DE69906575T2

DE69906575T2 - Isoliertes material mit anti-organotropischer wirkung

Info

Publication number: DE69906575T2
Application number: DE69906575T
Authority: DE
Inventors: John Ernest Hart
Original assignee: Endocrine Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Endocrine Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: NZ512123A; US7572465B1; DE69906575D1; ATE235910T1; ZA200104487B; WO2000032208A2; ES2192419T3; US20050244507A1; EP1135145B1; CA2353590A1; WO2000032208A3; GB9826186D0; EP1135145A2; PT1135145E; JP2002531410A; AU1399500A; US7700132B2; DK1135145T3; AU758592B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Material, das allgemein die Organmasse verringert, und dessen therapeutische Verwendung.

Hintergrund der Erfindung

Die Säugergonaden sondern eine Reihe von Hormonen, wie Östrogen und Testosteron, sowie andere Signalmoleküle, wie Wachstumsfaktoren und Cytokine, die Wirkungen im gesamten Körper haben, ab. Die Mechanismen, die die Massen von Geweben und Organen regulieren, können in ihrer Gesamtheit als das "organotrophe System" bezeichnet werden. Der endokrine (hormonale) Beitrag zu diesem System schließt die Hypothalamus-Hypophyse-Gonaden-Achse, die Nebennieren, die Schilddrüse und weitere endokrine Gewebe ein. Zu den allgemein positiven endokrinen Einflüssen im organotrophen System gehören Östrogene und Testosteron. Organotrophe Wirkungen von Östrogenen werden von Hart, Pharmac. Ther. (1990) 47: 203-218, diskutiert.
Hart, Toxicology (1990) 61: 185-194, berichtet, dass der Östrogen-Antagonist Clomiphen die meisten Organgewichte in weiblichen Ratten verringern kann. Hart postuliert, dass Clomiphen möglicherweise als ein Antagonist der bekannten positiven organotrophen Östrogenwirkung wirkt.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden eines endogenen Materials (nachstehend als "Micrin" beschrieben), das die Größe und das Gewicht vieler Organe und Gewebe im gesamten Körper verringern kann. Micrin kann nach einem Verfahren erhalten werden, das folgende Stufen umfasst:
(i) Behandlung eines weiblichen Säugers mit Clomiphencitrat (diese Stufe ist optional);
(ii) Auffangen von ovarialem venösem Blut aus dem Säuger;
(iii) Herstellung von ovarialem venösem Plasma aus dem in Stufe (ii) aufgefangenen Blut; und
(iv) mindestens teilweise Reinigung von Micrin aus dem ovarialen venösen Plasma.
Micrin kann als ein endogenes Material definiert werden, das durch Clomiphen induziert werden kann und das die Wirkung im Allgemeinen der Verringerung der Organ- oder Gewebemasse in einem Säugerkörper hat. Bei Micrin kann es sich um eine einzelne Verbindung oder eine Gruppe von Verbindungen handeln. Micrin weist einen Molekulargewichtsbereich von nominal 10 bis 20 kD auf, wenn es aus Blut aufgereinigt wird, wie hier definiert, wobei es jedoch möglich ist, dass es einen größeren oder kleineren Anteil mit physiko-chemischen Eigenschaften darstellt, die bewirken, dass es sich verhält, als ob es ein Anteil von 10 bis 20 kD wäre. Ferner ist es möglich, dass die aktive Komponente ein geringeres Molekulargewicht aufweist, indem sie mit einem Träger (kovalent oder mit größerer Wahrscheinlichkeit nicht kovalent) assoziiert ist oder indem sie ein Fragment von Micrin ist, das identifiziert wurde, oder indem der Anteil von 10 bis 20 kD ein biologisch aktives Fragment eine größeren Einheit ist.
Ohne an theoretische Betrachtungen gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass Micrin ein neu aufgefundenes Hormon ist, das hauptsächlich von Säugergonaden gebildet wird, wobei jedoch auch andere Quellen des Hormons in Betracht gezogen werden. Dies ist das erste Mal, dass ein Hormon mit weit verbreitetem negativem Einfluss auf die Organgröße entdeckt worden ist. In der Tat gab es ein technisches Vorurteil auf diesem Gebiet, das von der vorliegenden Erfindung weg wies, wobei angenommen wurde, dass es hauptsächlich positive endokrine Einflüsse auf die Organgröße gibt; es wurde vermutet, dass die Organschrumpfung durch das Fehlen eines positiven Faktors (wie z. B. trophischen Hypophysenhormonen) hervorgebracht wird. Die vorliegende Erfindung führt eine neue Einheit (Micrin) ein, die allgemein ein negativer Einfluss auf die Organgröße ist (wobei jedoch einzelne Organe verschieden ansprechen mögen).
Der Wirkungsmechanismus von Micrin ist noch nicht verstanden. Er mag eine oder mehrere der Wirkungen Zellschrumpfung, Hemmung der Zellteilung und eine verstärkte Wirkung bei der Apoptose beinhalten, oder Micrin mag mit einer Substanz assoziiert sein, die derartige Wirkungen aufweist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 bis 5 zeigen jeweils die Ergebnisse von Bioassays gegenüber Kontrollen der Wirkung von Micrin in verschiedenen Stadien der Isolierung auf die Gewichte verschiedener Organe.

Darstellung der Erfindung

Mit Bezug auf das vorstehend definierte vierstufige Verfahren umfasst Stufe (iv) vorzugsweise das Erhalten der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10 bis 30 kD aus ovarialem venösem Plasma, z. B. durch Membranfiltration. Stärker bevorzugt umfasst Stufe (iv) das Erhalten der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10 bis 20 kD aus ovarialem venösem Plasma, z. B. durch Gelfiltrationschromatographie. Insbesondere umfasst Stufe (iv) ferner das Unterwerfen der Fraktion von 10 bis 20 kD einer weiteren Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie und das Auffangen der Fraktion, die in 0,1 bis 0,2 M NaCl eluiert wird. Das Verfahren ist vollständig in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Das nachstehende Protokoll und das Flussdiagramm sind Zusammenfassungen.

Protokoll

1. Plasma, geklärt durch Zentrifugation bei +4ºC und 4.000 U/min für 5 min.
2. Geklärtes Plasma, zentrifugiert durch eine Amicon Centriprep-30-Patrone bei 2.000 U/min. um eine Fraktion von nominal 10 bis 30 kD zu ehalten.
3. Fraktion von nominal 0 bis 30 kD, zentrifugiert durch eine Amicon Centriprep- 10, um eine Subfraktion von nominal 10 bis 30 kD zu erhalten.
4. Subfraktion von nominal 10 bis 30 kD, konzentriert und gelfiltriert durch eine Pharmacia FPLC Superdex-75-Säule, um eine Subfraktion von nominal 10 bis 20 kD zu erhalten.
5. Subfraktion von nominal 10 bis 20 kD, wiederholt konzentriert und mit Puffer verdünnt und aufgetragen auf eine Pharmacia FPLC Mono-Q-Ionenaustauschsäule, eluiert mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl. Eluat aufgeteilt in Ionenaustauschfraktionen von 0 bis 0,1 M; 0,1 bis 0,2 M und 0,2 bis 0,3 M NaCl. Flussdiagramm
Falls erforderlich oder gewünscht, können weitere Standardreinigungs/Fraktionierungsverfahren durchgeführt werden. Diese umfassen physiko-chemische Verfahren, wie HPLC, FPLC, Gelfiltration, Elektrophorese, Säulenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrische Fokussierung und die Verwendung von lmmunoaffinitätssäulen.
Das Vorhandensein von Micrin in einer beliebigen Stufe kann durch den Bioassay, der nachstehend in Beispiel 3 berichtet wird, bestätigt werden. Micrin kann auch in anderen Fraktionen als denen, die durch die angegebenen Stufen erhalten werden, vorhanden sein; seine Wirkung ist jedoch allgemein geringer in derartigen anderen Fraktionen.
Micrin-reiches Plasma kann aus einem geeigneten Säuger, wie einem Schaf, erhalten werden. Zum Beispiel wird das Schaf (ungefähr 70 kg) mit Clomiphencitrat bei 1,5 g/Tag an Tag 3 post-Östrus seines Reproduktionszyklus und die folgenden drei Tage, wie hier beschrieben, behandelt. Abhängig von Faktoren, wie dem Alter des Schafs, mag die Clomiphen-Induktion nicht erforderlich sein.
Vorzugsweise weist das Micrin, z. B. erhalten nach dem angegebenen Verfahren, eine spezifische Aktivität von mindestens 1 Einheit/ml auf. Eine Einheit Micrin ist definiert als eine Menge an Micrin, die bei täglicher Verabreichung ausreichend ist, um das relative Organgewicht (nach Ausbluten) des weiblichen Rattenherzes um 5% bei Verabreichung in vier gleichen täglichen Dosen unter Verwendung des hier beschriebenen Bioassays zu verringern.
Micrin hat therapeutische Brauchbarkeit. Insbesondere kann es für die Behandlung von Organ- oder Gewebehyperthrophie und/oder Hyperplasie in einem Säuger verwendet werden. Spezielle Zustände, die behandelt werden können, umfassen z. B. Hypertrophie von Herz oder Prostata, polyzystisches ovariales Syndrom, Endometriose, polyzystische Nierenerkrankung und Hypophysenadenom.
Zu diesem Zweck kann es in der Form, die durch Extraktion oder weitere Reinigung, wie vorstehend beschrieben, erhalten wird, verwendet werden, oder es kann als ein Medikament formuliert werden. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegende Erfindung umfasst also eine pharmazeutische Zusammensetzung Micrin und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist geeignet für die parenterale Verabreichung, wie beispielsweise eine injizierbare Lösung, vorzugsweise steril. Weitere geeignete nicht-injizierbare Verfahren der Verabreichung, für die Micrin formuliert werden kann, wie geeignet, sind oral und nasal.
Geeignete Träger und Exzipienten und weitere geeignete Additive sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann eine Micrin-Lösung in einer sterilen Form unter Verwendung beliebiger geeigneter Techniken, wie beispielsweise Sterilfiltration, hergestellt werden.
Die zu verabreichende Dosis kann unter Berücksichtigung typischer Faktoren vom Fachmann bestimmt werden. Eine geeignete Dosierung ist 1-25 ml/Tag Micrin mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1 Einheit/ml. Eine bevorzugte Dosierung ist 2,5 bis 10 ml/Tag und insbesondere 5 ml/Tag.
Micrin kann auch als ein Forschungswerkzeug zur Untersuchung eines neuen Säuger-Micrin-Hormonsystems und/oder des organotrophen Systems verwendet werden. Es kann auch verwendet werden, um ein Screening auf Agonisten oder Antagonisten von Micrin durchzuführen, wie beispielsweise durch Mischen einer potentiellen Agonist- oder Antagonist-Verbindung mit einem partiell gereinigten Micrin, das hier beschrieben wird, und Messung der Differenzen in dem Bioassay, der hier beschrieben wird, im Vergleich mit geeigneten Kontrollen. Micrin kann auch als ein Surrogatmarker in klinischen Versuchen verwendet werden, um potentielle Arzneistoffe auf unerwünschte toxikologische Eigenschaften auf das Micrinhormonsystem zu screenen, wie in dem hier beschriebenen Bioassay nachweisbar, und um die Wirkungen auf das allgemeinere organotrope System zu bestimmen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 einen Bioassay (n = 10) von ovarialem venösem Testplasma aus einem mit Clomiphen behandelten Schaf ("aktives Plasma") in der weiblichen Ratte im Vergleich mit jugulärem venösem Plasma aus einem einer Ovariektomie unterzogenem ("ovx") Schaf, unbehandelt mit Clomiphen, als Kontrolle veranschaulicht;
Fig. 2 den Bioassay (n = 11) einer Fraktion von 10 bis 30 kD von aktivem Plasma in der weiblichen Ratte im Vergleich mit einer Fraktion von 10 bis 30 kD von venösem Plasma aus ovx-Schaf als Kontrolle veranschaulicht;
Fig. 3 den Bioassay (n = 8) einer Subfraktion von 10 bis 20 kD von aktivem Plasma in der weiblichen Ratte im Vergleich mit einer Subfraktion von 10 bis 20 kD von venösem Plasma aus ovx-Schaf als Kontrolle (n = 5) veranschaulicht;
Fig. 4 den Bioassay (n = 5) einer Ionenaustauschfraktion bei 0,1 bis 0,2 M NaCl ("aktive Ionenaustauschfraktion") der Subfraktion von 10 bis 30 kD von aktivem Plasma in der weiblichen Ratte im Vergleich mit physiologischer Pyrogen-freier Kochsalzlösung als Kontrolle (n = 20) veranschaulicht; und
Fig. 5 den Bioassay (n = 5) der aktiven Ionenaustauschfraktion in der männlichen Ratte im Vergleich mit einer Ionenaustauschfraktion bei 0,1 bis 0,2 M NaCl der Subfraktion von 10 bis 20 kD von venösem Plasma aus ovx-Schaf als Kontrolle veranschaulicht.
Die Daten in den Figuren wurden erhalten: die mittleren relativen Organgewichte (nach Ausbluten) der Testratten wurden zuerst als ein Prozentsatz der Kontrollmittelwerte ausgedrückt. Diese Zahlen wurden dann von 100 abgezogen, um die prozentuale Differenz zwischen Test- und Kontrollmittelwerten zu erhalten, wobei die Ergebnisse gegen eine Null-Basislinie, die Kontrollwerte darstellt, graphisch aufgetragen wurden. Die Sterne in den Figuren stellen die statische Signifikanz dar, wobei gilt:
* = p < 0,05, ** = p < 0,02, *** = p < 0,01; **** = p < 0,002; ***** p < 0,001.
Die statistische Analyse beinhaltete den Student-t-Test.

BEISPIEL 1: Herstellung von Micrin

1. Isolierung von ovarialem venösem Schafplasma

Mehrgebärende nicht-trächtige Mutterschafe wurden verwendet. Mutterschafe wurden mit einem einer Vasektomie unterzogenen Bock gehalten, um den Tag des Östrus (Tag 0) zu bestimmen. An Tag 3 post-Östrus wurde den Mutterschafen intramuskulär Clomiphencitrat (Sigma Chemical Co., Poole, UK, Katalog Nr. C6272) bei einer Dosis von 1,5 g/Tag, gelöst in warmer physiologischer Pyrogen-freier Kochsalzlösung bei einem Endvolumen von 10 ml injiziert. Die Clomiphen-Injektionen wurden an den Tagen 4, 5 und 6 post-Östrus wiederholt. An Tag 6 post-Östrus und unter Pentobarbiton (RMB Animal Health Ltd., Dagenham, UK)-Anästhesie wurde ovariales venöses Blut aus dem Schafnach dem Verfahren von Heap et al., J. Reprod. Fert. (1985) 74: 645-656 in Heparin (1 l.U./ml Blut) (C. P. Pharmaceuticals Ltd., Wrexham, UK) zur Verhinderung der Gerinnung gewonnen. Blutproben wurden unmittelbar anschließend bis zur Zentrifugation auf Eis gegeben. Das ovariale venöse. Plasma wurde dann aus dem ovarialen venösen Blut durch Zentrifugation bei +4ºC und 4.000 U/min für 20 min erhalten. Die Plasmaschicht wurde anschließend entfernt und in einer Kunststoffflasche in einem Gefriergerät bei -10ºC gelagert.

2. Herstellung der Fraktion mit einem Molekulargewicht von nominal 0 bis 30 kD aus dem ovarialen Schafplasma

Das Plasma (aus vorstehend 1) wurde durch Zentrifugation bei +4ºC und 4.000 U/min für 5 min geklärt. Die geklärte Plasmafraktion wurde dann in ein Amicon Centriprep-30, eine Zentrifugenvorrichtung mit konzentrischen inneren und äußeren Kompartimenten, getrennt durch eine Membran mit einem nominalen Grenzwert von 30 kD, gegossen. Die Vorrichtung wurde bei 2.000 U/min für 2 h bei +4ºC zentrifugiert. Das Filtrat, das sich in dem inneren Kompartiment gesammelt hatte, wurde durch Pipettieren entfernt, und die Zentrifugation wurde für weitere 2 h fortgesetzt. Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt, wobei anschließend das innere Kompartiment mit der Membran ersetzt wurde. Die Reihe der Zentrifugationen wurde dann wiederholt. Durch diese Maßnahme wurden 20 ml Filtrat der Fraktion mit nominal 0 bis 30 kD aus der Plasmafraktion erhalten. Die Fraktion mit nominal 0 bis 30 kD wurde in einer Kunststoffflasche bei -10ºC gelagert oder in 3 nachstehend verwendet.

3. Herstellung der Subfraktion mit einem Molekulargewicht von nominal 10 bis 30 kD aus dem ovarialen Schafplasma

Die Plasmafraktion mit nominal 0 bis 30 kD aus 2 vorstehend wurde in eine Amicon Centriprep-10 mit einem nominalen Grenzwert von 10 kD gegossen. Die Vorrichtung wurde bei 2.000 U/min für 1 h bei +4ºC zentrifugiert. Das Filtrat, das sich im inneren Kompartiment gesammelt hatte, wurde durch Pipettieren entfernt, und das Verfahren wurde wiederholt, bis ungefähr 2 ml Probe im äußeren Kompartiment verblieben. Diese wurden auf 15 ml mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, und die Zentrifugation wurde wiederholt, bis das Volumen im äußeren Kompartiment auf ungefähr 2 ml verringert war. Die resultierende Fraktion, die Subfraktion mit nominal 10 bis 30 kD, wurde in einer Kunststoffflasche bei -10ºC gelagert oder in 4 nachstehend verwendet.

4. Herstellung der Subfraktion mit einem Molekulargewicht von nominal 10 bis 20 kD aus ovarialem Schafplasma

Die Subfraktion mit nominal 10 bis 30 kD aus 3 vorstehend wurde anschließend auf 800 ul mit einem Amicon Centricon-10, einer kleinen Zentrifugenvorrichtung, ausgestattet mit einer Membran mit einem nominalen Grenzwert von 10 kD, durch Zentrifugation in einer Zentrifuge bei 2.000 U/min für 1 h eingeengt. Anteile von 200 ul wurden dann auf eine FPLC-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Superdex-75, HR 10/30, 30 cm lang, 1 cm Durchmesser) aufgetragen, die mit einem Protein-Molekulargewichtsstandard geeicht worden war. Die Elution wurde mit 25 ml PBS über eine Zeitspanne von 25 min durchgeführt, und Fraktionen von 0,5 ml wurden aufgefangen. Die Fraktionen, die in den Bereich mit einem nominalen Molekulargewicht von 10 bis 20 kD fielen, wurden vereinigt, wobei man eine Subfraktion mit nominal 10 bis 20 kD erhielt, und in einer Kunststoffflasche bei -10ºC gelagert oder in 5 nachstehend verwendet.

5. Herstellung von drei Ionenaustauschfraktionen (Natriumchlorid) aus der Subfraktion mit nominal 10 bis 30 kD des ovarialen Schafplasmas

Die Subfraktion mit einem nominalen Molekulargewicht von 10 bis 20 kD des ovarialen Schafplasmas aus 4 vorstehend wurde durch Zentrifugation in einer Amicon Centricon-3 (5 ml herab auf 1 ml) eingeengt. Die eingeengte Fraktion wurde einem Pufferaustausch mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7, durch wiederholte Verdünnung und erneutes Einengen in einer Amicon Centriprep-3 und Centricon-3 unterzogen. Anteile von 500 ul wurden dann auf eine FPLC-Ionenaustauschsäule (Pharmacia Mono-Q, HR 5/5, 4 cm lang, 0,5 cm Durchmesser) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M Natriumchloridlösung in 20 mM Tris-HCI- Puffer, pH 7, eluiert. Die Elution lief für 15 min bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min, und Fraktionen von 0,5 ml wurden aufgefangen. Die Eluatfraktionen wurden in drei Pools entsprechend den Bereichen 0 bis 0,1 M, 0,1 bis 0,2 M und 0,2 bis 0,3 M des NaCl-Gradienten aufgeteilt.

BEISPIEL 1A

Um die Ausbeute zu verbessern, können bestimmte Verfahren, die in Beispiel 1 angegeben sind, wie folgt geändert werden:

Das Plasma wurde durch Zentrifugation bei 2.000 g oder äquivalent für 10 min geklärt. Das geklärte Plasma (120 ml) wurde dann auf 8 · Amicon Centriprep-30-Filtrationseinheiten verteilt und bei 1.800 U/min für 10 bis 12 h bei +4ºC zentrifugiert. Das Filtrat wurde in Intervallen gewonnen, und die Zentrifugation wurde fortgesetzt, bis ein Endvolumen von 80 ml erzielt wurde. Diese Fraktion von nominal 0 bis 30 kD wurde über Nacht in Polypropylenröhrchen bei -20ºC gelagert.

3. Herstellung der Fraktion mit einem Molekulargewicht von nominal 3-30 kD aus dem ovarialen Schafplasma

Die Fraktion mit einem Molekulargewicht von nominal 0 bis 30 kD (erzeugt, wie ausführlich unter 2 vorstehend angegeben) wurde auf 6 · Amicon Centriprep-3- Filtrationseinheiten verteilt und bei 1.800 U/min für 8 bis 10 h bei +4ºC zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde durchgeführt, bis 3 ml Retentat im äußeren Kompartiment der einzelnen Centriprep-3-Einheiten verblieben. Das Retentat (Subfraktion mit einem Molekulargewicht von 3 bis 30 kD) wurde über Nacht bei -20ºC gelagert. Das Retentat wurde anschließend auf ein Endvolumen von 500 ul in einer Amicon Centricon-3-Einheit konzentriert. Nach Zentrifugation der Proben bei 3.000 U/min für 1 bis 2 h bei +4ºC wurde das Retentat auf Eis gegeben, bevor es auf die Gelfilfrationssäule aufgetragen wurde, wie ausführlich in 4 nachstehend beschrieben.

Proben (2 · 200 ul), hergestellt unter 3 vorstehend, wurden anschließend auf eine FPLC-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Superdex-75, HR 10130, 30 cm lang, 1 cm Durchmesser) aufgetragen, die mit Proteinmolekulargewichtsstandards geeicht worden war. Die Elution wurde mit PBS durchgeführt, und Fraktionen (1 ml/Röhrchen) wurden über eine Zeitspanne von 45 min aufgefangen. Fraktionen, die in den Molekulargewichtsbereich von nominal 10 bis 20 kD fielen, wurden vereinigt und auf 2 ml durch Zentrifugation in einer Centriprep-3-Einheit (1.800 U/min für 1 bis 2 h bei +4ºC) eingeengt. Das Retentat wurde in Polypropylenröhrchen bei -20ºC gelagert oder in 5 nachstehend verwendet.

5. Herstellung von Ionenaustauschfraktionen (Natriumchlorid) aus der Subfraktion mit einem Molekulargewicht von nominal 10 bis 20 kD von ovarialem Schafplasma

Die konzentrierte Fraktion, die unter 4 vorstehend erzeugt wurde, wurde einem Pufferaustausch durch Verdünnen auf 15 ml in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,6, unterzogen. Die Centriprep-3-Einheit wurde wie vorstehend zentrifugiert (1.800 U/min bei +4ºC), und zwar 6 bis 8 Stunden. Diese Fraktion wurde weiter eingeengt auf ungefähr 500 ul in Centricon-3-Einheiten (3.000 U/min für 1 bis 2 h bei +4ºC). Proben (2 · 200 ul) wurden dann auf eine Vydac-Protein SAX HPLC-Ionenaustauschsäule (0,75 · 5 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M Natriumchlorid in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,6, eluiert. Eluierte Fraktionen (2 ml/Röhrchen) wurden über 45 min aufgefangen und auf Aktivität im Rattenbioassay (Beispiel 3) untersucht.

BEISPIEL 2: Pharmazeutische Zusammensetzung

Steril filtriertes Micrin (5,5 ml; spezifische Aktivität von 1 Einheit/ml, wie hier beschrieben) als Ionenaustauschfraktion bei 0,1 bis 0,2 M NaCl, wie hier beschrieben, und geeignet verdünnt mit physiologischer Pyrogen-freier Kochsalzlösung und bereitgestellt in einem sterilen Glasfläschchen. Die Dosis (5 ml) kann durch Injektion in das Peritoneum unter Verwendung einer sterilen Nadel verabreicht werden.

BEISPIEL 3: Bioassay

Gesamtplasma und die verschiedenen Fraktionen von teilweise gereinigtem Micrin aus Beispiel 1 vorstehend wurden durch in vivo-Bioassay, wie nachstehend beschrieben, untersucht:
Ausgewachsenen weiblichen Wistar-Albinoratten (Gewicht 200 bis 220 g) oder ausgewachsenen männlichen Wistar-Albinoratten (Gewicht 300 bis 400 g) wurden intraperitoneal unter Verwendung steriler Nadeln, 0,5 · 16 mm, 25 g, täglich 1 · 1 ml- Dosen des ovarialen venösen Schafplasmas (oder einer der anderen Fraktionen, hergestellt in Beispiel 1 vorstehend) für 4 Tage injiziert. 96 h nach dem Beginn der Dosierung wurden die Ratten dann anästhesiert (terminal unter Verwendung von Kohlendioxid), und der Thorax wurde chirurgisch geöffnet. Man ließ die Ratten dann teilweise durch Herzpunktur ausbluten (5 ml); die Körper der einzelnen Ratten wurden dann seziert, wie von Hart, Toxicology (1990) 61: 185-194, beschrieben.
Die folgenden Organe wurden aus den teilweise ausgebluteten weiblichen Ratten in einer Standardreihenfolge entnommen, von Bindegewebe und Fett befreit und gewogen: Herz, Leber, Hypophyse, Nebennieren, Nieren, Milz, Uterus und Eierstöcke; aus männlichen Ratten: Herz, Leber, Hypophyse, Nebennieren, Nieren, Milz, Prostata und Hoden. Die einzelnen Organe wurden gewogen und die Ergebnisse als ein Prozentsatz des Ganzratten-Endkörpergewichts (g/kg oder %) ausgedrückt.
Kontrollversuche wurden unter Anwendung des gleichen Verfahrens mit jugulärem venösem Schafvollplasma und entsprechenden Fraktionen (Molekulargewicht- oder Ionenaustauschfraktionen), die aus jugulärem venösem Schafplasma abgeleitet waren, erhalten wie vorstehend in Beispiel 1, jedoch von einem einer Ovariektomie unterzogenen, nicht mit Clomiphen behandelten Schaf, durchgeführt.
Die Ergebnisse der Verringerung der Organmasse, die unter Verwendung von aktivem Plasma, Fraktionen von aktivem Plasma, Subfraktionen von aktivem Plasma und Ionenaustauschfraktionen von aktivem Plasma erhalten wurden, sind in den Fig. 1 bis 5 angegeben.

Claims

1. Material mit der Fähigkeit zur Verringerung der Organmasse, wobei das Material erhältlich ist durch:

Auffangen von ovarialem venösem Blut aus einem weiblichen Säuger;

Herstellung von ovarialem venösem Plasma aus dem Blut; und

mindestens teilweise Reinigung des Materials aus dem Plasma.

2. Material nach Anspruch 1, wobei die Reinigung die Gewinnung der Fraktion von 10-30 kD umfasst.

3. Material nach Anspruch 1, wobei die Reinigung die Gewinnung der Fraktion von 10-20 kD umfasst.

4. Material nach Anspruch 3, wobei die Reinigung zusätzlich eine Ionenaustauschchromatographie und das Auffangen der Fraktion, die in 0,1-0,2 M NaCl eluiert wird, umfasst.

5. Material nach Anspruch 1, wobei die Reinigung das folgende Protokoll umfasst:

Plasma, geklärt durch Zentrifugation;

geklärtes Plasma, zentrifugiert, um eine Fraktion von nominal 0-30 kD zu erhalten;

Fraktion von nominal 0-30 kD, zentrifugiert, um eine Subfraktion von nominal 10-30 kD zu erhalten;

Subfraktion von nominal 10-30 kD, konzentriert und gelfiltriert, um eine Subfraktion von nominal 10-20 kD zu erhalten;

Subfraktion von nominal 10-20 kD, wiederholt konzentriert und mit Puffer verdünnt, Auftragen auf eine Ionenaustauschsäure, eluiert mit einem Gradienten von 0-0,3 M NaCl; und

Eluat aufgeteilt in Ionenaustauschfraktionen von 0-0,1 M, 0,1-0,2 M, und 0,2 -0,3 M NaCl.

6. Material nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei sich es sich bei dem Säuger um ein Schaf handelt.

7. Material nach einem der vorstehenden Ansprüche für die therapeutische Verwendung.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Material nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger.

9. Verwendung eines Materials nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Organ- oder Gewebe- Hypertrophie.