CN112730399A - 基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法 - Google Patents

基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米材料‑有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，通过引入6种纳米材料和3种染料构建纳米材料/染料复合比色传感阵列，再经提取反应前后阵列点RGB的变化值（ΔRGB）作为检测信号，并利用模式识别及径向基神经网络对数据进行处理，以探究阵列检测白酒性能。本发明对不同白酒具有较强的识别检测能力，将纳米材料和传统染料结合，提高了阵列的识别灵敏度，减少阵列点的个数，数据处理简单，具有操作简单，测试时间短，检测效率高，灵敏度好等优点，在白酒的现场实时检测方面具有较好的应用前景。

Description

基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法。
背景技术
白酒大部分由乙醇和水组成，微量组分仅占2%。由于白酒酿造微生物的多样性，在各种微生物的共同作用下，白酒中的这些风味成分众多，研究人员利用色谱以及色谱-质谱联用技术，从白酒中分离鉴定出1874种微量组分，浓度都较低，从ng/L到mg/L不等，同时在各种白酒中的含量和比例不同，从而构成了各种白酒的不同香型和风格。目前，已有一些常规方法用于不同品类和产地白酒的区别，如质谱技术和光谱技术；虽然光谱技术是一种简单、快速、无损的方法，但其灵敏度相对较低，容易在具有相似光谱区域的组分间产生干扰。而质谱技术成本高，操作较为复杂，很难在现场中实现实时检测。因此，开发一种简便、快速且有效的对不同白酒鉴别的方法对于白酒质量监控和真伪评价分析具有重要意义。
比色传感阵列作为一种方便、快捷的检测技术，广泛应用于各个领域。目前关于比色传感器阵列检测白酒的报道大多是基于有机染料与白酒之间的广谱反应，所产生的反应信号相对较低。随着纳米材料的兴起，纳米金银的优良性质愈发引起研究者的关注，如光学效应，纳米金、银微粒表面电子以一定频率震荡，当其与外界光波长频率接近或一致时会吸收此部分的光，根据“补色原理”而显现出互补颜色的光，震荡频率与粒子本身有着密切的联系，因此微粒尺寸的不同导致纳米金、银溶液颜色具有一定差异。此外，纳米金银在不同的聚集状态或形貌改变时表现出明显的吸收光谱红蓝移的特性，使其在特异性比色分析中有着得天独厚的优势。大量研究基于纳米金、银与目标分析物之间的交联和静电吸附作用导致聚集，使检测体系产生由红至蓝色或者黄至黑色梯度变化，通过采集这种灵敏的颜色变化可实现对分析物的鉴别甚至定量分析。但上述方法灵敏度不佳并且阵列点较多，操作繁琐。
发明内容
针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供基于纳米材料-有机染料比色传感阵列简便，快速，高效检测白酒的方法，解决现有的检测方法存在成本高，操作繁琐，耗时费力和设备大型化，导致难以现场实时监测等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，包括以下步骤：
1）将检测材料分别加到孔培养皿上的多个阵列点上构建比色传感阵列，所述检测材料分别为溴甲酚紫+NaOH、茜素红、茜素红+NaOH、QC-Au NPs、AA-Au NPs、4AA-Au NPs、MnO2 NSs、Ag NPs和GSH-Au NPs；
2）向构建好的比色传感阵列中分别加入不同种类的待测白酒样品进行反应；
3）获取比色传感检测阵列的比色指纹图谱；
4）根据比色指纹图谱采用模式识别方法进行区分和判别。
作为优选的，所述检测材料中的纳米材料采用以下方法制得：
S1：向柠檬酸三钠溶液中加入HAuCl4，加热至沸腾，当溶液从浅黄色变为酒红色后继续加热30min后停止，得到Au NPs；然后将GSH溶液与所述Au NPs按照等摩尔比混合均匀，再将其在黑暗条件下室温反应，即制得GSH包裹Au NPs溶液（GSH-Au NPs）；
S2：将 HAuCl4和AA 的混合物在100℃下剧烈搅拌，当溶液的颜色变成樱桃红，即得到抗坏血酸包覆Au NPs（AA-Au NPs）；
S3：在沸腾状态下将 HAuCl4溶液和QC的NaOH 溶液混合并剧烈搅拌，上述混合溶液颜色变为红色，终止反应，即得到槲皮素功能化的Au NPs (QC-Au NPs)；
S4：将HAuCl4加热煮沸后剧烈搅拌，然后迅速加入 4AA溶液继续加热，上述混合溶液由淡黄色变成深粉红色，即得到4-氨基烟酸包覆的Au NPs (4 AA-Au NPs)；
S5：将AgNO3缓慢滴入CPB中，在25°C条件下持续搅拌，然后加入NaBH4，直至混合溶液由无色变为黄棕色停止反应，即得到Ag NPs；
S6：将四甲基铵和H2O2加入MnCl2·4H2O的水溶液中，混合均匀，将得到的混合物悬浊液在室温下敞口搅拌过夜，然后离心弃上清液，收集黑色沉淀依次用甲醇和超纯水清洗干净，再复溶于超纯水中，并在细胞破碎仪中超声30min，即得到MnO2 NSs。
作为优选的，所述检测材料与白酒的体积比为1~5：2~5。
作为优选的，步骤2）所述反应的时间为3~5min。
作为优选的，所述检测材料中NaOH的浓度为0.005~0.02 M。
作为优选的，所述获取比色传感检测阵列的比色指纹图谱的方法包括：通过平板扫描仪捕获反应前后每个阵列点的高清图像，每个图像均清晰的显示分布均匀的阵列点，图像采集后，通过计算机对平板扫描仪采集的图像进行处理，选择每个阵列点RGB的变化值作为特征信号描述检测前后的化学变化。
作为优选的，所述模式识别方法包括：主成分分析、层序聚类分析、线性判别分析以及径向基函数神经网络分析。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过引入的纳米金、纳米银、二氧化锰纳米片等6种纳米材料与3种传统染料结合，构建纳米材料/染料复合传感阵列检测不同白酒（如图1），通过提取反应前后阵列点RGB的变化值（ΔRGB）作为检测信号，并利用模式识别及径向基神经网络对数据进行处理，以探究阵列检测白酒性能。结果表明，不同白酒具有特异性差谱图，通过肉眼观察即可对白酒进行区分。模式识别结果表明，阵列对不同白酒具有良好的分类识别能力，PCA和LDA结果显示在二维空间图中相同种类白酒平行样能聚集在一起，并与其他种类相互分开；HCA结果表明五组平行样本聚集在一起且没有产生错误分类，分类成功率达到100%。在模式识别基础上，通过RBFN确定预测样本与实际样本之间的拟合关系，结果表明预测与实际基本吻合，表明阵列可实现对酒样的识别。此外，在模式识别分析中，白酒样品按照酒精浓度被分为2组，神经网路分析也呈现出相同的结果，表明阵列对白酒检测主要受酒精度的影响。可见，该阵列可实现对未知酒样的预测，并且具有识别白酒酒精度的潜力。
2、本发明基于纳米材料-有机染料构建比色传感阵列，提供了一种简便的白酒检测方法，降低了检测成本，缩短了检测时间，提高了分析效率，通过模式识别技术与径向基函数神经网络相结合对数据进行深度挖掘，提高了白酒的分类识别准确率，本发明为实现白酒快速、高效、准确的现场实时检测提供了全新思路，有助于建立标准的白酒检验方法。
附图说明
图1为本发明比色传感阵列构造及检测流程示意图。
图2为本发明比色传感阵列实物图及紫外-可见吸收光谱图。
图3为本发明比色传感阵列对8种不同成品酒特异性差谱图。
图4为本发明比色传感阵列对8种不同白酒主成分分析累积方差柱状图。
图5为本发明比色传感阵列对8种不同白酒主成分分析散点图。
图6为本发明比色传感阵列对8种不同白酒聚类分析树状图。
图7为本发明比色传感阵列对8种不同白酒的线性判别分析散点图。
图8为本发明比色传感阵列的径向基神经网络模型分析；A为对不同类型白酒的判别结果，B为对不同酒精度白酒的判别结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，包括以下步骤：
（1）检测材料的合成
GSH-Au NPs的合成：在剧烈搅拌下，将5 mL柠檬酸三钠（170 mM）加入盛有90 mL超纯水的250 mL圆底烧瓶中，然后将5 mL HAuCl4（5 mM）快速加入烧瓶，加热至沸腾，当溶液从浅黄色变为酒红色后继续加热30min后停止，冷却至室温后，得到Au NPs。然后将GSH溶液(50 mM溶于50%体积分数的乙醇与水混合物中)用氮气冲洗45 min，再加入等量的Au NPs，在黑暗下室温反应12 h，得到GSH包覆的Au NPs (GSH-Au NPs)。
AA-Au NPs的合成：将4.5 mL HAuCl4 (0.1 mM)和0.5 mL AA (0.75 mM)的混合物在100℃下剧烈搅拌，当溶液的颜色变成樱桃红，得到抗坏血酸包覆Au NPs（AA-Au NPs）。
4 AA-Au NPs的合成：将4.5 mL HAuCl4(1mM)转移到50 mL圆底烧瓶，加热煮沸后剧烈搅拌10 min，再将0.25 mL 4AA溶液(5.0 mM)迅速加入烧瓶，继续煮25 min，直至溶液由淡黄色变成深粉红色，即得到4-氨基烟酸包覆的Au NPs (4 AA-Au NPs)。
QC-Au NPs的合成：将10 mL HAuCl4 (1m M)放入50 mL的圆底烧瓶中，然后将0.5mL QC (2 mM)溶于5 mL NaOH (1 mM)溶液。在沸腾状态下将两种溶液混合并剧烈搅拌15min，溶液颜色变为红色，终止反应并将溶液转移至蓝盖瓶，得到槲皮素功能化的Au NPs(QC-Au NPs)
Ag NPs的合成：首先5 mL将AgNO3（1 M）缓慢滴入2.5 mL CPB（0.1 M）中，在25°C条件下持续搅拌，然后将10 mL NaBH4（0.1M）添加到AgNO3和CPB的混合溶液中，直至溶液从无色变为黄棕色停止反应，得到Ag NPs。
MnO2 NSs合成：在15s内分别将12 mL四甲基铵（TMA，1.0 M）和2 mL H2O2（30%）加入到10mL 0.593g MnCl2·4H2O（99.99%）的水溶液中，混合均匀。混合物悬浊液在室温下敞口搅拌过夜，然后将所得溶液分装到离心管中，在10000 rpm下离心10 min，弃去上清液。将得到的黑色沉淀用甲醇清洗3次，然后用超纯水清洗3次，并将其复溶于超纯水中，在细胞破碎仪中超声30min，得到MnO2 NSs溶液。
（2）将染料、纳米材料与氢氧化钠按照表 1所示计量加入96孔板中，构建好的比色传感阵列，然后向阵列点中加入一定量的白酒样本，反应3 min后进行数据采集。在本实施例中以8种泸州老窖为例进行阵列检测性能评估，白酒具体信息如表2所示。
表1 阵列点物质成分组成
阵列点 染料或纳米材料（μL） 白酒（μL） NaOH用量（μL）
1-1 溴甲酚紫（20） 100 20
1-2 茜素红（20） 100 —
1-3 茜素红（20） 100 20
2-1 QC-Au NPs（80） 100 —
2-2 Ag NPs（100） 60 —
2-3 AA-Au NPs100 40 —
3-1 GSH-Au NPs（100） 40 —
3-2 4AA-Au NPs（100） 40 —
3-3 MnO<sub>2</sub> NSs（100） 40 —
表2 白酒详细信息
编号 白酒 标记 香型 酒精度 (%)
1 国窖 52°NP 浓香型 52
2 特曲 52°Tequ 浓香型 52
3 头曲 52°Tequ 浓香型 52
4 二曲 52°Tequ 浓香型 52
5 国窖 38°NP 浓香型 38
6 特曲 38°Tequ 浓香型 38
7 头曲 38°Erqu 浓香型 38
8 二曲 38°Erqu 浓香型 38
如表1所示，该比色传感阵列的前三个阵列点（1-1、1-2、1-3）由染料构成，可与白酒中醇、酸、酯类物质进行广谱交叉反应，引起阵列点颜色的变化。其中阵列点1-1和1-3通过引入NaOH与白酒中微量组分反应，使整个反应体系的pH环境产生较大变化，从而引起pH指示剂BP和AR颜色变化；QC-Au NPs、AA-Au NPs、4AA-Au NPs、MnO2 NSs（2-1、2-3、3-2、3-3）可与酒体中氨基酸、小分子肽以及金属离子反应，引起材料聚集变色；Ag NPs（2-2）和GSH-Au NPs（3-1）广泛应用于金属离子和酸的检测，可作为酒体中金属离子和酸的检测探针。分别对阵列点材料进行UV-Vis表征，结果如图2所示，阵列点材料在不同的吸收波长下均有较明显的吸收峰，其中纳米银和二氧化锰纳米片的最大紫外吸收峰分别在391nm和408nm左右，经过不同染料修饰过后，Au NPs微粒的最大吸收峰出现了不同程度的红移，符合其光学特性。
（3）获取比色传感检测阵列的比色指纹图谱
采集反应前后每个阵列点RGB的变化值，并根据变化值做出每种白酒的指纹差谱图，如图3所示。基于比色观察结果，每种白酒差谱图呈现明显差异，仅通过肉眼观察即可对每种白酒进行区分。此外，对于相同品牌的白酒，酒精度越大，阵列的响应越强，但对于不同品牌白酒，阵列响应的欧式距离大小呈交叉排布，表明我们构建的复合阵列对于白酒的响应主要受酒精度和微量组分的影响。
（4）数据分析
采用主成分分析（Principle component analysis,PCA）、层序聚类分析（Hierarchical cluster analysis,HCA）、线性判别分析（Linear discriminantanalysis,LDA）以及径向基函数神经网络（Radical basis function neural networks,RBFN）对采集的数据进行处理，详情如下：
（1）主成分分析(PCA)
在本研究中，基于8种酒，每种酒5次平行实验，共进行40次实验，每种白酒可获得一组27维的矢量数据（9个阵列点×3个RGB值）。对于高维数据，需进行降维处理以达到准确分类的目的，而PCA作为一种降维技术，它可以通过删除冗余数据来降低维度，从而评估试验关键成分的贡献能力。通过PCA对数据进行降维，并对不同酒样进行分类，结果如图4所示，只需提取6维主成分即可解释全部信息的90.4%，更少的维度解释较大百分比信息表明阵列检测不同白酒具有较高的性能。
在PCA中，前两个主成分分别解释总体方差信息的36.43%和24.58%，因此基于每种白酒在主成分1和主成分2的得分绘制主成分分析二维散点图（图5），从散点图可以清楚的看出阵列对不同白酒检测效果，同一平行样的白酒在散点图中集中于相同区域，且不同白酒相互分开，无相互交叉现象。
（2）层序聚类分析(HCA)
HCA通过欧式距离的变化（每个阵列点ΔR2，ΔG2和ΔB2之和的平方根）对数据进行归类。其主要是对样本之间的相似度进行衡量，根据样本间的相似性，首先将最相似的样本合并在一起，然后依照相似度依次进行分类，直到所有样本归为一类为止。利用聚类分析法对不同白酒差谱图数据进行分析，结果如图6所示，同一白酒的不同平行样聚集成一组，不同品牌的白酒全部被正确分类。此外，除38°头曲和52°国窖被分到一组外，其余酒样均按度数被分为一组，无错误聚类。
（3）线性判别分析(LDA)
LDA主要根据已知数据建立分类判别函数，当新的样品加入时，通过所构建的判别函数判断其与已知样本的关系。与HCA相比，线性判别分析对样本量较大的数据有较好的分类能力。本研究采用LDA对8种酒样与阵列反应得到RGB数据进行分析，得到2个判别函数用于描述不同白酒之间的差异性，分别以2个线性判别函数为X轴和Y轴，绘制不同品牌白酒的二维散点图，结果如图7所示。在散点图中8种白酒被清晰的区分开，且相同种类酒样的平行样相互聚集成一簇。综上表明，阵列对不同白酒具有良好的分类能力和重复性。此外，对于相同酒精度的白酒，在散点图中也集中于某区域，显示阵列对于酒样的区分主要受酒精度影响。
（4）径向基神经网络分析(RBFN)
为进一步探究阵列对酒样的识别能力，我们采用RBFN来确定未知样本和实际样本之间的拟合关系。在每组试验中，随机抽取五分之四的样本作为训练样，其余的作为未知样。且为实现充分训练目的，将训练样本增加五倍。8种白酒径向基函数神经网络测试结果如图8A所示，从图中可以看出，预测结果与实际基本吻合，表明阵列对白酒有良好的识别能力。从图8B中可以看出，所有样品沿2种不同的酒精浓度轴聚集，第一轴为38o，第二轴为52o，此结果与PCA（图5）和LDA（图7）结果相同，显示阵列对于不同酒精度的白酒同样具有识别能力。此外，白酒种类和酒精度的RBFN残余误差分别为0.3和1.2。RBFN结果表明，阵列可实现对未知酒样的预测，并且具有识别白酒酒精度的潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将检测材料分别加到孔培养皿上的多个阵列点上构建比色传感阵列，所述检测材料分别为溴甲酚紫+NaOH、茜素红、茜素红+NaOH、QC-Au NPs、AA-Au NPs、4AA-Au NPs、MnO2NSs、Ag NPs和GSH-Au NPs；
2）向构建好的比色传感阵列中分别加入不同种类的待测白酒样品进行反应；
3）获取比色传感检测阵列的比色指纹图谱；
4）根据比色指纹图谱采用模式识别方法进行区分和判别。
2.根据权利要求1所述基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，所述检测材料中的纳米材料采用以下方法制得：
GSH-Au NPs的合成：向柠檬酸三钠溶液中加入HAuCl4，加热至沸腾，当溶液从浅黄色变为酒红色后继续加热30min后停止，得到Au NPs；然后将GSH溶液与所述Au NPs按照等摩尔比混合均匀，再将其在黑暗条件下室温反应，即制得GSH包裹Au NPs溶液；
AA-Au NPs的合成：将 HAuCl4和AA 的混合物在100℃下剧烈搅拌，当溶液的颜色变成樱桃红，即得到抗坏血酸包覆Au NPs；
QC-Au NPs的合成：在沸腾状态下将 HAuCl4溶液和QC的NaOH 溶液混合并剧烈搅拌，上述混合溶液颜色变为红色，终止反应，即得到槲皮素功能化的Au NPs；
4 AA-Au NPs的合成：将HAuCl4加热煮沸后剧烈搅拌，然后迅速加入4AA溶液继续加热，上述混合溶液由淡黄色变成深粉红色，即得到4-氨基烟酸包覆的Au NPs；
Ag NPs的合成：将AgNO3缓慢滴入CPB中，在25°C条件下持续搅拌，然后加入NaBH4，直至混合溶液由无色变为黄棕色停止反应，即得到Ag NPs；
MnO2 NSs的合成：将四甲基铵和H2O2加入MnCl2·4H2O的水溶液中，混合均匀，将得到的混合物悬浊液在室温下敞口搅拌过夜，然后离心弃上清液，收集黑色沉淀依次用甲醇和超纯水清洗干净，再复溶于超纯水中，并在细胞破碎仪中超声30min，即得到MnO2 NSs。
3.根据权利要求1所述基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，所述检测材料与白酒的体积比为1~5：2~5。
4.根据权利要求1所述基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，步骤2）所述反应的时间为3~5min。
5.根据权利要求1所述基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，所述检测材料中NaOH的浓度为0.005~0.02 M。
6.根据权利要求1所述基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，所述获取比色传感检测阵列的比色指纹图谱的方法包括：通过平板扫描仪捕获反应前后每个阵列点的高清图像，每个图像均清晰的显示分布均匀的阵列点，图像采集后，通过计算机对平板扫描仪采集的图像进行处理，选择每个阵列点RGB的变化值作为特征信号描述检测前后的化学变化。
7.根据权利要求1所述基于纳米材料-有机染料比色传感阵列快速检测白酒的方法，其特征在于，所述模式识别方法包括：主成分分析、层序聚类分析、线性判别分析以及径向基函数神经网络分析。
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