CN113466225B - 一种鉴别麦冬产地的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别麦冬产地的方法，包括：提供一系列不同pH值的包含金属指示剂的溶液作为检测液，其中pH值的范围为2～12；将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得比色阵列传感器；以及，将待测麦冬的块根提取液加入所述比色阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过观测混合反应体系的颜色变化并借助数理统计分析方法，从而实现对麦冬产地的鉴别。本发明提供的鉴别麦冬产地的方法，具有简单、高通量、准确等优点，为拓展比色阵列传感技术在道地中药材鉴别中的应用提供参考，并对形成基于产地模型的中药通用鉴别方法有积极影响。

Description

一种鉴别麦冬产地的方法
技术领域
本发明属于中草药产地鉴别领域，具体涉及一种鉴别麦冬产地的方法。
背景技术
麦冬(Ophiopogonjaponicus)属百合科沿阶草属药用植物，以块根入药，具有润肺养阴、益胃生津、清心除烦之功，是我国重要的常用大宗中药材品种。麦冬主要栽培于浙江和四川两省，分别俗称“浙麦冬”和“川麦冬”。浙麦冬是传统优质道地药材，是“浙八味”之一，主产于宁波慈溪、杭州笕桥等地。《本草纲目》中对浙麦冬的品质已有极高的评价：“浙中来者甚良。”浙麦冬需栽后第四年(栽培三周年)才可采收而川麦冬移栽后第二年(栽培一周年)即可采收。由于两地长期的生态条件、种植方式以及生长年限等不同，川麦冬和浙麦冬在表型性状、化学成分及有效成分含量上存在明显不同，浙麦冬药材具有明显的清香气味，检测表明挥发性成分含量明显较川麦冬高。与川麦冬相比，浙麦冬中含有的特征性成分龙脑次苷和龙脑苷分别具有抑制I/R导致的心肌细胞凋亡和抑制由缺血/再灌注引起的细胞凋亡等功效。
浙麦冬药材产量过低，种植收益较差，种植面积急剧萎缩，已无法保证全国市场供应，也严重影响了浙麦冬道地药材的临床应用。而川麦冬栽培面积却逐年扩大，约占全国麦冬总产量的70％，主导着国内麦冬的主流趋势和行情。如再不建立麦冬产地鉴别和质量评价体系，以实现优质优价，恢复农民种植浙麦冬的积极性，若干年后作为浙江的道地药材，浙麦冬将有可能消失。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种鉴别麦冬产地的方法，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种鉴别麦冬产地的方法，其包括：
提供一系列不同pH值的包含金属指示剂的溶液作为检测液，其中pH值的范围为2～12；
将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得比色阵列传感器；
以及，将待测麦冬的块根提取液加入所述比色阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过观测混合反应体系的颜色变化并借助数理统计分析方法，从而实现对麦冬产地的鉴别。
本发明实施例还提供了一种用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器，其包括检测液及传感单元，其中所述用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器的制备方法包括：
提供一系列不同pH值的包含金属指示剂的溶液作为检测液，其中pH值的范围为2～12；
以及，将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次将比色阵列传感技术实现了在麦冬产地鉴别方面的应用；
(2)本发明提供的鉴别麦冬产地的方法，鉴别度快，只需要5-10min，且准确性好、高通量；
(3)本发明提供的鉴别麦冬产地的方法，不需要复杂昂贵的仪器，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中制备“浙麦冬”的“指纹图谱”图1a和“川麦冬”的“指纹图谱”图1b。
图2是本发明实施例1中不同产地麦冬与阵列响应后的PCA结果。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
比色阵列传感技术是近年来出现的一种新型分析检测技术，该技术通过模拟人类或其它哺乳动物的嗅觉或味觉系统，采用多种具有强分子间相互作用和交叉响应能力的指示剂组成阵列，通过产生的特异性识别图案(pattern)或称为分子指纹(fingerprint)，可实现对多种分子结构、化学性质相近的单一组分分析物的识别和区分。该研究领域的代表主要是美国伊利诺伊大学香槟分校的Suslick教授，他提出了比色阵列传感器的概念，并将该技术应用到了对多种工业有毒气体、多种弱反应性有机挥发物、不同品牌和类型的软饮料等的识别区分中。近几年，比色阵列传感技术在复杂混合物的分析鉴别中也表现出了很高的应用潜力和价值，该技术已被成功应用于酒类、茶叶等的产地区分。因此，比色阵列传感技术在麦冬的产地鉴别分析中具有极大的应用潜力。
本发明实施例的一个方面提供了一种鉴别麦冬产地的方法，其包括：
提供一系列不同pH值的包含金属指示剂的溶液作为检测液，其中pH值的范围为2～12；
将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得比色阵列传感器；
以及，将待测麦冬的块根提取液加入所述比色阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过观测混合反应体系的颜色变化并借助数理统计分析方法，从而实现对麦冬产地的鉴别。
在一些较为具体的实施方案中，所述金属指示剂包括溴邻苯三酚红、邻苯三酚红、铬黑T、儿茶酚紫、铬天青S、二甲酚橙、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚、1-(2-联氮噻吩)-2-萘酚、4,2-噻唑间苯二酚、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚中的任意两种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述检测液中金属指示剂的浓度为1～10μmmol/L。
进一步的，所述各传感单元中检测液的体积为100～300μL。
在一些较为具体的实施方案中，所述传感单元包括96孔板，且不限于此。
进一步的，所述96孔板包括全透明微孔板、黑色微孔板、白色微孔板中的任意一种，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别麦冬产地的方法包括：将金属指示剂溶于一系列不同pH值的缓冲液中形成所述检测液。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别麦冬产地的方法包括：
将一系列已知产地的麦冬的块根提取液分别加入所述阵列传感器的各传感单元并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取各混合反应体系的颜色变化并进行数字化处理，从而获得麦冬的产地指纹图谱及HCA图谱和/或PCA图谱；
以及，将待测麦冬的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化并进行数字化处理，之后与所述麦冬的产地指纹图谱、HCA图谱、PCA图谱中的任意一种或两种以上的组合进行对照，从而鉴别得到待测麦冬的产地。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别麦冬产地的方法包括：
(1)将一系列不同已知产地的麦冬的块根提取液分别加入所述阵列传感器的各传感单元并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取各混合反应体系的颜色变化；
(2)通过图像处理软件对步骤(1)中扫描仪读取的颜色变化进行数字化处理，得到不同传感单元前后图像对应的RGB值，将反应后图像的RGB值减去反应前图像的RGB值，提取差减图像的ΔR、ΔG和ΔB值，从而获得麦冬的产地指纹图谱；
(3)将待测麦冬的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化，然后按照步骤(2)的处理方法进行处理，之后与所述麦冬的产地指纹图谱进行对照，从而鉴别得到待测麦冬的产地。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别麦冬产地的方法包括：
(1)将一系列不同已知产地的麦冬的块根提取液分别加入所述阵列传感器的各传感单元并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取各混合反应体系的颜色变化；
(2)通过图像处理软件对步骤(1)中扫描仪读取的颜色变化进行数字化处理及化学计量分析，得到不同传感单元反应前后图像产生的3N维的差向量，其中，N是指传感单元的数量，之后采用层次聚类分析或主成分分析，从而获得HCA图谱和/或PCA图谱；
(3)将待测麦冬的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化，然后按照步骤(2)的处理方法进行处理，之后与所述麦冬的HCA图谱和/或PCA图谱进行对照，从而鉴别得到待测麦冬的产地。
进一步的，所述图像处理软件包括Photoshop软件和/或ChemEye软件，且不限于此。
进一步的，所述化学计量分析采用的软件包括用多变量统计软件。
在一些更为具体的实施方案中，所述鉴别麦冬产地的方法可以包括：
(1)将比色阵列传感器与不同产地麦冬块根提取液混合后，所述阵列传感器上的传感单元与提取液反应后分别产生不同的颜色变化，利用平板扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之前”(对照组)和“之后”(实验组)的图像；
(2)利用ChemEye软件对步骤(1)中的扫描仪读取的颜色变化进行处理，从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地麦冬的响应差图(指纹图谱)；
(3)按照步骤(2)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化可以用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1,Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(4)按照步骤(3)的处理方法，采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，建立麦冬产地实验室判定标准；
(5)将待测样本与阵列传感器响应后的结果与步骤(2)中的指纹图谱和步骤(4)中的麦冬产地实验室判定标准进行对比，判断待测样本的产地来源。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器，其包括检测液及传感单元，其中所述用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器的制备方法包括：
提供一系列不同pH值的包含金属指示剂的溶液作为检测液，其中pH值的范围为2～12；
以及，将一系列所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器。
在一些较为具体的实施方案中，所述金属指示剂包括溴邻苯三酚红、邻苯三酚红、铬黑T、儿茶酚紫、铬天青S、二甲酚橙、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚、1-(2-联氮噻吩)-2-萘酚、4,2-噻唑间苯二酚、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚中的任意两种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述检测液中金属指示剂的浓度为1～10μmmol/L。
进一步的，所述各传感单元中检测液的体积为100～300μL。
在一些较为具体的实施方案中，所述传感单元包括96孔板，且不限于此。
进一步的，所述96孔板包括全透明微孔板、黑色微孔板、白色微孔板中的任意一种，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述鉴别麦冬产地的方法包括：将金属指示剂溶于一系列不同pH值的缓冲液中形成所述检测液。
在一些更为具体的实施方案中，所述用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器的制备方法可以包括：
(1)将金属指示剂溶解在不同pH值条件下得到不同的检测液；
(2)将一定体积步骤(1)得到的检测液放入96孔板中，得到用于鉴别麦冬产地的比色阵列传感器。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1
(1)将溴邻苯三酚红、铬黑T、铬天青S、二甲酚橙、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚分别溶解在pH＝3,6,9的缓冲液中得到18种浓度为10μM的检测液，取300μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与“浙麦冬”和“川麦冬”的提取液混合后，取300μL置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地麦冬的响应差图(指纹图谱)，建立麦冬指纹图谱库(如图1a-图1b所示)；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1,Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，建立麦冬产地实验室判定标准(如图2所示)，从图2可以看出，“浙麦冬”和“川麦冬”能被正确区分开来。
实施例2
(1)将溴邻苯三酚红、邻苯三酚红、铬黑T、儿茶酚紫分别溶解在pH＝3,9的缓冲液中得到8种浓度为10μM的检测液，取200μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与麦冬块根提取液混合后，取200μL置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地麦冬的响应差图(指纹图谱)，建立麦冬指纹图谱库；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1,Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，建立麦冬产地实验室判定标准。
实施例3
(1)将儿茶酚紫、铬天青S、二甲酚橙、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚、1-(2-联氮噻吩)-2-萘酚、4,2-噻唑间苯二酚、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚分别溶解在pH＝3,6,9的缓冲液中得到21种浓度为1μM的检测液，取300μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与麦冬块根提取液混合后，取300μL置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地麦冬的响应差图(指纹图谱)，建立麦冬指纹图谱库；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1,Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，建立麦冬产地实验室判定标准。
实施例4
(1)将邻苯三酚红、铬黑T、儿茶酚紫、铬天青S、二甲酚橙分别溶解在pH＝6,9的缓冲液中得到10种浓度为1μM的检测液，取100μL的检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之前”(对照组)的图像；
(2)将检测液与麦冬块根提取液混合后，取100μL置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之后”(对照组)的图像；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝(RGB)值的差异，得到不同产地麦冬的响应差图(指纹图谱)，建立麦冬指纹图谱库；
(4)“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件(Adobe Photoshop/ChemEye)进行处理获得，再利用多变量统计软件包(MVSP v.3.1,Kovach Computing)等对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对数据进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)或主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，建立麦冬产地实验室判定标准。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种鉴别麦冬产地的方法，其特征在于包括：
(1)将溴邻苯三酚红、铬黑T、铬天青S、二甲酚橙、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚分别溶解在pH＝3,6,9的缓冲液中得到18种浓度为1μM的检测液，将所述检测液分别置于阵列传感器的各传感单元中，制得比色阵列传感器，传感单元包括白色96孔板，取300μL的所述检测液放入白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之前”的图像；
(2)将所述检测液与麦冬块根提取液混合后，取300μL置于白色96微孔板中，利用扫描仪采集加入麦冬块根提取液“之后”的图像；所述麦冬块根提取液包括“浙麦冬”提取液和“川麦冬”提取液；
(3)利用ChemEye软件从“之后”图像中减去“之前”图像，通过提取“之后”和“之前”图像中各传感单元中心的红、绿、蓝值的差异，得到不同产地麦冬的响应差图，建立麦冬指纹图谱库；
(4)将“之后”和“之前”两幅图像的相减产生了一个3N维的差向量，其中N是指传感单元的数量；颜色差异的数字化用图像处理软件进行处理获得，再利用多变量统计软件包对色差向量进行化学计量分析；
(5)采用最小方差对所获数据进行层次聚类分析或主成分分析，从而获得“浙麦冬”和“川麦冬”的PCA图谱；
(6)将待测麦冬的块根提取液加入所述阵列传感器并与其中的检测液混合反应，通过扫描仪读取混合反应体系的颜色变化并进行数字化处理，之后与所述“浙麦冬”和“川麦冬”的PCA图谱进行对照，从而鉴别得到待测麦冬的产地，其中，鉴别得到待测麦冬的产地的时间为5-10min。
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