CN108421031A - 藻蓝蛋白在制备防治帕金森病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了藻蓝蛋白在预防与治疗帕金森病中的一种医药新用途。本发明通过离体帕金森病细胞模型实验和在体动物模型实验证明，藻蓝蛋白能抑制神经毒素MPP⁺/MPTP所致的神经元死亡和运动功能障碍及神经元CAT活和LDH活性降低、MDA含量增加的氧化损伤；藻蓝蛋白能抑制MPP⁺/MPTP的神经毒性，有较好的剂量依赖性，藻蓝蛋白对帕金森细胞模型和动物模型的神经元有一定的神经保护效应，可减轻帕金森小鼠的运动功能障碍，可用于制备防治帕金森病的药物。

Description

藻蓝蛋白在制备防治帕金森病药物中的应用

技术领域

本发明涉及藻蓝蛋白的应用，具体涉及藻蓝蛋白在制备预防与治疗帕金森病药物中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是发病率第二高的神经退行性疾病，我国65岁以上人群的患病率大约是1.7％，该病具有发病率高、病程长、致残率高、治疗效果差、费用昂贵等特点，给家庭和社会带来巨大的危害和负担。PD的主要临床表现是静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射等运动功能障碍。PD的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的大量丢失和路易小体的形成(Lewy body)。尽管PD的病理特征及临床表现都很清楚，但导致多巴胺能神经元特异性死亡的机制仍不十分明确。遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与多巴胺能神经元的变性死亡过程。PD一旦发病出现临床症状，50-60％的黑质多巴胺能神经元已经退行死亡，纹状体的多巴胺减少了70-80％，此时药物或其他疗法均已很难逆转病程，目前临床上尚无有效的根治方案。因此，探讨PD发病的分子机制，寻找有效的干预药物，对于保护我国人民尤其是中老年人的身体健康和生活质量至关重要。

藻蓝蛋白(phycocyanin)是从螺旋藻中提取的一种藻蓝胆素蛋白质，在螺旋藻中的含量高达10％～20％，是自然界中少见的色素蛋白之一。藻蓝蛋白不仅是一种极好的天然食用色素，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。藻蓝蛋白已被证明能抑制癌症细胞扩展，可以制成抗肿瘤的辅助治疗药物，用以化疗的辅助治疗可增强机体的免疫力；藻蓝蛋白可以帮助调节、合成人体代谢所需要的多种重要的酶，促进人体细胞的再生，调节人体免疫系统，增强免疫系统功能，提高人体对疾病的抵抗力；藻蓝蛋白还可清除体内自由基，促进细胞活性，改善卵巢功能，促进人体快速合成弹力蛋白；藻蓝蛋白还具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素的作用，能够调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用，增加体能，促进红血球增长，促进生长发育；藻蓝蛋白还具有抗辐射、抗过敏、抗疲劳、抗病毒、抗炎和神经保护作用。藻蓝蛋白无任何毒副作用，可以长期服用。本研究探讨藻蓝蛋白在预防与治疗帕金森病中的应用，为临床上预防和治疗帕金森病提供新思路。

发明内容

本发明的目的在于提供藻蓝蛋白的一种药物新用途。

具体的说，本发明涉及藻蓝蛋白在制备预防和治疗帕金森病的药物中的应用。

所述藻蓝蛋白作为药效成分的药物制剂为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等任一剂型，这是本领域技术人员可以理解的。

所述藻蓝蛋白亦可在制备预防和辅助治疗帕金森综合征的保健品中应用。

所述藻蓝蛋白作为作为有效成分的保健品剂型为散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等任一剂型，这是本领域技术人员可以理解的。

本发明通过细胞和动物实验研究发现：藻蓝蛋白有防治帕金森病的效果，起到抑制因帕金森病所致的多巴胺能神经元数目减少和运动功能障的一系列问题。藻蓝蛋白的预防和治疗有效量，应按照治疗者的年龄、身体状况等确定。

本发明所述的藻蓝蛋白是螺旋藻的主要活性成分之一，其具有免疫调节活性，能起到抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗辐射、抗疲劳、抗过敏等作用，并且目前尚未发现其有任何毒副作用。藻蓝蛋白可以通过市售得到，也可以通过多种方法提取获得，提取方法成熟。

本发明人研究了神经毒素MPP⁺/MPTP的致帕金森病作用，发现MPP⁺/MPTP致帕金森病发病的毒性作用主要是引起神经元氧化应激，活性氧产生增加，神经元死亡，进而引起小鼠运动功能障碍等一系列症状。

本发明通过细胞和动物实验观察了神经毒素MPP⁺/MPTP致帕金森病的毒性作用，以及藻蓝蛋白对MPP+/MPTP毒性的抑制作用。经研究发现，藻蓝蛋白能抑制神经毒素MPP⁺/MPTP所致的神经元死亡和运动功能障碍及神经元CAT活和LDH活性降低、MDA含量增加的氧化损伤；藻蓝蛋白能抑制MPP⁺/MPTP的神经毒性，有较好的剂量依赖性。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供了藻蓝蛋白的医药新用途，本发明人通过大量试验发现，藻蓝蛋白具有明显的神经保护作用，在动物体内外实验中证实藻蓝蛋白能够保护多巴胺能神经元免受神经毒素MPP⁺/MPTP的损伤，其保护作用与抗活性氧物质生成有关。藻蓝蛋白能抑制MPP⁺/MPTP所致帕金森病的多巴胺神经元死亡和运动功能障碍，并具有良好的剂量依赖性。

2.藻蓝蛋白无任何毒副作用，可以长期服用，其高安全性可以保证帕金森病人长期用药的需要。在目前阶段，帕金森病通常是不可逆的神经退行性疾病，病因复杂。为了保持患者病情不继续恶化，病人用药周期较长。因此，藻蓝蛋白作为结构明确的天然海洋活性物质，毒性低，安全性好，能够对抗神经毒素MPP⁺/MPTP所致的帕金森病，故在预防和治疗帕金森病及神经保护方面有良好的应用前景和巨大的新药开发价值。

3.我国已进入老龄化社会，本发明对中老年帕金森病患者具有深远的意义，能起到预防和治疗帕金森病，提高患者生活质量，延长寿命等作用。

具体实施方式

以下通过试验例来进一步阐述本发明中藻蓝蛋白的医药新用途及其有益效果，但不用来限制本发明的范围。

试验例1：藻蓝蛋白拮抗MPP⁺神经毒性的实验研究

1材料与方法

1.1材料

DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS、Neurobasal培养基、B27添加剂(Gibco公司)，MPP⁺、MTT(美国Sigma公司)，过氧化氢酶(CAT)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物公司)，藻蓝蛋白(中国海洋大学惠赠)。

1.2实验动物及分组

选取怀孕16-18天的SD大鼠，无菌条件下取E16-18大鼠胚胎置于预冷的D-hanks液中，用灭菌的手术器械剥离去除脑膜、血管、海马及中脑部分，然后将皮层用胰酶消化，再用移液器吹打，静置2min后取上清过200目晒网。将细胞悬液于1000rpm/min离心5min，然后将细胞沉淀中加入10％FBS新鲜DMEM培养液，并反复吹打成细胞悬液，计数后，按3×10⁶/孔细胞密度接种，若需培养细胞爬片，则底部铺盖玻片。培养7天后，神经元进行相关实验处理和检测。分别为正常对照组(A)、藻蓝蛋白对照组(B)、MPP⁺染毒组(C)、藻蓝蛋白低剂量保护组(D)、藻蓝蛋白中剂量保护组(E)。其中对照组(A)不给药，给予生理盐水，藻蓝蛋白对照组(B)给予藻蓝蛋白10mg/L，MPP⁺染毒组(C)给予200μM，藻蓝蛋白低剂量保护组(D)给予藻蓝蛋白5mg/L+MPP⁺200μM，藻蓝蛋白中剂量保护组(E)给予藻蓝蛋白10mg/L+MPP⁺200μM，藻蓝蛋白高剂量保护组(F)给予藻蓝蛋白20mg/L+MPP⁺200μM。

1.3统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量资料实验数据均以x±s进行表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One WayANOVA)。进一步进行组间两两比较时，若方差齐时，采用SNK检验；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。计数资料实验数据均以率表示，组间两两比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2方法与结果

我们在MPP⁺处理原代皮层神经元前半个小时添加藻蓝蛋白，处理48h后，MTT法测神经元细胞存活率，按照试剂盒说明书检测神经元中CAT、LDH活性和MDA含量。结果如表1和2所示。

表1 MTT法检测藻蓝蛋白对MPP⁺致神经元存活率下降的拮抗作用(n＝5)

注：与A组比较：*P<0.05，与C组比较：△P<0.05。

表1可见，与正常对照组(A)相比，MPP⁺染毒组(C)神经元存活率下降，差异有统计学意义(P<0.05)。藻蓝蛋白保护组能抑制MPP⁺染毒引起的神经元存活率下降，以藻蓝蛋白高剂量保护组(F)作用最显著。

表2藻蓝蛋白对MPP⁺致神经元氧化损伤的拮抗作用(n＝15)

注：与A组比较：*P<0.05，与C组比较：△P<0.05。

表2可见，与正常对照组(A)相比，MPP⁺染毒组(C)神经元CAT活性和LDH活性下降，MDA含量增多，差异有统计学意义(P<0.05)。藻蓝蛋白保护组能抑制MPP⁺染毒引起的神经元MDA含量增多及CAT活性和LDH活性下降，以藻蓝蛋白高剂量保护组(F)作用最显著，藻蓝蛋白高剂量保护组(F)神经元CAT活性、LDH活性及MDA含量，与MPP⁺染毒组(C)相比有显著差异(P<0.05)，与正常对照组(A)相比，没有显著差异(P>0.05)。

试验例2：藻蓝蛋白对MPTP致帕金森小鼠神经元死亡和运动功能障碍的影响

1材料与方法

1.1材料

MPTP(美国Sigma公司)，TH单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)，藻蓝蛋白(中国海洋大学生命学院惠赠)。

1.2实验动物及分组

成年雄性8周龄小鼠，随机分为6组，每组15只，分别为正常对照组(A)、藻蓝蛋白对照组(B)、MPTP染毒组(C)、藻蓝蛋白低剂量保护组(D)、藻蓝蛋白中剂量保护组(E)。其中对照组(A)不给药，给予生理盐水，藻蓝蛋白对照组(B)给予藻蓝蛋白100mg/kg，MPTP染毒组(C)给予25mg/kg MPTP，藻蓝蛋白低剂量保护组(D)给予藻蓝蛋白50mg/kg+MPTP 25mg/kg，藻蓝蛋白中剂量保护组(E)给予藻蓝蛋白100mg/kg+MPTP 25mg/kg，藻蓝蛋白高剂量保护组(F)给予藻蓝蛋白200mg/kg+MPTP 25mg/kg。

1.3统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量资料实验数据均以x±s进行表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One WayANOVA)。进一步进行组间两两比较时，若方差齐时，采用SNK检验；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。计数资料实验数据均以率表示，组间两两比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2方法与结果

帕金森小鼠模型组按照25mg/kg体重的剂量每天给与MPTP腹腔注射，连续5天，在MPTP造模前5天开始藻蓝蛋白给药，藻蓝蛋白采用灌胃方式进行给药，给药剂量为10ml/kg，连续15天，每天1次，对照组给予等量生理盐水，注射结束5天后，检测运动能力后(转棒实验检测)，牺牲小鼠，取中脑腹内侧组织，免疫荧光检测检测黑质神经元死亡情况。结果如表3和表4所示。

表3藻蓝蛋白对MPTP致黑质多巴胺神经元存活率下降的保护作用(n＝5)

注：与A组比较：*P<0.05，与C组比较：△P<0.05。

表3可见，与正常对照组(A)相比，MPTP染毒组(C)小鼠黑质多巴胺神经元存活率下降，差异有统计学意义(P<0.05)。藻蓝蛋白保护组能抑制MPTP染毒引起的小鼠黑质多巴胺神经元存活率下降，以藻蓝蛋白高剂量保护组(F)作用最显著。

表4藻蓝蛋白对MPTP致小鼠运动能力下降的保护作用(n＝15)

注：与A组比较：*P<0.05，与C组比较：△P<0.05。

表4可见，与正常对照组(A)相比，MPTP染毒组(C)小鼠的运动能力下降，在转棒上的运动时间减少，差异有统计学意义(P<0.05)。藻蓝蛋白保护组能抑制MPTP染毒组引起的小鼠运动能力下降，以藻蓝蛋白高剂量保护组(F)作用最显著，藻蓝蛋白高剂量保护组(F)小鼠在转棒上的运动时间，与MPTP染毒组(C)相比有显著差异(P<0.05)，与正常对照组(A)相比，没有显著差异(P>0.05)。

从以上各实验例可以看出，藻蓝蛋白能抑制MPP⁺/MPTP所致的神经元存活率下降和运动能力下降及氧化损伤增加，有较好的剂量依赖性，藻蓝蛋白对MPP⁺/MPTP所致神经毒性具有良好的抑制作用。藻蓝蛋白能抑制MPP⁺/MPTP所致的帕金森病症状，可用于制备防治帕金森病的药物。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案以及试验例对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，所属领域的普通技术人员可以对之作一些修改和改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上，所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.藻蓝蛋白在制备防治帕金森病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于预防或治疗帕金森病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于治疗或预防帕金森病时神经元的死亡和运动功能障碍。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述藻蓝蛋白作为有效成分的制剂为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂。