JP2001509513A

JP2001509513A - サメ軟骨から得られ、過剰なｐｈｆまたは過剰な細胞内カルシウムに関係する病気の治療に用いられる製剤

Info

Publication number: JP2001509513A
Application number: JP2000502067A
Authority: JP
Inventors: ケーティーパン，ピーター; ジェイシャン，ジャクリーヌ; ダブリューチュウ，カム
Original assignee: シーヴイテクノロジーズインコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2001-07-24
Also published as: CA2295519A1; EP1012163A1; EP1012163A4; US20070231404A1; WO1999002548A1; US7358342B2; US20040234617A1; KR100732322B1; HK1026708A1; CN1288165C; US7906150B2; CN1263534A; CA2295519C; AU8379098A; KR20010021764A

Abstract

(57)【要約】【課題】高血圧症および細胞内カルシウムの増加に関係する他の病気（インスリン非依存性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、癌、腸炎および喘息の治療に用いることができる製剤を提供する。【解決手段】サメ軟骨をＨ_２Ｏにより抽出し、得られた懸濁液を冷却する工程と、遠心分離して得られる上清１を保存し、ペレットに２回目の抽出を行う工程と、得られた懸濁液を冷却する工程と、遠心分離して得られる上清２を上清１と合わせ、噴霧乾燥してサメ軟骨抽出物を得る工程により生産される、抗上皮小体高血圧性因子（ＰＨＦ）活性を有するサメ軟骨抽出物、およびそれを用いた薬品組成物等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）この発明は、サメ軟骨から得られた抗上皮小体高血圧性因子（ａｎｔｉ−ＰＨ
Ｆ）に関する。本発明の化合物は、高血圧症および細胞内カルシウムの増加に関
係する他の病気（例えばインスリン非依存性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、
うっ血性心不全、癌（乳、大腸、腎および白血病を含む）、腸炎および喘息の治
療に用いることができる。

【０００２】（背景技術）高血圧は一般に、心収縮期および／または拡張期の動脈血圧の規格値１４０／
９０ｍｍＨｇ以上の上昇として定義される。高血圧に関係する病気はアテローム
性動脈硬化症、高血圧性腎不全、発作、うっ血性心不全および心筋梗塞を含む。
たくさんの治療法が動脈の血圧低下に有効であることが見つけられているが、本
態性高血圧の病因は本質的には不明のままである。遺伝的な高血圧症の傾向は一
般に受け入れられているが、高血圧の治療に有効と知られているたくさんの異な
る薬物、およびこれらの薬物が、異なる薬理学的な反応を引き起こして作用する
ように見えるという事実は、本態性高血圧に異なる主因が存在する可能性がある
ことを示唆する。

【０００３】たくさんの研究が、１つ以上の循環因子が高血圧の発生または持続に関与する
可能性があることを示唆している（Ｗｒｉｇｈｔら，自発性高血圧ラットで発見
された高血圧性物質；ＬｉｆｅＳｃｉ．１９８４；３４：１５２１−１５２８
；Ｄａｈｌら，高血圧の体液性伝染：２つの生体の血管系の外科的結合（パラビ
オーゼ）からの証拠；Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９６９；２４／２５（Ｓｕｐｐ．Ｉ
）：２１−２３；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，循環因子の自発性高血圧ラットにおけ
る静脈肥大の要因としての証拠；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８１；２４１
：Ｈ４２１−Ｈ４３０；Ｔｏｂｉａｎら，塩の高血圧を有するＤａｈｌＳラッ
トにおいて循環する体液性昇圧物質；Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．１９７９；５７：３４
５ｓ−３４７ｓ；Ｚｉｄｅｋら，本態性高血圧の病因における体液性因子；Ｋｌ
ｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１９８５；６３（Ｓｕｐｐ．．ＩＩ）Ｄ：９４−
９６；Ｈｉｒａｔａら，高血圧Ｄａｈｌ塩感受性ラットの血清における高血圧誘
発因子；Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ１９８４；６：７０９−７１６を参照）。例
えば、パラビオーゼおよび交叉循環の実験において、高血圧動物からの血液への
露出によって、正常血圧の動物で血圧上昇が起こされた可能性がある。自発性高
血圧ラット（ＳＨＲ）から得られる赤血球関連因子の皮下注射は、正常血圧のＷ
ｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）ラットにおいて高血圧を起こすことが示され
ており、また、高血圧の塩感受性Ｄａｈｌラットからの血清を正常血圧の塩非感
受性Ｄａｈｌラットに注射することにより、血圧の上昇が引き起こされる。

【０００４】高血圧ラットおよび高血圧ヒトの両方で細胞内カルシウムを増加させる循環因
子の報告もある。（Ｂａｎｏｓら，本態性高血圧患者の血小板におけるカルシウ
ム吸収の増加に関連する２つの因子；Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．
１９８７；９：１５１５−１５３０；Ｚｉｄｅｋら，透過性となったヒト好中球
におけるカルシウム輸送に対する高血圧患者血漿の効果；Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．１
９８８；７４：５３−５６；Ｌｉｎｄｅｒら，本態性高血圧患者の正常血小板の
細胞内遊離カルシウムに対する循環因子の効果；Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９
８７；３１６：５０９−５１３；Ｂｒｕｓｃｈｉら，自発性高血圧ラットおよび
本態性高血圧患者の血小板において細胞質の遊離カルシウムは増加する；Ｃｌｉ
ｎ．Ｓｃｉ．１９８５；６８：１７９−１８４；Ｗｒｉｇｈｔら，自発性高血圧
ラット赤血球の高血圧性を有する抽出物による大動脈組織のカルシウム吸収の亢
進；Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８６；６４：１５
１５−１５２０を参照）。血管の硬度は細胞内カルシウム濃度によって影響され
るため、血圧を上昇させる因子と細胞内カルシウムを増加させる因子は関係する
可能性がある。ある種の高血圧症においてカルシウムがホルモン調整に関与する
、増え続ける証拠がある。（Ｌ．Ｍ．Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８２
（Ｓｕｐｐ．１Ｂ），１６（１９８７）を参照）。上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）
はカルシウムを制御するホルモンである。本態性高血圧患者の３０％あるいはそ
れ以上は、免疫反応性上皮小体ホルモン（ｉｒ−ＰＴＨ）量の増加を特徴とする
サブグループに属する。（Ｌａｒａｇｈら，ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．３４，（Ｓ
ｕｐｐ．３５），Ｓ１６２（１９８８）を参照。）ＳＨＲにおいてＰＴＨ量の増
加が報告されており（ＭｃＣａｒｒｏｎら，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ３（Ｓｕ
ｐｐ．１），Ｉ１６２（１９８１）参照）、また、上皮小体機能亢進の患者がし
ばしば高血圧を示すことが観察されており、その症状の程度は、多くの場合に、
上皮小体摘出によって低減される（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｕｒ
ｏｌ．３０，１３（１９５８）参照）。上皮小体摘出による同様の結果がＳＨＲ
ラットにおいても報告されている。（Ｓｃｈｌｅｉｆｆｅｒら，Ｊａｐ．Ｃｉｒ
ｃ．Ｊ．４５，１２７２（１９８１）参照）。哺乳動物および他の脊椎動物にお
いて外部からのＰＴＨの投与は血圧の低下を生じさせる（Ｐａｎｇら，Ｇｅｎ．
Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４１，１３５（１９８０）参照）にも関わら
ず、様々な研究から、ＰＴＨが本態性高血圧の進行に寄与することが示唆されて
いる。ＰＴＨの血管拡張作用はまた、高カルシウム血症の影響に介在する部分か
ら離れた、分子の特定の部分とも関係している（Ｐａｎｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ，１１２，２８４（１９８３）参照）。ＰＴＨはまた、Ｌ型カルシウ
ムチャネルを介して（Ｗａｎｇら，ＦＥＢＳ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．２，ｐｐ
．３３１−３３４（１９９１）参照）、血管平滑筋へのカルシウムの流入を阻害
することも見られている（Ｐａｎｇら，ＬｉｆｅＳｃｉ．，４２，１３９５（
１９８８）参照）。この矛盾は、ＰＴＨレベルの増加した高血圧患者が、減少し
た血清カルシウムイオンレベルを示すという事実により、さらに高められる（Ｒ
ｅｓｎｉｃｋら，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０９，８８８（１９８３
）：Ｈｖａｒｆｎｅｒら，ＡｃｔａＭｅｄ．Ｓｃａｎｄ．２１９，４６１（１９
８６）参照）。ＰＴＨがまず上げられた場合に、血清カルシウムイオンレベルが
上げられることが予想される。

【０００５】ＳＨＲラットの血液における循環因子の存在が、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎ
ｓ．，２，２６−３１（１９８９）に報告された研究により確かめられている。
これらの研究において、ＳＨＲラットの血漿が正常血圧ラットに注射されたとき
、輸液による場合とボーラス（瞬時投与）による場合のいずれも、ＷＫＹおよび
ＳＤラットの血圧の上昇が見られた。さらに、ラットの尾静脈の切断により試験
管内で（ｉｎｖｉｔｒｏ）、緩衝液をベースとする培地内のＳＨＲラット血漿
の濃度が高くなるにつれて、^４５Ｃａの取り込みが添加量依存的に上昇したこと
が見られている。これらの実験の結果は、血圧の上昇および細胞内のカルシウム
の取り込みはいずれも、系に存在し利用可能であるＳＨＲ血漿の量に、量依存的
であったことを明らかに示す。興味深いことに、両方の現象の開始は遅くなって
緩やかとなり、一方では、既知のノルエピネフリン、アンジオテンシンＩＩおよ
びバソプレッシンのような内在性昇圧物質が、投与後、実に素早く血圧を上昇さ
せることが観察されている。既知の内在性昇圧物質は約１〜２分で血圧の上昇お
よび細胞内へのカルシウム取り込みの増加の開始を示すが、一方で、上皮小体高
血圧性因子は、そのような開始が起こる前に２０〜３０分の遅れがある。これら
の研究において観察された他の一つの結果は、ＳＨＲプラズマの輸液が中止され
、正常血圧ラットの血漿と交換されたときに、観察された血圧はベースラインに
実に素早く低下したことであった。観察された低下は、たくさんの効果を阻害し
た。関連した実験で、高血圧患者からの透析された血漿が、正常血圧ＳＤラット
に注射され、高血圧を起こすことが見られた。これらの患者からの血漿はまた、
ラットの尾静脈のカルシウムの取り込みを試験管内で（ｉｎｖｉｔｒｏ）増加
させた。正常血圧の患者から透析された血漿は、血圧の顕著な上昇は何も起こさ
なかった。

【０００６】循環因子の起源は不明であったが、高血圧ラットでＰＴＨが上昇したという個
々の事例の報告は、上皮小体を研究の目標として示唆した。ＳＨＲラットの上皮
小体摘出は、血圧を低下させることが知られており、上皮小体が摘出されたＳＨ
Ｒラットの血漿は、正常血圧ラットにおいて血圧の上昇を起こさなかった。逆に
、ＳＨＲラットから正常血圧のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットへ
の上皮小体の移殖は、分離された血漿を他の正常血圧ラットへ注射することによ
り見られたように、血圧の上昇および血漿内の因子の出現を起こした。（Ｐａｎ
ｇおよびＬｅｗａｎｃｚｕｋ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２，８９８
（１９８９））。

【０００７】これらの研究に基づいて、上皮小体は循環因子の起源であることが決定され、
血圧の上昇を起こす物質に「上皮小体高血圧性因子」またはＰＴＨという名前が
提案された。

【０００８】上皮小体に起源を持つ循環因子の単離および精製は、ＳＨＲラットおよび本態
性高血圧症をもつたくさんのヒトにおいて示されており、１９８９年３月２２日
に出願され現在放棄されたシリアル番号第３２７，４５０号の特許出願の一部継
続出願である、１９９０年１１月２１日に出願されたシリアル番号第６０３，７
４５号の関連した特許出願の主題の事柄である。関連する特許出願の開示は、上
皮小体高血圧性因子の精製の教示を含むそれらの教示を参照して、ここに取り込
まれている。

【０００９】前記の関連する特許出願に記載されているように、ＰＨＦは細胞外のカルシウ
ムの取り込みを制御することが見られており、食物中のカルシウムレベルの増加
により阻害され得る。ＰＨＦは単離されており、ＰＨＦに対して作製された抗体
を用いる、ＰＨＦをスクリーニングする方法が記載されている。ＰＨＦは約２，
７００ダルトンの分子量を持ち、正常血圧のラットに投与されたとき、それらの
血圧上昇の遅れた開始の特性を有し、血圧の上昇は時間的に、血管平滑筋による
細胞外カルシウムの取り込みの上昇と関係している。バイオアッセイのデータか
ら、ヒトおよびラットにおけるその因子は、実質的に同様であることがわかって
いる。

【００１０】血管肥大は、本態性高血圧症を含むたくさんの心臓血管の病気の、病気による
機能の変化と関係することが示されている。血管平滑筋の増殖は、血管の肥大お
よび血管の硬度の上昇の要因である可能性がある。ＰＨＦが、細胞内カルシウム
の制御とは独立した機構を介して、血管平滑筋の細胞増殖を増加させたことが報
告された（Ｓｈａｎら，Ａｂｓｔｒａｃｔｉｎ１７ｔｈＳｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃＭｅｅｔｉｎｇｓｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃ
ｉｅｔｙｏｆＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，７−１１
Ｊｕｎｅ１９９８）。

【００１１】ＰＨＦのアンタゴニストは本発明者により見出されている。本発明者は、腫瘍
の血管形成を阻害する物質を含有し（Ｌｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２
１，ｐｐ．１１８５−１１８７，（１９８３））、抗炎症成分を含有する（Ｓｃ
ｈｉｎｉｔｓｋｙＵ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．４，４７３，５５１）ことが
その技術分野において知られているサメ軟骨が、ＰＨＦのアンタゴニストとして
作用し、結果として血圧低下および細胞内カルシウム制御への影響が生じること
を、予期せず見出した。本発明者はまた、サメ軟骨抽出物がＳＨＲラットまたは
ＷＫＹラットにおいて、ＰＨＦにより誘起されるＶＳＭＣの増殖を阻害したこと
も見つけた。このことから、本発明のサメ軟骨抽出物は高血圧および細胞内カル
シウムの上昇に関係する他の病気の治療に有用であると予想される。

【００１２】（発明の詳細な説明）本発明者は、サメ軟骨から調整された抽出物が血圧の降下を起こすことを発見
した。サメ軟骨抽出物は、上皮小体高血圧性因子の活性を上昇させずに上皮小体
高血圧性因子サイトに結合するような上皮小体高血圧性因子のアンタゴニスト（
拮抗剤）を含むと考えられている。

【００１３】このサメ軟骨抽出物は、清浄にされ、乾燥され、細かい粉末状に粉砕された市
販のサメ軟骨を、さらに精製することにより得られる。乾燥され粉砕されたサメ
軟骨は、まず、Ｈ_２Ｏにより４〜１２０℃（好適には９５℃）の温度で２〜４時
間（好適には２時間）抽出される。溶質の溶媒に対する比率は１：８から１：１
２の間である。次に、得られた懸濁液を４０〜６０℃の間（好適には５０℃）に
冷却し、約５２００〜５７００ｒｐｍで遠心分離して懸濁液を上清（＃１）とペ
レットに分離する。ペレットが第２の抽出に供されている間、約８％の固形物を
含有する上清（＃１）は冷却タンクに４〜８℃で貯蔵される。第２の抽出におい
てペレットはＨ_２Ｏにより４〜１２０℃（好適には９５℃）の温度で２〜４時間
（好適には２時間）抽出される。溶質の溶媒に対する比率は１：４〜１：６であ
る（最初の材料に基づく）。得られた懸濁液を４０〜６０℃の間（好適には５０
℃）に冷却し、約５２００〜５７００ｒｐｍで遠心分離して懸濁液を上清とペレ
ットに分離する。その後、上清は第１の抽出の上清と一緒に貯留され、噴霧乾燥
されて、本発明の精製されたサメ軟骨抽出物が得られる。

【００１４】本発明の抽出物は、そのような処置が必要な温血哺乳動物に非経口で、局所的
に、経口あるいは直腸投与で、あるいは吸入により投与されてもよい。容認され
ている薬学の実用に従って、抽出物を従来の賦形剤、添加剤、結合剤、防腐剤、
安定剤、発色剤や要求される同様のものと混合することにより、抽出物は非経口
あるいは経口の投与量に成形されてもよい。

【００１５】非経口投与としては１〜１０ｍｌの静脈、筋肉あるいは皮下注射が１日１〜４
回与えられるであろう。注射剤は水性の滅菌された等張液、または、フェノール
のような防腐剤あるいはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような可溶化剤
と分離している懸濁液に、本発明のサメ軟骨抽出物を含有するであろう。容認さ
れる賦形剤および溶剤の中では、水、リンガー液および等張性塩化ナトリウム溶
液が採用されてよい。さらに、滅菌され固形化された油は溶媒あるいは分散媒と
して従来採用されている。合成モノグリセリド、ジグリセリド、脂肪酸（例えば
オレイン酸）は、注射可能なものの調製に不揮発性油として用いられる。

【００１６】直腸投与としては、抽出物は、ココアバターあるいはポリエチレングリコール
のような刺激性のない適切な添加剤と混合することにより、座剤の形で調製可能
である。

【００１７】局所的な投与としては、抽出物は軟膏、ゼリー剤、溶液、懸濁液または皮膚接
着性の貼付剤の形で調製可能である。

【００１８】粉末のエアゾールの場合、マサチューセッツ、ベッドフォードのＦｉｓｏｎｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手されるスピンヘイラー・ターボ吸入器（Ｓｐ
ｉｎｈａｌｅｒｔｕｒｂｏ−ｉｎｈａｌｅｒ）を用いて、カプセル当たり約０
．１〜５０ｍｇ、平均的な人に１日１〜８カプセル投与される速度で、抽出物が
投与されてもよい。液体エアゾールの場合、抽出物は「パフ」当たり約１００〜
１０００μｇの速度で投与されるか、あるいは標準量のスプレー用圧縮不活性ガ
スの放出により活性化される。液体エアゾールは治療される症状の重度、患者の
体重、およびエアゾールの粒子サイズ分布に応じた投与量の変更を加え、１日当
たり１〜８「パフ」の速度で与えられるであろう。液体エアゾールのスプレー用
圧縮不活性ガスとしては、フッ素化炭化水素またはイソブタンを用いることがで
きる。

【００１９】１日の投与量は、特定の化合物の活性や、処置される対象の年齢、体重、性別
および状態、病気の種類や重度、投与の頻度および経路に応じて、体重１ｋｇ当
たり約０．０１〜約２００ｍｇの範囲（好適には１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ）で
ある。よく知られているように、１つの投与量を形成するために担体物質と結合
するかもしれない活性成分の量は、治療されるホストや投与の特定の形態に依存
して変化する。

【００２０】サメ軟骨抽出物は、上記の状態の治療に有効であると知られている薬物と合わ
せることもできる。例えば、高血圧を治療するため、サメ軟骨抽出物はカルシウ
ムチャネル阻害薬（例えばベラパミル、ニフェジピンおよびジルチアゼム）のよ
うな、知られている抗高血圧薬と合わせることもできる。

【００２１】本態性高血圧症の治療に加えて、本発明の抽出物は、高血圧を含むが必ずしも
高血圧を主症状として含まない他の病気の治療に用いることもできる。例えば、
インスリン非依存性糖尿病患者はしばしば高血圧である。逆に、高血圧症患者は
しばしば、欠陥のあるグルコース耐性を見せる。したがって、サメ軟骨抽出物は
、高血圧症および細胞内カルシウムの増加に関与する他の病気の治療に、有用で
あると期待される。

【００２２】本発明は、包含しようとするものであり、サメ軟骨抽出物からの活性成分の分
離、同定および合成的な生産を包含しようとするものである。

【００２３】以下の例は本発明を表し、制限しようとするものではない。本発明の範囲を逸
脱せずに、当業者にとって様々な変更が明白であろう。

【００２４】（実施例１）サメ軟骨の抽出清浄にされ、乾燥され、粉砕されたサメ軟骨が購入された。乾燥され、粉砕さ
れたサメ軟骨は、まず、Ｈ_２Ｏにより８５〜９０℃の温度で２時間抽出された。
溶質の溶媒に対する比は１：８であった。その後、得られた懸濁液は５０℃に冷
却され、懸濁液を上清とペレットに分離するために、５２００ｒｐｍ（３２４５
ｇ）で遠心分離された。約８％の固形物を含有する上清は、ペレットが２回目の
抽出に供されている間、冷却タンク内に４℃で保存された。２回目の抽出におい
て、ペレットはＨ_２Ｏにより９５℃で３時間抽出された。溶質の溶媒に対する比
は、最初の材料に基づいて１：４．８であった。その後、得られた懸濁液は５０
℃に冷却され、懸濁液を上清とペレットに分離するために、５２００ｒｐｍ（３
２４５×ｇ）で遠心分離された。約３％の固形物を含有する上清は、１回目の抽
出からの上清と一緒に貯留され、本発明の精製されたサメ軟骨抽出物を得るため
に噴霧乾燥された。

【００２５】ＳＨＲおよびＳＤラットにおけるサメ軟骨抽出物のボーラス注射（１ｍｇ／ｋｇ
）の効果６匹の自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）および３匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ
ｅｙ（ＳＤ）ラットに、ＤＦＩ−４０と示されるサメ軟骨抽出物が静脈ボーラス
注射された。５匹の自発性高血圧ラット（ＳＨＲ）および３匹のＳｐｒａｇｕｅ
−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに、ＤＦＩＩ−４０と示されるサメ軟骨抽出物が
静脈ボーラス注射された。サメ軟骨抽出物は４０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与
された。血圧は注射後９０分間、測定された。図１に示すように、サメ軟骨抽出
物は、ＳＤラットにおいては何も効果を起こさなかったが、ＳＨＲラットにおい
て血圧を低下させた。

【００２６】（実施例３）ＳＨＲおよびＳＤラットへのサメ軟骨抽出物の経胃投与の効果ＳＨＲラットの３つのグループに、３つの異なる投与量（１０、２０および４
０ｍｇ／ｋｇ）でバッチＤＦＩＩ−５３のサメ軟骨抽出物を経胃投与した。１
１匹のラットには１０ｍｇ／ｋｇ体重のサメ軟骨抽出物が投与され、４匹のラッ
トには２０ｍｇ／ｋｇ体重のサメ軟骨抽出物が投与され、４匹のラットには４０
ｍｇ／ｋｇ体重のサメ軟骨抽出物が投与された。血圧は投与後９０分間、測定さ
れた。図２、２ａおよび２ｂに示すように、すべてのラットは投与量に関係した
血圧の低下を示した。より高い投与量（２０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重）が与えられ
たラットは、血圧の降下する速度がより大きく、約５０〜６０分で最大の低下に
到達する（図２ａ）。５０〜６０分後、血圧はおそらくラットの血圧調整機構に
よって変動する。

【００２７】（実施例４）サメ軟骨抽出物の存在下および非存在下における、ＳＤラットの血圧に対するＰ
ＨＦの効果７匹のＳＤラットにＰＨＦの１ｍｌ等量が静脈ボーラス注射により投与された
。６匹のラットにＰＨＦの１ｍｌ等量が静脈ボーラス注射により投与され、１０
分後にサメ軟骨抽出物（ＤＦＩＩ−５３）の４０ｍｇ／ｋｇ体重が投与された
。血圧は注射後９０分間、測定された。図３に示すように、ＰＨＦは血圧の遅れ
た上昇を起こし、サメ軟骨抽出物はこの反応を阻害した。

【００２８】（実施例５）サメ軟骨抽出物の存在下および非存在下における、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）
の増殖に対するＰＨＦの効果オスＷｅｓｔＫｙｏｔｏ（ＷＫＹ）ラットまたは自発性高血圧ラット（ＳＨ
Ｒ）（体重１００〜２００ｇ）の尾の動脈が切除され、ＣａがなくＭｇがなく冷
たいハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ，ＧｒａｎｄＩｓｌａ
ｎｄ，ＮＹ）に浸漬された。尾動脈はＨＢＳＳ酵素溶液ＩＩおよびＩにより、連
続して２回分解された。各分解は１時間続いた。ＨＢＳＳ酵素溶液ＩはＣａＣｌ
_２（０．２ｍＭ）、コラゲナーゼ／ディスパーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂｌｌ，ＷｅｓｔＧｅｒｍａｎｙ）
、エラスターゼ（タイプＩ、０．５ｍｇ／ｍｌ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、トリプシンインヒビター（タイプＩ、
１ｍｇ／ｍｌ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）およびウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）（脂肪酸なし、２ｍｇ／ｍｌ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．）を含有した。ＨＢＳＳ酵素溶液ＩＩはコラゲナーゼ（タイプＩＩ、
１ｍｇ／ｍｌ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）、トリプシンインヒ
ビター（０．３ｍｇ／ｍｌ）およびＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）を含有した。その後
、細胞の懸濁液は平底の９６ウェル組織培養プレート内の、１０％ＦＣＳを加え
たＤＭＥＭ培地に播種され、空気中に５％のＣＯ２を有し、湿気がある雰囲気に
おいて３７℃で３６時間、細胞をプレートの底に接着させるため培養された。細
胞を２〜４日間、不活発な状態とするために、培地は０．４％ＦＣＳを含むＤＭ
ＥＭに交換された。この処置は、Ｇｏ−Ｇ１の境界にある細胞と同期した。ＰＨ
Ｆおよびサメ軟骨抽出物は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに溶解された。ＰＨＦ
のみ、あるいはＰＨＦとサメ軟骨が静止期の細胞に添加された。３６時間の培養
後、細胞は３Ｈ−チミジン（０．２（／ウェルにより放射性同位元素に露出され
、さらに２４時間培養された。その後、培地が除去され、細胞がＨＢＳＳにより
２回洗浄されてから、０．１％トリプシンと一緒に１５〜３０分間、室温で保温
された。その後、細胞の収集によって、細胞はフィルターペーパー上に収集され
た。細胞に取り込まれた放射能の量は、液体シンチレーションカウンターを用い
て定量された。図４に示すように、ＰＨＦはＷＫＹラットにおいてＶＳＭＣの細
胞増殖を亢進させた。図５は、ＷＫＹラットのＶＳＭＣに対するＰＨＦの促進効
果は、サメ軟骨抽出物によって阻害されることを示す。図６は、サメ軟骨抽出物
はＳＨＲラットのＶＳＭＣの増殖を阻害したことを示す。

【００２９】（実施例６）サメ軟骨抽出物の化学的組成（１）タンパク質の含量の定量タンパク質の総量はＢＣＡ法を用いて決定される。ＢＣＡタンパク質アッセイ
（検定）試薬はＰＩＲＲＣＥから購入される。既知の濃度の標準タンパク質の検
量線は、ＢＣＡタンパク質検定試薬キットにより供給される、ＢＳＡ（ウシ血清
アルブミン）の標準溶液を用いて作成することができる。２４本のガラス管が、
標準試料用に３行、７列に並べられ、他の４本の管が分光光度計の校正用に並べ
られた。０．９％塩化ナトリウムの９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０
および３０μｌが、管の第１列にそれぞれ加えられた。同一の手順が、第２およ
び第３列に繰り返された。標準タンパク質（キットにより供給され、２ｍｇ／ｍ
ｌの濃度）の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０および７０μｌ、が０．
９％塩化ナトリウムを含む管の第１列に加えられた。同一の手順が、第２および
第３列に繰り返された。その後、５０部の試薬Ａと１部の試薬Ｂとの混合物であ
る作用試薬の２ｍｌが、各管に加えられた。全ての試料が十分に混合され、３７
℃で３０分間保温された。タンパク質は、分光光度計（ＭｏｄｅｌＰＵ８６
２０ＵＶ／ＶＩＳ／ＮＩＲ，Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて５６２ｎｍにおける吸
光度を測定することにより、定量された。薬理学的計算システム−バージョン４
．２Ａの回帰分析ラインＮｏ．５を用いることにより、標準の各濃度の平均値が
計算され、検量線が作成された。この検量線は、各未知試料のタンパク質濃度の
定量に用いられた。サメ軟骨抽出物の１％溶液が、２回蒸留（ＤＤ）水で調整された。試料溶液のタ
ンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）が検量線を用いることにより計算され、サメ軟骨の
％によるタンパク質含量が、以下の式を用いることにより計算された：

【００３０】タンパク質％（ｗ／ｗ）＝試料タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×希釈倍率（２
．５）／試料濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）×１００

【００３１】検量線用およびサメ軟骨試料の正確なデータを求めるため、検量線作成のため
の操作およびサメ軟骨抽出物のタンパク質含量の定量は同時に行われ、作用試薬
は標準タンパク質試料およびサメ軟骨試料の全ての管に最後に加えられた試薬で
あった。

【００３２】タンパク質含量は、サメ軟骨抽出物の１６バッチの全てで１５．１１（２．７
９％）である。

【００３３】（２）ムコ多糖の定量Ｐ．Ｗｈｉｔｅｍａｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３１：３５１−３５７，１９
７３）およびＥ．Ｇｏｌｄ（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
９９：１８３−１８８，１９７９）による方法が適用された。標準試料のコンド
ロイチン硫酸Ｃ、カタログ番号Ｃ−４３８４、ロット番号２１Ｈ０１０３はＳｉ
ｇｍａｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ．から購入された。標準または試料は、１０ｍ
ｇのコンドロイチン硫酸Ｃまたはサメ軟骨抽出物を、５０ｍｌの２回蒸留水に溶
解させることにより調製された。反応試薬は、２０ｍｇのＡｌｅｉａｎＢｌｕ
ｅ８ＧＸを２０ｍｌの緩衝液（水５００ｍｌ中に５．０７ｇの塩化マグネシウ
ムおよび３．４ｇの酢酸ナトリウム）および０．２ｍｌの酢酸に溶解させること
により、調製された。１ｍｌ中に４０〜２００μｇの範囲の一連のサメ軟骨抽出
物試料が、５０ｍｌのプラスチック管にそれぞれ加えられた。反応試薬の１ｍｌ
がこれらの管に加えられた。混合物は攪拌させながら室温で２時間平衡化された
。９５％エタノールの２０ｍｌが加えられ、その後遠心分離された。上清をデカ
ントした後、０．２Ｍ塩化カルシウムの３ｍｌが沈殿に加えられた。ムコ多糖
の含量は、沈殿の塩化カルシウム溶液の吸光度を６２０ｎｍで測定することによ
り定量された。

【００３４】ムコ多糖の含量はサメ軟骨抽出物の６バッチて５０．３３（２．２５（％）で
あった。

【００３５】（３）コンドロイチン硫酸Ｃの単離および定量Ｌ．Ｒｏｄｅｎら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９７２
），Ｖｏｌ．２８，ＣｏｍｐｌｅｘＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｐａｒｔ
Ｂ，ｅｄ．ｂｙＶ．Ｇｉｎｓｂｕｒｇからの方法が適用された。カタログ番号
ＩＲ−１２０ＰｌｕｓのＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲ−１２０ＰｌｕｓはＳｉｇｍ
ａｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ．から購入された。酢酸カルシウム緩衝液は、１．
２Ｌの２回蒸留水を６２．５ｇの酢酸カルシウムに加えることにより調製された
。ｐＨは、３５．５ｍｌの氷酢酸により４．５に調整された。サメ軟骨抽出物の
２ｇが２Ｌのガラスフラスコ内で、酢酸カルシウム緩衝液の４００ｍｌに加えら
れた。試料溶液はウォーターバス中で、３７℃で２０分間加熱され、その後、室
温に冷却された。エタノール（１００％、１１６．２５ｍｌ）が試料溶液に、室
温で激しく攪拌しながら非常にゆっくり加えられた。フラスコを４℃のバスに３
時間固定し、その後、１５分間、４℃で遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、１９，
０００ｇ）した。沈殿は２回蒸留水に溶解され、凍結乾燥された。上清は室温に
加温され、エタノール（１００％）の８０ｍｌの中に、激しく攪拌しながら、ゆ
っくりと加えられた。フラスコは再び４℃のバス内に、ゆっくりと攪拌しながら
、一夜固定された。溶液は４℃で（１１，０００ｒｐｍ）１５分間、遠心分離さ
れた。２番目の沈殿は２回蒸留水に溶解され、凍結乾燥された。上清は室温に加
温され、激しく攪拌しながら１００ｍｌのエタノールがゆっくりと加えられた。
フラスコは再び４℃のバス内に一夜、ゆっくりと攪拌しながら固定され、その後
、１１，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離された。３番目の沈殿に２回蒸留水
（１２５ｍｌ）が加えられ、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲ^＋−１２０^＋（Ｎａ^＋ｆ
ｏｒｍ）カラム（２．５×１６ｃｍ、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲ−１２０Ｐｌｕ
ｓの約６０ｇ）に装填された。カラムは２回蒸留水の７５ｍｌで洗浄された。溶
液を、０．１Ｍの塩とするために、１．１６８ｇのＮａＣｌを加えた後、激しく
攪拌しながら精製エタノールの３倍量（６００ｍｌ）が装填された。再び、フラ
スコは４℃のバス内に一夜置かれ、その後、４℃で１５分間、遠心分離（１１，
０００ｒｐｍ）された。最後の沈殿は２回蒸留水に溶解され、凍結乾燥された。
最後の沈殿の重量は、コンドロイチン硫酸Ｃの量を表す。

【００３６】コンドロイチン硫酸Ｃの含量は、サメ軟骨抽出物の２バッチで５．９％（１．
９８（％）であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＳＨＲおよびＳＤラットにおけるサメ軟骨抽出物のＩＶ（静脈内）ボ
ーラス注射の結果を表す。図１に示すように、サメ軟骨抽出物はＳＤラットには
効果を示さなかったが、ＳＨＲラットにおいては血圧を降下させた。

【図２】図２は、ＳＨＲラットにおけるサメ軟骨抽出物の胃管への投与の結果を表す。
図２に示すように、サメ軟骨抽出物は、すべてのラットにおいて血圧の降下を起
こした。図２ａおよび図２ｂは、血圧の降下が投与量に関係し、約５０〜６０分で最大
の降下に達することを示す。

【図３】図３は、ＰＨＦは遅れた血圧の上昇を起こし、サメ軟骨抽出物はこの反応に拮
抗することを示す。

【図４】図４は、ＰＨＦがＷＫＹラットのＶＳＭＣの増殖を添加量依存的に亢進したこ
とを示す。０．６２５×１０^−３、１．２５×１０^−３および２．５×１０^−３
吸収単位の添加量において、ＰＨＦは細胞増殖を１２０（８．５（％）（Ｐ＜０
．０５，ｎ＝１６）、１３７．９１（１２（％）（Ｐ＜０．０１，ｎ＝１６）お
よび１８１．９（１４．３（％）（Ｐ＜０．０５，ｎ＝１６）にそれぞれ増加さ
せた。

【図５】図５は、軟骨抽出物の存在下における、ＷＫＹラットのＶＳＭＣの増殖に対す
るＰＨＦの効果を示す。５０（ｇ／ｍｌの添加量で、サメ軟骨抽出物はＰＨＦに
より誘起されるＶＳＭＣの増殖を顕著に阻害する。

【図６】図６は、ＳＨＲラットのＶＳＭＣに対するサメ軟骨抽出物の効果を示す。５、
５０および５００（ｇ／ｍｌの添加量で、サメ軟骨抽出物はＶＳＭＣの増殖を添
加量依存的に阻害する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/12 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 1/02 Ｃ０７Ｋ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シャン，ジャクリーヌジェイカナダアルバータティー６ジェイ６ワイ２，エドモントン，ツインブルックスコーヴ 136 (72)発明者チュウ，カムダブリューカナダアルバータティー６ジー０ティー９，エドモントン，アヴェニュー 11007−83，スイート 1106 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA03 BA34 CA45 DB70 NA14 ZA362 ZA422 ZA452 ZA592 ZA662 ZB212 ZB262 ZC352 ZC422 4C086 AA01 AA02 EA25 GA17 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZA59 ZA66 ZB21 ZB26 ZC35 ZC42 4C087 AA01 AA02 AA04 BB29 CA14 CA16 CA47 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZA59 ZA66 ZB26 ZC35 ZC42 4H045 AA10 AA20 AA30 CA52 EA23 EA27 GA01 GA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗上皮小体高血圧性因子（ＰＨＦ）活性を有するサメ軟骨抽出物。
【請求項２】前記サメ軟骨抽出物は以下の諸工程，すなわち，清浄にされ、乾燥され、粉砕されたサメ軟骨をＨ_２Ｏにより４〜１２０℃の温
度で２〜４時間抽出する工程，得られた懸濁液を４０〜６０℃に冷却する工程，冷却された懸濁液を５２００〜５７００ｒｍｐで遠心分離して、懸濁液を上清
１とペレットに分離する工程，上清１を冷却タンク内に４〜８℃で保存する工程，ペレットに、Ｈ_２Ｏにより４〜１２０℃の温度で２〜４時間、２回目の抽出を
行う工程，得られた懸濁液を４０〜６０℃に冷却する工程，冷却された懸濁液を５２００〜５７００ｒｐｍで遠心分離して、懸濁液を上清
２とペレットに分離する工程，上清１を上清２と貯留する工程，および貯留された上清を、サメ軟骨抽出物を得るために噴霧乾燥する工程により生産される請求項１記載の抗ＰＨＦ活性を有するサメ軟骨抽出物。
【請求項３】高血圧の治療を必要とする患者に対する、抗高血圧に有効な量のサメ軟骨抽出
物の投与を有する高血圧の治療方法。
【請求項４】前記量は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項３記載の方法。
【請求項５】過剰なＰＨＦに関係する病気の治療を必要とする患者に対する、病気の治療に
有効な量のサメ軟骨抽出物の投与を有する過剰なＰＨＦに関係する病気の治療方法。
【請求項６】細胞内カルシウムの増加に関係する病気の治療を必要とする患者に対する、病
気の治療に有効な量のサメ軟骨抽出物の投与を有する細胞内カルシウムの増加に関係する病気の治療方法。
【請求項７】抗上皮小体高血圧性因子（ＰＨＦ）活性を有するサメ軟骨抽出物と、薬学的に許容される担体とを含有する薬品組成物。
【請求項８】抗上皮小体高血圧性因子活性を有するサメ軟骨抽出物と、抗高血圧物質と、薬学的に有効な担体とを含有する薬品組成物。
【請求項９】抗上皮小体高血圧性因子活性を有するサメ軟骨抽出物の有効量の投与を含む上
皮小体高血圧性因子活性の阻害方法。
【請求項１０】清浄にされ、乾燥され、粉砕されたサメ軟骨をＨ_２Ｏにより４〜１２０℃の温
度で２〜４時間抽出する工程，得られた懸濁液を４０〜６０℃に冷却する工程，冷却された懸濁液を５２００〜５７００ｒｐｍで遠心分離して、懸濁液を上清
１とペレットに分離する工程，上清１を冷却タンク内に４〜８℃で保存する工程，ペレットに、Ｈ_２Ｏにより４〜１２０℃の温度で２〜４時間、２回目の抽出を
行う工程，得られた懸濁液を４０〜６０℃に冷却する工程，冷却された懸濁液を５２００〜５７００ｒｐｍで遠心分離して、懸濁液を上清
２とペレットに分離する工程，上清１を上清２と貯留する工程，および貯留された上清を、サメ軟骨抽出物を得るために噴霧乾燥する工程とを有する
抗上皮小体高血圧性因子活性を有する精製されたサメ軟骨抽出物の製造方法。
【請求項１１】前記抽出工程は９５℃で２時間行われる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】前記遠心分離工程において、デカンター遠心分離機が用いられる請求項１０記載の方法。
【請求項１３】貯留された上清の、８〜１０％の固形物含量が達成されるまでの濃縮を、さら
に有する請求項１０記載の方法。
【請求項１４】血管平滑筋細胞の増殖の阻害に有効な量の請求項７記載の組成物の、そのよう
な治療を必要とする患者に対する投与を有する血管平滑筋細胞の増殖の阻害方法。
【請求項１５】前記抽出物は５〜３０％のタンパク質、１５〜８０％のムコ多糖および１〜２
０％のコンドロイチン硫酸Ｃからなる請求項２記載の抽出物。