JPH1143440A

JPH1143440A - 脳機能改善剤

Info

Publication number: JPH1143440A
Application number: JP9202718A
Authority: JP
Inventors: Haruki Yamada; 陽城山田; Takeshi Yabe; 武士矢部; Hiroaki Kiyohara; 寛章清原
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1997-07-29
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 1999-02-16

Abstract

(57)【要約】【課題】オンジサポニンＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇまたはこ
れらの混合物よりなる脳機能改善剤を得るものである。【解決手段】オンジサポニンＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇまた
はこれらの混合物を有効成分とする脳機能改善剤であっ
て、経口投与剤または非経口投与剤の型で投与される。
オンジサポニンＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇまたはこれらの混合
物は脳内アセチルコリントランスフェラーゼ発現および
ＮＧＦ産生促進作用を有し、脳機能改善剤として有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脳神経細胞群のコ
リンアセチルトランスフェラーゼ（以下ＣｈＡＴと略す
ることもある）発現および神経成長因子（以下ＮＧＦと
略することもある）産生促進作用を有し、アルツハイマ
ー病や老人性痴呆症を中心とする脳疾患に有用な脳機能
改善剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病や老人性痴呆症などの
痴呆症は、種々の因子が複雑に絡み合って神経細胞死が
生じる多因子複合疾患である。その原因の詳細は依然と
して不明のままであり、その治療薬の開発に関して確立
された方法論は存在せず、臨床応用レベルで満足のいく
痴呆症治療薬（本発明でいう脳機能改善薬）は皆無とい
っても良いのが現状である。

【０００３】これらの痴呆症では、マイネルト基底核で
のコリン作動性ニューロンの脱落やアセチルコリン合成
酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏ
ｌｉｎｅａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｃｈ
ＡＴ）活性の低下が認められており、コリン作動系の異
常による脳内アセチルコリン量の低下が、アルツハイマ
ー症で見られる痴呆症状の直接の原因であると考えられ
ている。すなわち、コリン作動性神経細胞の脱落を防ぐ
か、残存しているニューロンの機能を賦活化することに
より脳内アセチルコリン量を高めることができれば、痴
呆症状を改善できる可能性が考えられる。

【０００４】レシチンより合成されたコリンはａｃｅｔ
ｙｌ−ＣｏＡとともにコリン作動性ニューロンに取り込
まれ、ＣｈＡＴの触媒作用によりアセチルコリンが合成
され、神経終末に貯蔵される。さらに合成されたアセチ
ルコリンは電気的刺激によりシナプス間隙に放出されて
受容体に作用し、その後、シナプス前終末部および後部
に存在するアセチルコリンエステラーゼによってコリン
と酢酸に分解される。分解されたコリンは高親和性取込
み機構によりシナプス前終末部に取り込まれ、アセチル
コリン生合成に再利用される。

【０００５】したがって、これらの段階のいずれかに作
用し、アセチルコリン量を増加させるような薬物が治療
薬として考えられる。これまでに（１）アセチルコリン
前駆体、（２）アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、
（３）アセチルコリン受容体賦活薬、（４）ＣｈＡＴ賦
活薬、（５）アセチルコリン遊離促進薬などが治療薬と
して期待され、実際に臨床など試されてきたが、副作用
や作用時間の短さなどの問題点があり、現段階では日本
国で認可されている薬物は未だにない。

【０００６】また、中枢のコリン作動性神経細胞に対し
て分化誘導、生存維持、機能調節作用などを有する内因
性の因子としてｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏ
ｒ（以下ＮＧＦと略する）やｂｒａｉｎｄｅｒｉｖｅ
ｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（以下Ｂ
ＤＮＦと略することもある）などの神経栄養因子類が知
られており、アルツハイマー病などの痴呆症治療への応
用が期待されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の神経栄養因子類は、ペプチド性因子であるために脳血
液関門を通過できず脳内投与を行わなければならないな
どの問題点があり、従って経口投与でＣｈＡＴ発現促進
などの神経栄養因子様活性を示すかもしくは神経栄養因
子を誘導するような薬物の開発が期待されていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、痴呆症治
療薬としての脳機能改善剤を開発すべく鋭意検討を行っ
ており、ＣｈＡＴ発現およびＮＧＦ産生促進作用を有す
る物質の探索を行ってきた結果、下記式（Ｉ）、（I
I）、（III)、（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物で表され
るある種のサポニンに、ＣｈＡＴ発現およびＮＧＦ産生
促進作用があることを見出し、本発明を完成させた。

【０００９】すなわち、本発明は下記式（Ｉ）

【化６】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤に関す
る。

【００１０】更に本発明は下記式（II）

【化７】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤に関す
る。

【００１１】更にまた本発明は下記式（III)

【化８】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤に関す
る。

【００１２】更にまた本発明は下記式（ＩＶ）

【化９】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤に関す
る。

【００１３】更にまた本発明は下記式（Ｖ）

【化１０】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤に関す
る。

【００１４】更にまた本発明は、請求項１ないし５に記
載の化合物を少なくとも２種以上含むことを特徴とする
脳機能改善剤に関し、更にまたオンジおよびセネガより
調製したサポニンを含む脳機能改善剤に関する。

【００１５】前記の式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される本発明
の化合物は、例えば以下のようにして得ることができ
る。すなわち、各式の化合物含有生薬であるオンジ（Ｐ
ｏｌｙｇａｌａｅＲａｄｉｘ）、その原植物であるＰ
ｏｌｙｇａｌａｔｅｎｕｉｆｏｌｉａＷｉｌｌｄ．
またはセネガ（Ｓｅｎｅｇａ）、またはその原植物であ
るＰｏｌｙｇａｌａｓｅｎｅｇａＬ．、またはその
他の同属植物をメタノール、エタノール、ブタノールな
どの低級アルコール、クロロホルム等の有機溶媒または
水で抽出し、溶媒を留去した後、抽出エキスにつきシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーなどを行うことにより
各式の化合物を得ることができる。

【００１６】また、場合によっては、含水有機溶媒で抽
出を行った後、ヘキサン等の炭化水素類を用いて脱脂
後、クロロホルム、ブタノールまたは水とクロロホル
ム、水とブタノールなどの混合溶媒で分配し、有機溶媒
可溶部の溶媒を留去し、抽出エキスにつきカラムクロマ
トグラフィーを行っても良い。さらに必要に応じて、メ
タノール等を用いて再結晶することにより精製しても良
い。

【００１７】このようにして得られる請求項１〜５に記
載の式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物は既知化合物で
あり、去痰薬として気管支炎、気管支喘息、鎮静強壮薬
として用いられ、またストレス性潰瘍に対する有効性も
知られている。しかしながら、これらの化合物が脳機能
改善作用を有することは、本発明者らにより初めて解明
されたものであり、従来まったく知られていなかったこ
とである。上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物の製
造は以下のようにして行われる。

【００１８】（１）上記の式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される
化合物は各々オンジサポニンＡ、Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧと
呼ばれ、例えば以下のように庄司らの方法に準じて得る
ことができる［Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２
９，２４３１−２４４１（１９８１）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈ
ａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３０，８１０−８２１（１９８
１）］。

【００１９】すなわち、庄司らの方法に準じてオンジ５
００ｇをメタノール１リットルを用いて還流し、メタノ
ール可溶性画分を得る。残渣について同様の操作を６回
繰り返し、メタノール可溶性画分を減圧乾固することに
よりメタノールエキスを得る（収量；１５０ｇ、収率；
３０％）。得られたメタノールエキスを精製水に溶解
後、ベンゼン１リットルを用いて振とう抽出する操作を
３回繰り返し、脂質画分を除去する。得られた水層をさ
らに水飽和ブタノール１．５リットルを用いて振とう抽
出する操作を６回繰り返し、ブタノール可溶性画分を得
た。

【００２０】このブタノール可溶性画分を減圧乾固後、
再度ブタノール３リットルに溶解し、約１／５にまで減
圧濃縮し、析出した沈殿を粗サポニン画分として分取す
る（収量；４０ｇ、収率；８％）。この粗サポニン画分
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて水飽和
ブタノールを用いて分画し、オンジサポニンＤ、Ｅ、Ｆ
およびＧの混合物画分（フラクションＮｏ．１）とオン
ジサポニンＡ、Ｂ及びＣの混合物画分（フラクションＮ
ｏ．２）を得ることができる。

【００２１】これらの混合物画分（フラクションＮｏ．
１）及び（フラクションＮｏ．２）を各々シリカゲルク
ロマトグラフィーにより分画し［溶出液；クロロホル
ム：メタノール：エタノール：１０％酢酸＝８：４：
１：２（上層を使用）］、フラクションＮｏ．１からは
粗精製オンジサポニンＦ画分、Ｇ画分およびＤ、Ｅ混合
物画分を、またフラクションＮｏ．２からは粗精製オン
ジサポニンＡ画分、Ｂ画分およびＣ画分を得る。オンジ
サポニンＤ、Ｅ混合物画分はさらにシリカゲルクロマト
グラフィーにより分画し［溶出液；ブタノール：酢酸エ
チル：水＝４：１：２（上層を使用）］、粗精製オンジ
サポニンＤ画分およびＥ画分を得ることができる。

【００２２】これらの粗精製オンジサポニン画分をさら
にセファデックスＬＨ−２０を用いて精製し（溶出液；
メタノール）、精製オンジサポニンＡ（収率：０．５２
％）、精製オンジサポニンＢ（収率：０．７７％）、精
製オンジサポニンＥ（収率：０．２８％）、精製オンジ
サポニンＦ（収率：０．９４％）、および精製オンジサ
ポニンＧ（収率：０．１１％）をそれぞれ得ることがで
きる。

【００２３】（２）また、式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される
化合物はオンジの水抽出や種々のカラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっても精製する
ことができる。すなわち、オンジ５００ｇを精製水１０
リットルで液量が半量になるまで煎出した後、ステンレ
スメッシュを用いてろ過し、残渣について再度精製水１
０リットルを加え、同様の操作を行う。抽出液は合わせ
てガラス繊維ろ紙を用いてろ過し、得られたろ液を凍結
乾燥することにより、熱水抽出エキスを得る。

【００２４】この熱水抽出エキス１３３．９０ｇを精製
水１．７９リットルで溶解させ、遠心分離することによ
り上清を得る。上清に４倍量のエタノールを加え、室温
で一晩攪拌することにより、エタノール沈殿を行う。沈
殿を分別するため、この溶液を一日間静置することによ
り沈殿を沈降させ、上清と沈殿を分別し、さらに分別で
きなかった部分については遠心分離を行う。得られた上
清については、エタノールを減圧留去することにより、
エタノール沈殿上清画分を得る。

【００２５】このエタノール沈殿上清画分を水１リット
ルで再溶解した後、ヘキサン６００ｍｌを用いて振とう
抽出し、脂質画分を除去する。水層について、さらにク
ロロホルム１リットル、次いで水飽和ブタノールを用い
て振とう抽出し、溶媒を減圧留去することにより、クロ
ロホルム可溶性画分およびブタノール可溶性画分を得
る。これらのクロロホルム可溶性画分およびブタノール
可溶性画分を水１リットルで懸濁後、透析膜（排斥分子
量；１０，０００）を用いて、１０日間精製水に対し透
析し、透析内液の溶媒を減圧留去することにより、クロ
ロホルム可溶性およびブタノール可溶性の非透析性活性
画分を得ることができる。

【００２６】これらのクロロホルム可溶性およびブタノ
ール可溶性の非透析性活性画分をハイドロキシアパタイ
トカラムを用いたＨＰＬＣにより水とアセトニトリルの
混合溶媒を溶出液として分画し、前記式（Ｉ）〜（Ｖ）
で表される化合物の混合物を得る。さらにこれらの活性
混合物画分をフェニルカラムを用いたＨＰＬＣにより水
とアセトニトリルの混合溶媒を溶出液として分画し、式
（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物を含む精製画分を得る
ことができる。この精製法のうち、ハイドロキシアパタ
イトを用いたＨＰＬＣの過程を経なくても式（Ｉ）〜
（Ｖ）で表される化合物は精製できる。

【００２７】（３）式（Ｉ）および（II）で表される化
合物はオンジサポニンＡおよびＢであり、すでにセネガ
（ＰｏｌｙｇａｌａｓｅｎｅｇａＬ．）から各々セ
ネギンＩＶおよびセネギンIII として精製されており、
例えば以下のように庄司らの方法に準じて得ることがで
きる［薬学雑誌、９１、１５６４−１５７４（１９７
３）］。

【００２８】すなわち、ヒロハセネガ（Ｐｏｌｙｇａｌ
ａｓｅｎｅｇａＬ．ｖａｒ．ｌａｔｉｆｏｌｉａ
ＴｏｒｒｙｅｔＧｒａｙ）の乾燥根５００ｇを熱メ
タノール３リットルで３回繰り返し抽出し、得られた抽
出エキスの溶媒を留去する。この抽出物を水に懸濁させ
ベンゼンを用いて振とう抽出後、水可溶物をさらに水飽
和ブタノールで振とう抽出する。

【００２９】次いで、ブタノール抽出液の溶媒を留去
し、淡黄色粉末を得る。この淡黄色粉末をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーに付し、水飽和酢酸エチルに順
次５％、１０％、２０％および５０〜１００％の濃度で
メタノールを加えた溶媒により溶出させ、５０〜１００
％メタノール溶出画分の溶媒を留去して粗サポニンを得
る。

【００３０】この溶出画分中にはシリカゲル薄層クロマ
トグラフィーによりＲｆ値０．１４（セネギンIII)およ
び０．１１（セネギンＩＶ）（展開溶媒；ブタノール：
酢酸：水＝４：１：５、上層を使用）に展開されるサポ
ニンを含んでいる。この粗サポニンをケイ酸カラムクロ
マトグラフィーに付し、上記の薄層クロマトグラフィー
でモニターしながら、クロロホルム：メタノール：水＝
７：３：１（下層を使用）により溶出させ、エタノール
から再結晶することによりセネギンIII およびセネギン
ＩＶを得ることができる。

【００３１】次に、式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物
がＣｈＡＴ発現およびＮＧＦ産生促進活性を有し、脳機
能改善剤として有用であることについて具体的に説明す
る。

【００３２】実験例１ＮＧＦ産生促進作用妊娠１７−１８日目のＷｉｓｔａｒ系ラットの頚動脈を
切り屠殺した後に、腹部を切開し子宮をＤｕｌｌｂｅｃ
ｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｍｅｄｉｕ
ｍ（ＤＭＥＭ）の入ったシャーレに取り出し、以降、無
菌的に胎児を取り出し、脳を摘出した。実体顕微鏡下で
大脳皮質部分を切り出し、メスでよく刻んだ後に、０．
２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ５ｍｌを加え３０分間
インキュベーションした。ＤＭＥＭで２回洗浄した後に
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ１０ｍｌを加え、ピペッテ
ィングにより細胞を分散させ培養用フラスコ（７５ｃｍ
²）で５％ＣＯ₂下、３７℃で培養を行った。

【００３３】１〜２週間予備培養した大脳皮質初代培養
細胞を継代培養を行うことにより、残存する神経細胞を
除去することによりアストログリア培養細胞を得た。ま
た、混在するマイクログリアやオリゴデンドログリアは
振とう法により除去した。このアストログリア細胞の培
養がコンフルエントに達した後に無血清培地（ｉｎｓｕ
ｌｉｎ、ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ、ｓｅｌｅｎｉｕｍ、ウ
シ血清アルブミン）に切り替え、細胞を静止期に誘導し
た後に式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物の水溶液を加
えて２４時間、５％ＣＯ₂下、３７℃で培養した。本培
養液上清中のＮＧＦ量を抗ＮＧＦ抗体を用いた二抗体サ
ンドイッチ酵素免疫測定法により測定した。なお、対照
として、化合物の滅菌蒸留水のみを加えた培養細胞を用
いた。

【００３４】図１は式（Ｉ）〜（Ｖ）（オンジサポニン
Ａ、Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧ）で表される化合物のＮＧＦ産
生に対する影響を示したものであるが、オンジサポニン
ＦおよびＧは同程度に最も強くアストログリア細胞のＮ
ＧＦ産生を増強した。また、オンジサポニンＡ、Ｂおよ
びＥもＮＧＦ産生を高めていたが、オンジサポニンＡの
活性は最も弱かった。

【００３５】実験例２ＣｈＡＴ発現促進作用妊娠１７日目のラットの頚動脈を切り屠殺した後に、腹
部を切開し子宮をＤｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆ
ｉｅｄＥａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）とＨａ
ｍ’ｓＦ１２の等比混合培地（ＤＦ培地）の入ったシ
ャーレに切り出し、以降、無菌的に胎児を取り出し、脳
を摘出した。実体顕微鏡下で中隔野あるいは前脳基底野
部分を切り出し、メスでよく刻んだ後に、０．０２％Ｌ
−システインで活性化した１．５Ｕ／ｍｌのパパイン酵
素液を加え３０分間、３７℃でインキュベーションし
た。

【００３６】この前脳基底野初代培養細胞に５％牛胎児
血清および５％馬血清を含むＤＦ培地を加え、ピペッテ
ィングにより細胞を分散させ４×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｗ
ｅｌｌとなるように６穴のプレート（プライマリア、フ
ァルコン）に加えた。本プレートを５％ＣＯ₂下、３７
℃で一週間予備培養後、式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化
合物の水溶液を加えて、６時間同様の条件で培養した。
なお、対照として滅菌蒸留水のみを加えた培養細胞を用
いた。

【００３７】この前脳基底野初代培養細胞からＡＧＰＣ
法により総ＲＮＡ画分を調製し、Ｆｉｒｓｔｓｔｒａ
ｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ファル
マシア社製）によりｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は
ｃＤＮＡ２．５μｌ、ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ０．２５μｌ、５倍濃度のＰＣＲ緩衝液１０μｌ、
２５ｍＭｄＮＴＰｓ０．５μｌ、２ｐｍｏｌ／μｌ
ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ及び２ｐｍｏｌ／μｌｄｏ
ｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒを２．５μｌずつ加
えて、蒸留水で全量を５０μｌとし、２７回の増幅を行
った。

【００３８】また、ＰＣＲ反応は（１）熱変性；９４
℃、３０秒、（２）アニーリング；５５℃、１分、
（３）伸長反応；７２℃、１分の条件で行った。使用し
たセンスプライマー（Ａ）とアンチセンスプライマー
（Ｂ）は、それぞれ公知のｃＤＮＡ配列に基づいて合成
した［Ｂｅｒｒａｒｄ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４，９２８０−９２８４（１９
８７）；Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ他、ＤＮＡ、７，２６１−
２７７（１９８８）］。

【００３９】合成したプライマーの塩基配列を下記に示
す。ＣｈＡＴ（ｓｅｎｓｅ）：５’−ＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴ
ＧＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＡＴ−３’ ＣｈＡＴ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：５’−ＣＡＣＡＧＡ
ＣＧＡＧＧＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴ−３’ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ（ｓｅｎｓｅ）：５’−ＧＧＴ
ＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＴＴＣＧＡ−３’ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：５’
−ＡＡＣＧＧＴＴＡＧＧＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡ
Ｃ−３’

【００４０】得られたＰＣＲ産物は、１．５％アガロー
スゲル電気泳動により分離した後、ＳｙｂｅｒＧｒｅ
ｅｎ（タカラ社製）により染色を行い、２５７ｎｍの紫
外線照射により得られる蛍光をポラロイドフィルム上に
検出した。得られた電気泳動像をスキャナーによりマッ
キントッシュコンピューター上に取り込んだ後に、ＮＩ
Ｈｉｍａｇｅにより染色強度を数値化した。

【００４１】図２は式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物
のうち、式（ＩＶ）（オンジサポニンＦ）のＣｈＡＴ発
現に対する影響を示したものであるが、１μｇ／ｍｌお
よび１０μｇ／ｍｌの用量においてオンジサポニンＦは
対照に比べ、ＣｈＡＴのメッセンジャーＲＮＡの発現を
促進していることが明らかとなり、この効果は同時に用
いたＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）より強いことが示され
た。

【００４２】実験例３ＣｈＡＴ発現促進作用前記の実験例２と同様に調製した２４穴プレートの前脳
基底野初代培養細胞１×１０⁶ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌに式
（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物を含むサポニン画分
（前記（２）のクロロホルム可溶性およびブタノール可
溶性の非透析性活性画分）の水溶液を加え、５％ＣＯ₂
下、３７℃で３日間培養した。なお、対照として、本発
明に用いられる化合物を含まない滅菌蒸留水を加えた。
本培養神経細胞中のＣｈＡＴ活性をＦｏｎｎｕｍの方法
の変法により測定した［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，２４，４０７−４０９（１９７５）］。

【００４３】すなわち、前脳基底野の初代培養細胞をリ
ン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した後に、１％トリトンＸ
−１００を含む５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）で可溶化した。この可溶化液に０．２Ｍ食塩、８ｍ
Ｍ塩化コリン、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭエゼリ
ン、０．５％トリトンＸ−１００、２５μＭ［１−
¹⁴Ｃ］ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡを含む反応液を加え３７
℃、３０分間インキュベーションした。

【００４４】反応終了後、３００μｌの氷冷した１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）を加え、直ちに５ｍｇ／ｍｌの四フェニルホウ
酸ナトリウムを含むアセトニトリル溶液１ｍｌとトルエ
ン２ｍｌを加え攪拌した後に、３０００ｒｐｍで１０分
間遠心した。有機溶媒層１ｍｌをトルエン系シンチレー
ターと混合し放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。

【００４５】図３は式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物
を含むサポニン画分として前記（２）のクロロホルム可
溶性およびブタノール可溶性の非透析性活性画分のＣｈ
ＡＴ発現に対する影響を示したものであるが、これらの
オンジサポニンＡ、Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧを含む粗サポニ
ン画分はＣｈＡＴ活性を上昇させ、ＣｈＡＴ発現促進活
性を有することが明らかとなった。

【００４６】実験例４活性サポニンの溶血性試験従来サポニン類は溶血毒として知られている。そこで、
本発明の活性サポニンの毒性を検討するために以下のよ
うに溶血性を測定した。綿羊赤血球をリン酸緩衝化生理
食塩水で３回洗浄した後、同緩衝液で２．５倍に希釈
し、実験に用いた。１００μｌの式（Ｉ）〜（Ｖ）で表
される化合物の水溶液（２００、１００、５０、２５、
６．２５、３．１２５μｇ／ｍｌリン酸緩衝化生理食塩
水溶液）を分注した９６穴のＶ底マイクロプレートに、
２５μｌの綿羊赤血球懸濁液を加え、３０分間室温で放
置した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。その上清
５０μｌを平底プレートに移し、バイオラッドマイクロ
タイタープレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定
した。

【００４７】図４は式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物
の溶血反応を示したものであるが、溶血した綿羊赤血球
からのヘモグロビンの放出により４９０ｎｍの吸光度を
上昇させた。また、式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物
間で溶血性に大きな違いが認められた。オンジサポニン
ＥおよびＦでは２００μｇ／ｍｌにおいてもほとんど溶
血性は認められなかったのに対し、オンジサポニンＧで
は中程度の溶血性が認められ、オンジサポニンＡおよび
Ｂは試験した化合物のうち最も強い溶血性を示した。

【００４８】次に、本発明による請求項１〜７に記載の
脳機能改善剤の投与量および製剤化について説明する。
請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物はそのま
ま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物および人に投与
することができる。投与形態としては、特に限定がな
く、必要に応じて適宜選択して使用され、経口剤として
は例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤など
が挙げられ、非経口剤としては注射剤、座剤などが挙げ
られる。

【００４９】経口剤としての所期の効果を発揮するため
には、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、
通常成人で式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物もしくは
混合物の重量として１ｍｇ〜５ｇを一日数回に分けての
服用が適当と思われる。経口剤は、例えばデンプン、乳
糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、
コーンスターチ、無機塩類などを用いて常法に従って製
造される。この種の製剤には、前記のごとく賦形剤の他
に、適宜、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動
性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することがで
きる。

【００５０】結合剤としては、例えばデンプン、デキス
トリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピ
ルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結
晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリド
ン、マクロゴール等が挙げられる。崩壊剤としては、例
えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセル
ロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置
換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

【００５１】界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸
ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポ
リソルベート８０などが挙げられる。滑沢剤としては、
例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸
エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カ
ルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレング
リコール等が挙げられる。流動性促進剤としては、例え
ば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成
ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられ
る。

【００５２】また、式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物
もしくは混合物は、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ
剤、エリキシル剤としても投与することができ、これら
の各種剤形には矯味剤、矯臭剤、着色剤を含有しても良
い。非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患
者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人
で式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物もしくは混合物の
重量として０．０１ｍｇ〜１ｇまでの静注、点滴、皮下
注射、筋肉注射が適当と思われる。

【００５３】非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤
として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶
液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、
トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール等を用いることができる。更に必要に応じ
て、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。

【００５４】また、非経口剤は安定性の点から、バイア
ル等に充填後、冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分
を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製する
こともできる。さらに、必要に応じて適宜、等張化剤、
安定化剤、防腐剤、無通化剤などを加えても良い。その
他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏などの塗布剤、
直腸内投与のための座剤等が挙げられ、これらは常法に
従って、製造される。

【００５５】

【発明の実施の態様】以下に実施例を挙げて本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。実施例１（１）コーンスターチ４４．０ｇ（２）結晶セルロース４０．０ｇ（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム５．０ｇ（４）軽質無水ケイ酸０．５ｇ（５）ステアリン酸マグネシウム０．５ｇ（６）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１０．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００５６】上記の処方に従って（１）〜（６）を均一
に混合し、打錠機にて圧縮成型して一錠２００ｍｇの錠
剤を得た。この錠剤の一錠には請求項１〜７に記載の化
合物もしくは混合物２０ｍｇが含有されており、成人一
日１０〜２５錠を数回に分けて服用する。

【００５７】実施例２（１）結晶セルロース８４．５ｇ（２）ステアリン酸マグネシウム０．５ｇ（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム５．０ｇ（４）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１０．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００５８】上記の処方に従って（１）、（４）および
（２）の一部を均一に混合し、圧縮成型した後、粉砕
し、（３）および（２）の残量を加えて混合し、打錠機
にて圧縮成型して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。この錠
剤の一錠には、請求項１〜７に記載の化合物もしくは混
合物２０ｍｇが含有されており、成人一日１０〜２５錠
を数回に分けて服用する。

【００５９】実施例３（１）結晶セルロース４９．５ｇ（２）１０％ヒドロキシプロピルセルロースエタノール溶液３５．０ｇ（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム５．０ｇ（４）ステアリン酸マグネシウム０．５ｇ（５）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１０．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００６０】上記の処方に従って（１）、（２）および
（５）を均一に混合し、常法によりねつ和し、押し出し
造粒機により造粒し、乾燥・粉砕した後、（３）および
（４）を混合し、打錠機にて圧縮成型して、一錠２００
ｍｇの錠剤を得た。この錠剤一錠には、請求項１〜７に
記載の化合物もしくは混合物２０ｍｇが含有されてお
り、成人一日１０〜２５錠を数回に分けて服用する。

【００６１】実施例４（１）コーンスターチ３４．５ｇ（２）ステアリン酸マグネシウム５０．０ｇ（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム５．０ｇ（４）軽質無水ケイ酸０．５ｇ（５）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１０．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００６２】上記の処方に従って（１）〜（５）を均一
に混合し、圧縮成型機にて圧縮成型後、粉砕機により粉
砕し、篩い分けして顆粒剤を得た。この顆粒剤１ｇに
は、請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１００
ｍｇが含有されており、成人一日２〜５ｇを数回に分け
て服用する。

【００６３】実施例５（１）結晶セルロース５５．０ｇ（２）１０％ヒドロキシプロピルセルロースエタノール溶液３５．０ｇ（３）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１０．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００６４】上記の処方に従って（１）〜（３）を均一
に混合し、ねつ和した。押し出し造粒機により造粒後、
乾燥し、篩い分けして顆粒剤を得た。この顆粒剤１ｇに
は、請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１００
ｍｇが含有されており、成人一日２〜５ｇを数回に分け
て服用する。

【００６５】実施例６（１）コーンスターチ８９．５ｇ（２）軽質無水ケイ酸０．５ｇ（３）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１０．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００６６】上記の処方に従って（１）〜（３）を均一
に混合し、２００ｍｇを２号カプセルに充填した。この
カプセル剤１カプセルには、請求項１〜７に記載の化合
物もしくは混合物２０ｍｇが含有されており、成人一日
１０〜２５カプセルを数回に分けて服用する。

【００６７】実施例７（１）大豆油５．０ｇ（２）注射用蒸留水８９．５ｇ（３）ダイズリン脂質２．５ｇ（４）グリセリン２．０ｇ（５）請求項１〜７に記載の化合物もしくは混合物１．０ｇ ────────────── 計１００．０ｇ

【００６８】上記の処方に従って（５）を（１）および
（３）に溶解し、これに（２）と（４）の溶液を加えて
乳化し、注射剤を得た。

【００６９】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明の脳機能
改善剤は、脳神経細胞群のコリンアセチルトランスフェ
ラーゼ発現および神経成長因子産生促進活性を有し、ア
ルツハイマー病や老人性痴呆症を中心とする脳疾患に有
用な薬剤が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いられる化合物のＮＧＦ産生促進作
用を示したものである。

【図２】本発明に用いられる化合物オンジサポニンＦの
コリンアセチルトランスフェラーゼメッセンジャーＲＮ
Ａ発現促進作用を示したものである。

【図３】本発明に用いられる化合物オンジサポニン画分
のコリンアセチルトランスフェラーゼ発現促進作用を示
したものである。

【図４】本発明に用いられる化合物の溶血性を示したも
のである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（Ｉ）【化１】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤。
【請求項２】下記式（II）【化２】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤。
【請求項３】下記式（III) 【化３】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤。
【請求項４】下記式（ＩＶ）【化４】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤。
【請求項５】下記式（Ｖ）【化５】で表される化合物を有効成分とする脳機能改善剤。
【請求項６】請求項１ないし５に記載の化合物を少な
くとも２種以上含むことを特徴とする脳機能改善剤。
【請求項７】オンジおよびセネガより調製したサポニ
ン含むことを特徴とする脳機能改善剤。