CN113466224B - 用于鉴别三叶青产地的阵列传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别三叶青产地的阵列传感器及其制备方法与应用。所述阵列传感器的制备方法包括：提供一系列不同pH值的包含化学染料的溶液作为检测液，其中所述化学染料包括酸碱染料、极性染料、氧化还原指示剂、染料‑络合剂中的任意两种或两种以上的组合；将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得用于鉴别三叶青产地的阵列传感器。本发明首次将比色阵列传感技术创新性地应用到三叶青产地的鉴别中，所制备的阵列传感器在鉴别三叶青产地时，速度快，只需要5‑10min；同时本发明提供的三叶青产地鉴别方法准确、高效、成本低。
Description
技术领域
本发明属于中草药产地鉴别领域，具体涉及一种用于鉴别三叶青产地的阵列传感器及其制备方法，以及所述阵列传感器在鉴别三叶青产地中的应用。
背景技术
三叶青是新“浙八味”道地药材之一。具有显著的抗炎退热、消肿散结、抗肿瘤等功效，被誉为“植物抗生素”。药材市场上三叶青主要来源于人工栽培，主产于浙江、福建、云南、贵州等地，受气候、土壤等条件不同的影响，不同产地三叶青差异较大。云贵等西南地区的三叶青块根较大，产量高，1-2年即可达到商品药材的要求，价格较低；浙江地区的三叶青生长缓慢，需3-5年才能达到商品药材的要求，产量低，价格较高。多项研究表明不同产区三叶青药材成分与品质均差异悬殊。郑军献等测定了10份不同产地三叶青样品，结果显示黄酮含量差异最大可达7倍。许文等定量测定30批不同产地三叶青中10种黄酮类成分，结果表明，各类成分含量差异悬殊，甚至有些批次中未检测出。浙江产区药材在解热、抑制肝癌细胞增殖的活性等方面都占有明显的优势。
当前对于三叶青产地的鉴别手段主要有感官检测与理化分析法。前者主要是依靠经验丰富的专业人员根据颜色、形状、气味等差异进行鉴别，该方法虽然操作简便，但易受主观条件及客观环境因素的干扰，其准确度有待提高。2015年版《浙江省中药材炮制规范》中仅采用醇溶性浸出物(不得少于7.5％)对三叶青进行质量控制。文献研究中则是通过测定缺乏专属性的成分含量来进行质量控制，如总黄酮、总多糖等粗放性指标；甚至选择胡萝卜苷、β-谷甾醇等在很多植物中均存在的甾体类成分。而作为尚未列入中国药典的地方用药品种，三叶青质量评价指标的研究尚不完善。因此，开发一种快速、准确的三叶青产地鉴别方法至关重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于鉴别三叶青产地的阵列传感器及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种用于鉴别三叶青产地的阵列传感器的制备方法，其包括：
提供一系列不同pH值的包含化学染料的溶液作为检测液，其中所述化学染料包括酸碱染料、极性染料、氧化还原指示剂、染料-络合剂中的任意两种或两种以上的组合；
以及，将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得用于鉴别三叶青产地的阵列传感器。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器。
本发明实施例还提供了前述的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器于鉴别三叶青产地中的用途。
本发明实施例还提供了一种三叶青产地的鉴别方法，其包括：采用前述的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器对待测三叶青进行检测，从而实现了对三叶青产地的鉴别。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次将比色阵列传感技术创新性地应用到多组分分析物三叶青的产地鉴别中；
(2)本发明制备的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器，三叶青的鉴别度快，只需要5-10min；
(3)本发明提供的三叶青产地鉴别方法操作简单，不需要复杂昂贵的仪器；
(4)本发明提供的三叶青产地鉴别方法准确、高效，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中构建的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器对三叶青产地鉴别的流程示意图；
图2是本发明一典型实施例中构建的三叶青的产地指纹图谱；
图3是本发明一典型实施例中构建的三叶青的产地HCA图谱。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
比色阵列传感技术是近年来出现的一种新型分析检测技术，该技术通过模拟人类或其它哺乳动物的嗅觉或味觉系统，采用多种具有强分子间相互作用和交叉响应能力的指示剂组成阵列，通过产生的特异性识别图案(pattem)或称为分子指纹(fingerprint)，可实现对多种分子结构、化学性质相近的单一组分分析物的识别和区分。该研究领域的代表主要是美国伊利诺伊大学香槟分校的Suslick教授，他提出了比色阵列传感器的概念，并将该技术应用到了对多种工业有毒气体、多种弱反应性有机挥发物、不同品牌和类型的软饮料等的识别区分中。近几年，比色阵列传感技术在复杂混合物的分析鉴别中也表现出了很高的应用潜力和价值，该技术已被成功应用于酒类、茶叶等的产地区分。因此，比色阵列传感技术在三叶青的产地鉴别分析中具有极大的应用潜力。
本发明实施例的一个方面提供了一种用于鉴别三叶青产地的阵列传感器的制备方法，其包括：
提供一系列不同pH值的包含化学染料的溶液作为检测液，其中所述化学染料包括酸碱染料、极性染料、氧化还原指示剂、染料-络合剂中的任意一种或两种以上的组合；
以及，将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得用于鉴别三叶青产地的阵列传感器。
在一些较为具体的实施方案中，所述化学染料包括酸碱染料、极性染料、氧化还原指示剂、染料-络合剂中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述化学染料包括茜素红、硝氮黄、尼罗红、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺、儿茶酚紫、铬黑T-Zn2+中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，将化学染料溶于一系列不同pH值的缓冲液中形成所述检测液。
在一些较为具体的实施方案中，所述检测液中化学染料的浓度为1～10μmmol/L。
在一些较为具体的实施方案中，所述pH值的范围为3～10。
在一些较为具体的实施方案中，所述各传感单元中检测液的体积为100～300μL。
在一些较为具体的实施方案中，所述传感单元包括96孔板，且不限于此。
进一步的，所述96孔板包括黑色微孔板、白色微孔板、全透明微孔板中的任意一种，且不限于此。
在一些更为具体的实施方案中，所述用于鉴别三叶青产地的阵列传感器的制备方法可以包括：
(1)将化学染料溶解在不同pH值条件下得到不同的检测液；
(2)将一定体积的步骤(1)得到的检测液加入96孔板中，得到用于鉴别三叶青产地的阵列传感器。
本发明中，三叶青提取液是一种混合成分，包含有机酸、黄酮类、酚类、胺类等，所以要针对这些成分选取可能会发生变色反应的化学染料，如有机酸类选酸碱指示剂；黄酮类可以选染料-金属离子组合(黄酮类可以与金属离子发生络合反应，将与金属离子络合的染料释放出来，体系颜色发生变化)；酚类可以选能引起其发生变色反应的指示剂；胺类选氧化还原指示剂，如：3，3′，5，5′-四甲基联苯胺；还有不同产地三叶青块根提取液极性不一样，可选用一些极性染料，如：尼罗红；最终用于构造阵列的化学染料涵盖上述两种或以上类型染料。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器于鉴别三叶青产地中的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种三叶青产地的鉴别方法，其包括：采用前述的用于鉴别三叶青产地的阵列传感器对待测三叶青进行检测，从而实现了对三叶青产地的鉴别。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别方法包括：
将一系列不同已知产地的三叶青的块根提取液分别加入所述阵列传感器的各传感单元并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取各混合反应体系的颜色变化并进行数字化处理，从而获得三叶青的产地指纹图谱及HCA图谱和/或PCA图谱；
以及，将待测三叶青的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化并进行数字化处理，之后与所述三叶青的产地指纹图谱及HCA图谱和/或PCA图谱进行对照，从而鉴别得到待测三叶青的产地。
本发明中，HCA是一种基于数据集中所有数据点对之间的相对距离对数据点进行聚类的方法，欧式距离通常用作数据点之间的距离度量，欧式距离度量计算具有N维(N是指传感单元的数量)的两个数据点之间的距离，最终把所有数据分裂到尽可能多的集群中。
PCA是通过将数据分解为特征向量和特征值来降低数据集的维数。特征值的大小表示数据中的方差，然后可以用主成分(PC)轴图形化地显示方差。当对PCA图进行可视化检查时，如果不仅可以检测到表示相同分析类的重复的数据点之间的紧密聚类，还可以检测到表示不同分析类的数据点之间的良好分离，表明对分析物的鉴别是成功的。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别方法具体包括：
(1)将一系列不同已知产地的三叶青的块根提取液分别加入所述阵列传感器的各传感单元并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取各混合反应体系的颜色变化；
(2)通过图像处理软件对步骤(1)中扫描仪读取的颜色变化进行数字化处理，得到不同传感单元前后图像对应的RGB值，将反应后图像的RGB值减去反应前图像的RGB值，提取差减图像的ΔR、ΔG和ΔB值，从而获得三叶青的产地指纹图谱；
(3)通过图像处理软件对步骤(1)中扫描仪读取的颜色变化进行数字化处理及化学计量分析，得到不同传感单元反应前后图像产生的3N维的差向量，其中，N是指传感单元的数量，之后采用层次聚类分析或主成分分析，从而获得HCA图谱和/或PCA图谱；
(4)将待测三叶青的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化，然后按照步骤(2)、(3)的处理方法进行处理，之后与所述三叶青的产地指纹图谱及HCA图谱和/或PCA图谱进行对照，从而鉴别得到待测三叶青的产地。
进一步的，所述图像处理软件包括Photoshop软件和/或ChemEye软件，且不限于此。
进一步的，所述化学计量分析采用的软件包括用多变量统计软件，且不限于此。
在一些更为具体的实施方案中，参见图1所示，所述三叶青产地的鉴别方法具体包括如下步骤：
(1)将前述的阵列传感器与不同产地三叶青块根提取液混合后，取一定体积置于96孔板中，所述阵列传感器上的传感单元与提取液反应后分别产生不同的颜色变化，利用平板扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之前”(对照组)和“之后”(实验组)的图像；
(2)利用ChemEye软件对步骤(1)中的扫描仪读取的颜色变化进行处理，从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地三叶青的响应差图(指纹图谱)；
(3)按照步骤(2)，“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化可以用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1，Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(4)按照步骤(3)的处理方法，采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，建立三叶青产地实验室判定标准；
(5)将待测样本与阵列传感器响应后的结果与步骤(2)中的指纹图谱和步骤(4)中的三叶青产地实验室判定标准进行对比，判断待测样本的产地来源。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1
(1)将尼罗红、硝氮黄、铬黑T-Zn2+分别溶解在pH＝5，7，9的缓冲液中得到9种浓度为10μM的检测液，取300μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与已知不同产地的三叶青块根提取液(产地包括：浙江、云南、贵州、广西、四川、福建、江西、湖南)混合后，取300μL混合液置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地三叶青的响应差图(指纹图谱)，建立三叶青指纹图谱库(如图2所示)；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1，Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，从而建立三叶青产地实验室判定标准(如图3所示)。
实施例2
(1)将茜素红、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺、儿茶酚紫分别溶解在pH＝5，9的缓冲液中得到6种浓度为10μM的检测液，取200μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与三叶青块根提取液混合后，取200μL混合液置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地三叶青的响应差图(指纹图谱)，建立三叶青指纹图谱库；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1，Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，建立三叶青产地实验室判定标准。
实施例3
(1)将茜素红、尼罗红、铬黑T-Zn2+分别溶解在pH＝5，7，9的缓冲液中得到9种浓度为1μM的检测液，取300μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与三叶青块根提取液混合后，取300μL混合液置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地三叶青的响应差图(指纹图谱)，建立三叶青指纹图谱库；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1，Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)或主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)，建立三叶青产地实验室判定标准。
实施例4
(1)将茜素红、尼罗红、铬黑T-Zn2+分别溶解在pH＝7，9的缓冲液中得到6种浓度为1μM的检测液，取100μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与三叶青块根提取液混合后，取100μL混合液置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入三叶青块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地三叶青的响应差图(指纹图谱)，建立三叶青指纹图谱库；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1，Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)或主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)，建立三叶青产地实验室判定标准。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种三叶青产地的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将化学染料溶于一系列不同pH值的缓冲液中形成检测液；其中，所述化学染料选自茜素红、硝氮黄、尼罗红、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、儿茶酚紫、铬黑T-Zn2+中的任意三种或三种以上的组合；所述检测液中化学染料的浓度为1~10μmol/L；所述pH值的范围为3~10；之后将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得用于鉴别三叶青产地的阵列传感器；
（2）将一系列不同已知产地的三叶青的块根提取液分别加入所述阵列传感器的各传感单元并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取各混合反应体系的颜色变化；
（3）通过图像处理软件对步骤（2）中扫描仪读取的颜色变化进行数字化处理，得到不同传感单元前后图像对应的RGB值，将反应后图像的RGB值减去反应前图像的RGB值，提取差减图像的ΔR、ΔG和ΔB值，从而获得三叶青的产地指纹图谱；
（4）通过图像处理软件对步骤（2）中扫描仪读取的颜色变化进行数字化处理及化学计量分析，得到不同传感单元反应前后图像产生的3N维的差向量，其中，N是指传感单元的数量，之后采用层次聚类分析或主成分分析，从而获得HCA图谱和/或PCA图谱；
（5）将待测三叶青的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化，然后按照步骤（3）、（4）的处理方法进行处理，之后与所述三叶青的产地指纹图谱及HCA图谱和/或PCA图谱进行对照，从而鉴别得到待测三叶青的产地。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于：所述图像处理软件选自Photoshop软件和/或ChemEye软件；所述化学计量分析采用的软件包括用多变量统计软件。
3.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于：所述各传感单元中检测液的体积为100~300μL。
4.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于：所述阵列传感器为96孔板；所述96孔板选自黑色微孔板、白色微孔板、全透明微孔板中的任意一种。
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