JPS62174025A - 肝疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、上皮細胞成長因子（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒ
ｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）、その誘導体またはこれらの
塩を有効成分とする肝疾患治療剤に関する。

先行技術 上皮細胞成長因子は、ヒトや馬の尿中からもウサギ、ラ
ットおよびマウスの顎下腺からも単離され、哺乳動物中
にその種を越えて存在していることが知られている〔文
献１、特開昭５６−２５１１２号公報等〕。なかでも、
ヒト上皮細胞成長因子（ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　：ｈＥＧＦ）は、１
９７５年にコーエン（Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ）らにより人尿
中から単離された上皮組織の増殖角化を促進するヒト由
来の因子として紹介され〔文献２〕、また同年グレゴリ
−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ）らによって人尿中から単離さ
れた胃酸分泌抑制作用をもつヒトウロガストロン（ｔｌ
ｕｍａｒｌ　ｕｒｏｇａｓｔｒｏｎｅ：ｈ−ＵＧ）とし
て紹介された〔文献３〕ポリペプチドと同一物質であっ
て、分子量約６０００，５３残基のアミノ酸よりなって
いてその分子中に３本のジスルフィド結合を有するポリ
ペプチド（代謝、Ｖ、５１〜５８（１９８０））である
ということが現在わかっている（以下、上皮細胞成長因
子をＥＧＦと記す）。

そして、ＥＧＦの生理活性として現在までに報告されて
いるものは、胃酸分泌抑制作用〔文献４５〕、抗潰瘍作
用〔文献６．７〕、消化管粘膜保護作用（特願昭６０−
９６８６号明細書〕、ＤＮＡ合成促進作用〔文献６．８
〕、角膜修復作用〔特開昭５９−６５０２０号公報〕、
カルシウム遊離促進作用〔文献９〕、創傷治癒促進作用
〔文献１０．１１〕、抗炎症作用〔特願昭６０−１１５
７８４号明細書〕および鎮痛作用〔特願昭６０−１１５
７８５号明細書〕等がある。

一方、最近我国では、肝疾患による死亡例が増加しつつ
ある。肝疾患はその経過によって急性肝炎、亜急性肝炎
および慢性肝炎に分類され、また、症状、原因によって
劇症肝炎、肝硬変、脂肪肝、薬剤性・アルコール性肝障
害、自己免疫性肝炎等に分類される。そして、それらの
原因はＡＳＢ型および非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス、薬剤、
アルコール、栄養因子、寄生虫等が考えられているが、
まだまだ不明な点も多いとされでいる。これら諸原因中
、我国においては各種ウィルスによる肝疾患が多発して
いる。一方、欧米ではアルコール性肝障害が多発してお
り、しかも予後不良となるケースが多く、我国でも最近
このような肝障害が増加傾向にある。そして、上記肝疾
患は、上記原因により肝実質細胞に障害が引き起こされ
、その後の脂肪蓄積、肝再生不良、線繊増殖異常等によ
り種々の肝疾患に発展し、慢性肝炎から肝硬変、肝癌に
至るケースが多いとされている。

従来、肝疾患の治療法は安静および食事療法が主流で、
肝疾患に効く薬剤はないとされてきた。

最近になって、Ｂ型肝炎ワクヂンを初め二、三の肝疾患
治療用薬剤が開発されて実用化に至ってはいる（医薬ジ
ャーナル、２１．１２５５　（１９８５）　）。しかし
ながら、これらの薬剤は上記肝実質細胞障害に起因する
種々の肝疾患に対して極めて有効と言うわけではなく、
また、重篤な副作用発生率も高く、臨床上、著しい効果
をあげるには至っていない。そして、特に、国が難病に
指定した、劇症肝炎、慢性肝炎および肝硬変〔医科学大
辞典３５、゛難病″、（１９８３）。講談社刊〕に対す
る有効な薬剤は皆無に等しい。

従って、肝疾患の根本的な原因となる肝細胞障害を抑制
すると共に、障害を受けた旧細胞の機能回復を行うべく
肝再生を効果的に促進する有効な肝疾患治療剤の開発が
待ち望まれているところである。

〔発明の概要〕

要　　旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、ＥＧ
Ｆの作用として従来より知られている細胞増殖促進作用
以外に、肝疾患治療作用があるという当業者にとっても
思わぬ発見に基づいて成されたものである。

なお、本発明は、実験動物としてマウスを用い、本発明
の薬剤の有効成分であるＥＧＦが四塩化炭素によって引
き起こされる肝細胞障害を抑制し、また、慢性化（肝線
雑化）した症状を改善するという作用（肝細胞障害抑制
及び機能回復作用）を確認してなされたものである。

従って、本発明による肝疾患治療剤は、上皮細胞成長因
子、その誘導体またはこれらの塩を有効成分とすること
、を特徴とするものである。

効　　果 本発明の肝疾患治療剤は、上記成分を有効成分としてな
るものである。従って本発明は新しい肝疾患治療剤を提
供することはもとより、前記諸問題を解決するとともに
下記のような利点を有するものである。

イ）　肝細胞障害抑制作用を有するとともに肝再生促進
作用を有する。

ＥＧＦは肝細胞中のＤＮＡ合成促進作用を有することが
知られており〔文献１３．１３の２〕、本発明において
は肝再生促進作用が示されている（後記実験例参照）。

従って、これら二つの作用をあわせもつところから、す
なわち広範囲に壊死を起している肝疾患においても肝障
害を抑制しながら正常細胞の増殖を促進することができ
るところから、本発明の薬剤は他の肝治療用薬剤にはみ
られない画期的な肝疾患治療剤ということができよう。

なお、本発明の薬剤の有効成分は、上記作用の他、抗潰
瘍作用、胃粘膜保護作用を有することも知られている（
前記）。ところで、肝疾患治療の目的として広範囲肝切
除が行なわれることがあるが、この際に重篤な合併症と
してストレス潰瘍症候群がみられることがある〔文献１
４〕。そしてこの場合、ストレス潰瘍症候群を抑えるた
めにシメチジンが使用されるのがふつうであるが、この
シメチジンには肝再生を抑制する作用があることも報告
されている〔文献１４の２〕。従って、このような場合
にも上記二つの作用をあわせもつ本発明の薬剤は有効で
あると言えよう。

さらに、本発明の薬剤の有効成分は、上記作用の他、創
傷治癒促進作用をも有する（文献１０．１１）。そこで
、外科手術等において麻酔剤、特に全身麻酔に用いられ
る薬剤（例えばへロタン（ｈａｌｏｔｈａｎｅ　）等に
より肝細胞障害が引き起こされることが問題となってい
るところ、本発明の薬剤の有効成分は上記したように薬
物による肝障害の予防と同時に術創の治療促進効果をも
有するので、他の肝疾患治療剤と比べて広範囲にわたっ
て肝疾患治療効果を有すると言えよう。

このように本発明の薬剤は、種々の原因により引き起さ
れた肝疾患に対して優れた治療効果を有するものである
と言えよう。

口）　低毒性である。

本発明の薬剤の有効成分は、一般に低毒性である（後記
）。従って、本発明薬剤は医薬品として有用であること
はいうまでもない。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の肝疾患治療剤の有効成分は、上皮細胞成長因子
（ＥＧＦ）　、その誘導体またはこれらの塩を有効成分
とするものである。

ＥＧＦが公知の物質であることは、前記したところであ
る。

本発明の肝疾患治療剤の有効成分として用いられるＥＧ
Ｆは、天然に存在するＥＧＦおよびたとえば遺伝子工学
的手法によって合成した合成ＥＧＦそのもののみならず
、ＥＧＦを構成するアミノ酸の任意の置換、アミノ酸付
加もしくは欠如によって得られて、しかもＥＧＦと同様
のあるいは類似の生理活性を有するもの、のようなＥＧ
Ｆの誘導体をｂ包含するものである。ここで、他のアミ
ノ酸で置換し得るＥＧＦ構成アミノ酸は、置換体がＥＧ
Ｆの活性を保存し得る限りどのアミノ酸であってもよく
、また置換によって導入するアミノ酸（上記のアミノ酸
付加によって導入するアミノ酸の場合も同様）は天然の
ものであっても、誘導体アナログ（例えばケイ光性を具
備するもの、脂溶性の高いもの等）〕であってもよい。

なお、ここで誘導体というのは、それがＥＧＦと同様の
あるいは類似の生理活性を持つものである限りその分子
量を問わないから、これはアミノ酸欠失誘導体の範賭に
属するものとしてフラグメントおよびその誘導をも包含
するものである。

上記においてフラグメントは、少なくともＥＧＦ受容体
との結合活性を有する部分のことであって、ＥＧＦの一
部の部分構造を有するポリペプチドである。例えば、Ｃ
末端やＮ末端からアミノ酸が１個あるいは２個以上欠け
たものやあるいはＣ末端やＮ末端及び任意の部分から切
断されてできたものでアミノ酸２個以上から成るものを
包含する。

ＦＧＦおにび上記のようなその誘導体およびフラグメン
トは遊離のアミノ基および力Ｊレボキシル基を持ってい
るから、酸との塩および塩基との塩でもありうる。この
Ｊ：うな塩を形成すべき酸および塩基としては、製剤上
許容される有機ないし無機の酸および塩基が一般に使用
可能であり、具体的には、たとえば、塩酸、硫酸、酢酸
、マロン酸、コハク酸、水酸化ナトリウム、アミン類な
どを挙げることができる。

本発明でいうＥＧＦの誘導体は、前記のようなアミノ酸
の置換、付加および欠失によって得られたものの外に、
種々の化学修飾を施したものをも包含するものである。

このような誘導体は、たとえば、アルキル化、酸化、還
元、氷解等のそれ自体公知の化学修飾またはこれらの組
合Ｕによる化学修飾によって得られる。

要するに、本発明は、ＦＧＦそのもののみならず、ＥＧ
Ｆと同様のあるいは類似の活性を有するそのすべての誘
導体ならびにそれらの塩をも包含するものである。ＥＧ
Ｆは、生体（具体的には、血液、尿、唾液、涙液、母乳
、各組織・臓器等）より抽出することができるほか、Ｅ
ＧＦやその誘導体等は化学合成および遺伝子工学的手法
等の方法を含む種々の方法により調製することができる
〔日本組ＩＫ＠養学金線「細胞成長因子」（１９８４年
朝倉書店発行）に収録されている文献参照〕。そして、
このようにして調製された［ＧＦは、本発明に使用する
には高純度であることが好ましい。

ＥＧＦは、ヒトや馬などの尿中からも、ウサギ、ラット
およびマウス顎下腺からも単離され、哺乳動物中にその
種を越えて存在していることが知られている〔文献１、
特開昭５６−２５１１２号公報等〕。なかでも、本発明
の薬剤をヒ１〜に適用する場合は、ヒト上皮細胞生長因
子（ｈｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｉａｌ　Ｇｒｏｓｔｈ　Ｆ
ａｃｔｏｒ：　ｈＥＧＦ　）が好ましい。

具体例 ＦＧＦの調製には、例えば生体成分より単離する方法〔
特開昭５８−９９４１８号、同５８−２１９１２４号、
同５９−２０４１２３号公報等、特公昭４　／Ｉ−１２
７４，４号、同５３−４５２７号、同５９−５０３１５
号、同５９−５０３１６号、同５９−４２６５０号公報
等）や化学的に合成する方法〔特開昭５９−２７８５８
号公報等〕および遺伝子工学的手法により造成する方法
〔特開昭５７−１２２０９６号、同５８−２１６６９７
号、同５９−４２６５０号公報等〕が提案されている。

一方、ＥＧＦ誘導体としては、遺伝子工学的手法により
造成されたもの〔ヒトＥＧＦ （ｈＥＧＦ））を構成する５３アミノ酸残基中Ｎ末端か
ら２１番目をメヂニオンのかわりにロイシンとしたもの
（（Ｌｅｕ２１）−ｈＥＧＦ　：特開昭６０−２８９９
４号公報）が提案されている。伯のＥＧＦ誘導体として
、ｈＥＧＦのＣ末端が二つ欠けたものであるｈＥＧＦ−
Ｕも得られている（本発明者らの共同研究者らによって
提案された特願昭６０−２２６３０号の明ｍ用参照）。

ここで本発明者らの共同研究者らによって遺伝子工学的
に調製されたｈＦＧＦは高＠度（９９，９％程−１１一 度以上）であり、このように高純度のものであることは
本発明による肝疾患治療剤の有効成分として好ましい。

さらに他のアミノ酸欠失体すなわちＥＧＦフラグメント
として、ＥＧＦのＣ末端が５コまたは６コ欠けたもので
あるｄｅｓ−（４９−５３）−ＥＧＦ　（ＥＧＦ−５＞
、ｄｅｓ−（４８−５３＞−ＥＧＦ　（ＥＧＦ−６＞（
文献１６．１７．１８および１９）、ＥＧＦがその種々
の作用を発現するための最小単位と考えられる２０、３
１ （（Ａｃｍ）ｃｙｓ　　　　）ＥＧＦ−（２０−３１）
および（Ａｌａ２０）ＥＧＦ−（１４−３１）〔文献２
０）ならびに臭化シアンによって処理することにより得
られた誘導体であるＣＮＢｒ−ＥＧＦ　（文献１６．２
１〕なども知られており、このような物質も本発明の薬
剤の有効成分であり得る。

なお、現在ＥＧＦ以外の成長因子は約４０種が知られて
いて、分子構造上いくつかの族に分類されている。この
成長因子の一群として、本発明薬剤の有効成分であるＥ
ＧＦが属する上皮細胞成長−１２＝ 因子族があり、ＥＧＦの伯に腫瘍細胞成長因子（Ｔｕｍ
ｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：　ＴＧ＋’）もこ
の族に属する。

このＴＧＦはＥＧＦとアミノ酸配列に大きな相似部を持
つものであって、現在は三つのクラスに分類されている
。すなわち、ＴＧＦα、ＴＧＦβおよびＴＧＦγである
。ＴＧＦβは、ＴＧＦαあるいはＥＧＦと相乗的に作用
して細胞の成長を促進する。ＴＧＦγは、単独でこの作
用を発揮する。

ＥＧＦとこの三種のＴＧＦとは同じ成長因子族の筒部に
属し、特にＴＧＦαはＥＧＦとアミノ酸配列の類似性が
高く、Ｔ　Ｇ　Ｆαの５０残基中２１残基までがＥＧＦ
の相同の位置に見出されている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８１．７３６３（１９８４
））。

また、ＴＧＦαはＥＧＦレセプターと結合し、これはＥ
ＧＦと競合する〔「医学のあゆみ」１３３．１０４０−
１０４４　（１９８５））。さらに、ＴＧＦαはＥＧＦ
レセプターキナーゼを活性化しくＮａｔｕｒｅ、　２９
２．２５９（１９８１））　、抗ＥＧＦレセプター抗体
はＴＧＦαのバラクリン作用を止める（Ｊ。

ｅｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９　、１１８９５（１９
８４））　。こられの事らの事実から、ＥＧＦとＴＧＦ
とは非常に近似した作用を有するものと解される。

肝疾患治療作用 本発明でいう「肝疾患治療作用」とは、肝細胞障害抑制
作用及び慢性肝障害治療作用をいう。ここで、［肝細胞
障害抑制作用］とは、肝障害に伴う肝細胞壊死の抑制あ
るいは肝細胞の機能障害の抑制を意味する。また、「慢
性肝障害治療作用」とは、慢性的に進行する肝細胞障害
の抑制及び肝疾患に伴って低下した肝細胞の機能回復を
意味する。

なお、これらの作用は、ＥＧＦの公知作用である細胞増
殖作用によるものではない。種々の肝疾患（慢性型の肝
疾患では特に）では、肝障害を引き起こす原因は、接続
的に存在することが知られている〔日本臨床、±ｌ、１
１９４〜１２００゜（１９８４）。第１０回犬山シンポ
ジウム、１２７〜１３８、（１９７９）。医薬ジャーナ
ル、２２．３６１〜３０５、（１９８６））。この様に
、原因が持続し、かつ障害が進行している劣悪な環境下
では、肝細胞の増殖はきわめて困難なものとなる。従っ
て、本発明による肝疾患治療剤の効果は、持続的に存在
するあるいは消失していない原因による障害を抑制し、
合わせて、障害を受けたＩＦＦＩＩＩＩＩ胞の機能を回
復させることである。これらの効果によって、上記の劣
悪な環境は改善されて、効果的な肝再生および肝臓レベ
ルでの機能回復が可能となる。

本発明では、このような作用を調べるにあたり、今日一
般的に行なわれている四塩化炭素肝障害モデル〔ファル
マシア・レビュー１３．６５〜７８（１９８４，）　、
および生薬学雑誌、ｌ旦、８０（１９８５））を用いて
いる。まず、実験動物マウスに四塩化炭素を役向して、
人工的に肝実質細胞に障害を引き起こさせる〈急性肝障
害モデル）。

するとＧ　ＯＴ　（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ＯＸａｌＯａ
Ｃｅｔａｔｅ−ｔｒａｎＳａ−ｍｉｎａｓｅ）　、Ｑ　
Ｐ　Ｔ　（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｐｙｒｕｖａｔｅ−ｔ
ｒａｓａｍ−ｉｎａｓｅ）等のトランスアミナーゼが血
中に多量に遊離してくる。そこで、上記障害を有するマ
ウスに本薬剤の有効成分を投与したとき、これらＧＯＴ
やＧＰＴ値の上昇が抑制されるか否かを調べることによ
って肝細胞障害抑制作用を調べることができる。

一方、実験用動物ラットに四塩化炭素を長期間投与する
ことによって用意される肝障害として、慢性肝障害（肝
線維症）モデル〔ファルマシア・レビュー、工３−１６
５〜７８（１９８４）、および炎症学叢書４、第２５３
〜２７７頁（１９７５）医学書院〕がある。このモデル
は、症状が固定化されて長期間血中のＧＯＴ、ＧＰＴ並
びにγ−Ｇ　Ｔ　Ｐ　（ｒ　−ｏｌｕｔａｍｙｌ　ｔｒ
ａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ　）　、Ａ　Ｌ−ｐ　（ａｌ
ｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が増加し、脂
質代謝異常を伴うものである。従って、これらの慢性肝
障害（肝線維症）の指標となる酵素レベルの改善効果を
調べることによっても肝細胞障害抑制あるいは肝細胞機
能の回復を調べることができる。

このように、上記二つのモデルによって、本発明の薬剤
の肝疾患治療作用を調べることができる。

そして、さらに慢性肝障害モデルでは病理組織学的所見
からも本薬剤の肝疾患治療作用を調べることができる。

肝疾患治療剤 本発明による肝疾患治療剤は、前記有効成分と製剤上の
補助成分とからなるものであることがふつうである。こ
のうち補助成分として具体的なものには、担体（賦形剤
、結合剤、希釈剤等）、安定剤、保存剤、溶解補助剤な
どがある。担体としては、たとえば炭酸カルシウム、乳
糖、シ」糖、ツルピッ１〜、マンニット、デンプン、ア
ミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、カカオ脂
、水、パラフィン、油脂等がある。水、パラフィンおよ
び油脂の場合は、これは溶媒として作用する外に本発明
肝疾患治療剤をエマルジョンないしサスペンションの形
にすることもある。

投与の剤形としては、粉末、顆粒、細粒剤、錠剤、丸剤
、カプセル材、トローチ、坐剤、ローション剤、注射剤
（たとえば、注射用蒸溜水や種々の輸液等に本発明の有
効成分を溶解または懸濁させる）、軟青剤、パップ剤な
ど投与可能な任意のものがあり得る。これら（ま、経口
的または非経口的（注射を含む）に投与することができ
るうえ、必要に応じて伯の薬剤を調合させてもよい。

投与量は、患者の年令、体重、病状等に応じて決めれば
よい。経口的及び非経口的（注射を含む）には通常成人
の１日当りの有効成分として１０ｎｇ〜１０ｍｇ程度が
望ましい。

本発明の望ましい具体例は、この１日当りの投与量を１
日１回ないし数回投与させるため単位投与形態のもので
ある。

なお、本発明による肝疾患治療剤は、上記ポリペプチド
（ＥＧＦ）を、雌雄マウス、ラット各１群６匹に対して
皮下注射で１１０１ｎ／Ｎｇ、静脈内注射で１ｍ９７に
９＜ヒト血中ＥＧＦｉｌｆ１度の約１００万倍および１
０万倍量に相当）を投与しても一般症状に変化がなく、
また死亡例もないことより、低毒性である（特開昭５９
−６５０２０号公報参照）。

実　　　験　　　例 四塩化炭素肝障害モデルを用い、本薬剤の有効成分の効
果を以下のＪ：うにして調べた。

Δ、魚性肝障害モデルを用いた実験 １、実験動物 ｄｄＹ系雄性マウスを、恒温（２３±０．５℃）恒湿（
６０±５％）室で１週間以上予備飼育したのち、健康と
思われる体重３５〜３９ｇのマウスを選び、５〜８匹を
１群として本実験に用いた。

２、実験方法 ｄｄＹ系雄性マウスに被検液を５ｒｎｌｌ／Ｋｇ皮下注
射し、３０分後に３％四塩化炭素２ｍＲ／Ｋｇを皮下注
射した。そして、この時より２５時間後に眼窩静脈叢よ
り採血して、血清を調製した。この血清を希釈し、１〜
ランスアミナーゼＣ■−テスト（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａ
ｓｅ　ＣＩＩ−ｔｅｓｔＲ）　　（和光）　ヲ用イＴＧ
ＯＰおよびＧＰＴ値を測定した。なお、これらの測定値
はカーメン（Ｋａｒｍｅｎ）単位／−を用いて表視した
。

被検液は下記のものを用いた。

（イ）生理食塩水（０，０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む
）（対照） ！ＩＭ！／Ｎｇ （ロ）ｈｌ：ＧＦ　（０，１ＮＩ￥酸に溶解させたのち
、上記の生理食塩水で希釈した。） １０μ’Ｊ／に’Ｊ→５ｄｌ／に９ （ハ）ｈＥＧＦ　　１００μ’ｊ／に９日５ｍｆｌ／に
９３、実験結果 本実験の結果を第１表に示す。第１表中、抑制率（％）
は、下式より求めたものである。

第１表 ☆ｓ＝ｓｅｒｕｍ なお、上記実験結果は、Ｆ−検定によって分散が等しい
ことを確かめた後、スチューデンツ（Ｓｔｕｄｅｎｔ’
ｓ　）　Ｔ−検定を行なって得たものである。

有意差　＊　：ｐ＜ｏ、００５、 ＊＊；ｐ＜Ｑ、Ｏ１ ４、結果の解析 第１表より、ｈＥＧＦ投与群においては１０μｇ／に９
おにび１００μｇ／に９のいずれの投与群においても四
塩化炭素によって引き起こされたＧＯＴおよびＧＰＴの
上界を著明（こ抑制する効果（肝ｌｌｌ１２！障害抑制
作用）が認められた。そして、その抑制率は４５．０〜
５６．１％という高率であり、かつ対照群と比較して有
意であった。

Ｂ、慢性肝障害モデルを用いた実験 １、実験動物 ＳＤ系雄性ラう１〜を、恒温（２３±０．５℃）、恒湿
（６０±５％）室で１週間予備飼育し、体重１９５〜２
１５９のものを用いた。

２、実験方法 ＳＤ系雌雄性ラット四塩化炭素１ｄ／Ｎｇ（オリーブ油
との等＠混合液として２ｄ／Ｎｇ）を週２回、８〜１２
週間皮下投与して、慢性肝障害（肝線維症）ラットを用
意した。

イ）脂質系への影響 四塩化炭素を８週間投与した慢性肝障害ラットに被検液
を１日１回、７日間皮下投与した。８日日にラットの腹
大動脈より採血し、常法により血漿を得た。血漿中絶脂
質は、リン酸−バニリン法で測定した。血漿水中性脂肪
は、トリグリセライドＧテスト（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉ
ｄｅ　　Ｇ−ＴｅｓｔＲ１和光）を用いて測定した。ま
た、肝臓中中性脂肪は、肝臓生理食塩水中でホモジナイ
ズしてホモジネートを調製したのち、これを水で適宜希
釈してトリグリセライドＧテストで上記と同様に測定を
行った。

口）血漿中酵素系への影響 四塩化炭素を１２週間投与して作成した慢性肝障害ラッ
トに、被検液を１日１回、１４日間皮下投与した。１５
日目にラットを層殺し、血漿中のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬ
−Ｐおよびγ−ＧＴＰを日立７１６型自動分析装置によ
って測定した。

また、肝の病理１織学的検索を以下のようにして行った
。すなわち、ラットを摺殺後、直ちに肝を摘出し、ホル
マリン固定を行った。ついで、常法に従って薄切切片を
調製し、ヘマトオキシリン−エオシン染色およびアザン
染色を行った。

ハ）被検液 被検液は、下記のものを用いた。

ａ）生理食塩水（０，０１％　Ｔｗｅｅｎ　８０を含む
）２＃ｌｉ！／Ｋｙ／日 ｂ）　　ｈＥＧＦ　　（６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）に溶解させた後、上記 生理食塩水で希釈） ３０μｇ／Ｋｙ／日→２ｍＲ／Ｋｇ／日３、実験結果 脂質系への影響に関して、血漿中絶脂質、血漿水中性脂
肪、肝臓中中性脂肪の結果を、各々第１〜３図に示した
。また、血漿中酵素系への影響に関して、ＧＯＴ、ＧＰ
Ｔ、ＡＬ−Ｐおよびγ−ＧＴＰの結果を各々第４〜７図
に示した。なお、第１〜７図の実験結果は、スチューデ
ンッＴ−検定もしくは、アスピンーウェルチ法（Ａｓｐ
ｉｎ−１’１ｅｌＣｈ　ｌｌ１ｅｔｈＯｄ）に従って、
薬物投与群と対照群との間および正常群と対象群との間
で有意差の検定を行った。なお有意差は、図面中、下記
のようにして示した。

有意差　（ネ）：ｐ＜０．１０ ＊　　：ｐ＜０．０５ ネ＊　　　：ｌ）＜０．０１ また、次式により治癒係数を算出して、ｈＥＧＦ投与群
に付記した。

（ｈＥＧＦ投与群の値） （％）　　　（正常群の値） −（対照群の値） 肝の病理組織学的所見 本実験モデルの肝組織を病理組織学的見地から調べ、そ
のときの所見を以下に述べる。

対照群の病理組織像では、多量の結合組織により境界さ
れた明らかな偽小葉（肝臓の組織学的な一機能単位であ
る小葉構造が線維組織で小区画化され、本来の小葉と異
なった構造をとったものをいう。）が認められた。そし
てこのような偽小葉内の細胞には、脂肪滴、コロイド滴
が存在し、いくつかの偽小葉は、さらにその中心部に空
胞化変性細胞の存在が認められた。

また、対照群の肝の大部分の細胞は一般に大型で、■ル
ガストプラズマ（粗小胞体の集団で、タンパク合成にか
かわる細胞器官）を欠いていた。

一方、ｈＥＧＦ投与群では、対照群に比べ偽小菓は少な
かった。また、偽小葉内の細胞中の脂肪滴やコロイド滴
も、対照群と比べ明らかに減少していた。さらに、偽小
葉中心部の空胞化変性細胞も少なく、その細胞中にはエ
ルガストプラズマも対照群より明らかに多く認められた
。そして、偽小葉間の結合組織内には、正常細胞の所見
を呈する細胞が出現しており、しかも分裂像も多数認め
られた。

以上の所見より、ｈＥＧＦによる細胞増殖の促進作用は
もとより、本発明の薬剤の作用である肝細胞障害抑制作
用および肝機能障害回復作用が示唆された。

４、結果の解析 四塩化炭素８週間投与による慢性肝障害ラットでは、血
漿中脂質レベルの低下および肝臓中中性脂肪の蓄積が認
められ、これらの変化は、四塩化炭素の投与中止後１週
間の時点でも同様であった。

これらの脂質系の変化に対し、ｈＥＧＦ３０μ９／　Ｋ
’ｊ　７日間の皮下投与によって、血漿中総脂質および
中性脂肪レベルの著明な改善（治癒係数は各々８８，１
％おにび２８．７％）および肝臓中の中性脂肪蓄積の改
善傾向（治癒係数７２．８％）が認められたく第１〜３
図参照）。

四塩化炭素１２週間投与による慢性肝障害ラッ１〜では
、血漿中のＧＯＴ、ＧＰＴ、、ＡＬ　−Ｐおよびγ−Ｇ
ＴＰ等の肝障害の指標どなる酵素類が激増し、四塩化炭
素の投与中止後２週間の時点でも著明な高値を示した。

これらの血漿酵素系に対し、ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　３０　Ｉ
Ｉ　ｇ／　Ｋ９を１４日間皮下投与することによって、
治癒係数４５．４％〜７２．８％の著明な改善効果が認
められた。

これらの結果は、肝の病理組織学的所見と合せて、肝細
胞機能障害回復および慢性肝炎における肝実質細胞の持
続的障害に対する抑制作用をも示唆するものである。

製剤例１（注射剤） ｈＥＧＦを発熱物質不含の０．１％Ｗ／Ｖゼラチンを含
む１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４，）に溶かして
最終濃度を１５μｇ／ｄにした。そして、この溶液（ｐ
Ｈ７，４）に塩化ナトリウムを終濃度が７５ｍＭとなる
ように加えた。この溶液を無菌の濾過膜〔例えば、０．
２２μｍのミレックスＧ　Ｖ　（Ｈｉｌｌｅｘは登録商
標）フィルター（ミリポア社製）〕を通して２ｒｒ１．
ずつ各アンプルに分注して密封した。

！乳員ユ（注射剤） ｈＥＧＦを発熱物質不含の０．００１％Ｗ／Ｖポリソル
ベート８０を含む１／１５Ｍリン酸緩衝液に溶解して、
最終濃度を１５μｇ−／ｄとした。そして、この溶液に
塩化す１〜リウムを終濃度が７５ｍＭとなるように加え
た。この溶液を製剤例１と同じ要領で除菌ン濾過し、ア
ンプルに２ｄずつ分注して密封した。

製剤例３（凍結乾燥注射剤） 製剤例１で調製された注射剤にマンニトールを最終８１
度２％Ｗ／■となるように溶解した。ついで、この液を
製造例１と同じ要領で除菌ン濾過した後に、２ｄずつ、
ガラス製バアイル瓶に分注し、−４０℃、１時間で凍結
を行い、−１０℃、真空度０．０４　ｎ＋ｎ＋ｌ１ｇで
凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、常法により無菌状態で
密封した。

製剤例４（凍結乾燥注射剤） 先の製剤例２で調製された注射剤より、製剤例３と同じ
要領で凍結乾燥注射剤を調製した。

製剤例５（注射剤） ｈＥＧＦ　　　　　　　　　　　　　　３０μ９酢酸ナ
トリウム　　　　　　　　　　　２ｍ。

パラオキシ安息香酸メヂル　　　　　　２ｍｇ無水グリ
セロール　　　　　　　　　３２ｍｑポリソルベート８
０　　　　　　　　２０μ９注射用蒸留水　　　　　　
　　　　　　適量水酸化ナトリウム　　　　　　　　　
　適量ＤＨ７，４に調製 １アンプル当り　２ｍｌ 上記配合割合で製剤例１と同一の要領で除菌ン戸過し、
注射剤を調製した。

割り罰（注射剤） ｈＥＧＦ　　　　　　　　　　　　　　３０μｑフエノ
ール　　　　　　　　　　　　４ｍｑ無水グリセロール
　　　　　　　　　３２ｍｑポリソルベー１〜８０　　
　　　　　２０μｑ注射用蒸留水　　　　　　　　　　
　　適量水酸化す１〜リウム　　　　　　　　　　適量
１アンプル当り　２ｍｌ 上記配合割合で製剤例１と同一の要領で除菌ン濾過し、
注射剤を調製した。

製剤例７（注射剤） ｈＦＧＦ　　　　　　　　　　　　　　３０μ９ｍ−ク
レゾール　　　　　　　　　　　６ｍＣ］無水グリセロ
ール　　　　　　　　　３２ｍｑポリソルベー１〜８０
　　　　　　　２０μ９注躬用蒸留水　　　　　　　　
　　　　適量水酸化ナトリウム　　　　　　　　　　適
量ｐＨ７，４に調製 １アンプル当り　２ｍｌ 上記配合割合で製剤例１と同一の要領で除菌か過し、注
射剤を調製した。

引用外国文献 １、　アドバンシズ・イン・メタポリツク・ディスオー
ダース（八ｄｖ、　Ｈｅｔａｂ、旧Ｓ、）、８゜２、　
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
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エンテロロジー （Ａ、　　Ｊ、　　Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．）　
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・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
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Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　　）　、　　１７．３１４１８、
　ビタミンズ・アンド・ホルモンズ（Ｖｉｔａｍ、　Ｈ
ｏｒｍ、＞３７．６９．（１９７９）１９、　クリニカ
ルφリサーチ（ＣＩｉｎ、　Ｒｅｓ、）２５．３１２Ａ
　（１９７７） ２０、　　プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
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デッド・ステーブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、八ｃａｄ、　ｓｃｔ、　ＵＳＡ）　。

氏ユ、１３５１　　（１９８４） ２１、　ネイヂｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、　　２７８
．８３５

【図面の簡単な説明】

第１図は、血漿中の総脂質含量を示すヒストグラムであ
る。 第２図は、血漿中の中性脂肪含量を示すヒストグラムで
ある。 第３図は、肝臓中の中性脂肪含量を示すヒス１〜グラム
である。 第４図は、血漿中のＧＯＴ活性を示すヒストグラムであ
る。 第５図は、血漿中のＧＰＴ活性を示Ｊ−ヒストグラムで
ある。 第６図は、血漿中のＡＬ−Ｐ活性を示すヒストグラムで
ある。 第７図は、血漿中のγ−ＧＴＰ活性を示すヒス＝　３５
− トゲラムである。 第１図 第２図 第３図 正常詳　ス羽θ群ｈＥ（ｒＦ投与群 慎４閃 第５図 第６図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 上皮細胞成長因子、その誘導体またはこれらの塩を有効
   成分とすることを特徴とする肝疾患治療剤。