CN113219120B - 基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法 - Google Patents

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CN113219120B CN202110685043.8A CN202110685043A CN113219120B CN 113219120 B CN113219120 B CN 113219120B CN 202110685043 A CN202110685043 A CN 202110685043A CN 113219120 B CN113219120 B CN 113219120B
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Abstract

本发明属于中药薄层分析领域，具体涉及一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法。该远志薄层色谱定性分析方法包括样品溶液点样、展开、晾干、薄层色谱图像采集、结果自动分析等操作。其中薄层色谱结果自动分析操作包括薄层板图像处理、量取色度值、颜色格式转换、数据分析等操作。通过软件设置实现对色谱图像按展开条带划分自动量取色度值，转化得到所需要的颜色代码；再对所得数据进行相似度分析、聚类分析及主成分分析等数据分析。本发明针结果分析准确、客观，不局限于人眼观察分辨能力影响的基于颜色处理技术的薄层色谱定性分析方法，使远志质量评价结果更准确。

Description

基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法
技术领域
本发明属于中药薄层分析领域，具体涉及一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法。
背景技术
目前，中药市场上经常出现代用品、伪品或掺杂等现象，严重危害用药安全。提高中药质量标准、完善中药质量评价方法是中医药行业发展亟待解决的问题，影响着中药材产收、加工、销售、使用等各个领域。中药质量标准需要更全面、更准确，结果分析评价更客观直接。
薄层色谱法是将固定相材料均匀涂布于平面基片上，待点样、展开后，根据比移值对比进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。是一种快速分离、分析混合样品的中药质量评价技术，广泛应用于药物检测、质量评价分析等方面。
远志药材成分复杂，对分离条件要求较高，现有薄层色谱法的评价标准多是对3,6′- 二芥子酰基蔗糖、远志酮Ⅲ、细叶远志皂苷等指标成分的定性鉴别，未能实现多种成分信息同时评价。而且薄层色谱结果分析多采用色谱斑点直接对比，受限于人眼色彩分辨能力，灵敏度、客观性较差，重现性不佳。
发明内容
本发明针对现有远志质量评价技术存在的缺陷，提出一种结果分析准确、客观，不局限于人眼观察分辨能力影响的基于颜色自动分析处理技术的薄层色谱定性分析方法，使远志质量评价结果更准确。
基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，包括以下步骤：
步骤1、制备供试品溶液：取远志供试药材粉末0.2-2.0g，加入一定浓度的甲醇、乙醇溶液 10-50ml，超声处理10-60min，滤过，蒸干，加甲醇0.5-2ml溶解，作为远志供试品溶液。
步骤2、制备对照药材溶液：取远志对照药材粉末末0.2-2.0g，加入一定浓度的甲醇、乙醇溶液10-50ml，超声处理10-60min，滤过，蒸干，加甲醇0.5-2ml溶解，作为远志对照药材溶液。
步骤3、薄层色谱试验：分别吸取供试品溶液0.5-10μl和对照药材溶液0.5-10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以一定体积比的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，置366nm紫外光灯下进行观察，数字图像保存备用。
步骤4、采用图片分析软件打开保存后的数字图像，将薄层板上各样品的斑点条带按照斑点宽度等分为五份，取中间3份为条带色度分析样本。
步骤5、进行按坐标自动采集色度的脚本软件编写操作，固定薄层色谱图片、色度分析软件和结果输出文档的位置，并用编写软件实现某坐标点位色度的自动采集。
步骤6、对薄层色谱图片上各样品色谱条带上各点进行自动量取色度操作，并在文档中按照不同取色坐标位置输出各样品点16进制颜色值。
步骤7、通过颜色转化软件，将各样品点的16进制颜色值转换为Lab色值。
步骤8、将得到各个样品点的Lab色值通过公式总色值进行计算，求出各个样品条带上不同坐标点的总色值E。
步骤9、计算步骤7得到的各个样品的3份样本色谱条带上同高度的三个斑点总色值 E的平均值，作为该高度斑点的总色值，计算不同条带上不同高度各斑点的总色值，得到薄层板上不同条带的不同坐标位置的色度值，即得整张薄层板所有样品色谱条带的整体色度值数据。
步骤10、采用数据分析软件，对整张薄层板所有条带色度值数据进行相关性分析，得到各样品间相关系数。
步骤11、根据各样品间的相关系数，与标准药材相关系数大于某阈值的判定为远志正品。
步骤12、按照与对照药材的相关系数大小情况进行分级。
步骤13、采用数据分析软件，对整张薄层板所有条带色度值数据进行聚类分析，通过各个样品之间距离值进一步进行远志药材分类评价。
步骤14、采用数据分析软件，对各个条带取色样品点数据进行聚类分析，通过样品点之间距离，将薄层板斑点位置进行区域划分，分析影响远志药材质量的色谱斑点区域情况。
步骤15、根据步骤14的区域划分结果，对各个区域进行主成分综合评分计算，可以得出影响相似度结果的具体关键区域。
进一步地，所述步骤3中所述三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为(5-20):(20-50):(10-30):(5-20)。
进一步地，所述步骤4中图片分析软件为美图秀秀、Photoshop、Picasa、JPEGView等，优选Photoshop软件。
进一步地，所述步骤7中颜色转化软件，可以是颜色转换器、Color Tell颜色转换工具、Colorhexa颜色转换工具等。
进一步地，所述步骤8中总色值公式为E＝(L2+a2+b2)0.5。
进一步地，所述步骤10、13、14中数据分析软件为State统计软件、SPSS、SAS、Minitab、BMDP统计软件等，优选SPSS软件。
进一步地，所述步骤12中分级为：相关系数在0.930以上为一等，相关系数在0.870-0.930之间为第二等，相关系数在0.80-0.87之间为第三等。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
本发明针对现有远志药材的薄层色谱评价技术存在的缺陷，提出一种结果分析准确、客观、基于颜色自动分析处理技术的薄层色谱定性分析方法，使远志质量评价结果更全面、准确、客观。颜色自动分析处理能够克服人眼对相近颜色识别误差，提高薄层斑点鉴别能力，特别适于条带数目多，斑点复杂的中药材薄层鉴别，能够提高分析灵敏度。采用聚类分析方法对薄层板进行定性分析评价，以各样品条带间整体相似度作为判别依据，对各个样品条带进行等级划分，更准确全面。采用主成分分析方法对样品条带的主要特征区域进行划分，得出影响样品聚类分析结果的主要区域，有助于远志的薄层鉴别特征对照分析。
附图说明
图1步骤5中进行按坐标自动采集色度的脚本软件编写操作示例图。脚本软件编写，设置操作位置、调用取色软件、自动取色操作的代码。
图2图像处理软件，采用图像处理，将图片按照条带个数及展开高度进行取色区域的划分。
图3屏幕取色软件，通过单击左上方的屏幕取色，自动复制左下方的颜色16进制代码。
图4颜色格式转换，将所复制的16进制颜色代码转换成Lab颜色格式，方便运算及分析。
图5通过固定屏幕上各个软件的位置，使用图1脚本软件对各个软件进行屏幕坐标定位，在输入至脚本中，正确运行脚本，实现自动取色。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1。
基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，包括以下步骤：
步骤1、制备供试品溶液：取远志供试药材粉末0.5g，加入70％的甲醇25ml，超声处理 30min，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为远志供试品溶液。
步骤2、制备对照药材溶液：取远志对照药材粉末0.5g，加入70％的甲醇25ml，超声处理30min，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为远志对照药材溶液。
步骤3、薄层色谱试验：分别吸取供试品溶液3μl和对照药材溶液3μl，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:40:22:10的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水冷冻后的下层溶液为展开剂，展开，展距在15cm以上，取出，晾干，置366nm紫外光灯下进行观察，数字图像保存备用。
步骤4、对保存后的数字图像采用Photoshop图片分析软件打开，将斑点条带按照点样宽度等分五份，取中间3值为条带取色样本。
步骤5、按照图5的方式，对各个软件在屏幕上的位置进行固定，使用脚本软件对各个软件的位置进行坐标采集。
步骤6、对展开条带上各个色谱斑点按步骤4的划分在软件中输入坐标，运行脚本进行自动取色，并在文档中按照不同取色高度输出各样品点16进制颜色值。
步骤7、通过Color Tell颜色转换工具软件将步骤6的16进制颜色值转换为Lab色值。
表1条带部分取色点Lab色值表。
Figure BDA0003124289560000041
Figure BDA0003124289560000051
步骤8、将得到各个样品点的Lab色值通过公式总色值E＝(L2+a2+b2)0.5进行计算，求出各个样品点不同取色高度的总色值E。
表2条带部分取色点总色值表。
Figure BDA0003124289560000052
步骤9、将步骤8得到的总色值E，求出对应高度三个总色值E的平均值，代表该条带在此高度下的色值。
表3条带取样点平均总色值表。
Figure BDA0003124289560000053
Figure BDA0003124289560000061
步骤10、采用SPSS数据分析软件，对整张薄层板所有条带数据进行Spearman相关性分析，得到各十七份样品与对照药材的相关系数。
表4条带间相关系数示例表。
Figure BDA0003124289560000062
步骤11、根据各样品间的相关系数，与远志对照药材相关系数大于0.80的为远志正品。
步骤12、按照与对照药材的相关系数大小情况进行分级，相关系数在0.930以上的S3、S9、S10、S13为一等，相关系数在0.870-0.930之间的S1、S4、S6、S11、S12、S14、 S16为第二等，相关系数在0.830-0.870之间的S2、S5、S7、S8、S15、S17为第三等。
步骤13、采用SPSS数据分析软件，对整张薄层板所有条带数据进行聚类分析，通过各个样品之间距离进一步佐证远志药材分类。
步骤14、采用SPSS数据分析软件，对各个条带取色样品点数据进行聚类分析，通过样品点之间距离，将薄层板进行区域划分。
表5条带区域划分结果表。
Figure BDA0003124289560000071
步骤15、根据步骤14的区域划分结果，通过SPSS软件对各个区域进行主成分综合评分计算，结果示例见表6。
表6综合评分结果表。
Figure BDA0003124289560000072
可以得出，影响相似度分析的主要区域为第七区域，其次为第五、第六区域。
对该方法进行精密度考查，在相同位置，使用相同方法检测同一张图片，每次检测前均重新对像素点进行定位。以6次测定结果的RSD为评价指标，考查方法的精密度和结果稳定性，结果各被检测条带RSD(n＝6)为0.27％、0.91％、0.37％、0.71％、0.36％、 1.42％，表明精密度良好。
实施例2。
基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，包括以下步骤：
步骤1、制备供试品溶液：取远志供试药材粉末1.5g，加入70％的乙醇25ml，超声处理30min，滤过，蒸干，加甲醇2ml溶解，作为远志供试品溶液。
步骤2、制备对照药材溶液：取远志对照药材粉末0.5g，加入70％的甲醇25ml，超声处理30min，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为远志对照药材溶液。
步骤3、薄层色谱试验：分别吸取供试品溶液3μl和对照药材溶液3μl，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为12:36:20:12的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水冷冻后的下层溶液为展开剂，展开，展距在15cm以上，取出，晾干，置366nm紫外光灯下进行观察，数字图像保存备用。
步骤4、对保存后的数字图像采用Photoshop图片分析软件打开，将斑点条带按照点样宽度等分五份，取中间3值为条带取色样本。
步骤5、按照图5的方式，对各个软件在屏幕上的位置进行固定，使用脚本软件对各个软件的位置进行坐标采集。
步骤6、对展开条带上各个色谱斑点按步骤4的划分在软件中输入坐标，运行脚本进行自动取色，并在文档中按照不同取色高度输出各样品点16进制颜色值。
步骤7、通过Color Tell颜色转换工具步骤6的16进制颜色值转换为Lab色值。
表7条带部分取色点Lab色值表。
Figure BDA0003124289560000081
步骤8、将得到各个样品点的Lab色值通过公式总色值E＝(L2+a2+b2)0.5进行计算，求出各个样品点不同取色高度的总色值E。
表8条带部分取色点总色值表。
Figure BDA0003124289560000091
步骤9、将步骤8得到的总色值E，求出对应高度三个总色值E的平均值，代表该条带在此高度下的色值。
表9条带取样点平均总色值表。
Figure BDA0003124289560000092
Figure BDA0003124289560000101
步骤10、采用SPSS数据分析软件，对整张薄层板所有条带数据进行Spearman相关性分析，得到十份样品的相关系数。
表10样品条带与对照药材条带间相关系数结果表。
Figure BDA0003124289560000102
步骤11、根据各样品间的相关系数，与远志对照药材相关系数大于0.80的为远志正品。
步骤12、按照与对照药材的相关系数大小情况进行分级，相关系数在0.860以上的S1、S4、S8为一等，相关系数在0.820-0.860之间的S3、S6、S9为第二等，相关系数在 0.800-0.820之间的S2、S7、S8为第三等。
步骤13、采用SPSS数据分析软件，对整张薄层板所有条带取样点的总色值E进行聚类分析，通过各个样品条带之间距离进一步佐证步骤12远志药材分类。
步骤14、采用SPSS数据分析软件，对各个条带取色样品点总色值E进行聚类分析，根据各个条带取色样品点之间聚类距离，对薄层板进行区域划分。
表11条带区域划分结果表。
Figure BDA0003124289560000111
步骤15、根据步骤14的区域划分结果，通过SPSS软件对各个区域进行主成分综合评分计算，可以得出影响相似度分析的主要区域为第五区域，其次为第四区域。
表12综合评分结果表。
Figure BDA0003124289560000112
对该方法进行精密度考查，在相同位置，使用相同方法检测同一张图片，每次检测前均重新对像素点进行定位。以6次测定结果的RSD为评价指标，考查方法的精密度和结果稳定性，结果各被检测条带RSD(n＝4)为0.59％、1.42％、0.84％、0.87％，表明精密度良好。
实施例3。
基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，包括以下步骤：
步骤1、制备供试品溶液：取远志供试药材粉末0.25g，加入50％的甲醇25ml，超声处理 30min，滤过，蒸干，加甲醇0.5ml溶解，作为远志供试品溶液。
步骤2、制备对照药材溶液：取远志对照药材粉末1.0g，加入50％的甲醇25ml，超声处理30min，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为远志对照药材溶液。
步骤3、薄层色谱试验：分别吸取供试品溶液3μl和对照药材溶液3μl，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为16:45:20:11的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水冷冻后的下层溶液为展开剂，展开，展距在15cm以上，取出，晾干，置366nm紫外光灯下进行观察，数字图像保存备用。
步骤4、对保存后的数字图像采用Photoshop图片分析软件打开，将斑点条带按照点样宽度等分五份，取中间3值为条带取色样本。
步骤5、按照图5的方式，对各个软件在屏幕上的位置进行固定，使用脚本软件对各个软件的位置进行坐标采集。
步骤6、对展开条带上各个色谱斑点按步骤4的划分在软件中输入坐标，运行脚本进行自动取色，并在文档中按照不同取色高度输出各样品点16进制颜色值。
步骤7、通过Color Tell颜色转换工具步骤6的16进制颜色值转换为Lab色值。
表13条带部分取色点Lab色值结果表。
Figure BDA0003124289560000121
步骤8、将得到各个样品点的Lab色值通过公式总色值E＝(L2+a2+b2)0.5进行计算，求出各个样品点不同取色高度的总色值E。
表14条带部分取色点总色值结果表。
Figure BDA0003124289560000122
Figure BDA0003124289560000131
步骤9、将步骤8得到的总色值E，求出对应高度三个总色值E的平均值，代表该条带在此高度下的色值。
表15条带取样点平均总色值表。
Figure BDA0003124289560000132
步骤10、采用SPSS数据分析软件，对整张薄层板所有条带数据进行Spearman相关性分析，得到十份样品的相关系数。
表16条带间样品相关系数表。
Figure BDA0003124289560000141
步骤11、根据各样品间的相关系数，与远志对照药材相关系数大于0.80的为远志正品。
步骤12、按照与对照药材的相关系数大小情况进行分级，相关系数在0.920以上的S1、S4、S5为一等，相关系数在0.860-0.920之间的S3、S7、S8为第二等，相关系数在 0.800-0.860之间的S2、S6、S9为第三等。
步骤13、采用SPSS数据分析软件，对整张薄层板所有条带取样点的总色值E进行聚类分析，通过各个样品条带之间距离进一步佐证步骤12远志药材分类。
步骤14、采用SPSS数据分析软件，对各个条带取色样品点总色值E进行聚类分析，根据各个条带取色样品点之间聚类距离，对薄层板进行区域划分。
表17条带区域划分结果表。
Figure BDA0003124289560000142
步骤15、根据步骤14的区域划分结果，通过SPSS软件对各个区域进行主成分综合评分计算，可以得出影响相似度分析的主要区域为第七区域，其次为第三区域。
表18综合评分结果表。
Figure BDA0003124289560000143
对该方法进行精密度考查，在相同位置，使用相同方法检测同一张图片，每次检测前均重新对像素点进行定位。以6次测定结果的RSD为评价指标，考查方法的精密度和结果稳定性，结果各被检测条带RSD(n＝4)为0.72％、2.09％、0.93％、1.34％，表明精密度良好。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，包括以下步骤：
步骤1、制备供试品溶液：取远志供试药材粉末0.2-2.0g，加入甲醇、乙醇溶液10-50ml，超声处理10-60min，滤过，蒸干，加甲醇0.5-2ml溶解，作为远志供试品溶液；
步骤2、制备对照药材溶液：取远志对照药材粉末0.2-2.0g，加入甲醇、乙醇溶液10-50ml，超声处理10-60min，滤过，蒸干，加甲醇0.5-2ml溶解，作为远志对照药材溶液；
步骤3、薄层色谱试验：分别吸取供试品溶液0.5-10μl和对照药材溶液0.5-10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，置366nm紫外光灯下进行观察，数字图像保存备用；
步骤4、采用图片分析软件打开保存后的数字图像，将薄层板上各样品的斑点条带按照斑点宽度等分为五份，取中间3份为条带色度分析样本；
步骤5、进行按坐标自动采集色度的脚本软件编写操作，固定薄层色谱图片、色度分析软件和结果输出文档的位置，并用编写软件实现某坐标点位色度的自动采集；
步骤6、对薄层色谱图片上各样品色谱条带上各点进行自动量取色度操作，并在文档中按照不同取色坐标位置输出各样品点16进制颜色值；
步骤7、通过颜色转化软件，将各样品点的16进制颜色值转换为Lab色值；
步骤8、将得到各个样品点的Lab色值通过公式总色值进行计算，求出各个样品条带上不同坐标点的总色值E；
步骤9、计算步骤7得到的各个样品的3份样本色谱条带上同高度的三个斑点总色值E的平均值，作为该高度斑点的总色值，计算不同条带上不同高度各斑点的总色值，得到薄层板上不同条带的不同坐标位置的色度值，即得整张薄层板所有样品色谱条带的整体色度值数据；
步骤10、采用数据分析软件，对整张薄层板所有条带色度值数据进行相关性分析，得到各样品间相关系数；
步骤11、根据各样品间的相关系数，与标准药材相关系数大于阈值的判定为远志正品；
步骤12、按照与对照药材的相关系数大小情况进行分级；
步骤13、采用数据分析软件，对整张薄层板所有条带色度值数据进行聚类分析，通过各个样品之间距离值进一步进行远志药材分类评价；
步骤14、采用数据分析软件，对各个条带取色样品点数据进行聚类分析，通过样品点之间距离，将薄层板斑点位置进行区域划分，分析影响远志药材质量的色谱斑点区域情况；
步骤15、根据步骤14的区域划分结果，对各个区域进行主成分综合评分计算，可以得出影响相似度结果的具体关键区域。
2.如权利要求1所述的一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，其特征在于，所述步骤3中所述三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为（5-20）:（20-50）:（10-30）:（5-20）。
3.如权利要求1所述的一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，其特征在于，所述步骤4中图片分析软件为美图秀秀、Photoshop、Picasa、JPEGView中的一种。
4.如权利要求1所述的一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，其特征在于，所述步骤7中颜色转化软件，是颜色转换器、Color Tell颜色转换工具、Colorhexa颜色转换工具中的一种。
5.如权利要求1所述的一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，其特征在于，所述步骤8中总色值公式为E=(L2+a2+b2)0.5。
6.如权利要求1所述的一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，其特征在于，所述步骤10、13、14中数据分析软件为State统计软件、SPSS、SAS、Minitab、BMDP统计软件中的一种。
7.如权利要求1所述的一种基于颜色自动分析处理技术的远志薄层色谱定性分析方法，其特征在于，所述步骤12中分级为：相关系数在0.930以上为一等，相关系数在0.870-0.930之间为第二等，相关系数在0.80-0.87之间为第三等。
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