JPWO2012099216A1 - プロテオグリカンの大量調製法 - Google Patents
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Description
項1.
魚類軟骨からプロテオグリカンを抽出する方法であって、
(A)凍結魚類軟骨小片を水中で加熱する工程
を含む、プロテオグリカン抽出方法。
項2.
凍結魚類軟骨小片が、1小片あたり0.001〜0.5gである、項1に記載のプロテオグリカン抽出方法。
項3.
凍結魚類軟骨小片が、魚類軟骨を凍結後小片化したものである、項1又は2に記載のプロテオグリカン抽出方法。
項4.
魚類軟骨が、脱脂処理された魚類鼻軟骨である、項3に記載のプロテオグリカン抽出方法。
項5.
抽出されるプロテオグリカンに分子量が90万以上のプロテオグリカンが含まれる、項1〜4のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
項6.
水中での加熱が、3時間より長い時間行われる、項1〜5のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
項7.
加熱における水の温度が80℃以上である、項1〜6のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
項8.
加熱に供する凍結魚類軟骨小片全体の質量と、水の質量との比が、1:1〜1:10である、項1〜7のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
項9.
加熱後に回収する残渣の質量が、加熱に供した凍結魚類軟骨小片の質量以下になるまで加熱することを特徴とする、項1〜8のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
項10.
加熱後に回収する残渣が、加熱後に5000rpm、20分、4℃での遠心分離処理により得られる沈殿である、項9に記載のプロテオグリカン抽出方法。
項11.
凍結魚類軟骨小片を水中で加熱する工程を含む、魚類軟骨からのプロテオグリカン抽出効率を向上させる方法。
カラム: Sepharose CL-4B 充填カラム(Sepharose CL-4Bを担体としてφ1cm×38.5cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-4Bは、例えばGE Healthcare社等から入手できる。
Sepharose CL-4Bは、4%架橋アガロース、粒子径40-165μm(レーザー回折散乱法による)、CAS登録番号61970-08-9である。)
バッファー: 0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.0, 0.2M NaCl含有)
フラクション量: 1mL/tube
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA)・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000(SIGMA) ・・・ 670kDa
Dextran Standard 410,000(SIGMA) ・・・ 410kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA) ・・・ 270kDa
デキストランの定量(吸光度測定)は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法に従い、次のようにして行う。
〔1〕105×15mmの試験管に試料水溶液あるいは標準単糖(マンノース)水溶液を500μl加える。
〔2〕フェノール試薬(5 v/v%フェノール水溶液)を500μl加え、撹拌する。
〔3〕濃硫酸を2.5mL加え、すぐに10秒間激しく撹拌する。
〔4〕室温に20分以上放置する。
〔5〕分光光度計で490nmの吸収を測定する。
サケ鼻軟骨からのプロテオグリカン抽出検討
<抽出に用いた試料>
以下の3種類((1)〜(3))のサケ鼻軟骨由来試料を、プロテオグリカン抽出検討に用いた。なお、サケ鼻軟骨としては、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に6時間さらして洗浄及び脱脂した後、さらにピンセットで肉片等を取り除き手で水洗いして得られたサケ鼻軟骨を用いた。
(1)凍結サケ鼻軟骨ブロック
サケ鼻軟骨をフリーザーに保存して凍結させ、これを凍結サケ鼻軟骨ブロックとして用いた。なお、用いたサケ頭部の大きさにもよるが、凍結サケ鼻軟骨ブロックは、およそ、大きさ 2.5×1.5 〜 4.5×2 cm、重さ 1.71 〜 6.91 gの塊(7個あたりの平均の重さは3.701g)であった。凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真を図1aに示す。
(2)凍結サケ鼻軟骨小片
(1)の凍結サケ鼻軟骨ブロックをブレンダーに入れて10秒間破砕し、凍結サケ鼻軟骨小片を得た。凍結サケ鼻軟骨小片の写真を図1bに示す。なお、ランダムに20小片を採取して、各小片の大き及び重量を検討したところ、大きさはおよそ0.2 〜 0.7 cm、重さは約0.0890 〜 0.0116 g(20個の平均の重さは0.033 g)であった。また、凍結サケ鼻軟骨ブロック100gから95.6gの凍結サケ鼻軟骨小片が得られた。
(3)脱脂サケ鼻軟骨粉末
(1)の凍結サケ鼻軟骨を用いて、特許文献1(特開2009−173702号公報)の実施例1に記載の方法により、プロテオグリカン組成物粉末を得た。当該粉末を脱脂サケ鼻軟骨粉末として用いた。凍結サケ鼻軟骨ブロック100gから、脱脂サケ鼻軟骨粉末は5.83g得られた。脱脂サケ鼻軟骨粉末の写真を図1cに示す。
上述のようにして得られた(2)凍結サケ鼻軟骨小片に水を加え、100℃で加熱することによりプロテオグリカンの抽出を試みた。具体的には、次のようにして検討を行った。凍結サケ鼻軟骨小片約12gに対し60mLの蒸留水を加えたサンプルを4サンプル調製し、これらを100℃で1時間、2時間、3時間、4時間それぞれ加熱し、それらを遠心分離機により5,000rpm、20分、4℃で遠心分離し、不溶物(残渣)を取り除き上清を回収した。回収上清液量を測定した後、回収上清液中のプロテオグリカン量をカルバゾール硫酸法によりウロン酸(図表ではグルクロン酸の略記「GlcA」で表す)相当量として測定した。また、回収上清液中のタンパク質量をブラッドフォード法にて測定した。結果を表1に示す。また、表1をグラフにした図を図2に示す。
(1)凍結サケ鼻軟骨ブロック及び(3)脱脂サケ鼻軟骨粉末についても、上記(2)凍結サケ鼻軟骨小片の場合と同じ条件でプロテオグリカンを抽出し、その抽出量を比較した。結果を表2に示す。なお、表2には、抽出されたプロテオグリカン及びタンパク質の量を、凍結サケ鼻軟骨ブロック100g当たりの量に換算して示した。また、表2をグラフにした図を図3に示す。図3に示される各試料の記載(1〜9)は、表2の「グラフNo.」欄の記載と対応する。
上記のようにして抽出されたプロテオグリカンの分子量を検討した。具体的には、次のようにして行った。上記<凍結サケ鼻軟骨小片を用いたプロテオグリカン抽出検討>で得られた、(2)凍結サケ鼻軟骨小片から抽出されたプロテオグリカンを含む回収上清液を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより各フラクションに分離した。そして、各フラクションに含まれるウロン酸量(プロテオグリカン量を反映する)をカルバゾール硫酸法により定量した。また、各フラクションの280nmでの吸光度を測定し、これを含まれるタンパク質量を反映する値とした。そして、これらの結果を基にして、プロテオグリカンウロン酸量クロマトグラム及びプロテオグリカンタンパク質量クロマトグラムを描いた。結果を図4に示す。
カラム: Sepharose CL-4B 充填カラム(Sepharose CL-4Bを担体としてφ1cm×38.5cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-4Bは、例えばGE Healthcare社等から入手できる。
Sepharose CL-4Bは、4%架橋アガロース、粒子径40-165μm(レーザー回折散乱法による)、CAS登録番号61970-08-9である。)
バッファー: 0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.0, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量: 回収上清液 約0.5mL(ウロン酸量 約1mg)
流速: 約0.15mL/min
フラクション量: 1mL/tube
分子量検量線:次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件(但しアプライサンプル量は1mg)でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各溶出フラクションに含まれる糖量(すなわちデキストラン量)を定量し、検量線を作製した。
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA) ・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000(SIGMA) ・・・ 670kDa
Dextran Standard 410,000(SIGMA) ・・・ 410kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA) ・・・ 270kDa
デキストランの定量は、具体的には、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法に従い、次のようにして行った。
〔2〕フェノール試薬(5 v/v%フェノール水溶液)を500μl加え、撹拌した。
〔3〕濃硫酸を2.5mL加え、すぐに10秒間激しく撹拌した。
〔4〕室温に20分以上放置した。
〔5〕分光光度計で490nmの吸収を測定した。
カラム: DEAE Sephacel 充填カラム(DEAE(ジエチルアミノエチル) Sephacelを担体としてφ2.5cm×10cmのカラムに充填したもの。DEAE Sephacelは、例えばGE Healthcare社等から入手できる。)
バッファー: 7M Urea/50mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) (0.1M NaClにより、直線濃度勾配溶出を行う)
フラクション量: 10mL/tube
Claims (11)
- 魚類軟骨からプロテオグリカンを抽出する方法であって、
(A)凍結魚類軟骨小片を水中で加熱する工程
を含む、プロテオグリカン抽出方法。 - 凍結魚類軟骨小片が、1小片あたり0.001〜0.5gである、請求項1に記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 凍結魚類軟骨小片が、魚類軟骨を凍結後小片化したものである、請求項1又は2に記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 魚類軟骨が、脱脂処理された魚類鼻軟骨である、請求項3に記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 抽出されるプロテオグリカンに分子量が90万以上のプロテオグリカンが含まれる、請求項1〜4のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 水中での加熱が、3時間より長い時間行われる、請求項1〜5のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 加熱における水の温度が80℃以上である、請求項1〜6のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 加熱に供する凍結魚類軟骨小片全体の質量と、水の質量との比が、1:1〜1:10である、請求項1〜7のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 加熱後に回収する残渣の質量が、加熱に供した凍結魚類軟骨小片の質量以下になるまで加熱することを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 加熱後に回収する残渣が、加熱後に5000rpm、20分、4℃での遠心分離処理により得られる沈殿である、請求項9に記載のプロテオグリカン抽出方法。
- 凍結魚類軟骨小片を水中で加熱する工程を含む、魚類軟骨からのプロテオグリカン抽出効率を向上させる方法。
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食肉加工シリーズ編集員会編, <食肉加工シリーズ>4食肉加工の機械装置, 1963年3月, 株式会社光琳書院, P, JPN6016002071, ISSN: 0003240311 * |
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