DE69714856T2

DE69714856T2 - Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend einen embryonalen extrakt und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69714856T2
Application number: DE69714856T
Authority: DE
Inventors: Pier Mario Biava; Adriana Carluccio
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-06-12
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2017-06-13
Also published as: IT1284571B1; WO1998011905A1; ITMI961945A1; ES2181004T3; EP0929308A1; DE69714856D1; AU3258097A; EP0929308B1; ATE222499T1

Description

Es ist bekannt, dass es im Verlauf der Schwangerschaft durch die Zelldifferenzierung zur Bildung von immer spezialisierteren Zellen aus den undifferenzierten und totipotenten Zellen kommt.
Während der Organogenese verhindern einige regulierende Substanzen die unbegrenzte Zellvermehrung, die typisch für eine Krebsentwicklung ist, und führen zu einer spezifischen Differenzierung.
Andererseits zeigen Studien über die Interaktionen zwischen Krebszellen und Embryonengewebe, dass die Tumorentwicklung während des Differenzierungsprozesses verringert oder supprimiert ist (Einhort, L. (1982) Oncodev. Biol. Med., 4, 219-229).
Tatsächlich führt die Verabreichung von kanzerogenen Substanzen vor oder während der Organogenese zu Missbildungen, induziert aber keinen Tumor, wogegen nach vollständiger Organogenese die Tumorinduktion steigt und die Missbildungsrate zurückgeht (Brent, R. L.) (1980) Radiation teratogenesis. Teratology, 21, 281-298).
Auf Grundlage dieser Informationen wurde ein Experiment durchgeführt, um die Wirkungen von Embryonalhomogenisaten auf das Wachstum und die Disseminierung der Tumoren in Mäusen zu bestimmen (Cancer Letters, 41 (1988) 265-270).
In besagtem Experiment wurden die Auswirkungen der Verabreichung von Homogenisaten aus Mäuseuteri und Embryonen 9 Tage nach der Befruchtung mit denjenigen Effekten verglichen, die sich durch die Verabreichung von Homogenisaten aus nicht tragenden Uteri und normalen Lebern ergaben.
Die Effekte wurden in Mäusen bestimmt, denen Zellen aus einem Lewis- Lungenkarzinom subkutan implantiert worden waren.
Die Bildung des Primärtumors und der Lungenmetastasen wurde in der Gruppe der Mäuse, die mit Homogenisaten aus tragenden Uteri behandelt wurden, vollständig unterdrückt, während die Homogenisate aus den nicht tragenden Uteri, aus Embryonen und normalen Lebern keine Wirkung zeigten.
Andererseits stellt der Tumor ein komplexes Problem für die Genese dar, zu dein verschiedene Faktoren beitragen: Onkogenese, Fehlen der Onkosuppressorgene, autokrine Wachstumsfaktoren u. a.. Eine derart komplexe Situation kann nicht durch therapeutische Strategien beherrscht werden, die auf dem Einsatz einiger weniger Substanzen basieren. Daher besteht das Problem auch weiterhin darin, nach differenzierten Behandlungsmethoden unter Berücksichtigung der verschiedenen Tumorarten zu suchen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wir haben nun herausgefunden, dass Embryonen, die in bestimmten Stadien der embryonalen Entwicklung entnommen werden, wirksam sind bei der Behandlung von Tumoren und anderen Erkrankungen, die durch das p53 Antionkogen gesteuert werden, und dass diese spezifischen Stadien in Abhängigkeit von der Spezies, aus der der Extrakt erhalten wurde, unterschiedlich sind.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoffe Extrakte von Embryonen enthalten, die in bestimmten Stadien der Embryonalentwicklung entnommen wurden, zusammen mit einer Mischung aus pharmazeutisch akzeptablen Agenzien als Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe, die für die Behandlung von Tumoren und anderen durch das p53 Antionkogen kontrollierten Krankheiten geeignet sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich des Weiteren auf den Prozess zur Herstellung der besagten Extrakte und der besagten Zusammensetzungen.
Embryonen, die für den Einsatz entsprechend der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden aus den Spezies Brachydanio rerio, Forelle und Drosophila entnommen.
Die Embryonen werden in Abhängigkeit von den verschiedenen Erkrankungsarten und in Abhängigkeit der unterschiedlichen Spezies in bestimmten Stadien der embryonalen Entwicklung entnommen.
Wir haben herausgefunden, dass insbesondere der primitive Tumor der Leber erfolgreich mit Embryonalextrakten aus Forellen im Entwicklungsstadium von 20 Somiten und das Glioblastoma multiforme mit Forellenembryonalextrakten im Stadium von 5 und 20 Somiten und mit Embryonen von Brachydanio rerio im Medioblastula- Gastrula-Stadium erfolgreich behandelt werden kann. Der Ovarioncus wird erfolgreich mit Embryonalextrakten aus Brachydanio rerio im Entwicklungsstadium der Medioblastula-Gastrula behandelt, und der Lewis-Tumor wird erfolgreich mit Drosophila-Embryonalextrakten im Blastodermstadium therapiert.
Die Zubereitung der Extrakte erfolgt auf verschiedene Arten entsprechend der Herkunft der Embryonen und dem Embryogeneseablauf, der für die zu untersuchende Spezies erarbeitet wurde und in Übereinstimmung mit den Methoden, die in den unten stehenden Beispielen ausführlich beschrieben sind.
Die Zubereitung der Extrakte wird in folgenden Schritten ausgeführt:
a) Embryonen in dem für die Embryonalentwicklung spezifischen Stadium werden entnommen;
b) besagte Embryonen werden mehreren Beschallungszyklen unterzogen;
c) ein Lösungsmittel wird zugesetzt;
d) die Mischung von Schritt c) wird mit einem Turbodiffuser verrührt;
e) die Mischung wird zuerst durch einen Filter mit einer Maschenweite von 90 Mikrometer filtriert und dann durch Filter mit einer Maschenweite von 5-10 Mikrometer
Die Beschallungszeit in Schritt a) beträgt vorzugsweise 1 bis 4 Stunden. Das Lösungsmittel in Schritt c) besteht aus einer Mischung von Glycerin und einer 30 Vol- %igen wässrigen Ethylalkohollösung in einem Volumenverhältnis von 85 : 15.
Das Gewichtsverhältnis zwischen besagtem Lösungsmittel und besagten Embryonen liegt vorzugsweise im Bereich von 20 : 1 bis 2 : 1.
Das Rühren unter Schritt d) wird, wie die anderen Schritte auch, vorzugsweise bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 bis 15 Stunden ausgeführt.
Die Extrakte gemäß der vorliegenden Erfindung wurden in einem in-vitro-Experiment eingesetzt, um ihre Antitumorwirkung zu bestimmen.
Ein solches Experiment wurde gemäß der folgenden Kriterien ausgeführt:
1) Es wurde an Kulturen durchgeführt mit einer stabilen Zelllinie, die aus unterschiedlichen Tumorarten stammen.
2) Die Krebszellen wurden mit Embryonalextrakten aus dem Medioblastula-Gastrula- Stadium, dem 5-Somiten- und dem 20-Somiten-Stadium von Brachydanio rerio sowie mit Embryonalextrakten aus dem Medioblastula-Gastrula-Stadium, dem 5-Somiten- und dem 20-Somiten-Stadium der Forelle in einer Konzentration von 0,001 g/ml bis 0,1 g/ml behandelt. Die in vitro mit Embryonalextrakten behandelten Zellkulturen wurden mit den unbehandelten Kontrollkulturen verglichen.
3) Die behandelten Krebszellkulturen und die unbehandelten Kontrollkulturen wurden den folgenden Bewertungen unterzogen: zelluläre Wachstumskurve und p53 Antionkogen-Aktivierung. Eine solche Aktivierung wurde entweder durch immunhistochemische Nachweismethoden mit einem basischen Phosphatase- Nachweisreagenz oder durch zytofluorometrische Methode bestimmt.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Verlangsamung der Wachstumskurve der Krebszellen, die mit den Extrakten behandelt wurden und Aktivierung des p53 Antionkogens.
Die Aktivierung eines solchen Antionkogens ist ein wichtiger Kennfaktor der Antitumor-Aktivität der Embryonalextrakte.
Darüber hinaus wurden die Extrakte in einem in-vivo-Experiment an Mäusen getestet, wie in einem speziellen Beispiel beschrieben wird, sowie bei zahlreichen anderen Erkrankungen wie unten berichtet.
Die durch das Experiment gewonnenen Resultate zeigen, dass die Embryonalextrakte entsprechend der vorliegenden Erfindung möglicherweise erfolgreich bei der Zubereitung von Zusammensetzungen sein können, die zur Behandlung von durch das p53 Antionkogen gesteuerten Erkrankungen geeignet sind, welche neben den Tumorerkrankungen auch andere Krankheiten wie autoimmune Thyroiditis, Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, genetische Erkrankungen wie pigmentöse Sklerodermie und Psoriasis und Viruserkrankungen wie multiple Sklerose, AIDS u. a. mit einschließen.
Die besagten Zusammensetzungen werden in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und der Art der Erkrankung mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln und Hilfsstoffen in fester, halbfester oder flüssiger Form zubereitet.
Insbesondere werden die besagten Zubereitungen als Flüssiglösungen zur parenteralen, topischen und oralen Anwendung hergestellt, ebenso in Form von Sprays und Augentropfen, halbfesten Zubereitungen wie beispielsweise Cremes, Gele, Salben und Pasten, Feststoffzubereitungen wie Pulver und gefriergetrocknete Produkte, imprägnierte Gazen, Urethral-Sticks, orale Emulsionen und Sprays, Sirups, einfache und ummantelte Granulate, einfache Tabletten und Manteltabletten, weiche und harte Kapseln, einfache Kapseln und solche, die den Wirkstoff zeitverzögert freisetzen, Suppositorien, Vaginalglobuli, Vaginalzäpfchen und Pflaster.
Die Zubereitungen entsprechend der Erfindung können zur Humantherapie von Krankheiten, die vom p53 Antionkogen gesteuert werden, eingesetzt werden mit einer Posologie, die eine Verabreichungsmenge von 10 ug bis zu 200 mg des Embryonalextraktes pro Tag erlaubt.
Die nachfolgenden Beispiele werden gegeben, um das Anwendungsziel der Erfindung zu veranschaulichen und nicht um die begrenzte Zielsetzung aufzuzeigen.

BEISPIEL 1

Es wurden 50.000 Forelleneier im Embryonalentwicklungsstadium von 5 Somiten genommen.
Die Eier wurden durch leichtes ventrales Drücken aus dem leicht narkotisierten Fisch gewonnen. Die Eier werden dann mehrere Male mit bidestilliertem Wasser abgespült und schließlich mit 60%igem Ethylalkohol gewaschen.
Sie werden dann mehreren Beschallungszyklen über einen Zeitraum von 2 Stunden unterzogen. Die Mischung hat ein Gewicht von etwa 1 kg. Ein Lösungsmittel wird hergestellt, das aus Glycerin und 30%igem Ethylalkohol in einem Volumenverhältnis von 85 : 15 besteht. Das Lösungsmittel wird dann zu der Mischung zugegeben bis ein Gesamtgewicht von 5 kg erreicht ist.
Danach wird die Mischung über 12 Stunden mit einem Vakuum-Turbodiffuser behandelt mit alternierenden Ruhepausen.
Anschließend wird die Mischung unter Rühren mit einem Balkenrührer für 6 Stunden mazeriert und dann zum Absetzen 36 Stunden stehen gelassen, so dass der Überstand später dekantiert werden kann.
Die Mischung wird durch 90-Mikrometer-Filterkartuschen gefiltert und danach noch durch 10-Mikrometer-Kartuschen, um so die Eihülle und das Fett zu entfernen. Die Lösung mit einem Gewicht von etwa 5 kg wird mit Ethylalkohol bis auf ein Gewicht von 50 kg verdünnt. Anschließend wird diese Lösung über 5-Mikrometer- Kartuschen filtriert und erscheint klar.
Eine solche Lösung bildet die Flüssigformulierung für die orale Verabreichung. Um die gewünschte Dosis zu erhalten, kann die Lösung mit 30%igem Ethylalkohol weiter verdünnt werden.
Die bevorzugte Konzentration liegt bei 0,1 Embryo/ml.
50 Mikroliter eines auf diese Art erhaltenen Extraktes werden zu einer Kultur von 3,5 · 10&sup5; Krebszellen aus Glioblastoma multiforme gegeben und mit einer unbehandelten Kontrollkultur verglichen. Die Ergebnisse waren wie folgt: in den behandelten Krebszellen kam es zu einer Aktivierung des p53 Antionkogens, die um 25% höher lag als in der unbehandelten Kultur.

BEISPIEL 2

Es wurde ein Embryonalextrakt verwendet, der entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt wurde, der jedoch in diesem Versuch Forellenembryonen im Entwicklungsstadium von 20 Somiten enthielt und wie in Beispiel 1 einer Krebszellkultur aus Glioblastoma multiforme zugegeben und mit einer Kontrollkultur aus Glioblastomkrebszellen verglichen wurde.
Die Ergebnisse waren wie folgt: in den behandelten Krebszellen kam es zu einer Aktivierung des p53 Antionkogens, die um 20% höher lag als in der Kontrollkultur.

BEISPIEL 3

20 mg Brachydanio rerio Embryonen im Entwicklungsstadium der Medioblastula- Gastrula wurden entnommen.
Die Entnahme erfolgte gemäß der bereits zuvor beschriebenen Methode, d. h. die Eier wurden zum Zeitpunkt der Medioblastula-Gastrula-Entwicklung durch leichtes ventrales Drücken bei einem leicht narkotisierten Fisch gewonnen.
Der Extrakt wurde hergestellt wie in der Methode in Beispiel 1 beschrieben.
50 Mikroliter des so erhaltenen Extraktes wurden einer Kultur von 3,5 · 10&sup5; Krebszellen von Glioblastoma multiforme zugesetzt und mit einer unbehandelten Kontrollkultur von Glioblastoma multiforme verglichen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: es kam zu einer 18%igen Aktivierung des p53 Antionkogens, 18% höher in der behandelten im Vergleich zur unbehandelten Gruppe.

BEISPIEL 4 (Vergleich)

Der Extrakt wurde hergestellt wie in Beispiel 3, enthielt hier allerdings Brachydanio rerio Embryonen im Entwicklungsstadium von 5 Somiten. Wie in Beispiel 3 wurde der Extrakt anschließend zu einer Krebszellkultur aus Glioblastoma multiforme gegeben und mit einer unbehandelten Glioblastomkultur verglichen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: weder in der behandelten Krebszellkultur, noch in der unbehandelten Kontrollkultur kam es zu einer Aktivierung des p53 Antionkogens.

BEISPIEL 5

Der Extrakt wurde wie in Beispiel 3 hergestellt, enthielt aber Brachydanio rerio Embryonen im Entwicklungsstadium von 20 Somiten und wurde anschließend wie in Beispiel 3 einer Krebszellkultur aus Glioblastoma multiforme zugegeben und mit einer unbehandelten Kontrollkultur verglichen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: weder in der behandelten Krebszellkultur, noch in der unbehandelten Kontrollkultur kam es zu einer Aktivierung des p53 Antionkogens.

BEISPIEL 6 (Vergleich)

Der Extrakt wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, enthielt aber Forellen-Embryonen im Entwicklungsstadium der Medioblastula-Gastrula und wurde anschließend wie in Beispiel 1 einer Krebszellkultur aus Glioblastoma multiforme zugegeben und mit einer unbehandelten Kontrollkultur verglichen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: weder in der behandelten Krebszellkultur, noch in der unbehandelten Kontrollkultur kam es zu einer Aktivierung des p53 Antionkogens.

BEISPIEL 7 (in-vivo-Experiment an Mäusen)

Eine Million Zellen aus einem Lewis-Tumor, dessen mechanische Suspension bereits zuvor beschrieben wurde (Sava G., Giraldi T., Lassiani L., Dogani R. (1983) - Chem. Biol. Interaction 46-131), wurden subkutan an zwei verschiedene Gruppen von Mäusen verabreicht, die sich jeweils aus 10 C57BL/6 Mäusen zusammensetzten. Einer Gruppe wurden 50 Mikroliter einer Dulbecco Phosphat gepufferten Salzlösung (DPS), die 2 · 10.000 Embryonen von Drosophila/ml im Entwicklungsstadium des Blastoderms enthielten und einer Beschallung von 2 mal 10 Sekunden unterzogen worden waren, injiziert; der zweiten Gruppe wurden nur 50 Mikroliter DPS injiziert.
Die Wachstumskurve des Primärtumors und die Überlebensrate wurden abgeschätzt. Die Ergebnisse zeigten, dass in der Gruppe mit den behandelten Mäusen die Tumorwachstumsrate statistisch signifikant verlangsamt war (Student T am 7. Tag des Wachstums: 12,031, P < 0,0001; am 9. Tag T = 30,977, P < 0,0001; am 11. Tag T = 43,4, P < 0,0001; am 15. Tag T = 31,151, P < 0,0001 ebenso stieg die Überlebensrate (Student T = 20,661, P < 0,0001).

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, die für die Behandlung von vom Antionkogen p53 gesteuerten Tumoren und Krankheiten geeignet ist, wobei die Zusammensetzung als Wirkstoff einen Embryonalextrakt enthält, der in Abhängigkeit vom speziellen Tumor und von der speziellen Krankheit sowie in Abhängigkeit von der Ursprungs-Art des Extrakts aus spezifischen Stadien der embryonalen Entwicklung gewonnen ist, dadurch gekennzeichnet daß der Embryonalextrakt aus der Gruppe von Arten gewonnen wird, die folgende umfaßt: Forelle in den Stadien der Embryonalentwicklung von 5 und 20 Somiten, Brachydano rerio im Stadium der Embryonalentwicklung der Medioblastula-Gastrula, und Drosophila im Stadium der Embryonalentwicklung des Blastoderm.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die von vorn Antionkogen p53 gesteuerten Tumoren und Krankheiten den primitiven Lebertumor, das multiforme Glioblastoma, den Ovarioncus, den Lewis-Tumor, die autoimmun-Thyroidites, den Lupus erythematosus, die rheumatoide Arthritis, die Scleroderma pigmentosa, Psoriasis, multiple Sklerose und AIDS umfassen.

3. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen nach Anspruch 1, folgende Schritte umfassend:

a) die Entnahme von Embryonen in einem für die Embryonalentwicklung spezifischen Stadium,

b) die Behandlung der Embryonen in mehreren Beschallungszyklen,

c) die Zugabe eines Lösemittels,

d) die Verwirbelung der nach Schritt c) erhaltenen Mischung mit einem Turbodiffusor,

e) die Filtration der erhaltenen Mischung, zunächst mit 90-Mikrometer Filtern, dann mit 5- bis 10-Mikrometer Filtern, dadurch gekennzeichnet daß das spezifische Stadium der Embryonalentwicklung nach Schritt a) für Brachydano rerio aus dem Stadium der Medioblastula-Gastrula, für die Forelle aus dem 5- und 20-Somiten-Stadium und für Drosophila aus dem Blastoderm-Stadium gewählt ist, und dadurch, daß das Lösemittel nach Schritt c) aus einer Mischung aus Glycerin und einer 30 Vol-%igen wässerigen alkoholischen Lösung im Volumenverhältnis 85/15 besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis zwischen dem Lösemittel und den Embryonen von 20 : 1 bis 1 : 20 beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwirbelung nach Schritt d) bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 2 Stunden bis 15 Stunden durchgeführt wird.

6. Verwendung von Embryonalextrakten nach Anspruch 1, zur Herstellung von Zusammensetzungen für die Behandlung von vom Antionkogen p53 gesteuerten Tumoren und Krankheiten in Vermengung mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungs- und Streckmitteln in fester, halbfester oder flüssiger Form zur parenteralen, oralen oder topischen Verabreichung.