważ łuszczyca wydaje się być chorobą wieloczyrniikową, zakłada się, że odpowiedź pacjentów zależy od znaczenia czynników takich jak angiogeneza i zapalenie w powstaniu i utrzymywaniu tego stanu. Działalność przeciwangiogenna jest w istocie obecna w naszym preparacie, jak wykazano u szczurów traktowanych DMBA i w testach CAM. Sprawdzono także aktywność przeciwzapalną (dyskusja poniżej). Jest prawdopodobne, że byłoby możliwe uzyskanie lepszych wyników, jeśli ten typ preparatu byłby uzupełniany innymi środkami terapeutycznymi działającymi na inne związane z chorobą czynniki (środki keratzlitahzne, dodatkowe środki przeciwzapalne, actahistamiczwe, immunosupreczra itp.).

To uzupełnianie może przyjąć formę poprawienia formulacji tak by zawierał skuteczne ilości np. środka keratolitycznego. Mogłoby to być też osiągnięte przez oddzielne podawania takiego komplementarnego środka terapeutycznego razem lub naprzemiennie ze stosowaniem obecnego miejscowo stosowanego preparatu. Co więcej, komplementarny lek nie musi być podawany tą samą drogą.

Powyższy preparat nie wykazał żadnych efektów zgólcoustrojowach (efekt ogranicza się do miejsc traktowanych lekiem) i nie wykazał żadnych efektów ubocznych mimo wysokich zawartości wyciągu chrząstki.

NOWOTWORY:

Pacjent cierpiący na raka prostaty był leczony dawką 10-krotcegz koncentratu. W 1986 r. ndiagcznzwacz u niego gruczolakorak. W tym czasie rozpoczęto radioterapię. W 1991 poziom PSA (antygen prostaty w surowicy) wynosił 138 pg/1, podczas gdy górny limit normy wynosi 4 pg/1. Pacjent został poddany zupełnie innemu typowi terapii poprzez kastrację połączoną z terapią przeciwandrogenową (Euflex™). To leczenie było skuteczne przez trzy lata, po czym poziom PSA zaczął znowu rosnąć. Od czerwca 1994 pacjent spożywa 10x przesącz (codzienna dawka podjęzykowa około 75 mg białka/7 ml wody destylowanej, odpowiadająca około 1-1,5 mg na kg masy ciała/dzień. Choć znaczna część tej dawki jest połykana, jest ona prawdopodobnie wchłaniana w przewodzie pokarmowym, o ile można polegać na wynikach opisanych powyżej dla zwierząt traktowanych DMBA. Poziomy PSA spadły z 12 do 0,9 pg/ml (ostatnie wyniki uzyskano w maju 1995). Ten sposób podawania dawki może też

188 137 być modyfikowany zależnie od drogi podawania, biodostępności składników czynnych i pożądanej agresywności, która ma być kontrolowana w przebiegu patologia. W tym czasie sprawdzono brak działania toksycznego u szczurów (patrz przykłady powyżej) i u ludzi (dane nie przedstawione).

W drugim doświadczeniu in vivo przeprowadzonym na szczurach traktowanych DMBA, dawka płynnego wyciągu była około 190-220 mg białek na kg masy ciała, co prawdopodobnie miało duży wpływ na zmniejszenie powierzchni naczyń krwionośnych nowotworu (55% w związku ze znacznie większą dawką liofilizatu). Zakłada się więc, że dawka około 1 do około 200 mg/kg masy ciała dziennie jest rozsądnym zakresem dawek średnich (ED50) dla leczenia nowotworów przez zmniejszenie lub wyłączenie angiogenezy.

ARTRETYZM

Pacjenci cierpiący na artretyzm jako ochotnicy przyjmowali jedną do dwóch jednostek 7 ml całkowitego wyciągu płynnego dziennie przez kilka miesięcy. Pacjenci ci zaobserwowali stopniową poprawę ich stanu przez przywrócenie funkcji stawów, zmniejszenie bólu i zapalenia (do około 60%). Ponieważ artretyzm ma składniki angiogenne i zapalne, powyższy efekt może być przypisany właściwościom przeciwangiogennym i przeciwzapalnym wyciągu z chrząstki.

EFEKTY INNE NIŻ PRZECIWANGIOGENNE

TRĄDZIK:

Mimo iż wynalazcy nie słyszeli dotąd, aby trądzik klasyfikowano jako chorobę o czynniku angiogennym, było jednak interesujące przebadanie płynnego wyciągu chrząstki u pacjentów cierpiących na tę chorobę, sporządzono więc następujący preparat żelowy:

Carbopol™	1,2%
Czysta woda	Π2%
NaOH	0,3%
Fenoksetol™	0,3%
Tween 80™	0,3%
2 x wyciąg chrząstki	20,0%
40 x wyciąg z aloesu	0,5%
Wyciąg 2x chrząstki zawiera 9-12 mg/ml białek. Preparat ten daje uderzającą poprawę

wyglądu skóry pacjentów cierpiących na mniej lub bardziej ostre formy trądziku (trądzik zapalny i trądzik torbielowaty; dane nie przedstawione).

Te zadziwiające wyniki mogą być efektem działania przeciwnaczyniowego (co by wskazywało na komponentę angiogenną trądziku) lub też wynikiem działania składników czynnych o innym efekcie niż przeciwnaczyniowy (np. działanie przeciwzapalne, p. dyskusja poniżej).

Wszystkie wyniki uzyskane w powyższych próbach klinicznych pokazują duży potencjał płynnego wyciągu chrząstki w leczeniu chorób zależnych od angiogenezy i/lub zapalnych. Ilość wyciągu chrząstki jak i jego preparat może być zmieniany, tak by spełnić konkretne wymagania.

Można zauważyć, że o ile chodzi o zawartość białek, preparaty do miejscowego stosowania na skórze i wszystkie inne preparaty mogą zawierać szeroki zakres dawek wyciągu z chrząstki. Wśród trzech specyficznych badanych kategorii przypadków stosowano bardzo różne dawki i/lub preparaty. Dla wszystkich przewidywanych aplikacji w chorobach zależnych od angiogenezy (od kropli do oczu poprzez preparaty dermatologiczne i preparaty do terapii nowotworów) zakłada się, że minimalne końcowe stężenie białka w surowym przesączu może być bardzo niskie (od około 0,1 mg/ml). Ten niższy zakres dawki zależy od dostępności i przenikania aktywnych składników czynnych do miejsca działania jak i od skutecznego wyłapywania tych składników i czułości, czy odpowiedzi tkanki na inhibitory angiogenezy. Górna granica ostatecznego stężenia białka w preparatach do pewnych zastosowań nie jest obecnie znana. Najwyższe badane końcowe stężenia wynosiły około 9 mg/ml białek w preparatach do leczenia łuszczycy i około 12 mg/ml w dawce jednostkowej 7 ml podawanej w przypadku raka prostaty.

188 137

Jak wspomniano powyżej, płynny wyciąg z chrząstki rekina może tracić pewne aktywności przy liofilizacji w roztworze wodnym. Jednak dodatek przed liofilizacją znanych w tej dziedzinie wiedzy stabilizatorów czy czynników ochronnych może zachować wrażliwe aktywności i umożliwić podawanie wyższych dawek wyciągu z chrząstki w stanie suchym.

WYCIĄG Z CHRZĄSTKI JAKO ANTAGONISTA W PRZYPADKACH, W KTÓRYCH POŚREDNICZY KINAZA BIAŁKOWA C (PKC)

Niedawne prace wykazały, że aktywacja PKC wywołuje w normalnych keratynocytach produkcję zwiększonych ilości interleukiny 8 (IL-8), związku pośredniczącego w zapaleniach (Chabot-Fletcher i wsp. (1994) J. lnvest. Dermatol 103:509-515). Co więcej, keratynocyty przy łuszczycy produkują bardzo duże ilości lL-8, które dodatkowo sprzyjają unaczynianiu de novo w płytkach łuszczycowych (Nickoloff i wsp. (1994) Am. J. Pathol. 144: 820-828). Ponieważ wykazano, ze wyciąg z chrząstki jest bardzo obiecujący w leczeniu łuszczycy, zbadano jego wpływ na keratynocyty, w których PKC aktywowano stosując octan trójforbolu (TPA), znanego jako agonistę tej komórkowej drogi przekazywania sygnału.

Figura 16 pokazuje, ze poziom zróżnicowania keratynocytu wzrastał 5-krotnie w obecności TPA. Chrząstka rekina jako taka nie miała wpływu na wytwarzanie się zrogowaciałej otoczki. Jednak dodatek wyciągu z chrząstki rekina hamował wytwarzanie zrogowaciałej otoczki indukowane przez TPA w 60%. Nie wiemy, czy indukcja przez TPA jest taka sama jak w keratynocytach przy łuszczycy. Jeśli tak jest, wyniki te sugerują, że chrząstka może nie wpływać na normalne keratynocyty in vivo podczas gdy może mieć wpływ na łuszczycowe (lub zaktywowane) keratynocyty. Hamowanie wytwarzania IL-8 w keratynocytach, aktywowanych TPA, jak i na płytkach lub keratynocytach przy łuszczycy przez wyciąg z chrząstki musi zostać sprawdzony. Obniżone poziomy IL-8 byłyby cennym potwierdzeniem przeciwzapalnego i przeciwangiogennego działania tego wyciągu.

AKTYWNOŚĆ PRZECIWZAPALNA JEST DALEKA OD AKTYWNOŚCI PRZECIWANGIOGENNEJ W WYCIĄGU Z CHRZĄSTKI REKINA

Ponieważ angiogeneza w wielu chorobach występuje wraz z zapaleniem, byłoby pożądane odrębne przypisanie każdej aktywności dla wyciągu z chrząstki. W tym celu by przetestować wyciąg pod kątem jego aktywności przeciwzapalnej i łagodzącej wybrano model podrażnienia skóry, w którym nie podejrzewa się zachodzenia angiogenezy Do badań wybrano dziewięciu ochotników o znanej wrażliwości na balsam peruwiański. Testowano następujące związki:

1. 1 x chrząstkę rekina 50% w pożywce D-MEM

2. 1 x chrząstkę rekina 20% w pożywce D-MEM

3. 1 x chrząstkę rekina 10% w pożywce D-MEM

4. Cola nitida (Indena) 10% woda : alkohol 1:1 badane prenaraty nanoszono no wewnętrznej rtronie prnedramienia ochotników. Po absorpcji przez 20 minut nanoszono balsam peruwiański, związek podrażniający na te same miejsca. Podrażnienie skóry mierzono jako zwiększenie zaczerwienienia skpry. Stopień zaczerwienienia mierzono Chromametrem Minolta i porównywano z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi. Kontrolą pozytywną była barwa skóry traktowanej wyłącznie balsamem peruwiańskim a kontrolą negatywną barwa skóry traktowanej roztworem cola i badanej jak produkty testowane. Znaczenie statystyczne obliczano stosując test prawdopodobieństwa T z dwoma ogonami. Figura 17 pokazuje, że preparat zawierający 10% coli miał aktywność 70%. Chrząstka rekina miała 58% i 60% działanie łagodzące odpowiednio w stężeniach 20% i 10%. Nie było efektu dawka-odpowiedź. Te wyniki sugerują, że wyciąg z chrząstki zawiera aktywność przeciwzapalną i łagodzącą, która jest daleka od efektu aaneciwangiogennego.

AKTYWNOŚĆ PRZECIWKOLAGENOLITYCZNA

Chromatografia HPLC

Próbką 980 ml płynnego wyciągu z chrząstki (DUP) przesączono przez błonę o odcięciu 10 kD w aparacie do ^O^sączenia o przepływie stycznym (PELLICON™, Millipore). Jednostkę najpierw przepłukano 1 1 H2O. Ostateczne wydajności to 480 ml frakcji >10 kD i 1,8 1 frakcji < 10 kD. Frakcję < 10 kD zatężono stosując odparowanie na zimnym palcu do 180 ml (<10 10x). Osiem próbek po 100 p1 <1010x nałożono na kolumnę CDC-S-Hexyl, 5 pm do

188 137

HPLC (25 cm x 0,94 cm) i eluowano najpierw 100% H2O przy 4 ml/min a następnie przy

8,5 ml/min stosując 100% MeOH. Zbierano frakcje odpowiadające pikom OD214.

Zebrano pięć frakcji (fig. 18): Fr1, Fr2, Fr3, Fr4 i Fr5. Pierwsze trzy frakcje mają przynajmniej jeden duży pik.

Pomiary aktywności kolagenazy

Pomiary aktywności kolagenazy przeprowadzono na tych próbkach stosując ludzką rekombinowaną kolagenozę ze skóry, typ 1 (MMP1) stosując test z peptydem fluorogennym (test 1) i substrat kolagenowy (test 2).

Oznaczenie 1

Test ten jest opisany wKnight i wsp. (1992) FEBS Lett. 296, 263-266. Metoda wykorzystuje fluorogenny substrat peptydowy (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH2) imitujący aktywne miejsce działania metaloproteaz. Substrat ten ma grupę fluoryzującą (Mca) na jednym końcu i grupę gaszącą fluorescencję (Dpa) na drugim. W nienaruszonym substracie, grupa gasząca skutecznie maskuje fluorescencję. Po przecięciu substratu przez enzym fluorescencja w probówce rośnie.

Aktywacja kolagenazy jest opisana wWeingarten i wsp. (1985) Biochemistry 24, 6730.1 pg rozcieńczano do 100 pl 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCtypH 7,5, dodano 1 pl roztworu trypsyny 10 mg/ml w 1 mM HCl i inkubowano 15 min w 20°C. Aktywację stopowano przez dodanie 10 pl inhibitora trypsyny z soi (SBT, 5 mg/ml). Do każdej mikrokiuwetki dodawano:

lub 50 pl inhibitora (doprowadzonego do 50 pl H2O);

pl 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCh, pH 7,5;

pl aktywowanej kolagennay (66 nn koócowa); oraz pl s uustsatu ( 1 mM ηπίΑν-ΐΗ w DMSO, 22 pM koócowa)

Fluorescencję zapisywano przy Ae_X =328 nm, λ em = 393 nm.

Wyniki pokazują że Frł jest najbardziej czynną frakcją hamującą aktywność kolagenazy (fig. 19). Niższy poziom aktywności jest obecny we wszystkich innych frakcjach. Przy badaniu z zastosowaniem kolagenmy z kijanek enzym był znacząco hamowany przez wyciąg z chrząstki rekina (EC50 około 10-20 pg/ml).

Oznaczenie 2

Oznaczenie jest opisane w Welgus i wsp. (1979) JBC 256, 9511-9516. Metoda stosuje SDS-PAGE do badania trawienia przez kolzgenazę typ 1 (MMP1). Kolagenam typu 1 trawi natywny kolagen w jednym miejscu dając dwa fragmenty o wielkości 75% i 25% wielkości oryginalnego kolagenu. Po cięciu przez kilka godzin reakcje bada się przez oddzielenie produktu od substratu stosując SDS-PAGE. Stosunek trawionego do nietrawionego kolagenu ocenia się wizualnie po wybarwieniu żeli błękitem Coomassiego (lub srebrem).

ng akrg\ak\(anóa nejagcnazγ ty· w znaczenńc en dodano do o do kolggeou ge skźey cielęcej (Worthington +/- inhibitor w końcowej objętości 20 pl. Reakcje ineubowano przez 16 godz. w 35°C, następnie stopowano przez dodanie próbki do SDS-PAGE z 40 mM EDTA, gotowano i nakładano na 8% żel.

Wyniki podsumowano w następującej tabeli.

PRÓBKA	BARWIENIE KOLAGENU	BARWIENIE FRAGMENTÓW KOLAGENU
1	2	3
C - sam kolagen	++++	-
C + Enz	+	+++
C + Enz + EDTA	++++	-
C + Enz + DUP	+	++
C + Enz + Fr1	++++	-

188 137 cd. tabeli

1	2	3
C + Enz + Fr2	+++	+
C + Enz + Fr3	+++	+
C + Enz + Fr4	+++	+
C + Enz + Fr5	+++	+
C + Enz + > 10 kD	+	+++

EDTA 40 mM hamowała kolagenazę. Całkowity płynny wyciąg DUP wykazywał niską aktywność przeciwkolagenolityczną. Frakcje 1 do 5 były aktywne, najbardziej aktywna była frakcja 1. Frakcja o masie cząsteczkowej większej niż 10 kD nie wykazywała znaczącej aktywności hamującej.

ZASTOSOWANIA KOSMETYCZNE I PREPARATY:

Powyższe testy i próby wykazały, że wyciąg chrząstki według wynalazku może znaleźć liczne zastosowania medyczne. Wśród różnorodnych aktywności odzyskiwanych z tego wyciągu szczególnie pożądane w zastosowaniach kosmetycznych są aktywność przeciwkolagenolityczna, przeciwzapalna i hamująca efekt na różnicowanie indukowane przez PKC. Wyciąg z chrząstki według niniejszego wynalazku wykazał efekt antagonistyczny na procesy zachodzące w komórce, w których pośredniczy PKC i taki efekt antagonistyczny jest sugerowany w dziedzinie jako polepszający naprawę funkcji ochronnych skóry. Sposób polepszania procesu naprawy funkcji ochronnych skóry w skórze ssaków, który obejmuje etap nakładania na skórę preparatu zawierającego wyciąg z chrząstki i akceptowalny farmaceutycznie nośnik oraz taki preparat mieszczą się w zakresie tego wynalazku. Inne lub podobne preparaty mogą też być użyte w sposobie łagodzenia skóry lub w sposobie zmniejszaniu zapalenia skóry u ssaków. Zapalenie może być powodowane przez różne czynniki takie jak chemiczne środki drażniące, fizyczną abrazję i ekspozycję na promieniowanie ultrafioletowe. Rozważane są również kompozycje i sposoby do hamowania kolagenazy w skórze. Kolagenaza i zapalenie są wiązane z przedwczesnym starzeniem (degradacja kolagenu) tak wiać aktywności antagonistyczne odzyskiwane w wyciągu z chrząstki mogłyby także być zastosowane w preparatach i sposobach opóźniania przedwczesnego starzenia i dla regulowania zmarszczek i atrofii w skórze u ssaków. Jako przykłady powodujące zmarszczki lub atrofię wymienia się wiek, ekspozycję na promieniowanie ultrafioletowe lub zanieczyszczenia środowiska. Preparaty do stosowania miejscowego mogą zawierać skuteczne ilości chrząstki rekina ustalane przy każdym konkretnym zastosowaniu. Ogólnie, kompozycje te mogą zawierać od około 0,1 do około 75% wagowych płynnego lx do 20x wyciągu z chrząstki i od 50 do 99% wagowych farmaceutycznie akceptowalnego nośnika. Kompozycje te mogą zawierać przeciwutleniacz jako czynnik który zapobiega tworzeniu nadtlenków lipidów w skórze. Przykłady takich przeciwutleniaczy to tokoferol, pochodne tokoferolu, kwas askorbinowy, pochodne kwasu askorbiowego i BMT. Do kompozycji mogą być dodawane związki przeciwzapalne takie jak inhibitor fosfolipazy A2 lub roślinne związki cola i ekstrakt zielonej herbaty. Kompozycje do stosowania miejscowego mogą występować w różnych formach takich jak roztwory, zawiesiny, lotiony, nalewki, żele, kremy, spraje, emulsje, sztyfty, maści lub liposomy (przynajmniej część płynnego wyciągu z chrząstki znajduje się w liposomach).

WNIOSKI:

Wykazano, że sposób wg niniejszego wynalazku zapewnia produkcję wyciągów z chrząstki o dużej wartości klinicznej. Wyciągi z chrząstki rekina wytwarzane w tym procesie zawierają wiele aktywności, które są odzyskiwane z dobrą wydajnością. Wyciągi z chrząstki, szczególnie płynny wyciąg i jego frakcje mają szerokie możliwości zastosowań ponieważ są nietoksyczne dla normalnych komórek i skuteczne w wielu różnych chorobach i stanach.

188 137

WYMAGANY MATERIAŁ

- Chłodziarki

- Instrumenty chirurgiczne

- Maszynka do siekania mięsa

- Torby foliowe

- Przemysłowy homogenizator (Waring blender z trzema prędkościami nabyty od firmy Fischer Shientifih)

- System czyszczenia wody (odwrotna osmoza i sączenie przez pory 0,1 pm; Continental water System, model PRE 2202, nr serii 91089, Modulab Bizsyienhe RG/Polishing

System zakupiony od Fischer Scientific, Montreal, Quebec). System ten dostarcza wodę niepirogenną wysokiej jakości.

- Bardzo dokładna waga Mettler, seria AE nabyta od Fischer Sciectifih

- Wirówka Sorvall RC-285 kupiona od DuPont, Kanada

- Wirówka CEPA

- Kieszonka nylonowa o porach 30 pm

- Autoklaw (automatyczny sterylizator parowy Sanyo, model MAC 350 P)

- Pojemniki 500 ml Nalgene sterylizowane w 132°C przez 10 minut i suszone przez 35 minut

- Stożkowe filtry o porach 24 pm Whatman Reeve Angel

- Kolumna do ultrasączenia (odcięcie masy cząsteczkowej: 500 kDaltonów oraz 1 kD gdy to dotyczy); powierzchnia: 25 stóp kwadratowych; przepływ: 130 l/minutę; ciśnienie wpływu: 30 psi; ciśnienie wypływu: 5 psi; nabytu od Koch Membrane Systems Inc., Wilmington, MA, USA)

- Higieniczna pompa wirówkowa (Monarch Industries, model ACE-S100 typ A) dla zapewnienia przepływu 130 l/min.

- sterylny wyciąg (wyciąg o przepływie laminamym NuAire kupiony od Ingram& Bell)

- Millipack-60 jałowe filtry 0,22 pm

- Jałowe przezroczyste lub bursztynowe butelki szklane

- Koncentrator DC-10 Amicon

- Rotofor Biorad 170-2950

- Filtry Amicon SIOY10, SIOY30 i SIOY100 o wartościach odcięcia 10, 30 i 100 kD, odpowiednio

- FPLC Pharmacia 216007 (komputer Pharmacia 216014)

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Liofilizator Labconco 10273 A

Wynalazek został opisany powyżej, i widno być docenione że byłoby możliwe w ramach wiedzy i umiejętności eksperta w tej dziedzinie bez zbaczania z podanych w tym zgłoszeniu pouczeń wprowadzić modyfikacje przez zastąpienie pewnych elementów tego wynalazku ich praktycznymi ekwiwalentami co dałoby taki sam efekt. Te oczywiste warianty są też objęte niniejszym zgłoszeniem.

188 137

F «

188 137

2000 CM e

o >

<n

O

O a:

1000 a

LU

O

Q_

KONTROLA

TRAKTOWANE

CHRZĄSTKĄ

-- 7

188 137

τ~^ιι==τ~ 3Ά

F=r~.Q Fi

188 137

ABSORBANCJA O.D. 280 nm ABSORBANCJA O.D. 280 nm ABSORBANCJA O.D. 280 nm

2000

232

UDA

3.5 V_t

STANDARDY MASY CZĄSTECZKOWEJ (kDa)

70B

STANDARDY MASY CZĄSTECZKOWEJ (kDa)

30200IK

2000+232

STANDARDY MASY CZĄSTECZKOWEJ (kDa)

188 137

OBJĘTOŚĆ WYPŁUKIWANIA (ml)

188 137

WARTOŚĆ UNACZYNIENIA WARTOŚĆ UNACZYNIENIA

(n=8) (n=8)

188 137

WARTOŚĆ UNACZYNIENIA WARTOŚĆ UNACZYNIENIA

188 137

HAMOWANIE PODRAŻNIENIA SKÓRY (%) ZROGOWACIAŁE OTOCZKI/100 KOMÓREK

-^==1--7/7

~77

188 137

t-j‘-~7fl

188 137

OBJĘTOŚĆ DODANEGO INHIBITORA (μΙ)

188 137

STĘŻENIE CHRZĄSTKI(mg/ml)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie wyciągu z chrząstki rekina do wytwarzania leku do leczenia choroby lub zaburzenia pod warunkiem, że ta choroba lub zaburzenie nie jest rakiem, łuszczycą, trądzikiem lub artretyzmem, a wymieniony wyciąg z chrząstki jest frakcją nadsączu, otrzymanego po odwirowaniu wodnego homogenatu całej chrząstki rekina, który to wspomniany nadsącz jest frakcjonowany na kolumnie filtracyjnej o porowatości około 500 kilodaltonów (kD), po czym wyciąg zawiera cząsteczki o masie cząsteczkowej niższej niż około 500 kD, i posiada aktywność przeciw kolagenolizie i przeciwzapalną.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wyciąg z chrząstki jest zatężany na membranie filtracyjnej o molekularnej wartości odcięcia około 1 kD, po czym otrzymany zatężony wyciąg wzbogacony jest cząsteczkami o masie cząsteczkowej od 1-500 kD.
3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że lek jest lekiem stosowanym domiejscowo.
4. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, lub 3, znamienne tym, że lek dodatkowo zawiera przeciwutleniacz.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że przeciwutleniacz wybrany jest z grupy obejmującej tokoferol, pochodne tokoferolu, kwas askorbinowy, pochodne kwasu askorbinowego i BHT.
6. Zastosowanie według zastrz. 3 lub 4, lub 5, znamienne tym, że wymieniony lek zawiera dodatkowo środek przeciwzapalny.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że jako wymieniony środek przeciwzapalny zawiera środek pochodzenia roślinnego przeciwko podrażnieniu.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że wymieniony środek przeciwzapalny wybrany jest z wyciągów cola i zielonej herbaty.
9. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że wymieniony środek przeciwzapalny jest inhibitorem fosfolipazy A2.
10. Zastosowanie według zastrz. 6 lub 7, lub 8, lub 9, znamienne tym, że wymieniony lek wybrany jest z grupy obejmującej roztwory, zawiesiny, lotiony, nalewki, żele, kremy, spraye, emulsje, sztyfty i maście.
11. Zastosowane według zastrz. 10, znamienne tym, że wymieniony ekstrakt zawarty jest w liposomach.
12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniona choroba lub zaburzenie jest stanem zapalnym skóry.
13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wymienione zapalenie skóry jest spowodowane urazem fizycznym.
14. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wymienione zapalenie skóry jest spowodowane podrażnieniem chemicznym.
15. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wymienione zapalenie skóry jest spowodowane ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe.