KR100378323B1

KR100378323B1 - 항정신병 치료제로 유효한 폴리갈라사포닌계 화합물

Info

Publication number: KR100378323B1
Application number: KR10-1999-0014356A
Authority: KR
Inventors: 김용식; 박주배; 안종석; 이현선; 정인원; 신철진; 오원근; 김시경; 강웅구; 홍성민
Original assignee: 한국과학기술연구원; 김용식; 박주배; 정인원
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2003-03-29
Also published as: KR20000066933A; WO2000064463A1

Abstract

본 발명은 항정신병 치료제로 유효한 폴리갈라사포닌계 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 원지(Polygalae Radix) 추출물로부터 분리 분획된 것으로 기존 항정신병 약물의 행동 약리학적 특성인 아포모르핀(apomorphine)에 의하여 유발된 상동적 행동(stereotyped behaviors)과 등반 행동(climbing behaviors)을 억제하는 활성을 가지는 폴리갈라사포닌계 화합물의 항정신병 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

항정신병 치료제로 유효한 폴리갈라사포닌계 화합물{Polygalasaponins effective against antipsychotic treatment}

현대 정신 의학의 신경 약물학 분야에서는 정신분열증 등 주요 정신 장애의 원인을 규명하기 위하여 다양한 방법을 시도하고 있으나, 이를 규명하기가 용이하지 않으므로 일반적으로 경험적 또는 임상적으로 효과를 나타내는 의약품의 작용 기전을 밝히는 것을 중심으로 발전해 왔다. 예를들면 정신병의 약물치료에 획기적 전기를 마련한 클로로프로마진(chloropromazine) 또는 할로페리돌(haloperidol)의 경우, 도파민-2 수용체에 대한 친화력을 지니고 있어 신경 전달 물질인 도파민과의 결합을 방해하는 것으로 알려져 있다[Carlsson A and Lindqvist M (1963), Effect of chlorpromazine or haloperidol on formation of 3-methoxytyramine and normetanephrine in mouse brain, Acta Pharmacol Toxicol 20, 140∼144; Perry P.J, Miller DD, Arndt SV, and Cadoret RJ (1991), Clozapine and norclozapine plasma concentrations and clinical response of treatment-refractory schizophrenic patients, Am J Psychiatry 148, 231∼236]. 도파민은 중추신경계에서 신경전달물질(neutrotransmitter)로서 작용하는 것으로 노르-에피네프린의 중간 산물이며, 이들이 수용체와 결합하여 세포내의 인산화 작용과 함께 중추신경계에 자극을 전달하게 된다.

정신병의 도파민 가설과 관련한 동물 모형들로는 도파민 효현제의 투여에 의하여 유발된 항진 행동 모형이 기본적이다. 이때, 효현제로는 아페타민(amphetamine), 아포모르핀(apomorphine) 및 코카인(cocaine) 등이 사용되고, 유발된 항진 행동에는 상동적 행동(stereotypy), 등반 행동(climbing), 회전(rotation), 반복(repetition) 등이 있다. 이외에도 세로토닌이나 펜시클리딘(PCP, phencyclidine) 등의 신경 전달 물질이나 정신 활성제에 의한 동물 모형들이 제시되고는 있으나, 기본적으로는 도파민 차단 효과가 항정신병 약물의 필수적인 기능으로 인정되고 있다. 그러나, 이들 약물들은 아직까지는 정신 장애의 다양한 증상을 치료하는데 있어서 불충분한 임상적 효과와 많은 부작용 등의 한계를 극복하고 있지 못하는 형편에 있다.

또다른 항정신병 약물로서 비정형 항정신병 약물 예를들면 클로자핀(clozapine), 리스페리돈(risperidone) 및 올란자핀(olanzapine) 등이 최근 정신과 임상에서 주로 사용되고 있다. 상기한 비정형 항정신병 약물은 종래의 항정신병 약물과는 달리 도파민 이외의 세로토닌 또는 노르에피네프린 등과 같은 다른 신경 전달물질의 수용체에 대해서도 친화력을 지니고 있어 이들 물질의 조절에 관여하여 임상적으로 월등히 우수한 효과를 나타낸다. 그러나, 이러한 비정형 항정신병 약물 역시 부작용이나 임상 효과의 한계 등으로 인하여 아직까지는 바람직하지 않은 면이 있다.

따라서, 정신분열증 치료를 위한 보다 개선된 방법을 찾기 위해서는 기본적으로 도파민계 항진과정과 밀접한 관련을 갖고 있으면서, 정신분열증의 다양한 병리 과정에 영향을 미치는 새로운 개념의 원인론적 접근이 필요하며, 이에 따른 새로운 유효 활성 성분의 약제 개발이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러가지 방법론 중에서도, 기존 약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통 의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높다[Baldessarini RJ (1985), Chemotherapy in Psychiatry. Massachusetts, Harvard University Press; Evans WC (1989), Trease and Evans' Pharmacognosy. London, Bailliere Tindall, pp. 685∼696; Farnsworth NR (1993), Ethnopharmacology and future drug development, the North American experience. J Ethnopharmacol 38, 145∼152; Hikino H (1989), Oriental Drugs. In, Trease and Evans' Pharmacognosy. Ed by Evans WC, London, Bailliere Tindall, pp. 726∼738].

우리 나라에서는 동의보감을 비롯한 많은 한방의학(韓方醫學) 서적에서 정신 장애가 기술되어 있으며, 정신장애의 치료에 천연물 약제가 주재료로 사용되고 있다.

본 발명의 발명자들은 이전 연구를 통하여 우리 나라의 전통 의학에서 정신병의 치료에 사용되고 있는 약제들을 대상으로 하여 중추신경계 수용체 친화력을 방사선 리간드 수용체 결합 실험을 통하여 검색하였고, 이 결과 도파민-2 수용체에 원지(Polygalae Radix)가 친화력과 함께 용량-반응 곡선을 나타냄을 밝힌 바 있다[자연산물 정신병약제의 dopamine-2 및 serotonin-2 수용체결합, 신경정신의학 31, 856∼868, 정인원 등 1992].

또한, 본 발명의 발명자들은 원지(Polygalae Radix)의 일차 추출물에는 생쥐에서 아포모르핀(apomorphine)으로 유발된 상동적 행동을 억제하는 활성 물질이 존재함을 밝혀내었고, 이에 대하여 특허출원한 바도 있다[대한민국특허출원 제98-7390호]. 본 출원인이 기출원한 바 있는 대한민국특허출원 제98-7390호에는 상기 원지로부터 다양한 정신장애 치료에 유용한 유효 성분을 가장 활성이 우수한 조건으로 추출하는 방법과, 이로부터 추출된 원지 추출물을 함유한 항정신병 의약품으로서 사용 가능한 생약 조성물에 대하여 상세하게 기술되어 있다. 그러나, 대한민국특허출원 제98-7390호에서 수득한 원지(Polygalae Radix)의 일차 추출물은 다양한 성분의 복합체로서 보다 단일한 활성 성분을 동정하는 과정이 필요하다.

이에 본 발명에서는 원지(Polygalae Radix)의 일차 추출물을 대상으로 행동 약리학적 방법론인 아포모르핀으로 유발된 생쥐의 상동적 행동 및 등반 행동을 억제하는 정도를 비교하는 실험을 시행하였고, 그 결과 행동 약리학적 모델에서 특히 활성을 보이는 단일 분획을 원지(Polygalae Radix)의 일차 추출물로부터 획득할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 아포모르핀(apomorphine)에 의하여 유발된 상동적 행동(stereotyped behaviors)과 등반 행동(climbing behaviors)을 억제하는 항정신병 약물으로서의 폴리갈라사포닌계 화합물과 이를 원지(Polygalae Radix)로부터 추출 분리하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 원지로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물이 생쥐에서 아포모르핀(apomorphine)으로 유발된 상동적 행동을 억제하는 정도를 용량에 따라 각 시점별로 대조군과 비교한 것이다.

도 2는 원지로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물이 생쥐에서 아포모르핀으로 유발된 상동적 행동을 억제하는 정도를 전체 총점으로 비교한 것이다.

도 3은 원지로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물이 생쥐에서 아포모르핀으로 유발된 등반 행동을 억제하는 정도를 용량에 따라 대조군과 비교한 것이다.

도 4는 원지로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물이 생쥐에서 아포모르핀으로 유발된 등반 행동을 억제하는 정도를 용량에 따라 전체 총점으로 비교한 것이다.

도 5는 생쥐에서 아포모르핀으로 유발된 등반 행동의 억제 정도와 원지로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물 투여용량간의 상관관계를 나타낸 것이다.

본 발명은 항정신병 약물로 유용한 다음 화학식 1로 표시되는 폴리갈라사포닌계 화합물을 그 특징으로 한다. 또한, 본 발명은

1) 원지(Polygalae Radix)를 70 ∼ 230메쉬(mesh)로 분쇄한 후, 원지 함량 대비 3∼ 5배의 알콜 수용액을 사용하여 3회 용매 추출하는 단계와,

2) 상기 용매추출 단계에서 얻어진 여액을 70 ∼ 76 ㎝Hg 및 60 ∼ 70℃의 감압 승온 범위에서 증발 농축하는 단계와,

3) 상기 증발 농축 단계에서 얻어진 농축액을 10배 부피비의 증류수에 현탁시킨 뒤, 재차 알콜 용매를 여액 함량 대비 1 ∼ 2배를 넣고 진탕하여 각각 동일 조건으로 3회 추출하여 알콜층 만을 별도로 분리하는 단계와,

4) 상기 알콜 분리 단계에서 층분리된 알콜 용매 분획을 70 ∼ 76 ㎝Hg 및 60 ∼ 70℃로 감압 농축하여 엑기스를 얻는 단계와,

5) 상기에서 얻어진 엑기스를 엑기스 총량의 50 ∼ 100배의 증류수로 현탁한 후 디아이온 HP-20 레진에 통과시켜 흡착시킨 뒤, 100% 메탄올으로 활성 물질을 유출시키고 농축하여 엑기스를 얻는 단계와,

6) 상기에서 얻어진 엑기스를 엑기스 총량의 50 ∼100배의 증류수로 2 ∼ 3회 공비 농축한 후 동량의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤, 동결 건조시켜분말 엑기스를 얻는 단계와,

7) 상기에서 얻어진 분말 엑기스를 에테르에 용해시켜 용해된 에테르 분획과 침전물로 분리시켜 침전물을 얻는 단계와,

8) 상기에서 얻어진 침전물을 증류수에 포화시킨 후, HP-20 수지에 통과시켜 활성 부위를 메탄올로 용출하고 이를 실리카겔에 흡착시킨 후, 에틸아세테이트/메탄올/물의 용출액을 이용하여 활성 물질을 용출하는 단계와, 그리고

9) 상기 활성 물질을 다시 실리카겔에 흡착시키고, 트리클로로메탄/메탄올/에탄올/10%-아세트산의 혼합용액을 용매로 하여 분획하는 단계가 포함되는 상기 화학식 1로 표시되는 항정신병성 폴리갈라사포닌계 화합물을 원지(Polygalae Radix)로부터 추출 분리하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 아포모르핀에 의하여 유발된 상동적 행동과 등반 행동을 억제하는 활성 성분으로서의 상기 화학식 1로 표시되는 폴리갈라사포닌계 화합물과 원지(Polygalae Radix)로부터 상기 폴리갈라사포닌계 화합물을 추출 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 폴리갈라사포닌계 화합물을 원지로부터 추출하기 위해서는 대한민국특허출원 제98-7390호에서 서술한 바 있는 원지의 일차 추출물을 디아이온 HP-20 칼럼크로마토그래피(Diaion HP-20 column chromatography), 실리카겔 칼럼크로마토그래피(Silica-gel coulumnchromatography)를 이용한다. 이후, 추가 확인은 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피(Sephadex LH-20 coulumn chromatography)을 사용하였다. 또한, 각 분리 단계마다 활성 분획을 추적하기 위하여 생쥐에서 아포모르핀(apomorphine)투여로 유발된 상동적 행동(stereotyped behavior)을 억제하는 정도를 측정하여 가장 강한 활성을 보이는 분획을 추적하였다. 또한, 최종적으로 도출된 상기 화학식 1로 표시되는 폴리갈라사포닌계 화합물을 대상으로 생체내 활성도를 재확인하기 위하여, 아포모르핀으로 유발된 생쥐의 등반 행동을 억제하는 정도를 추적하는 실험을 시행하였으며, 그 결과 상동적 행동의 억제와 동일한 결과를 보임과 동시에 용량-반응 효과도 관찰되었다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 폴리갈라사포닌계 화합물을 원지(Polygalae Radix)로부터 추출 분리하는 방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

우선, 1)단계 방법으로서 원지(Polygalae Radix)를 잘게 분쇄한 후 메탄올 등의 알콜 수용액을 넣고 3회 용매 추출한다. 용매 추출은 3회 수행했을 때 가장 추출 효율이 좋게 나타났으며, 4회 이상의 다단계 추출은 경제적이지 못한 것으로 판단된다. 추출에 사용되는 알콜 수용액의 사용량은 생약 원료인 원지 함량 대비 3 ∼ 5배가 적당한 바, 알콜 수용액의 사용량이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 유효 성분의 추출 효율이 떨어지고, 지나치게 많은 양을 사용하게 되면 다음의 정제 단계에서 사용되는 알콜 용매의 사용량이 많아져서 비경제적이며 취급상의 문제가 발생할 수 있어 바람직하지 않다. 또한, 원지는 추출 효율 등의 여러 공정을 고려하여 70 ∼230 메쉬(mesh) 크기로 분쇄하도록 한다.

다음의 2)단계에서는 상기 1)단계 과정에서 분리된 알콜 추출액을 70 ∼ 76 ㎝Hg 및 60 ∼ 70℃의 감압 및 승온 조건하에서 50 ∼ 60분 동안 증발 농축하여 추출액 내의 알콜을 제거한다. 본 발명이 상기와 같은 농축 조건을 만족시키지 못하는 경우, 알콜 추출액내에 알콜 성분이 필요 이상으로 잔존하게 되어 다음 단계에서 용매 분획의 어려움이 있는 등 많은 부작용이 발생한다.

다음의 3)단계에서는 상기 2)단계에서 분리한 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하기 위하여 증류수에 현탁시킨 후 알콜으로 추출한다. 즉, 여액을 10배 부피비 정도의 증류수에 현탁시킨 뒤, 재차 부탄올, 프로판올 등의 알콜 용매를 여액 함량 대비 1∼ 2배를 넣고 진탕하여 각각 동일 조건으로 3회 층분리를 실시하여 알콜층만의 용매 분획을 얻어 불순물을 정제한다. 이때, 사용되는 알콜의 사용량이 여액에 비하여 너무 적은 경우에는 상대적으로 극성이 강한 다당류 및 단백질 등의 불순물 혼입이 높아져 추출물내 유효 성분의 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못한 문제점이 있다.

다음의 4)단계에서는 상기 3)단계과정에서 얻은 알콜 용매 분획을 70 ∼ 76 ㎝Hg 및 60 ∼ 70℃로 감압 농축하여 추출 용매로 사용된 알콜을 제거한다.

다음의 5)단계에서는 상기 농축과정 후에 얻어진 엑기스를 엑기스 총량의 50 ∼ 100배의 증류수로 현탁시킨 후 디아이온 HP-20(Diaion HP-20) 레진에 통과시켜 흡착시킨 뒤, 100% 메탄올을 사용하여 활성 물질을 유출시켜 농축한다.

다음의 6)단계에서는 상기 5)단계에서 얻어진 엑기스를 엑기스 총량의 50 ∼ 100배의 증류수로 2 ∼ 3회 공비 농축하고, 동량의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 후, 동결건조시켜 분말 엑기스를 얻는다. 이와 같이 농축공정에서 증류수를 사용하여 공비 농축하는 이유는 얻어진 생약 추출물을 의약품 원료로 사용하기 위해 잔존하는 부탄올 등의 저급 알콜의 함량을 조절하고자 함이다. 또한, 농축공정을 통하여 얻은 원지 추출액을 동결 건조시킴으로써 분말 상태의 엑기스를 얻다. 이상의 공정을 통하여 얻은 분말 엑기스는 기존의 한약서에 수록된 원지로부터의 열수 추출하여 얻은 탕제보다 항정신병 약물로서의 효과가 보다 탁월한 것으로 나타났으며, 종래 사용되어 오던 할로페리돌 등과 비교할 때 최소한 동일한 약리 효과가 더욱 있음을 본 발명자들은 확인할 수 있었다.

다음의 7)단계에서는 분말 엑기스를 에테르에 용해시켜 용해된 에테르 분획과 침전물로 분리하였다. 에테르를 이용하여 침지한 결과, 침전물 부분에서 활성이 관찰되었으며 이는 사포닌계 화합물들이 보통 에테르상에서 침전되므로 이를 이용하여 활성부분을 보다 농축하기 위한 것이다.

다음의 8)단계에서는 7)단계에서 얻은 침전물을 증류수에 포화시킨 후, 디아이온 HP-20 수지에 통과시켜 활성 부위를 메탄올로 용출하고 이를 실리카겔에 흡착시킨 후, 에틸아세테이트/메탄올(5/1)의 용출액으로 비활성부분을 제거하였다. 활성물질의 용출은 에틸아세테이트/메탄올/물 용출액을 사용하였으며 이때, 에틸아세테이트/메탄올/물 용출액의 부피비는 1/1/0.1인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

마지막 과정으로서, 다음의 9)단계에서는 상기 활성 물질을 다시 실리카겔에흡착시키고, 트리클로로메탄/메탄올/에탄올/10%-아세트산 혼합용액을 용매로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 본 발명의 목적 물질인 폴리갈라사포닌계 화합물을 분리한다. 트리클로로메탄/메탄올/에탄올/10%-아세트산 혼합용액은 혼합시 두 개의 층으로 분획되며 본 발명에서는 아래층을 활성물질의 분리를 위한 분획용매로 사용하였다. 상기 트리클로로메탄/메탄올/에탄올/10%-아세트산 혼합용액의 부피비는 8/4/1/2인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

이상의 추출 분리공정에 의해 최종적으로 분리된 활성화합물은 상동적 행동과 등반 행동에 억제 효과가 있는 바, 따라서 본 발명은 원지추출물로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물이 유효약물로 함유된 항정신병 치료 중의 하나인 정신분열 및 망상성 장애를 포함하는 정신분열증 치료용 약제를 포함한다. 본 발명의 폴리갈라사포닌계 화합물이 상기한 바와 같은 약효를 갖을 수 있었던 것은 도파민 뿐만 아니라 세로토닌이나 노르에피네프린 등과 같은 신경전달물질(neutrotransmitter)의 수용체에 대한 친화력을 지니고 있어 자극에 대한 중추 신경으로의 신경 전달 조절에 관여할 수 있게 되기 때문이다.

본 발명의 폴리갈라사포닌계 화합물을 임상적으로 이용시에는 약제학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다. 통상적인 담체를 상용하여 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를들면 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소적용할 수 있다.

본 발명의 폴리갈라사포닌계 화합물의 투여량은 일반적으로 성인에게 1일에 10 ∼ 500 ㎎, 바람직하게는 50 ∼ 300 ㎎의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 1회 내지는 6회 분할투여할 수 있다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 원지에서 일차 추출물의 분리

본 발명에서 사용된 원지는 충청북도 청주시 한약제 도매상에서 구입한 것으로, 주로 대원지를 대상으로 메탄올, 부탄올 등 유기용매를 사용하여 추출물을 분리하여 시료로 사용하였다. 대원지 500 g을 70 ∼ 230 메쉬 크기로 분쇄한 후 메탄올 2ℓ를 넣어 3회 용매 추출한 뒤, 감압하에서 증발 농축하여 메탄올 추출액을 제조하였다. 상기 메탄올 분획을 증발농축기 상에서 73 ㎝Hg 및 65℃의 조건으로 증발 농축한 뒤 10배의 증류수에 현탁화시키고, 동량의 부탄올을 넣고 진탕하여 3회 추출한 후 부탄올 층을 모았다. 그런 다음, 상기에서 층분리된 부탄올 분획을 73 ㎝Hg 및 65℃의 조건으로 감압 농축하여 엑기스를 얻고, 이 엑기스를 엑기스 총량의 100배의 증류수를 이용하여 현탁한 뒤 디아이온 HP-20 레진에 통과시켜 흡착시킨 뒤 70%의 메탄올을 사용하여 비활성 부분을 제거하였다. 이후 엑기스 총량의 10배의 메탄올을 사용하여 활성 물질을 유출시켜 농축하였다. 농축후 얻어진 엑기스는 엑기스 총량의 10배의 증류수로 3회 공비 농축하고 동량의증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤, 동결 건조시켜 분말 상태의 엑기스를 얻었다.

실시예 2 : 원지 일차 추출물로부터 최고 활성화합물의 분리

상기 실시예 1에서 얻어진 분말 엑기스(20 g)를 에테르(200 ㎖)에 용해시킨 다음, 에테르 분획과 침전물로 분리하였다. 분리된 침전물(17 g)을 증류수(170 ㎖)에 포화시킨 후, 디아이온 HP-20 수지에 통과시켜 활성 부위를 메탄올로 용출하고, 이를 실리카겔에 흡착시켰다. 실리카겔 흡착과정에서는 70 ∼ 230 메쉬의 실리카겔을 농축액의 4배량으로 흡착하였으며, 이때 실리카겔이 많거나 적으면 분리의 효율이 떨어진다. 그리고나서, 에틸아세테이트/메탄올/물=1/1/0.1(v/v/v)의 용출액을 이용하여 활성 물질을 용출하였다. 그런 다음, 상기 활성 물질을 다시 실리카겔에 흡착시키고 트리클로로메탄/메탄올/에탄올/10%-아세트산=8/4/1/2(아래상,v/v/v/v)을 용매로 하여 분획하여 활성화합물(150 mg)을 얻었다.

이후, 구조동정을 위하여 활성화합물들은 트리클로로메탄/메탄올=1/1을 전개용매로 하여 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피를 실시한후 구조동정을 위한 물질로 사용하였다.

실시예 3 : 구조 동정

상기 실시예 2에서 최종적으로 분리된 활성화합물을 트리클로로메탄/메탄올/에탄올/10%-아세트산=8/4/1/2(v/v/v/v) 전개용매에서 전개시켜 4개의 스팟(spot)을확인하였으며, 이들의 R_f값은 0.2 ∼ 0.4를 나타내었다.

각각의 분리된 4개의 활성화합물은 모두 흰색 분말이었고, 리베르만-부챠드(Libermann-Buchard) 반응에서 모두 양성이었다. IR-스펙트럼에서 수산기의 존재를 나타내는 3300 ∼ 3500 ㎚ 영역에서의 흡수 파장과 에스테르기의 존재를 알 수 있는 1730 ∼ 1750 ㎚ 영역에서의 흡수 파장 또한, 카르복실기와 이중 결합의 존재를 나타내는 피크를 1710 ㎚와 1635 ㎚에서 각각 확인하였다.

4개의 활성화합물 각각에 대한 UV-스펙트럼에서 232 ㎚, 312 ㎚ 영역에서 최대 흡수 파장을 나타내는 바, 이로써 이들 활성화합물은 모두 사포닌계 화합물임을 알 수 있었다. 사포닌(saponin)은 화학적으로 배당체(glycoside)라 부르는 화합물의 일종으로, 당부분(sugar, glycone)과 비 당부분(non-sugar, aglycone)으로 구성되어 있다. 사포닌의 비 당부분은 일반적으로 사포게닌(sapogenin)이라 부르며, 사포닌은 비 당부분의 골격 구조에 따라 트리테르페노이계 사포닌과 스테로이드계 사포닌 2가지로 구별된다.

본 발명이 원지 추출물로부터 얻은 사포닌은 대부분 트리테르페노이드계 화합물로서, 보통 C-2 위치에 수산기(OH)가 붙어있으며, C-3 및 C-28 위치는 당부분으로 치환되어 있기도 하다. C-3 및 C-28 위치에 치환되는 당부분으로는 일반적으로 글루코오즈(glucose), 크실로스(xylose), 아라비노즈(arabinose) 및 람노즈(rhamnose) 등의 당류가 에테르 결합을 하고 있으며, 이러한 원지 사포닌은 사쿠마(Sakuma)[Chem. Pharm. Bull, 29, 2431(1981)]등이 처음으로 분리하였고, 요시카와(Yoshikawa)[ibid, 43, 350(1995)]와 창(Zhang)[ibid, 44, 810(1996)] 등이 분리 보고하였다.

사포닌의 구조 동정은 당(sugar)의 치환 위치를 확인하기 의하여, 피리딘-d ₅용액내에서¹³C-NMR의 화학적 이동(chemical-shift) 값으로부터 추정하였다. 피리딘-d ₅용액내에서¹³C-NMR을 측정할 경우, 일반적으로 C-3 위치에 수산기(OH)가 결합될 때 76∼79 ppm의 화학적 이동값을 갖는데 반하여, C-3 위치의 수산기에 당(sugar)이 결합하게 되면 화학적 이동값(δ)은 저자장쪽으로 10 ppm 정도 이동하게 된다. 본 발명이 원지로부터 얻은 4개의 화합물은 모두 화학적 이동값이 85.9 ppm 근처이었는 바, 이로써 C-3 위치의 수산기가 당으로 치환되어 있음을 알 수 있었다.

이와 마찬가지로, C-4 위치의 화학적 이동값은 일반적으로 수산기가 결합되어 있지 않으면 17∼19 ppm, 수산기가 결합되면 66∼68 ppm, 당이 결합되면 77∼79 ppm 이다. 본 발명이 원지로부터 얻은 4개의 화합물의 경우 모두 21 ppm 근처에서 화학적 이동값을 갖는 것으로 보아 C-4 위치에는 당(sugar)이 치환되어 있지 않음을 알 수 있고, 또한 저자장쪽으로 2 ∼ 3 ppm 정도 이동된 것으로 미루어보아 카르복실산이 연결되어 있음을 알 수 있다.

한편, 본 발명이 원지로부터 얻은 4개의 화합물에 대한¹H-NMR 스펙트럼 분석결과, 특징적으로 나타나는 5개의 싱글렛(singlet) 메틸기를 0.79, 0.94, 1.13,1.57, 1.95 ppm에서 확인할 수 있었고, 5.79 ppm에서는 올레핀-프로톤(olefinic-proton) 피크를 확인할 수 있었다. 이는¹³C-NMR 스펙트럼 결과, 64.5 ppm에서의 메틸기의 카본 피크(carbon peak), 127 ppm 및 138 ppm 근처에서 나타나는 올레핀 카본 피크(olefinic carbon peak), 180.9 ppm 근처에서 나타나는 카르복실산 피크 및 176 ppm 근처의 C-28 위치에 에스테르 결합된 카본 피크로부터 확인할 수 있었다.

이상의 리베르만-부챠드 반응(Libermann-Buchard reaction), IR-스펙트럼, UV-스펙트럼,¹³C-NMR,¹H-NMR 등의 구조 동정 과정을 거친 결과, 본 발명이 원지로부터 추출 분리한 사포닌 계열의 물질은 상기 화학식 1로 표시되는 폴리갈라사포닌계 화합물임을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 경구투여용 정제의 제조

본 발명에서 원지로부터 분리 동정한 폴리갈라사포닌계 화합물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 제조하였다.

폴리갈라사포닌계 화합물(실시예 2) 100 mg

경질무수규산 10 mg

미세결정셀룰로오스 190 mg

스테아린산마그네슘 5 mg

전분글리콘산나트륨 60 mg

무수일산일수소칼슘 135 mg

실시예 5 : 주사제의 제조

본 발명에서 원지로부터 분리 동정한 폴리갈라사포닌계 화합물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

폴리갈라사포닌계 화합물(실시예 2) 100 mg

만니톨 180 mg

Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg

증류수 2974 mg

[원지 추출물의 행동 약리학적 실험]

실험예 1 : 아포모르핀(apomorphine)으로 유발된 상동적 행동의 억제

생쥐를 증류수와 폴리갈라사포닌계 화합물(실시예 2) 투여군으로 구분하고, 생쥐에 투여되는 실험 약물의 용량은 0.2 ㎖ 이하가 되도록 하였으며 추출 정도에 따라 1 ∼ 4 ㎎의 폴리갈라사포닌계 화합물을 아포모르핀을 투여하기 20분 전에 복강내 주사하였다. 실험 과정에서 시약 제조, 약물 투여 및 행동 평가는 서로 내용을 모르는 다른 검사자가 시행하였고, 특히 투여하는 주사기 내의 내용물을 확인할 수 없도록 모든 약물을 각각 1 ㎖용 주사기에 채우고 포장하여 행동 평가시 올 수 있는 편견을 제거하였다.

실험 약물 투여전에 실시한 생쥐의 행동량은 군간의 차이가 없었으며, 행동 평가는 히트리(Hitri) 등이 사용한 육안적 관찰 방법으로 아포모르핀의 복강내 주사 후, 각각의 생쥐를 옥수수 속대를 넣은 깨끗한 플라스틱 상자(28×20×15㎝)에 넣고 5분의 적응 기간을 둔 뒤 행동 관찰을 5분 간격으로 30초씩 실시하여 총 30분간 7회 연속 관찰하였다.

생쥐의 행동 관찰은 그루밍(grooming), 필로에렉션(piloerection), 테일레이징(tail raising), 스니핑(sniffing) 및 그나윙(gnawing) 등을 다음과 같이 점수화하여 각각 산출하였다: 전혀 보이지 않는 경우(0 점), 존재하나 지속적이지 않은 경우(1 점), 관찰 전 기간동안 보이는 경우(2 점). 합계를 산출하는 방식으로 해당 시간대의 점수로 구하였다. 그 결과는 다음 표 1 및 표 2, 그리고 도 1 및 도 2에 요약하여 나타내었다.

이상에서 알 수 있듯이, 모든 시점과 점수 총합 비교에서 본 발명이 원지로부터 얻은 폴리갈라사포닌계 화합물은 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 상동적 행동을 억제하고 있음을 알 수 있었으며 사후 검증 결과 각 시점에 따라 용량-반응 양상을 보이고 있었다.

실험예 2 : 아포모르핀으로 유발된 등반 행동의 억제

생쥐를 증류수와 폴리갈라사포닌계 화합물(실시예 2) 투여군으로 구분하고, 철망으로 만든 그물 상자(높이 13㎝, 직경 14㎝, 그물크기 3㎜)안에 약물을 투여한생쥐를 넣고 60분간의 적응 기간을 두었다. 생쥐에 투여되는 실험 약물의 용량은 0.2 ㎖ 이하가 되도록 하였으며, 추출 정도에 따라 1, 2, 3, 4 mg의 폴리갈라사포닌계 화합물을 아포모르핀을 투여하기 20분 전에 복강내 주사하였다. 실험 과정에서 시약 제조, 약물 투여 및 행동 평가는 서로 내용을 모르는 다른 검사자가 시행하였고, 특히 투여하는 주사기 내의 내용물을 확인할 수 없도록 모든 약물을 각각 1 ㎖용 주사기에 채우고 포장하여 행동 평가시 올 수 있는 편견을 제거하였다.

생쥐의 행동 평가는 무어(Moore) 등이 사용한 육안적 관찰 방법을 사용하여 아포모르핀 2.5 ㎎/㎏을 복강내 투여한 뒤 10분 후 부터 5분 간격으로 측정하여 다음과 같이 점수화하였다: 철망에 발을 전혀 올리지 않은 경우(0 점), 한발이 철망에 올라간 경우(1 점), 두발이 철망에 올라간 경우(2 점), 세발이 철망에 올라간 경우(3 점), 네발이 모두 철망에 올라간 경우(4 점). 해당 시간대의 점수 및 합계는 다음 표 3과 도 3, 도 4 및 도 5에 요약하여 나타내었다.

이상에서 알 수 있듯이, 집단간 점수 총합의 비교에서 상기 대조군은 18.4점으로 가장 높아 등반 행동을 나타내고 있음을 알 수 있으며, 폴리갈라사포닌계 화합물 0.05 ㎎/g 투여군, 0.1 ㎎/g 투여군, 0.15 ㎎/g 투여군, 0.2 ㎎/g 투여군 순으로 점수가 감소하고 있어 정도의 차이는 있지만 본 발명이 원지로부터 얻은 폴리갈라사포닌계 화합물은 아포모르핀이 유발한 등반 행동을 모두 억제하고 있음을 알 수 있다.

이러한 집단간의 총점의 차이는 도 2에 나타낸 바와 같이 통계적인 유의성을 보이고 있다(One-way ANOVA; F = 16.962, df = 4, p-value = 0.00). 또한 사후 검증에서 이러한 억제 정도는 대조군과 폴리갈라사포닌계 화합물 0.05 ㎎/g, 0.1 ㎎/g 투여군과 차이가 없었으나, 이 세 집단과 나머지 폴리갈라사포닌계 화합물 투여군 간에는 차이를 보여 폴리갈라사포닌계 화합물의 효과가 용량-반응 곡선을 보이고 있음을 알 수 있었다(post hoc test by Tukey HSD, α=0.05). 이를 확인하기 위하여 도 5와 같이 투여 폴리갈라사포닌계 화합물 용량과 등반 행동 점수간의 상관 분석을 시행하였으며, 통계적으로 유의한 상관성을 확인하였다(Spearman's correlation test, 상관계수=-0.757, p=0.000).

[독성 실험 결과]

본 발명이 원지로부터 얻은 폴리갈라사포닌계 화합물에 대한 독성을 알아보기 위하여, 폴리갈라사포닌계 화합물 1 ∼ 20 ㎎을 24마리의 생쥐에게 복강내 투여하여 행동 관찰 후 24시간 생존 여부를 확인하였다. 그 결과 20 ㎎을 투여한 6마리중 3마리가 생존하고 나머지 3마리는 희생당하였음을 알 수 있었다. 반면에, 20 ㎎ 미만의 용량을 투여한 생쥐의 경우는 모두 생존하였으며, 행동 관찰상 약물을 투여하지 않았던 생쥐와 비교하여 통계학상의 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 고려할 때, 생쥐에서 폴리갈라사포닌계 화합물의 대략적인 반수가 생존할 독성 용량(TD₅₀)은 20 mg(1 mg/g)으로 판단된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 원지로부터 추출 분리된 폴리갈라사포닌계 화합물은 중추신경계 도파민 수용체를 통하여 도파민의 작용을 억제하는 활성 성분으로서 항정신병 약물의 정신분열 및 망상성 장애를 포함하는 정신분열증 치료용 약제로 유용하다.

Claims

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원지(Polygalae Radix)를 알콜 수용액으로 용매 추출하여 원지 일차 추출물을 얻고, 상기에서 얻어진 원지 추출물을 디아이온 HP-20 칼럼크로마토그래피(CH₃OH 용출), 실리카겔 칼럼크로마토그래피(CH₃COOEt/CH₃OH/H₂O=1/1/0.1 용출) 및 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피(CHCl₃/CH₃OH=1/1 용출)를 순차적으로 수행하여 원지 분획물로 얻어지고,

- 리베르만-부챠드(Libermann-Buchard) 양성반응을 나타내고,

- R_f0.2 ∼ 0.4(CHCl₃/CH₃OH/EtOH/10%-CH₃COOH=8/4/1/2) 영역에서 분리되고,

- IR 분석에서 3300∼3500, 1730∼1750, 1710 및 1635 nm 영역에서 흡수 피 크가 관측되고,

- UV 흡수스펙트럼분석에서 232 ㎚, 312 ㎚ 영역에서 최대 흡수 파장을 나타내는 폴리갈라사포닌계 화합물이 유효약물로 포함되어 있으며,

도파민 수용체를 통한 도파민의 작용을 억제하는 기능을 발현하여 아포모르핀에 의해 유발된 상동적 행동과 등반 행동을 억제하는 항정신병 치료에 유효한 것임을 특징으로 하는 정신분열증, 분열형 또는 망상형 장애를 포함하는 정신분열증 치료용 약제.