JP2002531410A - 抗臓器栄養効果をもつ単離物質 - Google Patents
抗臓器栄養効果をもつ単離物質Info
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Abstract
(57)【要約】
臓器重量を減らす能力を持つ物質を、雌哺乳動物からの卵巣静脈血を採集すること、この血液から卵巣静脈血漿を調製すること、および血漿から得た該物質を少なくともある程度精製することによって、単離した。この物質は、たとえば臓器または組織の肥大化の治療において、医療用途および他の用途を持っている。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的に臓器重量を減らす単離物質およびその医療用途に関する。
【０００２】 （背景技術） 哺乳動物の生殖腺は、エストロゲンおよびテストステロンなどの種々のホルモ
ン、ならびに全身にわたって効果を示す成長因子およびサイトカインなどの信号
となる分子を分泌する。組織および臓器の重量を調節する機構は、その全体をと
らえて『臓器栄養ステム ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓｙｓｔｅｍ』と呼ぶ
ことができる。このシステムへの内分泌物（ホルモン）の寄与には、視床下部−
下垂体−生殖腺軸、副腎、胸腺および他の内分泌腺組織が関与している。臓器栄
養システムにおいて一般的にプラスの効果をもつ内分泌腺物質の中には、エスト
ロゲンおよびテストステロンがある。エストロゲンの臓器栄養効果は、Ｈａｒｔ
によって論じられている（Ｐｈａｒｍａｃ. Ｔｈｅｒ．（１９９０年）４７巻
２０３〜２１８ページ）。
ン、ならびに全身にわたって効果を示す成長因子およびサイトカインなどの信号
となる分子を分泌する。組織および臓器の重量を調節する機構は、その全体をと
らえて『臓器栄養ステム ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓｙｓｔｅｍ』と呼ぶ
ことができる。このシステムへの内分泌物（ホルモン）の寄与には、視床下部−
下垂体−生殖腺軸、副腎、胸腺および他の内分泌腺組織が関与している。臓器栄
養システムにおいて一般的にプラスの効果をもつ内分泌腺物質の中には、エスト
ロゲンおよびテストステロンがある。エストロゲンの臓器栄養効果は、Ｈａｒｔ
によって論じられている（Ｐｈａｒｍａｃ. Ｔｈｅｒ．（１９９０年）４７巻
２０３〜２１８ページ）。
【０００３】 Ｈａｒｔ（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９９０年）６１巻１８５〜１９４ページ
）は、エストロゲン拮抗剤クロミフェン（ｃｌｏｍｉｐｈｅｎｅ）が雌ラットの
ほとんどの臓器の重量を減ずることを報告した。Ｈａｒｔは、クロミフェンが、
エストロゲンの知られている臓器栄養効果の拮抗剤として作用すると主張した。
）は、エストロゲン拮抗剤クロミフェン（ｃｌｏｍｉｐｈｅｎｅ）が雌ラットの
ほとんどの臓器の重量を減ずることを報告した。Ｈａｒｔは、クロミフェンが、
エストロゲンの知られている臓器栄養効果の拮抗剤として作用すると主張した。
【０００４】 （発明の要約） 本発明は、身体中の多くの臓器および組織の大きさおよび重量を減らすことの
できる内生物質（本出願では「ミクリン（ｍｉｃｒｉｎ）」と記載する）の発見
に基づく。ミクリンは、 （i）雌哺乳動物をクロミフェンのクエン酸塩で処理すること（この工程は任
意） （ii）該哺乳動物から卵巣の静脈血を採取すること （iii）工程（ii）で採取した血液から卵巣静脈血漿を調製すること、および （iv）その卵巣静脈血漿からミクリンを少なくともある程度精製すること からなる工程によって得ることができる。
できる内生物質（本出願では「ミクリン（ｍｉｃｒｉｎ）」と記載する）の発見
に基づく。ミクリンは、 （i）雌哺乳動物をクロミフェンのクエン酸塩で処理すること（この工程は任
意） （ii）該哺乳動物から卵巣の静脈血を採取すること （iii）工程（ii）で採取した血液から卵巣静脈血漿を調製すること、および （iv）その卵巣静脈血漿からミクリンを少なくともある程度精製すること からなる工程によって得ることができる。
【０００５】 ミクリンは、クロミフェンによって誘発され、哺乳動物の体内にある臓器およ
び組織の重量を一般的に減らす効果をもつ内生物質であると定義することができ
る。ミクリンは、単一の化合物または一群の化合物であってよい。ミクリンは、
本出願に記載されているように血液から精製すると、１０〜２０キロダルトン（
ｋＤ）の範囲の見かけ分子量を持っているが、あたかも１０〜２０ｋＤの辺りで
あるかのように振舞わせる物理化学的性質を持つ、もっと大きな、または小さな
部分である可能性もある。さらに、活性成分は、担体と（共有結合的に、または
さらに可能性が高いのは非共有結合的に）結合することを通して、または同定さ
れたミクリンの断片であることによって、もっと小さい分子からなっているか、
あるいは１０〜２０ｋＤ部分がもっと大きい物質の生化学的活性フラグメントで
ある可能性もある。
び組織の重量を一般的に減らす効果をもつ内生物質であると定義することができ
る。ミクリンは、単一の化合物または一群の化合物であってよい。ミクリンは、
本出願に記載されているように血液から精製すると、１０〜２０キロダルトン（
ｋＤ）の範囲の見かけ分子量を持っているが、あたかも１０〜２０ｋＤの辺りで
あるかのように振舞わせる物理化学的性質を持つ、もっと大きな、または小さな
部分である可能性もある。さらに、活性成分は、担体と（共有結合的に、または
さらに可能性が高いのは非共有結合的に）結合することを通して、または同定さ
れたミクリンの断片であることによって、もっと小さい分子からなっているか、
あるいは１０〜２０ｋＤ部分がもっと大きい物質の生化学的活性フラグメントで
ある可能性もある。
【０００６】 理論的考察によって縛られることを願わないなら、このホルモンの別の出所も
考慮されるが、ミクリンは主として哺乳動物の生殖腺によって作られる新規に発
見されたホルモンであると信じられる。これは、臓器の大きさに対し広範囲にマ
イナスの効果を持つホルモンが発見された最初である。事実、本発明を除外する
と、本技術分野において技術的偏見があり、臓器の大きさには主にプラスの内分
泌的影響があると信じられた。つまり、臓器の縮小は、プラスの因子（たとえば
、下垂体栄養ホルモンのような因子）の欠如によって引き起こされると推定され
た。本発明は、通常臓器の大きさにマイナスに影響する（ただし、個々の臓器で
異なった応答をする）新規な物質（ミクリン）を導入する。
考慮されるが、ミクリンは主として哺乳動物の生殖腺によって作られる新規に発
見されたホルモンであると信じられる。これは、臓器の大きさに対し広範囲にマ
イナスの効果を持つホルモンが発見された最初である。事実、本発明を除外する
と、本技術分野において技術的偏見があり、臓器の大きさには主にプラスの内分
泌的影響があると信じられた。つまり、臓器の縮小は、プラスの因子（たとえば
、下垂体栄養ホルモンのような因子）の欠如によって引き起こされると推定され
た。本発明は、通常臓器の大きさにマイナスに影響する（ただし、個々の臓器で
異なった応答をする）新規な物質（ミクリン）を導入する。
【０００７】 ミクリンの作用のメカニズムは、まだ理解することができない。これには、細
胞の収縮、細胞分裂の阻害、およびアポトーシスの増強効果などの一つまたはそ
れ以上が含まれている可能性があるし、またはミクリンは、そのような効果をも
つ化合物と結合するのかもしれない。
胞の収縮、細胞分裂の阻害、およびアポトーシスの増強効果などの一つまたはそ
れ以上が含まれている可能性があるし、またはミクリンは、そのような効果をも
つ化合物と結合するのかもしれない。
【０００８】 （発明の開示） 上に記載した４段階工程に関して、工程（iv）は、好ましくは、たとえば、膜
濾過によって、卵 巣静脈血漿から１０〜３０ｋＤ分子量のフラクションを得ることからなる。さら
に好ましくは、工程（iv）は、たとえばゲル濾過クロマトグラフィーによって、
卵巣静脈血漿から１０〜２０ｋＤ分 子量のフラクションを得ることからなる。もっとも好ましいのは、工程（iv）は
、さらに、イオン 交換クロマトグラフィーによってさらに精製し、０．１〜０．２Ｍ ＮａＣｌ中
で溶出したフラクションを収集することからなる。工程は、下の実施例にくわし
く記載する。次のプロトコルおよびフローダイアグラムは、概要である。
濾過によって、卵 巣静脈血漿から１０〜３０ｋＤ分子量のフラクションを得ることからなる。さら
に好ましくは、工程（iv）は、たとえばゲル濾過クロマトグラフィーによって、
卵巣静脈血漿から１０〜２０ｋＤ分 子量のフラクションを得ることからなる。もっとも好ましいのは、工程（iv）は
、さらに、イオン 交換クロマトグラフィーによってさらに精製し、０．１〜０．２Ｍ ＮａＣｌ中
で溶出したフラクションを収集することからなる。工程は、下の実施例にくわし
く記載する。次のプロトコルおよびフローダイアグラムは、概要である。
【０００９】 （プロトコル） １．血漿は、＋４℃および４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、澄
明にする。 ２．澄明にした血漿を２０００ｒｐｍのアミコン セントリプレップ−３０（Ａ
ｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０）カートリッジを通して回転させて、
見かけ上０〜３０ｋＤのフラクションを得る。 ３．見かけ上０〜３０ｋＤのフラクションをアミコン セントリプレップ−１０
（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０）を通して回転させて、見かけ上
１０〜３０ｋＤのサブフラクションを得る。 ４．見かけ上１０〜３０ｋＤのフラクションをファルマシア ＦＰＬＣ スーパ
ーデックス−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５）
カラムを通して、濃縮しかつゲル濾過して、見かけ上１０〜２０ｋＤのサブフラ
クションを得る。 ５．見かけ上１０〜２０ｋＤのサブフラクションを繰返し濃縮し、緩衝液で希釈
し、ファルマシア ＦＰＬＣ モノ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣ Ｍｏ
ｎｏ−Ｑ）イオン交換カラムに移し、０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で溶出
する。溶出液は、０〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍおよび０．２〜０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌイオン交換フラクションに分割する。
明にする。 ２．澄明にした血漿を２０００ｒｐｍのアミコン セントリプレップ−３０（Ａ
ｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０）カートリッジを通して回転させて、
見かけ上０〜３０ｋＤのフラクションを得る。 ３．見かけ上０〜３０ｋＤのフラクションをアミコン セントリプレップ−１０
（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０）を通して回転させて、見かけ上
１０〜３０ｋＤのサブフラクションを得る。 ４．見かけ上１０〜３０ｋＤのフラクションをファルマシア ＦＰＬＣ スーパ
ーデックス−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５）
カラムを通して、濃縮しかつゲル濾過して、見かけ上１０〜２０ｋＤのサブフラ
クションを得る。 ５．見かけ上１０〜２０ｋＤのサブフラクションを繰返し濃縮し、緩衝液で希釈
し、ファルマシア ＦＰＬＣ モノ−Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣ Ｍｏ
ｎｏ−Ｑ）イオン交換カラムに移し、０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で溶出
する。溶出液は、０〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍおよび０．２〜０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌイオン交換フラクションに分割する。
【００１０】
【化１】
【００１１】 必要ならば、または望むならば、さらに、標準的精製/分別工程を行ってもよ
い。これには、ＨＰＬＣ、ＦＬＰＣ、ゲル濾過、電気泳動、カラムクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、または免疫アフィニ
ティーカラムなどの物理化学的方法を使用することが含まれる。
い。これには、ＨＰＬＣ、ＦＬＰＣ、ゲル濾過、電気泳動、カラムクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、または免疫アフィニ
ティーカラムなどの物理化学的方法を使用することが含まれる。
【００１２】 どの工程においてもミクリンの存在は、実施例３として下記するバイオアッセ
イによって確認することができる。ミクリンは、前述の工程によって得られたフ
ラクション以外のフラクションにも存在するかも知れないが、そのような他のフ
ラクション中の効果は一般的に低い。
イによって確認することができる。ミクリンは、前述の工程によって得られたフ
ラクション以外のフラクションにも存在するかも知れないが、そのような他のフ
ラクション中の効果は一般的に低い。
【００１３】 ミクリンを多く含む血漿は、ヒツジのような適当な哺乳動物から得られる。た
とえば、ヒツジ（約７０ｋｇ）に、本明細書に記載されているように繁殖サイク
ルの発情後３日目にクロミフェンのクエン酸塩１．５ｇ/日を投与する。ヒツジ
の年齢などの因子次第では、クロミフェン誘導は不必要であるかも知れない。
とえば、ヒツジ（約７０ｋｇ）に、本明細書に記載されているように繁殖サイク
ルの発情後３日目にクロミフェンのクエン酸塩１．５ｇ/日を投与する。ヒツジ
の年齢などの因子次第では、クロミフェン誘導は不必要であるかも知れない。
【００１４】 たとえば上記の方法によって得られたミクリンは、少なくとも１単位/ｍLの比
活性を持っていることが望ましい。ミクリンの１単位は、毎日投与したとき、本
出願に記載するバイオアッセイを用いて、日毎の同一等用量を４日間投与したと
きに、雌ラットの心臓の相対的（全放血後）臓器重量を５％減少させるに足るミ
クリンの量と定義する。
活性を持っていることが望ましい。ミクリンの１単位は、毎日投与したとき、本
出願に記載するバイオアッセイを用いて、日毎の同一等用量を４日間投与したと
きに、雌ラットの心臓の相対的（全放血後）臓器重量を５％減少させるに足るミ
クリンの量と定義する。
【００１５】 ミクリンは、医療に役立つ。特に、哺乳動物における臓器または組織の肥大お
よび/または過形成の治療に使用することができる。治療することのできる特定
症状には、たとえば、心臓または前立腺の肥大、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜
症、多嚢胞性腎疾患および下垂体線腫が含まれる。
よび/または過形成の治療に使用することができる。治療することのできる特定
症状には、たとえば、心臓または前立腺の肥大、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜
症、多嚢胞性腎疾患および下垂体線腫が含まれる。
【００１６】 この目的には、ミクリンは、上述のように、抽出によって、またはさらに精製
して得られた形態で使用することができるし、あるいは薬剤として処方すること
ができる。したがって、本発明の他の側面によれば、薬剤組成には、ミクリンお
よび薬剤学的に許される賦形剤または担体が含まれる。好ましい薬剤組成は、た
とえば、注射液（好ましくは無菌性）のような腸管外投与に適している。ミクリ
ンをその目的に適切に処方することのできる他の適当な非注射剤的投与方法は、
経口および鼻腔経由である。
して得られた形態で使用することができるし、あるいは薬剤として処方すること
ができる。したがって、本発明の他の側面によれば、薬剤組成には、ミクリンお
よび薬剤学的に許される賦形剤または担体が含まれる。好ましい薬剤組成は、た
とえば、注射液（好ましくは無菌性）のような腸管外投与に適している。ミクリ
ンをその目的に適切に処方することのできる他の適当な非注射剤的投与方法は、
経口および鼻腔経由である。
【００１７】 適当な担体および賦形剤、ならびに他の適当な添加剤は、当業者には公知であ
る。たとえば、ミクリン溶液は、たとえば無菌濾過のような何らかの適当な方法
を用いて無菌形態で調製することができる。
る。たとえば、ミクリン溶液は、たとえば無菌濾過のような何らかの適当な方法
を用いて無菌形態で調製することができる。
【００１８】 投与量は、当業者によって、典型的な因子に考慮して、決定される。適当な用
量は、約１単位／ｍＬの比活性を持つミクリンの１〜２５ｍL／日である。好ま
しい用量は、２．５〜１０ｍL／日、特に５ｍL／日である。
量は、約１単位／ｍＬの比活性を持つミクリンの１〜２５ｍL／日である。好ま
しい用量は、２．５〜１０ｍL／日、特に５ｍL／日である。
【００１９】 ミクリンは、新規な哺乳動物のミクリンホルモンシステムおよび／または臓器
栄養システムを開発するための実験道具として使用することもできる。ミクリン
は、たとえば、ここに記載するある程度精製したミクリンと作用剤または拮抗剤
の候補化合物を混合し、適当な対照と比較して、ここに記載するバイオアッセイ
において数値差を測定することによって、ミクリンの作用剤または拮抗剤をスク
リーンすることもできる。ミクリンは、ここに記載するバイオアッセイで検出で
きるようなミクリンホルモンシステムでの望ましくない毒物学的性質に対する候
補薬をスクリーンするために、およびより広い臓器栄養システムへの効果を検出
するために、臨床試験における代用マーカーとして使用することもできる。
栄養システムを開発するための実験道具として使用することもできる。ミクリン
は、たとえば、ここに記載するある程度精製したミクリンと作用剤または拮抗剤
の候補化合物を混合し、適当な対照と比較して、ここに記載するバイオアッセイ
において数値差を測定することによって、ミクリンの作用剤または拮抗剤をスク
リーンすることもできる。ミクリンは、ここに記載するバイオアッセイで検出で
きるようなミクリンホルモンシステムでの望ましくない毒物学的性質に対する候
補薬をスクリーンするために、およびより広い臓器栄養システムへの効果を検出
するために、臨床試験における代用マーカーとして使用することもできる。
【００２０】 下記の実施例は、添付図面に関連しながら、本発明を例示する。図の中で、
【００２１】 図１は、クロミフェンで処理していない卵巣摘出（“ｏｖｘ”）ヒツジから得
た頚静脈血漿を対照とした、雌ラットにおけるクロミフェン処理ヒツジから得た
試験用卵巣静脈血漿（「活性血漿」）のバイオアッセイ（ｎ＝１０）を示す。
た頚静脈血漿を対照とした、雌ラットにおけるクロミフェン処理ヒツジから得た
試験用卵巣静脈血漿（「活性血漿」）のバイオアッセイ（ｎ＝１０）を示す。
【００２２】 図２は、ｏｖｘヒツジ静脈血漿の１０〜３０ｋＤフラクションを対照として、
雌ラットにおける活性血漿の１０〜３０ｋＤフラクションのバイオアッセイ（ｎ
＝１１）を示す。
雌ラットにおける活性血漿の１０〜３０ｋＤフラクションのバイオアッセイ（ｎ
＝１１）を示す。
【００２３】 図３は、ｏｖｘヒツジ静脈血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションを対照（
ｎ＝５）として、雌ラットにおける活性血漿の１０〜２０ｋＤサブフラクション
のバイオアッセイ（ｎ＝８）を示す。
ｎ＝５）として、雌ラットにおける活性血漿の１０〜２０ｋＤサブフラクション
のバイオアッセイ（ｎ＝８）を示す。
【００２４】 図４は、パイロジェンフリーの生理食塩水を対照（ｎ＝２０）として、雌ラッ
トの活性血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションの０．１〜０．２Ｍ ＮａＣ
ｌイオン交換フラクション（「活性イオン交換フラクション」）のバイオアッセ
イ（ｎ＝５）を示す。
トの活性血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションの０．１〜０．２Ｍ ＮａＣ
ｌイオン交換フラクション（「活性イオン交換フラクション」）のバイオアッセ
イ（ｎ＝５）を示す。
【００２５】 図５は、ｏｖｘヒツジ静脈血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションの０．１
〜０．２Ｍ ＮａＣｌイオン交換フラクションを対照として、雄ラットの活性血
漿イオン交換フラクションのバイオアッセイ（ｎ＝５）を示す。
〜０．２Ｍ ＮａＣｌイオン交換フラクションを対照として、雄ラットの活性血
漿イオン交換フラクションのバイオアッセイ（ｎ＝５）を示す。
【００２６】 図中のデータは、次のようにして得られた。まず、試験ラットの平均相対（全
放血後）臓器重量を対照平均値に対するパーセンテージで表現した。１００から
これらの数字を引いて、試験平均値と対照平均値間のパーセンテージの差を出し
、その結果を、対照値を示すゼロベースラインに対してプロットした。図中の＊
印は、統計学的有意差を示す。すなわち、 ＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０２、＊＊＊＝ｐ＜０．０１、 ＊＊＊＊＝ｐ＜０．００２、＊＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 統計学的分析には、スチューデントのｔ−検定を用いた。
放血後）臓器重量を対照平均値に対するパーセンテージで表現した。１００から
これらの数字を引いて、試験平均値と対照平均値間のパーセンテージの差を出し
、その結果を、対照値を示すゼロベースラインに対してプロットした。図中の＊
印は、統計学的有意差を示す。すなわち、 ＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０２、＊＊＊＝ｐ＜０．０１、 ＊＊＊＊＝ｐ＜０．００２、＊＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 統計学的分析には、スチューデントのｔ−検定を用いた。
【００２７】 実施例１ ミクリンの調製 １．ヒツジ卵巣静脈血漿の単離 複産の非妊娠雌ヒツジを用いた。雌ヒツジは、発情期の初日（０日目）を知る
ために精管切除した雄ヒツジとともに小屋に入れた。発情後３日目に、クロミフ
ェンのクエン酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｐｏｏｌｅ、英国
）のカタログ番号Ｃ６２７２）１．５ｇ／日（パイロジェンフリーの温生理食塩
水で最終容量１０ｍＬに希釈した）を雌ヒツジに筋肉内注射した。クロミフェン
注射を、発情後４、５および６日後に繰り返した。発情後６日目に、ペントバル
ビタール（ＲＭＢ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄ．（Ｄａｇｅｎｈａｍ
、英国）麻酔のもとで、Ｈｅａｐらの方法（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．（１
９８５年）７４巻６４５〜６５６ページ）にしたがって、ヒツジから卵巣静脈血
を採集し、凝固を防ぐためにヘパリン（１国際単位／血液１ｍＬ）（Ｃ．Ｐ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｗｒｅｘｈａｍ、英国））に入れた
。血液試料は、遠心分離するまで、ただちに氷の上に置いた。ついで、卵巣静脈
血を４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、卵巣静脈血漿を得た。血漿
層を取り出し、それをプラスチック製ビンに入れて−１０℃の冷凍機中に保存し
た。
ために精管切除した雄ヒツジとともに小屋に入れた。発情後３日目に、クロミフ
ェンのクエン酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｐｏｏｌｅ、英国
）のカタログ番号Ｃ６２７２）１．５ｇ／日（パイロジェンフリーの温生理食塩
水で最終容量１０ｍＬに希釈した）を雌ヒツジに筋肉内注射した。クロミフェン
注射を、発情後４、５および６日後に繰り返した。発情後６日目に、ペントバル
ビタール（ＲＭＢ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄ．（Ｄａｇｅｎｈａｍ
、英国）麻酔のもとで、Ｈｅａｐらの方法（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．（１
９８５年）７４巻６４５〜６５６ページ）にしたがって、ヒツジから卵巣静脈血
を採集し、凝固を防ぐためにヘパリン（１国際単位／血液１ｍＬ）（Ｃ．Ｐ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｗｒｅｘｈａｍ、英国））に入れた
。血液試料は、遠心分離するまで、ただちに氷の上に置いた。ついで、卵巣静脈
血を４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、卵巣静脈血漿を得た。血漿
層を取り出し、それをプラスチック製ビンに入れて−１０℃の冷凍機中に保存し
た。
【００２８】 ２．ヒツジ卵巣血漿からの見かけ上０〜３０ｋＤ分子量のフラクションの調製 上の１で得た血漿を、＋４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、澄明に
した。ついで、澄明にした血漿フラクションを、見かけ上のカットオフサイズ３
０ｋＤを持つ膜によって分離された同心の内側コンパートメントおよび外側コン
パートメントをもつ遠心分離装置である、アミコン セントリプレップ−３０（
Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０）に注入した。装置を、＋４℃、２
０００ｒｐｍで２時間回転させた。内側コンパートメントに採集された濾液をピ
ペットで取り除き、さらに２時間遠心分離を継続した。この工程をさらに２回繰
返し、その後、内側コンパートメントを膜とともに交換した。遠心分離の連続操
作を繰返した。この方法によって、血漿フラクションから２０ｍＬの濾液、見か
け上０〜３０ｋＤのフラクションを得た。この見かけ上０〜３０ｋＤのフラクシ
ョンを−１０℃でプラスチック製容器に保存するか、下の３に使用した。
した。ついで、澄明にした血漿フラクションを、見かけ上のカットオフサイズ３
０ｋＤを持つ膜によって分離された同心の内側コンパートメントおよび外側コン
パートメントをもつ遠心分離装置である、アミコン セントリプレップ−３０（
Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０）に注入した。装置を、＋４℃、２
０００ｒｐｍで２時間回転させた。内側コンパートメントに採集された濾液をピ
ペットで取り除き、さらに２時間遠心分離を継続した。この工程をさらに２回繰
返し、その後、内側コンパートメントを膜とともに交換した。遠心分離の連続操
作を繰返した。この方法によって、血漿フラクションから２０ｍＬの濾液、見か
け上０〜３０ｋＤのフラクションを得た。この見かけ上０〜３０ｋＤのフラクシ
ョンを−１０℃でプラスチック製容器に保存するか、下の３に使用した。
【００２９】 ３．ヒツジ卵巣血漿からの、見かけ上１０〜３０ｋＤ分子量のサブフラクショ
ンの調製 上の２から得た、見かけ上０〜３０ｋＤの血漿フラクションを、見かけ上１０
ｋＤのカットオフサイズを持つアミコン セントリプレップ−１０（Ａｍｉｃｏ
ｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０）に注入した。装置を、＋４℃、２０００ｒｐ
ｍで１時間回転させた。内側コンパートメントに採集された濾液をピペットで取
り除き、約２ｍLの試料が外側のコンパートメントに残るまでこの操作を繰り返
した。これを、リン酸緩衝液を加えた食塩水（PBS）で１５ｍLに希釈し、外側コ
ンパートメントの容量が約２ｍLに減るまで、遠心分離を繰り返した。得られた
フラクション（見かけ上１０〜３０ｋＤのサブフラクション）は、−１０℃でプ
ラスチック製容器に保存するか、下の４に使用した。
ンの調製 上の２から得た、見かけ上０〜３０ｋＤの血漿フラクションを、見かけ上１０
ｋＤのカットオフサイズを持つアミコン セントリプレップ−１０（Ａｍｉｃｏ
ｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０）に注入した。装置を、＋４℃、２０００ｒｐ
ｍで１時間回転させた。内側コンパートメントに採集された濾液をピペットで取
り除き、約２ｍLの試料が外側のコンパートメントに残るまでこの操作を繰り返
した。これを、リン酸緩衝液を加えた食塩水（PBS）で１５ｍLに希釈し、外側コ
ンパートメントの容量が約２ｍLに減るまで、遠心分離を繰り返した。得られた
フラクション（見かけ上１０〜３０ｋＤのサブフラクション）は、−１０℃でプ
ラスチック製容器に保存するか、下の４に使用した。
【００３０】 ４．ヒツジ卵巣血漿からの、見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量サブフラクション
の調製 上の３から得られた、見かけ上１０〜３０ｋＤの血漿サブフラクションを、見
かけ上１０ｋＤのカットオフサイズを持つ膜を取り付けた小さな遠心分離装置で
ある、アミコン セントリコン−１０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１
０）を用い、２０００ｒｐｍで１時間遠心分離機中で回転させることによって、
８００μＬに濃縮した。２００μＬのアリコートを、タンパク質の分子量標品で
較正したＦＰＬＣゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７
５、ＨＲ １０/３０、長さ３０ｃｍ、直径１ｃｍ）にかけた。溶出は、ＰＢＳ
２５ｍＬで２５分間行い、０．５ｍＬのフラクションを採集した。見かけ上１０
〜２０ｋＤのサブフラクションを得るために、見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量の
範囲内に入ったフラクションをプールし、−１０℃でプラスチック製容器中に保
存するか、下の５で使用した。
の調製 上の３から得られた、見かけ上１０〜３０ｋＤの血漿サブフラクションを、見
かけ上１０ｋＤのカットオフサイズを持つ膜を取り付けた小さな遠心分離装置で
ある、アミコン セントリコン−１０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１
０）を用い、２０００ｒｐｍで１時間遠心分離機中で回転させることによって、
８００μＬに濃縮した。２００μＬのアリコートを、タンパク質の分子量標品で
較正したＦＰＬＣゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７
５、ＨＲ １０/３０、長さ３０ｃｍ、直径１ｃｍ）にかけた。溶出は、ＰＢＳ
２５ｍＬで２５分間行い、０．５ｍＬのフラクションを採集した。見かけ上１０
〜２０ｋＤのサブフラクションを得るために、見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量の
範囲内に入ったフラクションをプールし、−１０℃でプラスチック製容器中に保
存するか、下の５で使用した。
【００３１】 ５．ヒツジ卵巣血漿の見かけ上１０〜２０ｋＤのサブフラクションから得た３
個のイオン交換（塩化ナトリウム）フラクションの調製 上の４から得たヒツジ卵巣血漿の見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量のサブフラク
ションを、アミコン セントリコン−３（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−
３）中で遠心分離により（５ｍＬを１ｍＬに）濃縮した。濃縮したフラクション
を、希釈およびアミコン セントリプレップ−３およびセントリコン−３中での
濃縮を繰り返して、２０ｍＬのトリス・ＨＣｌ緩衝液で緩衝液交換にかけた。つ
いで、５００μＬのアリコートを、ＦＰＬＣイオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｍｏｎｏ−Ｑ、ＨＲ ５／５、長さ４ｃｍ、直径０．５ｃｍ）にかけ、２
０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中の０〜０．３Ｍ 塩化ナトリウム溶液
の線形グラジエントで溶出した。溶出は、１ｍＬ／分の流速で１５分間行い、０
．５ｍＬのフラクションを採集した。溶出液フラクションは、ＮａＣｌグラジエ
ントの０〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍおよび０．２〜０．３Ｍセクションに相
当する３個のプールに分けた。
個のイオン交換（塩化ナトリウム）フラクションの調製 上の４から得たヒツジ卵巣血漿の見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量のサブフラク
ションを、アミコン セントリコン−３（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−
３）中で遠心分離により（５ｍＬを１ｍＬに）濃縮した。濃縮したフラクション
を、希釈およびアミコン セントリプレップ−３およびセントリコン−３中での
濃縮を繰り返して、２０ｍＬのトリス・ＨＣｌ緩衝液で緩衝液交換にかけた。つ
いで、５００μＬのアリコートを、ＦＰＬＣイオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｍｏｎｏ−Ｑ、ＨＲ ５／５、長さ４ｃｍ、直径０．５ｃｍ）にかけ、２
０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中の０〜０．３Ｍ 塩化ナトリウム溶液
の線形グラジエントで溶出した。溶出は、１ｍＬ／分の流速で１５分間行い、０
．５ｍＬのフラクションを採集した。溶出液フラクションは、ＮａＣｌグラジエ
ントの０〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍおよび０．２〜０．３Ｍセクションに相
当する３個のプールに分けた。
【００３２】 実施例１Ａ 収率を上げるために、実施例１に掲げたいくつかの工程を下記のように変更し
てもよい。 ２．ヒツジ卵巣血漿から得られた見かけ上０〜３０ｋＤ分子量のフラクション
の調製 血漿を、２０００Ｇまたは同等の条件で１０分間遠心分離して、澄明にした。
澄明にした血漿（１２０ｍＬ）を８個のＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−
３０濾過ユニットに分配し、＋４℃、１８００ｒｐｍで１０〜１２時間濃縮した
。間隔をおいて濾過液を収集し、最終容量８０ｍＬが得られるまで、遠心分離を
続けた。この見かけ上０〜３０ｋＤのフラクションを−２０℃でポリプロピレン
チューブ中に一夜保存した。
てもよい。 ２．ヒツジ卵巣血漿から得られた見かけ上０〜３０ｋＤ分子量のフラクション
の調製 血漿を、２０００Ｇまたは同等の条件で１０分間遠心分離して、澄明にした。
澄明にした血漿（１２０ｍＬ）を８個のＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−
３０濾過ユニットに分配し、＋４℃、１８００ｒｐｍで１０〜１２時間濃縮した
。間隔をおいて濾過液を収集し、最終容量８０ｍＬが得られるまで、遠心分離を
続けた。この見かけ上０〜３０ｋＤのフラクションを−２０℃でポリプロピレン
チューブ中に一夜保存した。
【００３３】 ３．ヒツジ卵巣血漿からの見かけ上３〜３０ｋＤ分子量のフラクションの調製 （上の２で記載したようにして生成した）見かけ上０〜３０ｋＤ分子量のフラ
クションを、６個のアミコン セントリプレップ−３濾過ユニットに分配し、＋
４℃、１８００ｒｐｍで８〜１０時間遠心分離した。各セントリプレップ−３ユ
ニットの外側のコンパートメントに２ｍｌの残分が残るまで、遠心分離を行った
。残分（３〜３０ｋＤ分子量のサブフラクション）を−２０℃で一夜保存した。
続いて、この残分を、アミコン セントリコン−３ユニット中で５００μＬの最
終体積になるまで濃縮した。＋４℃、３０００ｒｐｍで１〜２時間試料を遠心分
離した後、残分を氷の上に置き、その後、下の４に記載するようにゲル濾過カラ
ムにかけた。
クションを、６個のアミコン セントリプレップ−３濾過ユニットに分配し、＋
４℃、１８００ｒｐｍで８〜１０時間遠心分離した。各セントリプレップ−３ユ
ニットの外側のコンパートメントに２ｍｌの残分が残るまで、遠心分離を行った
。残分（３〜３０ｋＤ分子量のサブフラクション）を−２０℃で一夜保存した。
続いて、この残分を、アミコン セントリコン−３ユニット中で５００μＬの最
終体積になるまで濃縮した。＋４℃、３０００ｒｐｍで１〜２時間試料を遠心分
離した後、残分を氷の上に置き、その後、下の４に記載するようにゲル濾過カラ
ムにかけた。
【００３４】 ４．ヒツジ卵巣血漿からの見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量のサブフラクション
の調製 上の３で調製した試料（２×２００μＬ）を、次に、タンパク質分子量標品で
較正したＦＰＬＣゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７
５、ＨＲ １０／３０、長さ３０ｃｍ、直径１ｃｍ）にかけた。溶出は、ＰＢＳ
で行い、４５分間にわたってフラクション（１ｍＬ／チューブ）を採集した。見
かけ上１０〜２０ｋＤ分子量の範囲内に入ったフラクションをプールし、セント
リプレップ−３ユニットでの遠心分離（＋４℃、１８００ｒｐｍで１〜２時間）
により２ｍＬに濃縮した。残分を、−２０℃でポリプロピレンチューブ中に保存
するか、下の５で使用した。
の調製 上の３で調製した試料（２×２００μＬ）を、次に、タンパク質分子量標品で
較正したＦＰＬＣゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７
５、ＨＲ １０／３０、長さ３０ｃｍ、直径１ｃｍ）にかけた。溶出は、ＰＢＳ
で行い、４５分間にわたってフラクション（１ｍＬ／チューブ）を採集した。見
かけ上１０〜２０ｋＤ分子量の範囲内に入ったフラクションをプールし、セント
リプレップ−３ユニットでの遠心分離（＋４℃、１８００ｒｐｍで１〜２時間）
により２ｍＬに濃縮した。残分を、−２０℃でポリプロピレンチューブ中に保存
するか、下の５で使用した。
【００３５】 ５．ヒツジ卵巣血漿の見かけ上１０〜２０ｋＤ分子量のサブフラクションから
の、イオン交換（塩化ナトリウム）フラクションの調製 上の４で生成した濃縮フラクションを、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．６）で希釈して１５ｍＬにすることにより緩衝液交換にかけた。セントリプ
レップ−３ユニットを、前と同じように、６〜８時間（＋４℃で１８００ｒｐｍ
）遠心した。このフラクションをさらに、セントリコン−３ユニット（＋４℃、
３０００ｒｐｍで１〜２時間）中で約５００μＬ以下に濃縮した。試料（２×２
００μＬ）を、Ｖｙｄａｃ’ｓ Ｐｒｏｔｏｎ ＳＡＸ ＨＰＬＣイオン交換カ
ラム（０．７５×５ｃｍ）に適用し、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
６）中の０〜１Ｍ塩化ナトリウムの線形濃度勾配で溶出した。溶出フラクション
（２ｍＬ／チューブ）を４５分間以上採集し、ラットのバイオアッセイ（実施例
３）で活性を測定した。
の、イオン交換（塩化ナトリウム）フラクションの調製 上の４で生成した濃縮フラクションを、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．６）で希釈して１５ｍＬにすることにより緩衝液交換にかけた。セントリプ
レップ−３ユニットを、前と同じように、６〜８時間（＋４℃で１８００ｒｐｍ
）遠心した。このフラクションをさらに、セントリコン−３ユニット（＋４℃、
３０００ｒｐｍで１〜２時間）中で約５００μＬ以下に濃縮した。試料（２×２
００μＬ）を、Ｖｙｄａｃ’ｓ Ｐｒｏｔｏｎ ＳＡＸ ＨＰＬＣイオン交換カ
ラム（０．７５×５ｃｍ）に適用し、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
６）中の０〜１Ｍ塩化ナトリウムの線形濃度勾配で溶出した。溶出フラクション
（２ｍＬ／チューブ）を４５分間以上採集し、ラットのバイオアッセイ（実施例
３）で活性を測定した。
【００３６】 実施例２ 薬剤組成 本明細書に記載したような０．１〜０．２Ｍ ＮａＣｌ活性イオン交換フラク
ションとしての無菌濾過したミクリン（５．５ｍＬ。ここに記載したように、比
活性１単位／ｍＬ）であって、パイロジェンフリーの生理食塩水で適当に希釈し
、かつ無菌ガラス製バイアルに入れて供給するミクリン。その投与量（５ｍＬ）
を、無菌針を用いる腹膜内注射によって投与することができる。
ションとしての無菌濾過したミクリン（５．５ｍＬ。ここに記載したように、比
活性１単位／ｍＬ）であって、パイロジェンフリーの生理食塩水で適当に希釈し
、かつ無菌ガラス製バイアルに入れて供給するミクリン。その投与量（５ｍＬ）
を、無菌針を用いる腹膜内注射によって投与することができる。
【００３７】 実施例３ バイオアッセイ 全血漿および上の実施例１から得られた、ある程度精製したミクリンを、下に
記載するようにインビボのバイオアッセイで試験した。
記載するようにインビボのバイオアッセイで試験した。
【００３８】 生育したウイスター系雌アルビノラット（体重２００〜２２０ｇ）または生育
したウイスター系雄アルビノラット（体重３００〜４００ｇ）に、ヒツジ卵巣静
脈血漿（または上の実施例１で調製した他のフラクション）の日毎投与量１×１
ｍＬを、４日間、無菌針（０．５×１６ｍｍ、２５ｇ）で腹膜内に注射した。投
与開始後９６時間後に、ラットに麻酔をかけ（最後は炭酸ガスを使用）、胸腔を
外科的に開いた。ラットには、心臓穿刺で少し放血させた（５ｍＬ）。ついで、
Ｈａｒｔ；Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９９０年）６１巻１８５〜１９４ページに
よって記述されている方法で、各ラットの全身解剖を行った。
したウイスター系雄アルビノラット（体重３００〜４００ｇ）に、ヒツジ卵巣静
脈血漿（または上の実施例１で調製した他のフラクション）の日毎投与量１×１
ｍＬを、４日間、無菌針（０．５×１６ｍｍ、２５ｇ）で腹膜内に注射した。投
与開始後９６時間後に、ラットに麻酔をかけ（最後は炭酸ガスを使用）、胸腔を
外科的に開いた。ラットには、心臓穿刺で少し放血させた（５ｍＬ）。ついで、
Ｈａｒｔ；Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９９０年）６１巻１８５〜１９４ページに
よって記述されている方法で、各ラットの全身解剖を行った。
【００３９】 下記の臓器を、標準的な順序で一部放血させた雌ラットから取り出し、結合組
織および脂肪を削ぎ落とし、重量を測定した：心臓、肝臓、下垂体、副腎、腎臓
、脾臓、子宮および卵巣。雄のラットからは、心臓、肝臓、下垂体、腎臓、脾臓
、前立腺および精巣。各臓器の重量を測定し、結果をラットの最終総体重に対す
るパーセンテージ（ｇ／ｋｇまたは％）として表示した。
織および脂肪を削ぎ落とし、重量を測定した：心臓、肝臓、下垂体、副腎、腎臓
、脾臓、子宮および卵巣。雄のラットからは、心臓、肝臓、下垂体、腎臓、脾臓
、前立腺および精巣。各臓器の重量を測定し、結果をラットの最終総体重に対す
るパーセンテージ（ｇ／ｋｇまたは％）として表示した。
【００４０】 対照実験は、上の実施例１におけるようにして、しかし卵巣摘出したクロミフ
ェン未処理のヒツジから得られた、ヒツジの全頚静脈血漿およびヒツジの頚静脈
血漿から得られた類似のフラクション（分子量フラクションまたはイオン交換フ
ラクション）でもって、同一方法を用いて行った。
ェン未処理のヒツジから得られた、ヒツジの全頚静脈血漿およびヒツジの頚静脈
血漿から得られた類似のフラクション（分子量フラクションまたはイオン交換フ
ラクション）でもって、同一方法を用いて行った。
【００４１】 活性血漿、活性血漿のフラクション、活性血漿のサブフラクションおよび活性
血漿のイオン交換フラクションを用いて得られた臓器重量の減少の結果を、図１
〜５に示す。
血漿のイオン交換フラクションを用いて得られた臓器重量の減少の結果を、図１
〜５に示す。
図１〜５は各々、種々の臓器の重量に及ぼす種々の単離段階でのミクリンの効
果のバイオサッセイの結果を、対照と比較して示す。
果のバイオサッセイの結果を、対照と比較して示す。
【図１】 クロミフェンで処理していない卵巣摘出（“ｏｖｘ”）ヒツジから得た頚静脈
血漿を対照とした、雌ラットにおけるクロミフェン処理ヒツジから得た試験用卵
巣静脈血漿（「活性血漿」）のバイオアッセイ（ｎ＝１０）を示す。
血漿を対照とした、雌ラットにおけるクロミフェン処理ヒツジから得た試験用卵
巣静脈血漿（「活性血漿」）のバイオアッセイ（ｎ＝１０）を示す。
【図２】 ｏｖｘヒツジ静脈血漿の１０〜３０ｋＤフラクションを対照として、雌ラット
における活性血漿の１０〜３０ｋＤフラクションのバイオアッセイ（ｎ＝１１）
を示す。
における活性血漿の１０〜３０ｋＤフラクションのバイオアッセイ（ｎ＝１１）
を示す。
【図３】 ｏｖｘヒツジ静脈血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションを対照（ｎ＝５）
として、雌ラットにおける活性血漿の１０〜２０ｋＤサブフラクションのバイオ
アッセイ（ｎ＝８）を示す。
として、雌ラットにおける活性血漿の１０〜２０ｋＤサブフラクションのバイオ
アッセイ（ｎ＝８）を示す。
【図４】 パイロジェンフリーの生理食塩水を対照（ｎ＝２０）として、雌ラットの活性
血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションの０．１〜０．２Ｍ ＮａＣｌイオン
交換フラクション（「活性イオン交換フラクション」）のバイオアッセイ（ｎ＝
５）を示す。
血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションの０．１〜０．２Ｍ ＮａＣｌイオン
交換フラクション（「活性イオン交換フラクション」）のバイオアッセイ（ｎ＝
５）を示す。
【図５】 ｏｖｘヒツジ静脈血漿の１０〜２０ｋＤのサブフラクションの０．１〜０．２Ｍ
ＮａＣｌイオン交換フラクションを対照として、雄ラットの活性血漿イオン交
換フラクションのバイオアッセイ（ｎ＝５）を示す。
ＮａＣｌイオン交換フラクションを対照として、雄ラットの活性血漿イオン交
換フラクションのバイオアッセイ（ｎ＝５）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 AA04 AA05 BB35 CA32 DA15 DA27 NA14 ZB21 4H045 AA10 AA20 CA40 DA30 EA28 FA71 GA15 GA23 HA05
Claims (9)
- 【請求項１】 臓器重量を減らす能力をもつ物質であり、 雌哺乳動物の卵巣静脈血から採集すること、 その血液から卵巣静脈血漿を調製すること、および その血漿から得た該物質を少なくともある程度は精製すること によって得られる物質。
- 【請求項２】 該精製が１０〜３０ｋＤフラクションを得ることからなる請
求項１記載の物質。 - 【請求項３】 該精製が１０〜２０ｋＤフラクションを得ることからなる請
求項１記載の物質。 - 【請求項４】 該精製が、さらに、イオン交換クロマトグラフィーおよび０
．１〜０．２Ｍ ＮａＣｌ中に溶出したフラクションを採集することを含む請求
項３記載の物質。 - 【請求項５】 該精製が下記のプロトコル： 血漿を遠心分離によって澄明にすること 澄明にした血漿を回転させて、見かけ上０〜３０ｋＤサブフラクションを得
ること 見かけ上０〜〜３０ｋＤのサブフラクションを回転させて、見かけ上１０〜
３０ｋＤのサブフ ラクションを得ること 見かけ上１０〜〜３０ｋＤのサブフラクションを回転させて、見かけ上１０
〜２０ｋＤのサブ フラクションを得ること 見かけ上１０〜２０ｋＤのサブフラクションを繰返し濃縮し、緩衝液で希釈
し、イオン交換カ ラムにかけ、０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で溶出
すること、および 溶出液を０〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍおよび０．２〜０．３Ｍ ＮａＣ
ｌイオン交換フラ クションに分割すること を含む請求項１記載の物質。 - 【請求項６】 哺乳動物がヒツジであることを特徴とする前記各請求項記載
の物質。 - 【請求項７】 医療用途のための前記各請求項記載の物質。
- 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載の物質および薬剤学的に許容
される賦形剤または担体からなる薬剤組成物。 - 【請求項９】 臓器または組織の肥大化の治療用薬剤を製造するための、請
求項１〜６のいずれかに記載の物質の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9826186.0A GB9826186D0 (en) | 1998-12-01 | 1998-12-01 | Chemical compound |
| GB9826186.0 | 1998-12-01 | ||
| PCT/GB1999/004013 WO2000032208A2 (en) | 1998-12-01 | 1999-12-01 | Isolated material having an anti-organotrophic effect |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002531410A true JP2002531410A (ja) | 2002-09-24 |
Family
ID=10843297
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000584903A Pending JP2002531410A (ja) | 1998-12-01 | 1999-12-01 | 抗臓器栄養効果をもつ単離物質 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7572465B1 (ja) |
| EP (1) | EP1135145B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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