CN1288165C - 用于治疗与phf过多或细胞内钙过多相关疾病的来自鲨软骨的制剂 - Google Patents
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Abstract
已经发现鲨软骨提取物是甲状旁腺高血压因子(PHF)的拮抗剂。鉴于这一点，可用鲨软骨提取物来治疗与PHF活性过度有关的病症。这类疾病包括高血压和其它一些与细胞内钙增多有关的疾病。本文还公开了制备鲨软骨提取物的方法和给药该提取物的方法。
Description
发明领域
本发明涉及来自鲨软骨的抗-甲状旁腺高血压因子(抗-PHF)。本发明的化合物可用于治疗高血压和其它一些与细胞内钙增多的疾病(如，非胰岛素依赖性糖尿病、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、癌症(包括乳腺癌、结肠癌、肾癌和白血病)、炎性肠疾病和哮喘)。
发明背景
高血压通常是指动脉收缩和/或舒张血压高于140/90mmHg的正常值水平。与高血压有关的疾病包括动脉粥样硬化、高血压性肾衰竭、中风、充血性心力衰竭和心肌梗塞。虽然人们已经找到了有效降低动脉血压的许多治疗方法，但是本质性高血压的病因仍然不十分清楚。遗传诱发导致高血压是被人们普遍接受的，但是许多已被发现对治疗高血压有效的各种药物和这些药物看起来是通过引发不同的药学反应来起作用这一事实，说明本质性高血压可能有不同的原发性病因。
许多研究已经提示，一种或多种循环因子在高血压的产生或维持方面可能起作用。[参见，Wright等人，在自发性高血压大鼠的血液中发现的高血压物质，生命科学(Life Sci.)1984，34：1521-1528；Dahl等人，高血压的体液传递：来自异种共生的证据，循环研究(Circ.Res.)1969，24/25(增刊I)：21-23；Greenberg等人，循环因子作为自发性高血压大鼠的静脉过度生长病因的证据，Am.J.Physiol.1981，241：H421-H430；Tobian等人，患有盐高血压的Dahl S大鼠中的循环体液加压剂，临床科学(Clin.Sci.)1979，57：345s-347s；Zidek等人，原发性高血压发病机理中的体液因子，Klin.Wochenschr.1985，63(增刊II)D：94-96；Hirata等人，在患有Dahl盐敏感性高血压的大鼠血清中的高血压产生因子，高血压(Hypertension)1984，6：709-716]。例如，在异种共生和交叉循环试验中，通过使血压正常的动物的血液暴露于高血压动物的血液，可以诱导血压正常的动物的血压升高。对血压正常的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠皮下注射来自自发性高血压大鼠(SHR)的红细胞-相关因子，可诱导WKY大鼠产生高血压，而且还可通过注射来自患有盐敏感性高血压的Dahl大鼠的血清，来诱导盐敏感性的血压正常的Dahl大鼠的血压升高。
还有一些有关患高血压大鼠和高血压病人中的循环因子的报道，所述循环因子使细胞内钙增多。[参见，Banos等人，与本质性高血压患者的血小板对钙的吸收增加有关的两个因子，Clin.Exp.Hypertens.1987，9：1515-1530；Zidek等人，来自高血压个体的血浆对人渗透性嗜中性白细胞中的钙运输的影响，《临术科学》，1988，74：53-56；Linder等人，患有本质性高血压的患者中的循环因子对正常血小板内胞内游离钙的影响，N.Eng.J.Med.1987，316：509-513；Bruschi等人，自发性高血压大鼠和本质性高血压病人的血小板内的胞浆游离钙的增多，《临床科学》1985，68：179-184；Wright等人，具有高血压特性的自发性高血压大鼠红细胞提取物对主动脉组织的钙吸收的刺激，Can，J.Physiol.Pharmacol.1986，64：1515-1520]。既然血管的紧张受细胞内钙水平的影响，那么使血压升高的因子和使细胞内钙增多的因子间可能存在着关联。这方面已积累了一些证据，这些证据提示在某些形式的高血压中有钙调激素的参与[参见：L.M.Resnick，Am.J.Med.82(增刊IB)，16(1987)]。甲状旁腺素(PTH)是一种钙调激素。30％或更多的本质性高血压患者是一类其特征在于免疫反应性甲状旁腺素(ir-PTH)水平升高的高血压患者。[参见：Laragh等人，Kidney Int.34(增刊35)，S162(1988)]。对于SHR大鼠，已有关于PTH水平升高的报道[参见：McCarron等人，《高血压》，3(增刊1)，1162(1981)]，还已经观察到，甲状旁腺素过多的患者经常表现出高血压，其严重程度在大多数情况下可通过甲状旁腺切除术来减轻[参见：Hellstrom等人，Brit.J.Urol.30，13(1958)]。对于SHR大鼠也有有关甲状旁腺切除术类似结果的报道。[参见：Schleiffer等人，Jap.Circ.J.45，1272(1981)]。各位研究人员已经提示，PTH与本质性高血压的发生有关，虽然外源给药PTH引起哺乳动物和其它脊椎动物的血压下降[参见：Pang等人，Gen.Comp.Endocrinol.41，135(1980)]。PTH的血管舒张作用还与该分子的一个特定区域有关，所述特定区域不同于产生血钙过多效果的区域[参见：Pang等人，Endocrinology，112，284(1983)]。还已表明，PTH抑制钙进入血管平滑肌[参见：Pang等人，《生命科学》42，1395(1988)]，PTH抑制钙通过L-型钙通过进入血管平滑肌[Wang等人，FEBS，第282卷，第2期，331-334页(1991)]。这一反论还得到了伴有PTH水平升高的高血压患者也表现出血清离子钙水平减低这一事实的支持[参见：Resnick等人，New Engl.J.Med.，309，888(1983)；Hvarfner等人，ActaMed.Scand.219，461(1986)]。可以预计，如果PTH水平原发性地升高了的话，血清离子钙水平将升高。
SHR大鼠血液中存在循环因子得到了发表在Am.J.Hypertens.，2，26-31(1989)上的研究报告的证实。这些研究表明，当将来自SHR大鼠的血浆注射进血压正常的大鼠(无论是通过输注还是通过丸剂注射)时，WKY和SD大鼠的血压升高。另外，大鼠尾动脉切片还表明，随着在缓冲介质中的SHR血浆浓度的增高，大鼠尾动脉对45Ca的体外吸收还以剂量依赖的方式增高。这些试验的结果清楚地表明，血压的升高和细胞对钙吸收的增加是剂量依赖的方式，其幅度取决于在系统中存在的和该系统所能获得的SHR血浆的量。令人不解的是，这两个事件的发作被延迟了，而且是渐进式的，但已观察到已知的内源加压剂如去甲肾上腺素、血管紧张素II和后叶加压素在给药后很快地就使血压升高。已知的内源加压剂在给药后约1-2分钟就开始使血压升高和使细胞对钙的吸收增加，而甲状旁腺高血压因子在发挥这种作用前却有20-30分钟的延迟。在这些研究中观察到的另一个结果是当停止输注SHR血浆而代之以来自血压正常的大鼠的血浆时，血压很快地下降到基础水平。所观察到的下降排除了简单的体积效应。在一相关试验中，将来自高血压病人的透析过的血浆输注到血压正常的SD大鼠中，结果显示出SD大鼠产生了高血压。来自那些病人的血浆也使大鼠尾动脉的体外钙吸收增加。来自血压正常的患者的经透析过的血浆没有使血压明显升高。
循环因子的来源尚不清楚，但高血压大鼠中PTH水平升高这一尚未被证实的报道提示我们可将甲状旁腺做为研究的目标。发现将SHR大鼠的甲状旁腺切除后使血压下降，并且来自其甲状旁腺已被切除的SHR大鼠的血浆并不能引起血压正常的大鼠的血压升高。相反，将SHR大鼠的甲状旁腺移植到血压正常的Sprague-Dawley(SD)大鼠中，导致血压升高，并在血浆中出现了循环因子，如同将分离的血浆输注到其它血压正常的大鼠中显示的结果一样。[Pang和Lewanczuk，Amer.J.Hypertens.2，898(1989)]。
在这些研究的基础上，人们确定了甲状旁腺就是循环因子的来源，人们建议用“甲状旁腺高血压因子”或PHF这一名词来表述引起血压升高的物质。
已在SHR大鼠和许多患有本质性高血压的病人中进行了循环因子的分离和纯化(所述循环因子来源于甲状旁腺)，循环因子的分离和纯化也是1990年11月21日递交的相关专利申请No.603745的主题，该申请又是于1989年3月22日提交的现已放弃的专利申请No.327，450的部分后续申请。这些相关专利申请公开的内容，包括有关甲状旁腺高血压因子的纯化的教导，均在此引入本文做参考。
如在上述相关专利申请中所描述的，已表明PHF能调节胞外钙吸收，并可被饮食中的钙水平增高所抑制。PHF已被分离出来，并且也有人描述了用抗PHF的抗体来筛选PHF的方法。PHF的分子量大约为2700道尔吨，并且在对血压正常的大鼠给药PHF后，该PHF具有延迟血压升高的特性，血压的升高在时间上与由血管平滑肌对胞外钙的吸收增加有关。生物活检数据已经表明，来源于人和大鼠的该因子基本上是类似的。
血管的过度生长与许多心血管疾病(包括本质性高血压)的病理生理学有关。血管平滑肌增生可能是血管过度生长以及血管紧张增加的原因。据报道，以不依赖于细胞内钙调节的机制，PHF促使血管平滑肌细胞增殖(Shan等人，国际高血压协会第17届科学大会摘要，阿姆斯特丹，1998年6月7-11日)。
本发明的发明者已发现了PHF的拮抗剂。发明者们已出人意料地发现，鲨软骨可起PHF拮抗剂的作用，将引起血压下降并影响细胞内钙的调节。在本领域中已知鲨软骨中含有抑制肿瘤生成的物质(Lee等人，科学，第221卷，1185-1187页(1983))，并含有抗炎症成分(Schinitsky，美国专利4,473,551)。本发明的发明者还发现，鲨软骨提取物抑制由PHF诱导的SHR大鼠或WKY大鼠中的VSMC增生。鉴于这一点，预期本发明的鲨软骨提取物可用于治疗高血压和其它一些与细胞内钙增多有关的疾病。
本发明的详细描述
本发明的发明者们已经发现从鲨软骨制备的提取物使血压下降。据信该鲨软骨提取物中含有甲状旁腺高血压因子拮抗剂，后者与甲状旁腺高血压因子位点结合但不激活甲状旁腺高血压因子的活性。
本发明的鲨软骨提取物可从市售的鲨软骨通过进一步的纯化而获得，首先将市售鲨软骨洗净、干燥并磨成细粉末。在4-120℃(优选95℃)下将磨细、干燥的鲨软骨粉先用水提取2-4小时(优选2小时)。溶质与溶剂的比例为1∶8-1∶12。然后将所得的悬浮液冷却至40-60℃(优选50℃)并以约5200-5700rpm离心，以将悬浮液分离成上清液(#1)和沉淀。上清液(#1)中含有约8％的固体，将该上清液保存在4-8℃的冷藏箱中，同时对沉淀部分进行第二次提取。在第二次提取中，用水对沉淀于4-120℃(优选95℃)提取2-4小时(优选2小时)。溶质与溶剂的比例为1∶4-1∶6(以原料计)。然后将所得的悬液冷却至40-60℃(优选50℃)，并在约5200-5700rpm下离心，以将之分离成上清液和沉淀部分。将该上清液与第一次提取得到的上清液合并，并对之进行喷雾干燥，以获得本发明经纯化的鲨软骨提取物。所述的提取步骤是在95℃下进行2小时，其中在所述的离心步骤中使用沉降式离心机。该方法还包括将合并的上清液浓缩直至使固体含量达到8-10％。
本发明的提取物含有5-30％的蛋白质、15-80％的粘多糖和1-20％的硫酸软骨素C。在包含鲨软骨提取物的治疗高血压药物组合物中，所述组合物产生的给用量为0.1-20mg鲨软骨提取物/kg体重。
可将本发明的提取物通过胃肠外、局部、口服或直肠途径或通过吸入方式而给药至需要此治疗的温血动物中。通过将提取物与常规的载体、赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等制药实践所接受的物质一起复合，可将提取物配制成胃肠外或口服的剂型。
对于胃肠外给药，每天可进行1-10ml的静脉内、肌肉内或皮下注射1-4次。所用注射液可含有溶解在等渗无菌水溶液中的本发明鲨软骨提取物，或是含有或不含防腐剂如苯酚或加溶剂如乙二胺四乙酸(EDTA)的悬浮液。那些可以使用的可药用载体和溶剂是水、Ringer’s溶液和等渗NaCl溶液。此外，无菌的固定油类通常被用作溶剂或悬浮介质。发现合成的甘油单酯、甘油二酯、脂肪酸(如油酸)可在制备可注射制剂时用作固定油类。
对于直肠给药，通过与适当的无刺激性赋形剂如可可脂或聚乙二醇混合，可将提取物配制成栓剂的形式。
对于局部应用，可将提取物配制成油膏、凝胶、溶液、悬浮液或皮肤粘贴剂。
在粉状气雾剂中的提取物可用Fisons公司(Bedford，Massachusetts)产的Spinhaler turbo-吸入器给药，比例为约0.1-50mg/胶囊，对于一般的人来讲，每天给药1-8个胶囊。在液体气雾剂中的提取物可以约100-1000mg/puff的比例给药，或用标准体积的推进剂活化释放。液体气雾剂可以每天1-8个puff的量给药，并可根据被治疗的病症的严重性、患者的体重、气雾剂中颗粒尺寸的分布等来改变剂量。氟化烃或异丁烷可用作液体气雾剂的推进剂。
依赖于具体化合物的活性、被治疗的个体的年龄、体重、性别和病症、病症的类型和严重程度、给药的频率和途径，给药的日剂量为约0.01-200mg/kg体重(优选1-10mg/kg体重)。正如人们所熟知的，可与载体材料混合的制备单剂的活性成分的量依被治疗的宿主和具体给药方式的不同而不同。
本发明的鲨软骨提取物也可和已知的治疗所述病症有效的药物联合。例如，对于治疗高血压，可将鲨软骨提取物与已知的抗高血压药如钙通道封闭剂(例如，戊脉安、硝苯吡啶和硫氮酮)联合。
除了对本质性高血压的治疗外，本发明的提取物也可用于治疗其它疾病(这些疾病包括有高血压症状，但高血压不必是其主要症状)。例如，非胰岛素依赖性糖尿病经常伴发高血压。反过来，高血压患者也经常表现出糖耐受损害。因此，预期鲨软骨提取物可用于治疗高血压和与细胞内钙水平升高有关的其它疾病。
本发明包括鲨软骨提取物的活性成分的分离、鉴定和合成制备。
用下列实施说明本发明，但并不意味着本发明受这些实施例的限制。在不背离本发明范围的前提下，对本领域的普通技术人员而言可进行各种修改。
实施例1
鲨软骨的提取
购买干净、干燥、粉状的鲨软骨。先用水在85-90℃下对所购得的干粉状鲨软骨提取2小时，溶质与溶剂的比例为1∶8。然后将所得的悬浮液冷却至50℃，并以5200rpm(3245g)离心，以将悬浮液分离成上清液和沉淀。将含有约8％固体的上清液放置在4℃的冷藏箱中，同时对所得沉淀进行第二次提取。在第二次提取中，用水对沉淀于95℃提取3小时。以原料计，溶质与溶剂的比例为1∶4.8。接着，将所得悬浮液冷却至50℃并于5200rpm(3245g)下离心，将悬浮液分离成上清液和沉淀。将含有约3％固体的此次上清液与第一次提取所得的上清液合并，并进行喷雾干燥，以获得本发明的经纯化的鲨软骨提取物。
实施例2
对SHR和SD大鼠注射鲨软骨提取物浓缩药团(1mg/kg)的效果
对6只自发性高血压大鼠(SHR)和3只Sprague-Dawley(SD)大鼠静脉注射被命名为DF I-40的鲨软骨提取物浓缩药团。对5只自发性高血压大鼠(SHR)和3只Sprague-Dawley大鼠静脉注射被命名为DF II-40的鲨软骨提取物浓缩药团。该鲨软骨提取物的给药剂量为40mg/kg体重。注射后90分钟测量血压，如图1所示，鲨软骨提取物对SD大鼠无影响，但使SHR大鼠的血压下降。
实施例3
以管饲法施用鲨软骨提取物对SHR和SD大鼠的影响
对三组SHR以管饲法饲喂被命名为DF II-53的三个不同剂量的鲨软骨提取物(10、20和40mg/kg)。11只大鼠给药10mg/kg体重的鲨软骨提取物，4只大鼠给药20mg/ml体重的鲨软骨提取物，4只大鼠给药40mg/kg体重的鲨软骨提取物。90分钟后测量血压。如图2、2a和2b所示，所有的大鼠均表现出血压降低，而且是剂量相关性的。在饲喂了较高剂量的大鼠中(20-40mg/kg体重)，血压下降的速率较高，其最大下降在约50～60分钟时出现(图2a)。在50～60分钟后，血压出现波动，这可能是由于大鼠的血压调节机制所致。
实施例4
在有或没有鲨软骨提取物存在下，PHF对SD大鼠血压的影响
对7只SD大鼠通过静脉内药团注射而给药1ml当量的PHF。对6只SD大鼠在经静脉内药团注射给药1ml当量的PHF后10分钟，再给药40mg/kg体重的鲨软骨提取物(DF II-53)。注射完后90分钟时测量血压，如图3所示，PHF产生了一延迟的血压升高，而鲨软骨提取物抵消了此反应。
实施例5
在有或没有鲨软骨提取物存在下，PHF对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。
将雄性West Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(SHR)(100-200g体重)的尾动脉解剖出来并浸入冷的不含Ca和Mg的Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Gibco，Grand Island，NY)中。将尾动脉用HBSS酶溶液I和II相继消化两次。每次消化持续1小时。HBSS酶溶液I含有CaCl2(0.2mM)、胶原酶/分散酶(1.5mg/ml)(Boehringer Mannheim GmbH，WestGermany)、弹性蛋白酶(I型，0.5mg/ml)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、胰蛋白酶抑制剂(I型，1mg/ml)(Sigma Chemical Co.)和牛血清白蛋白(BSA)(不含脂肪酸，2mg/ml)(Sigma Chemical Co.)。HBSS酶溶液II含有胶原酶(II型，1mg/ml)(Sigma Chemical Co.)、胰蛋白酶抑制剂(0.3mg/ml)和BSA(2mg/ml)。然后将细胞悬浮液接种在装有DMEM培养基的96孔平底组织培养板上(所述DMEM中补加有10％的FCS)，并在37℃、于5％CO2的湿润空气中培养36小时，以使细胞附着在培养板的底部。将培养基更换为含有0.4％FCS的DMEM，以使细胞静止2-4天。这一步骤使细胞均处在G0-G1交界期。将PHF和鲨软骨提取物溶解在含有10％FCS的DMEM中。将PHF单独地或与鲨软骨提取物一起加入到静止期的细胞中。温育36小时后，将细胞用3H-胸腺嘧啶(0.2/孔)脉冲标记，并继续温育24小时。然后弃去培养基，用HBSS将细胞洗涤两次，接着与0.1％胰蛋白酶于室温下温育15-30分钟。然后用细胞收获器将细胞收集在滤纸上。用液体闪烁计数器测定掺入到细胞中的放射活性的量。如图4所示，PHF刺激WKY大鼠中的VSMC的细胞增殖。图5表明，PHF对WKY大鼠的VSMC的刺激效果可被鲨软骨提取物抑制。图6表明，鲨软骨提取物抑制SHR大鼠的VSMC增殖。
实施例6鲨软骨提取物的化学组成
(1)蛋白含量的测定
采用BCA法来确定总蛋白含量。从PIRRCE购买BCA蛋白测定试剂。采用BCA蛋白测定试剂盒提供的BSA(牛血清蛋白)标准溶液来绘制已知浓度的标准蛋白的标准曲线。将24个玻璃管排成三排七列，用于装标准样品，将另外四管用于分光光度计的校正。向第一排的各管中分别加入95、90、80、70、60、50、40和30μl的0.9％的NaCl溶液。对于第二排和第三排的各管重复相同的步骤。向含有0.9％NaCl的第一排各管中分别加入5、10、20、30、40、50、60和70μl的标准蛋白(由试剂盒提供，其浓度为2mg/ml)。对第二排和第三排重复该相同的步骤。然后向各管中加入2毫升的工作试剂，后者是50份的试剂A和1份的试剂B的混合物。将所有的样品充分混合，并于37℃温育30分钟。通过用分光光度计(PU 8620UV/VIS/NIR型，Philips)在562nm处测光吸收，来确定蛋白质的量。计算各标准浓度的平均值，并用Analysis of the Regression Line No.5(药学计算系统-4.2A版)来绘制标准曲线。用该标准曲线来确定各未知样品的蛋白质浓度。
用双蒸(DD)水来制备鲨软骨提取物的1％的溶液。用标准曲线来计算样品的蛋白质浓度(mg/ml)，并按照下面的计算公式算出鲨软骨蛋白的百分含量：
蛋白质％(w/w)＝样品蛋白浓度(mg/ml)×稀释因子(2.5)/
样品浓度(10mg/ml)×100
为获得标准曲线和鲨软骨样品的精确数据，构建标准曲线的步骤和测定鲨软骨提取物蛋白含量的步骤同时进行，将工作试剂最后加入标准蛋白样品和鲨软骨样品的各管中。
在总数为16批次的鲨软骨提取物中，蛋白含量为15.11(2.79％)。
(2)粘多糖的测定
采用对P.Whiteman(Biochem.J.131：351-357，1973)和E.Gold(Analytical Biochemistry 99：183-188，1979)的方法加以调整后的方法。从Sigma Chemical.Co.购买标准样品硫酸软骨素C，编号为No.C-4384，Lot No.21H0103。将10mg硫酸软骨素C或鲨软骨提取物溶解在50mlDD水中，以此制备标准或样品。将20mg Aleian Blue 8GX溶解在20ml缓冲液(在500ml水中含有5.07g MgCl2和3.4g乙酸钠)和0.2ml乙酸中，以此来制备反应试剂。将在1ml中含有40-200μg鲨软骨提取物的一系列样品分别加入50ml塑料管中。向这些管中加入1ml的反应试剂。将混合物在室温搅拌下平衡2小时。加入20ml 95℃的乙醇，然后离心。倾去上清液后，向沉淀中加3ml 0.2M的CaCl2。通过测量沉淀的CaCl2溶液在620nm处的光吸收来确定粘多糖的含量。
在总共6个批次的鲨软骨提取物中，粘多糖含量为50.33(2.25％)。
(3)软骨素C的分离和确定
采用对L.Roden等人(酶学方法(Methods in Enzymology)(1972)，第28期，碳水化合物复合体，B部分，由V.Ginsburg编辑)的方法加以调整后的方法。从Sigma Chemical Co.购买Amberlite IR-120+，其编号为IR-120+。通过将1.2升的DD水加入62.5克的乙酸钙中，再用35.5ml冰乙酸调节pH至4.5，以此来制备乙酸钙缓冲液。将2克的鲨软骨提取物加入装在2升玻璃烧瓶中的400ml乙酸钙缓冲液中，将样品溶液用37℃的水浴加热20分钟，然后冷却至室温。于室温向样品溶液中极慢地加入乙醇(100％，116.25ml)，加乙醇的同时对溶液进行剧烈搅拌。将烧瓶置于4℃浴中3小时，然后以11000rpm(19000g)于4℃离心15分钟，并将沉淀溶解在DD水中，并冻干。使上清液升温至室温，并在剧烈搅拌下向其中慢慢加入80ml(100％)乙醇。将烧瓶再次置于4℃浴中过夜，同时缓慢搅拌。将溶液于4℃离心(11000rpm)离心15分钟。将第二次的沉淀溶解在DD水中并冻干。将上清液升温至室温并在剧烈搅拌下缓慢加入100ml乙醇。再次将烧瓶放入4℃浴中过夜，同时进行缓缓地搅拌。然后在11000rpm离心15分钟。向第三次沉淀中加入DD水125ml，并上样到Amberlite IR-120+(Na+型)柱(2.5×16cm，约60g的Amberlite IR-120+)上。用75ml的DD水洗涤该柱。在加入1.168g NaCl使溶液为0.1M后，在剧烈搅拌下用3体积(600ml)的无水乙醇洗脱。再次，将烧瓶置于4℃浴中过夜，然后以11000rpm在4℃离心15分钟，将最后一次的沉淀溶解在DD水中，并冻干。最后一次沉淀的重量就代表硫酸软骨素C的量。
在2批次的鲨软骨提取物中，硫酸软骨素C的含量为5.9(1.98％)。
附图简述
图1表示给SHR和SD大鼠静脉注射鲨软骨提取物浓缩药团后的结果。如图1所示，鲨软骨提取物对SD大鼠没有产生效果，但使SHR大鼠的血压下降了。
图2表示以管饲法给SHR大鼠饲喂鲨软骨提取物后的结果。如图2所示，鲨软骨提取物使所有大鼠的血压下降。
图2a和2b表示血压以剂量相关的方式下降并在约50-60分钟时下降到最低值。
图3表示PHF延迟血压的升高，并且鲨软骨提取物能抵消这一反应。
图4显示PHF以剂量依赖的方式刺激WKY大鼠的VSMC的增殖。在0.625×10-3、1.25×10-3和2.5×10-3吸收单位的剂量下，PHF使细胞增殖分别增加了120(8.5％，P＜0.05，n＝16)、137.91(12％，P＜0.01，n＝16)和181.9(14.3％，P＜0.05，n＝16)。
图5表示在鲨软骨提取物存在下，PHF对WKY大鼠的VSMC增殖的作用。在50g/ml的剂量下，鲨软骨提取物明显抑制由PHF诱导的VSMC增殖。
图6表示鲨软骨提取物对SHR大鼠的VSMC的作用。在5、50和500g/ml的剂量下，鲨软骨提取物以剂量依赖的方式抑制VSMC增殖。
Claims (14)
1.一种具有抗甲状旁腺高血压因子活性的鲨软骨提取物，其中所述的鲨软骨提取物是由下列步骤制备的：
在85-120℃对干净的、干燥的、粉状鲨软骨用水提取2-4小时，
将所得的悬浮液冷却至40-60℃，
将冷却的悬浮液以5200-5700rmp离心，以将悬浮液分离成上清液1和沉淀，
将上清液1放置于4-8℃的冷藏箱中，
于95-120℃对上述沉淀用水再次提取2-4小时，
将所得的悬浮液冷却至40-60℃，
将冷却的悬浮液以5200-5700rpm离心，以将悬浮液分离成上清液2和沉淀，
将上清液1和上清液2合并，以及
将合并的上清液喷雾干燥，以获得上述的鲨软骨提取物。
2.根据权利要求1的提取物，其中所述的提取物含有5-30％的蛋白质、15-80％的粘多糖和1-20％的硫酸软骨素C。
3.权利要求1所述的鲨软骨提取物在制备治疗高血压的药物组合物中的应用。
4.根据权利要求3的应用，其中所述的组合物产生的给用量为0.1-20mg鲨软骨提取物/kg体重。
5.权利要求1所述的鲨软骨提取物在制备治疗与甲状旁腺高血压因子过量有关的疾病的药物组合物中的应用。
6.权利要求1所述的鲨软骨提取物在制备治疗与细胞内钙增多有关疾病的药物组合物中的应用。
7.一种药物组合物，包含权利要求1所述的具有抗-甲状旁腺高血压因子活性的鲨软骨提取物和可药用载体。
8.一种药物组合物，包含权利要求1所述的具有抗-甲状旁腺高血压因子活性的鲨软骨提取物、抗高血压的物质和药学上有效的载体。
9.权利要求1所述的鲨软骨提取物在制备抵消甲状旁腺高血压因子活性的药物组合物中的应用。
10.一种制备权利要求1所述的具有抗-甲状旁腺高血压因子活性的鲨软骨提取物的方法，包括如下步骤：
在85-120℃对干净的、干燥的、粉状鲨软骨用水提取2-4小时，
将所得的悬浮液冷却至40-60℃，
将冷却的悬浮液以5200-5700rmp离心，以将悬浮液分离成上清液1和沉淀，
将上清液1放置于4-8℃的冷藏箱中，
于95-120℃对上述沉淀用水再次提取2-4小时，
将所得的悬浮液冷却至40-60℃，
将冷却的悬浮液以5200-5700rpm离心，以将悬浮液分离成上清液2和沉淀，
将上清液1和上清液2合并，以及
将合并的上清液喷雾干燥，以获得上述的鲨软骨提取物。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的提取步骤是在95℃下进行2小时。
12.根据权利要求10的方法，其中在所述的离心步骤中使用沉降式离心机。
13.根据权利要求10的方法，还包括将合并的上清液浓缩直至使固体含量达到8-10％。
14.权利要求1所述的鲨软骨提取物在制备抑制血管平滑肌细胞增殖的药物组合物中的应用。
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