JPH0987187A - アポトーシス抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】アポトーシス起因性疾患の治療、すなわち、ア
ルツハイマー症、老人性神経症、退行性神経変性症、パ
ーキンソン氏病、精神分裂症（破瓜病）、小脳変性症、
ウィルソン氏病、ダウン症候群、網膜色素変性症及び老
化予防等に有効な薬物を提供する。 【構成】当帰芍薬散を有効成分として含有することを特
徴とするアポトーシス抑制剤

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗アルツハイマー症
剤、抗パーキンソン氏病剤、抗精神分裂症剤（抗破瓜病
剤）、老人性神経症剤、抗小脳変性症剤、抗ウィルソン
氏病剤、抗ダウン症剤、及び抗網膜色素変性症剤、さら
に老化防止剤等の医薬として利用可能な神経細胞及びそ
の他の細胞のアポトーシス抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞が死に至る過程には、アポトーシス
とネクローシスの二種類が知られている。アポトーシス
とは、「プログラムされた細胞死」と呼ばれ、細胞の核
から死ぬ細胞自身の遺伝子に最初から組み込まれている
死であると考えられており、中枢神経細胞死のほとんど
がこのアポトーシスによることがわかっている。一方の
ネクローシスは、「壊死」と呼ばれ細胞膜から死ぬもの
で、通常の細胞死はこのネクローシスによるものであ
る。

【０００３】現在、大きな社会問題となっているアルツ
ハイマー症は、神経系の障害が原因で起こるものである
が、このアルツハイマー症の患者は通常人に比べて脳神
経細胞の数が非常に少ないことが特徴とされている。す
なわち、患者の脳神経細胞がアポトーシスを起こして急
速に死ぬことに起因する。

【０００４】アルツハイマー症の予防および治療法は、
例えば、特公昭５６ー５００３７４、特開昭５９ー１６
７５１４、特開平２ー２１５３５１等のように、アセチ
ルコリン生合成の原料であるコリンを含有するリン脂質
であるホスファチジルコリンを摂取することにより脳内
に低下したアセチルコリンを補給する方法、特開平１ー
２４６２２４等のように、大脳皮質におけるニコチン・
アセチルコリンレセプターおよび神経伝達物質であるノ
ルエピネフリンの合成を促進する方法、特開平２ー３１
１４２２等のように、コリン・アセチル転移酵素活性を
賦活しアセチルコリンの生合成を促進する方法、および
特開平７ー２５７７等のように、神経栄養因子生合成を
促進する方法等があるが、いずれも対処療法的でアポト
ーシスを防ぐものではなく、根本的な解決には到ってい
ない。

【０００５】また、従来のアルツハイマー症の予防およ
び治療剤は、副作用を持つものがあり、使用には危険を
伴うものであった。

【０００６】本発明のアポトーシス抑制剤は、アルツハ
イマー症を含む老人性神経症だけでなく、退行性神経変
性症であるパーキンソン氏病、精神分裂症（破瓜病）、
及び小脳変性症剤等や、遺伝病であるウィルソン氏病、
ダウン症候群、及び網膜色素変性症等の治療、そして今
後さらに高齢化が進む日本にとって対策を講じなければ
ならない最も大きな課題の一つである「老化」の予防剤
にも効果があり、国民への利益ははかり知れない。

【０００７】また本発明のアポトーシス抑制剤は、ヒト
以外の動物、特にペット、家畜、家禽、及び絶滅の危険
性のある保護動物等の細胞のアポトーシスにも有用であ
る。しかし、従来の薬剤の中には臨床に用いることので
きうる公知のアポトーシス抑制剤はない。

【０００８】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は副作
用がなく臨床に用いることのできるアポトーシス抑制剤
を提供することである。

【０００９】

【問題点を解決するための手段】かかる事情に鑑み、鋭
意研究を重ねた結果、漢方処方の一つである当帰芍薬散
がアポトーシスを劇的に抑制することを見出し本発明を
完成した。 即ち本発明は当帰芍薬散を有効成分として
含有することを特徴とするアポトーシス抑制剤を提供す
るものである。

【００１０】当帰芍薬散は漢方処方の古典である金匱要
略にその構成生薬、分量、抽出法等が記載されており、
副作用のない漢方薬として、妊娠中毒症や更年期障害等
の婦人病に使用され、血流の改善によりその効果を発揮
するといわれている。しかし、アポトーシス抑制作用の
あることは従来全く知られていなかった。以下、本発明
を更に詳細に説明する。

【００１１】本発明のアポトーシス抑制剤の有効成分
は、生薬として公知である当帰（第十二改正日本薬局
方、廣川書店、平成３年４月１７日発行、１８８５頁記
載）、芍薬（同１７７６頁記載）、沢瀉（同１８４８頁
記載）、茯苓（同１９７３頁記載）、蒼朮（同１８３８
頁記載）および川きゅう（同１８２８頁記載）の６種の
生薬の混合物よりなる当帰芍薬散及び、当帰、芍薬、沢
瀉、茯苓、蒼朮および川きゅうの、６種の生薬から選択
される一種又は二種以上の生薬混合物からなる。

【００１２】本発明のアポトーシス抑制剤の有効成分と
して当帰芍薬散を含有する場合、当帰、芍薬、沢瀉、茯
苓、蒼朮および川きゅうの配合比は、構成生薬の産地、
採取時期、自然条件によって含有される有効成分の量が
変化するものであるため、各構成生薬の配合比は適宜増
減する必要があるが、当帰２〜５重量部、芍薬３〜８重
量部、沢瀉２〜８重量部、茯苓２〜６重量部、蒼朮２〜
６重量部および川きゅう２〜５重量部の比率で混合した
ものが、効果が高く望ましいが特にこれに限定されな
い。

【００１３】本発明の薬剤の投与量は、投与経路、疾患
の程度、被投与者の年齢によって異なるが、有効成分が
当帰芍薬散の場合は、一般には経口投与の場合、大人一
人当たり当帰芍薬散乾燥エキス量として１日当たり１〜
１０ｇ程度となる量を１〜３回に分けて投与すればよ
い。有効成分が前記６種の生薬から選択される単体又は
二種以上の混合物の場合は、経口投与の場合、生薬合計
重量として１日当たり体重１kgに対して0.001〜１５ｇ
量を１〜３回に分けて投与すればよい。

【００１４】なお、本発明で用いる生薬および漢方製剤
は、既に長年に渡って使用されており、安全性が確認さ
れたものであるので、安心して使用することができる。
例えば、当帰芍薬散であれば、ラットおよびマウスに対
し、投与限界である１５ｇ／ｋｇの経口投与で死亡例が
認められないことから明らかなように極めて安全性の高
いものである。

【００１５】本発明のアポトーシス抑制剤の１日の服用
量は、有効成分である当帰芍薬散又はを体重１ｋｇに対
し0.001ｇから10ｇを１日１回又は数回に分けて服用す
る。

【００１６】本発明のアポトーシス抑制剤の服用方法
は、有効成分である当帰芍薬散又は前記６種の生薬から
選択される一種又は二種以上の混合物の混合粉末をその
まま服用してもよいが、通常は一般の生薬原料と同様、
当帰芍薬散の混合粉末を１０〜２０倍量の水又は湯で煎
じ、服用することもできる。

【００１７】また、服用のし易さ、携帯の便利さを考慮
して、上記の混合生薬から、通常の熱抽出、固液分離、
濃縮、乾燥の過程を経て得られる漢方薬エキス製剤とし
たものをアポトーシス抑制剤として使用することもでき
る。

【００１８】本発明の薬剤は、上記の各生薬をそのま
ま、またはその抽出物を公知の医薬用担体、及び公知の
漢方成分と組み合わせて製剤化することができる。投与
形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択し
て使用され、製剤の通則に従って、顆粒剤、カプセル
剤、錠剤、細粒剤、散剤等の経口剤や、注射剤、点滴用
剤、座剤等の非経口剤のいずれによっても投与すること
ができる。

【００１９】経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白
糖、マンニット、カルボキシメチルセルロースコーンス
ターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。
この種の製剤には、適宜上記賦形剤の他、結合剤、崩壊
剤、界面活性剤、活沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色
剤香料等を使用することができる。

【００２０】例えば、本発明の製剤原料として使用可能
な結合剤としては、デンプン、デキストリン、アラビア
ゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、
エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴー
ル等が有るが特にこれに限定されない。

【００２１】本発明の製剤原料として使用可能な崩壊剤
としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロー
ス、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が有るが特
にこれに限定されない。

【００２２】本発明の製剤原料として使用可能な界面活
性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチ
ン、ショ糖脂肪酸エステル、ポロソルベート８０等が有
るが特にこれに限定されない。

【００２３】本発明の製剤原料として使用可能な活沢剤
としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂
肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン
酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレ
ングリコール等が有るが特にこれに限定されない。。

【００２４】本発明の製剤原料として使用可能な流動性
促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニ
ウム、合成ケイ酸マグネシウム等が有るが特にこれに限
定されない。

【００２５】一方、非経口剤は常法によって製造され、
希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ
糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイ
ズ油、トウモロコシ油、ポリエチレングリコール、プロ
ピレングリコール等を使用することができる。

【００２６】更に必要に応じて殺菌剤、防腐剤、安定剤
を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点か
ら、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結技術により
水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製
することもできる。更に、必要に応じて適宜、等張化、
安定剤、防腐剤無痛化剤等を加えてもよい。

【００２７】本発明のアポトーシス抑制剤の対象となる
細胞及び生物は、アポトーシスを起こす神経細胞を含む
全ての細胞が対象となり、その対象生物は、ヒトを含む
全ての真核動物のアポトーシスが対象となる。以下、本
発明の実施例、効果試験例を示して本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより制限されるものでは
ない。

【００２８】

【実施例１】当帰３ｇ、芍薬４ｇ、沢瀉４ｇ、茯苓４
ｇ、蒼朮４ｇおよび川きゅう３ｇの混合生薬に２２０ｍ
ｌの水を加えて１時間、１００℃で加熱抽出し、得られ
た抽出液を濾過後、スプレードライして３．８ｇの本発
明の粉剤を得た。

【００２９】

【実施例２】当帰１０ｇ、及び芍薬１２ｇの混合生薬
に、２２０ｍｌの水を加えて１時間、１００℃で加熱抽
出し、得られた抽出液を濾過後、スプレードライして
３．５ｇの本発明の粉剤を得た。

【００３０】

【実施例３】当帰３００ｇ、芍薬４００ｇ、沢瀉４００
ｇ、茯苓４００ｇ、蒼朮４００ｇおよび川きゅう３００
ｇの混合生薬に２２Ｌの水を加えて１時間、１００℃で
加熱抽出し、得られた抽出液を遠心分離機にかけ、残渣
を分離して溶液を得た。 この溶液を０．３μｍのメン
ブランフィルター（東洋濾紙社製）により無菌清澄濾過
した。得られた濾液をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バ
イオエンジニアリング社製：分画分子量１００００）を
用いて限外濾過した。この限外濾過は、内容積２．０Ｌ
の容器の下面に直径１５２ｍｍの膜をセットし、圧力３
ｋｇ／ｃｍ2 で行い、容器内の液が濃縮されるにつれ精
製水約２Ｌを添加するというように実施し限外濾過を行
い本発明の液剤を得た。

【００３１】

【実施例４】上記実施例１により製造した薬剤２００ｇ
を乳糖９９ｇおよびステアリン酸マグネシウム１ｇと混
合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠して、直径２
０ｍｍ、重量約２．３ｇのスラッグ錠を作り、これをオ
シレーターにて粉砕し、整粒し、選別して２０〜５０メ
ッシュの粒子の良好な顆粒剤を得た。この顆粒剤は、症
状に合わせて１．５〜１５．０ｇ（本発明の薬剤の乾燥
エキス粉末重量として１．０〜１０．０ｇに相当）を１
日３回に分けて服用する。

【００３２】

【実施例５】上記実施例１により製造した薬剤２００ｇ
を微結晶セルロース２０ｇおよびステアリン酸マグネシ
ウム５ｇと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠
して、直径７ｍｍ、重量２２５ｍｇの錠剤を製造した。
本錠剤１錠中には、本発明の薬剤の乾燥エキス粉末を２
００ｍｇ含有する。本錠剤は、症状に合わせて１回量５
〜５０錠を１日３回に分けて服用する。

【００３３】

【実施例６】上記の具体例１により製造した薬剤５００
ｍｇを硬カプセルに充填した。本カプセルは症状に合わ
せて２〜２０カプセルを１日３回に分けて服用する。

【００３４】

【効果試験例１】 （１）小脳顆粒細胞の調製および培養方法：８日齢のＳ
Ｄ系ラットを断頭し、小脳を摘出後、０．０２５％トリ
プシン含有クレブス・リンガー緩衝液中で温度３７℃
下、１３分間インキュベートし、大豆由来トリプシンイ
ンヒビターおよびデオキシリボヌクレアーゼを添加して
反応を止め、小脳顆粒細胞一つ一つが分散するようによ
く混合した。この懸濁液を小脳顆粒細胞数が１．２５×
１０6 個／ｍｌとなるようにイーグル基礎培地（１０％
牛胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシン、２５ｍＭＫＣｌ含有）に拡散させ、ポリ−Ｌ
−リジンをコーティングした直径３５ｍｍ培養皿にて温
度３７℃、二酸化炭素濃度５％で培養した。なお、神経
細胞以外の細胞の増殖を防ぐため、培養１８時間後に１
０μＭシトシンアラビノサイドを加えた。

【００３５】（２）小脳顆粒細胞の形態学的変化および
細胞死の検討：培養７日目に、培地を、試験区として、
本発明実施例１の当帰芍薬散含有粉剤０．０５ｍｇ／ｍ
ｌを有効成分として添加したイーグル基礎培地（１０％
牛胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシン、５ｍＭＫＣｌ含有）、及び対照区として、当
帰芍薬散無添加イーグル基礎培地２種（５ｍＭＫＣｌ含
有培地と２５ｍＭＫＣｌ含有培地）に交換し、その３日
後に、ＦＤＡおよびＰＩ染色を行い、位相差顕微鏡にて
細胞の形態像を観察するとともに、紫外線照射によるＦ
ＤＡおよびＰＩの蛍光発色を指標に、細胞の持つ酵素活
性および細胞の生死を観察した。

【００３６】ＦＤＡは、細胞内に吸収され、酵素により
代謝されて、紫外線照射により緑色の蛍光を発する。発
色が観察されれば、その細胞は生細胞であり、その発色
の強弱により、細胞の持つ酵素活性を評価できる。ま
た、ＰＩによって核が染まり、紫外線照射により赤色の
蛍光が観察される。しかし生細胞はＰＩを吸収しない
（細胞膜を通過しない）ため、アポトーシスにより死に
至った細胞の核のみが赤色に染まることになる。

【００３７】その結果、２５ｍＭＫＣｌ含有当帰芍薬散
無添加培地の細胞の形態像では、アポトーシスが認めら
れなかったが、５ｍＭＫＣｌ含有当帰芍薬散無添加培地
では、細胞縮小、核濃縮、核断片化等が認められ、明ら
かにアポトーシスが惹起されたことが確認された。ま
た、このアポトーシスにより死に至った細胞は、ＰＩ染
色により全体の７０〜８０％を占め、生細胞について
は、ＦＤＡによる緑色発色が弱く、酵素活性の低下が認
められた。ところが、当帰芍薬散存在下では、細胞縮
小、核濃縮、核断片化等がほとんど認められず、死細胞
は１０〜２０％であり、生細胞の緑色発色も強かった。

【００３８】（３）ｃ−ｆｏｓタンパクの有無の検討：
（１）と同様に小脳顆粒細胞を調製し、５ｍＭＫＣｌ含
有及び２５ｍＭＫＣｌ含有当帰芍薬散無添加培地、そし
て、０．０５ｍｇ／ｍｌ当帰芍薬散添加５ｍＭＫＣｌ含
有培地（当帰芍薬散は培養２日目に添加）にて８日間培
養後、細胞を収集し、０．５％ＮＰ−４０含有トリス・
塩酸緩衝液にて、４℃、３０分間処理して細胞膜を溶解
させ、核が７×１０7 個／ｍｌとなるよう調製後、３０
％ショ糖含有トリス・塩酸緩衝液を加え、４℃、１５０
０回転で３０分間遠心分離して核を捕集した。核膜をＰ
ＭＳＦ添加４０％グリセロール含有トリス・塩酸緩衝液
で溶解させ、アセトンを加えてタンパクを沈殿させ、ア
セトンを除去してその残渣にＬａｅｍｍｌｉ液を加え
て、ＳＤＳゲルによる電気泳動を行った。そのゲルに展
開したタンパクをニトロセルロース膜に移し、ｃ−ｆｏ
ｓ１次抗体を結合させ、さらに羊由来ラットＩｇＧ２次
抗体を結合させて、ペルオキシダーゼ発色法を用い、ｃ
−ｆｏｓタンパクの存在の有無を調べた。ｃ−ｆｏｓタ
ンパクが検出されれば、核が正常に働いていることを示
し、アポトーシスにより核が破壊されればｃ−ｆｏｓタ
ンパクは検出されない。

【００３９】その結果、５ｍＭＫＣｌ含有当帰芍薬散無
添加培地からはｃ−ｆｏｓタンパクは検出されなかった
が、当帰芍薬散添加５ｍＭＫＣｌ含有培地及び２５ｍＭ
ＫＣｌ含有当帰芍薬散無添加培地ではｃ−ｆｏｓタンパ
クが検出された。実際、ｃ−ｆｏｓタンパクが検出され
なかった５ｍＭＫＣｌ含有当帰芍薬散無添加培地の細胞
を位相差顕微鏡にて観察したところ、細胞縮小、核濃
縮、核断片化等が認められ、明らかにアポトーシスが惹
起されたことが確認された。

【００４０】（４）ＤＮＡフラグメンテーションの検
討：（２）と同様に、培養７日目に、培地を、試験区と
して、０.０５ｍｇ／ｍlの濃度に調整した当帰芍薬散添
加イーグル基礎培地（２ｍＭグル夕ミン、５０μｇ／ｍ
ｌゲンタマイシン、５ｍＭＫＣｌ含有、ただし牛胎児血
清は含有せず）、及び対照区として、当帰芍薬散無添加
イーグル基礎培地（２ｍＭグル夕ミン、５０μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン、５ｍＭＫＣｌ含有、ただし牛胎児血清
は含有せず）に交換し、４８時間後にスクラッパーにて
固着細胞をかきとり、ＰＢＳで洗浄後、ライシス緩衝液
（２００ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ８.５）、１００ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ及び２０μｇ／ｍｌＲＮＡａｓ
ｅ）にて３７℃で一夜インキュベートし、更に１００μ
ｇ／ｍｌとなるようプロテナーゼＫを加えて５０℃で３
時間インキュベートして細胞ホモジネートを得た。これ
をフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）、
及びクロロホルムにて順次処理して蛋白を除去し、０.
３ｍＭ酢酸ナトリウム溶液及びエタノールを用いてＤＮ
Ａを沈殿させた。このＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭト
リス-塩酸（ｐＨ８.０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解後、
２０μｇのＤＮＡをエチジウムブロマイドを加えたｌ.
２％アガロースゲルによる電気泳動にて解析した。

【００４１】その結果、対照区からはＤＮＡが切断され
た断片が検出されたが、当帰芍薬散を添加した試験区で
は断片が検出されなかった。

【００４２】

【効果試験例２】効果試験例１と同様な方法で本発明実
施例２の粉剤0.05mg/mlを用いて、小脳顆粒細胞の形態
学的変化及び細胞死を検討したところ、本発明実施例１
の当帰芍薬散含有粉剤程ではないが、細胞縮小、核濃
縮、核断片化等があまり認められなかった。また、細胞
死は３０〜３５％であった。

【００４３】以上の効果試験の結果から、本発明の当帰
芍薬散含有製剤がアポトーシスを抑制することが明らか
となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/84 ＡＥＤ Ａ６１Ｋ 35/84 ＡＥＤＡ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 当帰芍薬散を有効成分として含有するこ
   とを特徴とするアポトーシス抑制剤。
2. 【請求項２】 当帰、芍薬、沢瀉、茯苓、蒼朮および川
   きゅうのうちいずれか１種、または２種以上の生薬を含
   有することを特徴とするアポトーシス抑制剤。