CN103429608A

CN103429608A - 蛋白多糖的大量制备方法

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Publication number: CN103429608A
Application number: CN2012800059288A
Authority: CN
Inventors: 加藤阳治
Original assignee: Hirosaki University NUC
Current assignee: YoKa Institute of Food Science
Priority date: 2011-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-01-19
Also published as: JP6071558B2; RU2013138356A; US20130303736A1; JPWO2012099216A1; US9284359B2; CN103429608B; EP2666779B1; WO2012099216A1; RU2592850C2; EP2666779A1; EP2666779A4; NZ614126A

Abstract

本发明以高效地从水生动物组织中提取蛋白多糖为课题。本发明涉及从鱼类软骨中提取蛋白多糖的方法，只要是包括在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序的蛋白多糖提取方法，就可以简便并且非常高效地从鱼类软骨中提取蛋白多糖。特别是，就该方法而言，可以提取高分子量的蛋白多糖。而且，就该方法而言，由于可以仅使用水进行提取，因此与现有的使用有机溶剂或者酸·碱的提取方法相比，提取作业及所得的蛋白多糖是安全的，也不需要除去有机溶剂的烦杂工序。

Description

蛋白多糖的大量制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白多糖的制备方法。更具体来说，本发明特别是涉及能够大量地制备高分子量的蛋白多糖的、高效率的蛋白多糖的提取方法。

背景技术

蛋白多糖是与胶原蛋白等一起形成结缔组织的细胞外基质中的基质的主要生物高分子。以往，蛋白多糖是将哺乳动物（特别是牛）的软骨中所含的物质提取分离而得到，然而，由于报告过牛脑海绵状症（BSE）的发病，因此希望避免从哺乳动物软骨中提取，需要将其取而代之的蛋白多糖供给源。此外，以往的蛋白多糖提取工序烦杂且产量不高，因此制造成本非常高，不能充分地实现工业应用，因此需要一种更加简便且产量高的制造方法。

水生动物组织是有力的蛋白多糖供给源替代候选。尝试过提取作为水生动物的鲸、鲨鱼的软骨中所含的蛋白多糖。但是，这些水生动物的捕获量存在限制，很难制造大量的蛋白多糖。此外，提取分离操作也很烦杂，提取所用的溶剂等中存在有毒性不低的物质等。

为了解决这些问题，尝试过从大量废弃的水生动物组织（例如鲑鱼鼻软骨）中提取蛋白多糖。专利文献1中记载有由鲨鱼的鼻软骨来制造含有蛋白多糖的组合物（鼻软骨粉末）的方法。特别给出了以下启示，即，源自鲑鱼鼻软骨的蛋白多糖对炎症性肠疾病具有治疗以及预防效果，蛋白多糖的需求正在提高。然而，就专利文献1的方法而言，其蛋白多糖的制造效率并非很高，在效率方面还存在着改善余地。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009－173702号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于，高效率地从水生动物组织中提取蛋白多糖。

用于解决课题的方法

本发明人等惊奇地发现，在将鱼类软骨冷冻并将其小片化后，在水中进行加热，可以高效率地提取蛋白多糖，从而进一步改良并完成本发明。

即，本发明包含例如以下项目1～11所述的蛋白多糖提取方法（也可以称为蛋白多糖制造方法）、以及提高蛋白多糖提取效率的方法。

项目1.

一种蛋白多糖提取方法，其为从鱼类软骨中提取蛋白多糖的方法，包含：（A）在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序。

项目2.

根据项目1所述的蛋白多糖提取方法，其中，每1小片的冷冻鱼类软骨小片为0.001～0.5g。

项目3.

根据项目1或2所述的蛋白多糖提取方法，其中，冷冻鱼类软骨小片是将鱼类软骨冷冻后小片化而成。

项目4.

根据项目3所述的蛋白多糖提取方法，其中，鱼类软骨是经脱脂处理的鱼类鼻软骨。

项目5.

根据项目1～4中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其中，提取的蛋白多糖中包含分子量为90万以上的蛋白多糖。

项目6.

根据项目1～5中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其中，在水中进行长于3小时的加热。

项目7.

根据项目1～6中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其中，加热时的水的温度在80℃以上。

项目8.

根据项目1～7中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其中，供于加热的冷冻鱼类软骨小片总体的质量与水的质量之比为1：1～1：10。

项目9.

根据项目1～8中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其特征在于，一直加热到加热后回收的残渣质量达到供于加热的冷冻鱼类软骨小片的质量以下为止。

项目10.

根据项目9所述的蛋白多糖提取方法，其中，加热后回收的残渣是加热后在5000rpm、20分钟、4℃下通过离心分离处理而得到的沉淀。

项目11.

一种提高来自鱼类软骨的蛋白多糖的提取效率的方法，其包含在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序。

发明的效果

根据本发明的蛋白多糖提取方法，可以简便并且非常高效地从鱼类软骨提取蛋白多糖。特别是，就本发明的提取方法而言，可以提取高分子量的蛋白多糖。而且，就本发明的提取方法而言，由于可以仅使用水进行提取，因此与现有的使用有机溶剂或者酸·碱的提取方法相比，提取作业以及所得到的蛋白多糖是安全的，也不需要除去有机溶剂的烦杂工序。

附图说明

图1a为置于托盘中的冷冻鲑鱼鼻软骨块的照片。

图1b为置于塑料袋中的冷冻鲑鱼鼻软骨小片的照片。

图1c为置于塑料袋中的脱脂冷冻鲑鱼鼻软骨粉末的照片。

图2为表示在冷冻的鲑鱼鼻软骨小片中加入水并在100℃下提取时的、蛋白多糖产量随时间的变化的图表。

图3为对由脱脂鲑鱼鼻软骨粉末（粉末），冷冻鲑鱼鼻软骨块（块）或者冷冻鲑鱼鼻软骨小片（小片）提取蛋白多糖时的、糖醛酸量（以葡萄糖醛酸的简写GlcA表示）及蛋白质（以Protein表示）的产量进行比较图表。将GlcA及Protein的产量值换算为由每100g冷冻鲑鱼鼻软骨块提取的情形。需要说明的是，糖醛酸量反映蛋白多糖量。

图4为使用凝胶过滤色谱法将包含提取自冷冻鲑鱼鼻软骨小片的蛋白多糖的回收上清液分离，测定各馏分中的糖醛酸量（GlcA）及280nm的吸光度，并根据所得到的测定值绘制成的色谱图。

图5为使用阴离子交换色谱法将包含提取自冷冻鲑鱼鼻软骨小片的蛋白多糖的回收上清液分离，测定各馏分中的糖醛酸量（GlcA）及280nm的吸光度，并根据所得到的测定值绘制成的色谱图。

具体实施方式

以下，对本发明进一步详细地进行说明。需要说明的是，“质量”与“重量”可以替换。

本发明的蛋白多糖提取方法是从鱼类软骨提取蛋白多糖的方法，包含：（A）在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序。

鱼类软骨是鱼类的软骨。作为鱼类，优选鲑鱼科鲑鱼属的鱼，具体而言优选例示出鳟鱼（细鳞大马哈鱼、樱鳟鱼、五月鳟等）、鲑鱼（白鲑、红鲑、银鲑、大鳞大马哈鱼、虹鳟等）、鲨鱼、鳕鱼等。特别优选鲑鱼或者鳟鱼。此外，作为软骨，没有特别限制，但是优选头部软骨，尤其是鼻软骨。此外，因为在将鱼类加工成食品产品等时通常将头部废弃，所以具有头部软骨的获得成本低，可以大量且稳定供给的优点。

冷冻鱼类软骨小片可以通过下述方法得到：（i）冷冻鱼类软骨后将其小片化，或者（ii）将鱼类软骨小片化后冷冻。此外，也可以是（iii）冷冻鱼类软骨后的鱼类软骨本身。在本发明中特别优选通过（i）得到的冷冻鱼类软骨小片。本发明还包含蛋白多糖的提取方法，其中，所述蛋白多糖的提取方法在（A）工序之前，还包括（α）将鱼类软骨冷冻的工序、和/或（β）将冷冻鱼类软骨小片化的工序。

冷冻方法没有特别限定，可以使用公知的冷冻方法。例如，可以例示出使用冷冻机，在－20～－80℃左右将鱼类软骨保存24～72小时左右的方法。

小片化可以利用公知的方法进行。例如，可以使用公知的搅拌器或研磨机等，将鱼类软骨（优选冷冻鱼类软骨）小片化。优选尽可能在低温（例如4℃以下）下进行小片化操作。

优选每1小片的冷冻鱼类软骨小片为0.001～0.5g左右，更优选为0.005～0.3g左右，进一步优选为0.001～0.1g左右。优选以能够得到这样的冷冻鱼类软骨小片的方式进行小片化操作。此外，在将鱼类软骨冷冻后即已得到前述程度重量的小片的情况下，也可以不特别地进行小片化操作。此外，虽然没有特别限制，但是在供于加热的全部冷冻鱼类软骨小片中，优选具有上述质量的小片在50质量%以上，更优选在70质量%以上，进一步优选在90质量%以上。该比例以如下方式求出：从供于加热的冷冻鱼类软骨小片整体中随机选取20小片，分别测定该20小片的质量，计算出上述的质量小片在20小片中所占的百分比。此外，“小片整体”表示各小片的集合。即表示多个小片集合而成的集合体。

虽然没有特别限定，但是作为鱼类软骨，优选使用经脱脂处理的鱼类软骨。其原因在于，通过使用脱脂处理后的鱼类软骨，可以得到脂质的混入较少的提纯度高的含有蛋白多糖的提取物。脱脂处理可以使用公知的方法进行。例如，可以例示出将鱼类软骨用流水（例如来自自来水水龙头的流水）漂洗1～24小时左右的方法。需要说明的是，鱼类软骨的获取可以通过公知的方法进行，例如可以例示出如下方法：将鱼类组织（优选鱼类头部）在水中浸渍1～24小时左右使其膨胀，除去软骨（优选鼻软骨）之外的组织的方法；或者，将冷冻鲑鱼头部解冻后，立刻取出鼻软骨，然后用流水漂洗1～24小时左右来进行洗涤及脱脂的方法。需要说明的是，残存有肉片等的情况下，优选使用镊子等将残存的肉片等除去。

通过本发明的蛋白多糖提取方法所提取出的蛋白多糖包含高分子量的蛋白多糖。本发明的发明人发现，就蛋白多糖所具有的对炎症性肠疾病的治疗及预防效果而言，越是高分子量的蛋白多糖其效果越高。因此，可以说能够得到高分子量的蛋白多糖的本发明在这一点上是有利的。这里的高分子量蛋白多糖，具体而言是指分子量为90万以上的蛋白多糖，优选分子量为100万以上的，更优选分子量为120万以上。此外，认为就本发明的方法而言，能够得到分子量为250万以上、甚至分子量为500万以上的蛋白多糖。需要说明的是，该优选的高分子量蛋白多糖是指，通过下述条件的凝胶过滤色谱法，对通过本发明的蛋白多糖的提取方法得到的含有蛋白多糖的提取物进行处理，用咔唑硫酸法对所得的各馏分中包含的糖醛酸量（反映蛋白多糖量）进行定量，基于该糖醛酸量的色谱图的峰位置为上述的分子量（90万、优选为100万、更优选为120万）以上。以下，将以这种方式操作而得到的色谱图称为“蛋白多糖糖醛酸量色谱图”。此外，对各馏分的280nm处的吸光度进行测定，使所含的蛋白质量相对值化（即，成为反映所含蛋白质量的值），从而能够绘制出基于该吸光度的色谱图（反映蛋白质量）。以下，将该色谱图称为“蛋白多糖蛋白质量色谱图”。

〔凝胶过滤色谱法〕

色谱柱：Sepharose CL－4B填充色谱柱（以Sepharose CL－4B作为载体而填充到Φ1cm×38.5cm的色谱柱中而成。Sepharose CL－4B例如可从GE Healthcare公司等获得。

Sepharose CL－4B为4%交联琼脂糖，粒径为40－165μm（由激光衍射散射法得到），CAS注册号为61970－08－9。）

缓冲液：0.1M磷酸缓冲液（pH7.0，含有0.2M的NaCl）

馏分量：1mL/试管

分子量校正曲线：使用如下制作出的校正曲线，即，对于下述的各种葡聚糖分子量标记物，在与上述同样的条件下进行凝胶过滤色谱法处理，利用用于检测糖链的公知方法即苯酚·硫酸法，测定各馏分的吸光度（反映葡聚糖量），制作出的校正曲线。

<葡聚糖分子量标记物>

Dextran Standard（葡聚糖标准品）1400000（SIGMA）···1400kDa

Dextran Standard 670000（SIGMA）···670kDa

Dextran Standard 410000（SIGMA）···410kDa

Dextran Standard 270000（SIGMA）···270kDa

按照Hodge,J.E.and Hofreiter,B.T.,Method in CarbohydrateChemistry,1338（1962）中记载的方法，如下所述进行葡聚糖的定量（吸光度测定）。

〔1〕在105×15mm的试管中加入500μl的试样水溶液或标准单糖（甘露糖）水溶液。

〔2〕加入500μl的苯酚试剂（5v/v%苯酚水溶液），并进行搅拌。

〔3〕加入2.5mL的浓硫酸，立即剧烈搅拌10秒钟。

〔4〕在室温下放置20分钟以上。

〔5〕使用分光光度计测定490nm的吸收。

需要说明的是，咔唑硫酸法是将作为糖醛酸（葡萄糖醛酸（GlcA）、艾杜糖醛酸等）的显色色素的咔唑溶液添加至测定检体中，使用分光光度计测定吸光度的公知的方法。使用规定浓度的葡萄糖醛酸标准溶液制作出校正曲线，求出检体中的葡萄糖醛酸含量。更具体而言，按下述方法进行。将0.95g硼酸钠·10水合物溶解在100mL的浓硫酸中得到试剂，用试管取2.5mL该试剂，进行冰冷。接着在其上轻轻地重叠0.5mL被检物（包含2～20μg糖醛酸）。在水冷的同时充分进行搅拌，以使其温度不会达到室温以上。用玻璃球将其盖上后，在沸水浴中加热10分钟，水冷至室温。在其中加入将125mg咔唑溶解于100mL无水甲醇中而得的试剂0.1mL并进行混合，然后在沸水浴中加热15分钟。之后，水冷至室温，测定530nm的吸光度。使用0.5mL的蒸馏水作为空白对照。同时，使用葡萄糖醛酸制作出校正曲线。

以可发挥本发明的效果的程度进行（A）工序的加热。只要可以发挥本发明的效果，则没有特别限制，具体而言可以例示出以下这样的加热条件。加热时间由加热温度决定，但优选长于3小时，更优选为3.5小时以上，进一步优选为4小时以上。加热温度由加热时间决定，但优选水的温度在80℃以上，更优选在90℃以上，进一步优选沸腾状态下的温度（在1个大气压下为100℃或以上）。

此外，供于加热的冷冻鱼类软骨小片的量及水量可以适宜设定，但是优选该小片整体浸渍在水中，更具体而言，优选该小片整体的质量与水的质量之比（小片整体：水）为1：1～1：10左右。

如果将冷冻鱼类软骨小片浸渍在水中，则水浸润该小片而增量。而且，通过加热慢慢地使该膨胀的鱼类软骨小片变软，其形状逐渐崩坏，最后成为糊状且溶解于水中的部分也出现。因此，也可以根据加热后的该膨润鱼类软骨小片（即，加热后存在的残渣）的质量来规定优选的加热程度。即，在本发明中，优选加热至加热后的膨润鱼类软骨小片整体（即残渣）的质量，达到供于加热的冷冻鱼类软骨小片整体的质量以下为止，更优选加热至达到供于加热的冷冻鱼类软骨小片整体的质量的70%以下为止，进一步优选加热至达到50质量%以下为止。

需要说明的是，此处的加热后的膨润鱼类软骨小片整体（即残渣）是指，在5000rpm、20分钟、4℃下对加热后的液体进行离心分离而得到的沉淀。（是指在该离心分离处理后将溶液部分除去后的沉淀）。

经由（A）工序，液体部分（即水部分）中包含大量的蛋白多糖。因此，通过将液体部分回收，可以得到含有蛋白多糖的提取物。液体部分的回收，例如可以通过进行离心分离（优选上述条件下的离心分离）处理、并回收上清液来实施。该液体（上清液）可以直接使用，也可以通过公知方法进一步精制。或者，也可以通过蒸馏法或冷冻干燥法等进行浓缩。也可以通过冷冻干燥法、喷雾干燥法进行粉末化。只要不损害本发明的效果，则也可以实施此处例示以外的其他的操作。以这种方式操作而得到的蛋白多糖优选作为例如食品、化妆品、医药品等的原材料来使用。

就通过本发明的方法得到的蛋白多糖而言，其使用方式没有特别限制。由于蛋白多糖例如具有上述效果，因此适宜用作外用组合物或口服组合物。即，优选以包含通过本发明的方法得到的蛋白多糖的外用组合物或口服组合物的形式来使用。此外，外用组合物或口服组合物可以以医药组合物、准药品组合物、化妆组合物、食品组合物等的形式来使用。它们可以通过使用由本发明的方法得到的蛋白多糖、利用常用方法来制造。特别是，这些组合物可以优选用于口腔护理领域、化妆品领域及饮食品领域。

就口腔护理领域中所使用的口腔用组合物（以下，有时记为“本发明所涉及的口腔用组合物”）而言，其中所述口腔用组合物包含由本发明的方法得到的含有蛋白多糖的提取物，该口腔用组合物既可以是该含有蛋白多糖的提取物本身，也可以是将该提取物与口腔用组合物所使用的其他成分（例如研磨剂、发泡剂、洗涤剂、表面活性剂、湿润剂、pH调节剂、增稠剂、香味剂等）适宜配合制造而得的组合物。例如，可以通过常用方法制造成糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂敷剂、喷雾剂、填补剂、液态剂、漱口水、贴剂、口嚼剂、含片、片剂等形态。

优选将这样的本发明所涉及的口腔用组合物用作口腔组织的炎症改善用、抗老化用。即，本发明所涉及的口腔用组合物包括炎症改善用的口腔用组合物、抗老化用的口腔用组合物。

就化妆品领域中所使用的化妆品组合物而言（以下，有时记为“本发明涉及的化妆品组合物”），其中所述化妆品组合物包含由本发明的方法得到的含有蛋白多糖的提取物，该化妆品组合物既可以是该含有蛋白多糖的提取物本身，也可以是将该提取物与容许用于化妆品的介质、基剂、载体、添加剂、其他容许用于化妆品的成分、材料适宜配合，通过常用方法制造而得的组合物。具体而言，可以列举出包含本发明的鱼类软骨水提取物而制造的乳液、化妆水、乳霜、美容液、粉底霜、肌底液、防晒霜等。这样的本发明所涉及的化妆品组合物，可以优选用于炎症改善或抗老化，更具体而言，例如可以优选用于防晒、晒后修复、保湿以及抗皮肤老化（例如，用于预防或改善干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤褶皱·松弛等）。

就饮食品（饮料以及食品）领域中所使用的饮食品组合物（以下，有时记为“本发明所涉及的化妆品组合物”）而言，其中所述饮食品组合物包含由本发明的方法得到的含有蛋白多糖的提取物，该饮食品组合物既可以是该含有蛋白多糖的提取物本身，也可以是将该提取物与食品卫生学上所容许的基剂、载体、添加剂、其他可用于食品的成分·材料等适宜配合而得的组合物。例如可以例示出：包含该含有蛋白多糖的提取物的用于保湿以及抗皮肤老化（例如，用于预防或改善干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤褶皱·松弛等）的加工食品、饮料、健康食品（营养功能食品、特定保健用食品等）、补充剂、美容食品、患者用食品等。而且，这样的包含本发明所涉及的饮食品组合物的保湿剂、抗皮肤老化剂也包含在本发明中。该保湿剂、抗皮肤老化剂可以以美容用或抗皮肤老化用（例如，用于预防或改善干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤褶皱·松弛等）的饮用剂、锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、胶冻剂、糖锭剂等形态提供。

在本发明所涉及的口腔用组合物、化妆品组合物、或饮食品组合物中，虽然没有特别限制，但这些组合物中所包含的该含有蛋白多糖的提取物的量，例如相对于组合物整体通常为0.001～100质量%，优选为0.01～95质量%。

在通过本发明的蛋白多糖提取方法而得到的、含有蛋白多糖的提取物中，蛋白多糖被非常高效地提取出来。具体而言，以糖醛酸换算（即，利用咔唑硫酸法进行测定值换算）计，可提取出所使用的冷冻鱼类软骨小片中包含的蛋白多糖量的60质量%以上、优选为70质量%以上、更优选为80质量%以上、进一步优选为90质量%以上的蛋白多糖。而且，如上所述，通过本发明的蛋白多糖提取方法得到的蛋白多糖为高分子量的蛋白多糖。具体而言，在通过本发明的蛋白多糖提取方法而得到的含有蛋白多糖的提取物中，优选包含分子量为90万以上（更优选分子量为100万以上的，进一步优选分子量为120万以上的）的蛋白多糖。该分子量以上的蛋白多糖，优选为所提取的蛋白多糖整体的60质量%以上，更优选为70质量%以上，进一步优选80质量%以上，更进一步优选为90质量%以上。在上述的蛋白多糖糖醛酸量色谱图中，可由峰面积进行推导来确定上述分子量以上的蛋白多糖以何种程度的比例存在。即，通过求出上述分子量以上的蛋白多糖所占的面积在该色谱图的全部峰面积中为何种程度的比例来确定。

此外，本发明还包含提高来自鱼类软骨的蛋白多糖的提取效率的方法，其中该方法包含在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序。关于该方法中的冷冻鱼类软骨小片的制备、加热条件、蛋白多糖的提取效率的测定等，均可以使用如上所述的方法及条件。

通过上述方法，可以简便且非常高效地从鱼类软骨中提取蛋白多糖，此外，还可以提高来自鱼类软骨的蛋白多糖的提取效率。特别是就本发明的提取方法而言，可以提取高分子量的蛋白多糖。以下并非是对本发明的限定解释，但认为能够这样高效率地提取蛋白多糖（特别是高分子量的蛋白多糖）的原因在于，虽然有使鱼类软骨小片化再使用的原因，但还可能是由于小片化时其被冷冻，因此骨组织中包含的酶（特别是分解蛋白多糖的酶）的活性受到抑制，而且可通过加热处理使该酶失活的原因。从该观点出发，认为优选尽可能在低温下进行鱼类软骨的处理，而在加入冷冻鱼类软骨小片时尽可能处于高温。

实施例

以下，对本发明具体地进行说明，但是本发明并不限定于下述的示例。

来自鲑鱼鼻软骨的蛋白多糖的提取研究

<提取所使用的试样>

将以下3种（（1）～（3））的源自鲑鱼鼻软骨的试样用于蛋白多糖的提取研究。需要说明的是，作为鲑鱼鼻软骨，使用如下得到的鲑鱼鼻软骨：将冷冻鲑鱼头部解冻后，立刻取出鼻软骨，然后用流水漂洗6小时来进行洗涤及脱脂，之后，用镊子除去肉片等再用手水洗而得到。

（1）冷冻的鲑鱼鼻软骨块

将鲑鱼鼻软骨保存在冷冻机中并使其冷冻，将其用作冷冻鲑鱼鼻软骨块。需要说明的是，虽然冷冻鲑鱼鼻软骨块的大小和重量与所使用的鲑鱼头部的大小有关，但冷冻鲑鱼鼻软骨块大致是大小为2.5×1.5～4.5×2cm、重量为1.71～6.91g块体（每7个的平均重量为3.701g）。将冷冻鲑鱼鼻软骨块的照片示于图1a。

（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片

将（1）的冷冻鲑鱼鼻软骨块置于搅拌器中粉碎10秒钟，得到冷冻鲑鱼鼻软骨小片。将冷冻鲑鱼鼻软骨小片的照片示于图1b。需要说明的是，随机选取20小片，检查各小片的大小及重量，其大小大致为0.2～0.7cm，重量约为0.0890～0.0116g（20个的平均重量为0.033g）。此外，由100g冷冻鲑鱼鼻软骨块得到95.6g冷冻鲑鱼鼻软骨小片。

（3）脱脂鲑鱼鼻软骨粉末

使用（1）的冷冻鲑鱼鼻软骨，利用专利文献1（日本特开2009－173702号公报）的实施例1中记载的方法，得到蛋白多糖组合物粉末。将该粉末用作脱脂鲑鱼鼻软骨粉末。由100g冷冻鲑鱼鼻软骨块，得到5.83g脱脂鲑鱼鼻软骨粉末。将脱脂鲑鱼鼻软骨粉末的照片示于图1c。

需要说明的是，将专利文献1的实施例1的记载摘录如下。“粉碎100g冷冻鲑鱼鼻软骨，向其中加入等容量的15℃的自来水，缓慢搅拌使其充分混合，并使所得混合物维持在5℃左右，立即使用离心分离器在9000rpm、30分钟、4℃下对该混合物进行离心分离，将脂质与包括蛋白多糖在内的其他组合物分开。离心分离层分为3层，除去最上部的脂质层和中间层的水层，回收沉淀物。将沉淀物冷冻干燥后，使用离心式粉碎机进行粉碎，得到水脱脂微粉。在该阶段，取一部分并使用醚萃取测定脂质，结果为脂质残存8.8%，如果将脱脂前的脂质设为100%，则除去率达到75.0%，有轻微的异味。接着，在水脱脂微粉中加入10倍容量的乙醇，

溶解提取含有异味的脂质。将本操作重复2次并将乙醇溶液过滤除去，使溶剂蒸发得到微黄褐色无味的蛋白多糖组合物粉末。相对于鲑鱼鼻软骨的收率为58.7%（干基），蛋白多糖含有率为77.7%。蛋白多糖组合物粉末的异味完全消失。”专利文献1的实施例1的“冷冻鲑鱼鼻软骨”相当于上述的“冷冻鲑鱼鼻软骨块”。此外，“干基”是指干燥质量换算。

<使用冷冻鲑鱼鼻软骨的蛋白多糖的提取研究>

在以上述方式操作而得到的（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片中加入水，通过在100℃下加热来尝试蛋白多糖的提取。具体而言，如下操作而进行了研究。相对于约12g冷冻鲑鱼鼻软骨小片加入60ml的蒸馏水，配制出4份样品，在100℃下将他们分别加热1小时、2小时、3小时、4小时，然后通过离心分离机在5000rpm、20分钟，4℃下对它们进行离心分离，除去不溶物（残渣）回收上清液。测定回收上清液的量后，利用咔唑硫酸法测定回收上清液中的蛋白多糖量作为糖醛酸（在图表中，以葡萄糖醛酸的简记“GlcA”表示）的相当量。此外，利用Bradford法测定回收上清液中的蛋白质量。将结果示于表1。此外，将使表1图表化而成的图示于图2。

[表1]

由表1及图2可知，随着加热时间的延长，蛋白多糖的提取量增加。此外，可知特别是如果加热长于3小时（例如4小时），则蛋白多糖提取量会大幅度增加。

<冷冻鲑鱼鼻软骨小片、与冷冻鲑鱼鼻软骨块及脱脂鲑鱼鼻软骨粉末的比较>

关于（1）冷冻鲑鱼鼻软骨块及（3）脱脂鲑鱼鼻软骨粉末，在与上述（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片的情况相同的条件下提取蛋白多糖，并对其提取量进行比较。将结果示于表2。需要说明的是，在表2中，将提取的蛋白多糖及蛋白质的量换算为每100g冷冻鲑鱼鼻软骨块的量来表示。此外，将使表2图表化而成的图示于图3。图3所示的各试样的记载（1～9）与表2的“图表No.”栏的记载相对应。

[表2]

由表2及图3可知，在水中、在100℃下将冷冻鲑鱼鼻软骨小片加热4小时的情况下，提取的葡萄糖醛酸量（反映蛋白多糖量）显著地增加。特别是，如果考虑到每100g鲑鱼鼻软骨中包含的糖醛酸量（反映蛋白多糖量）约为1.6g（冷冻干燥后粉碎，使用4M盐酸胍/50mM醋酸缓冲液进行提取，并利用咔唑硫酸法进行测定而得的值），则就100℃、4小时的条件下提取出的糖醛酸量而言，在冷冻鲑鱼鼻软骨块的状态下为832mg（提取率为52%），而如果变为冷冻鲑鱼鼻软骨小片则达到1490.6mg，提取率竟达到93.2%。提取效率如此之高的蛋白多糖提取方法过去并不为人所知，可以说是通过本发明首次能够实现这样的提取效率。需要说明的是，由100g冷冻鲑鱼鼻软骨块得到5.83g脱脂鲑鱼鼻软骨粉末，因此在100℃、4小时下提取脱脂鲑鱼鼻软骨粉末的情况下，如果将所得到的量换算为每100g鼻软骨则是733mg，提取率为45.8%。

<蛋白多糖的分子量的研究>

对以上述方式操作所提取出的蛋白多糖的分子量进行研究。具体而言，如下所示来进行。通过下述条件的凝胶过滤色谱法，将包含提取自（2）冷冻鲑鱼鼻软骨小片的蛋白多糖的回收上清液分离成各馏分，其中所述回收上清液由上述“使用冷冻鲑鱼鼻软骨小片的蛋白多糖的提取研究”得到。然后，利用咔唑硫酸法对各馏分中包含的糖醛酸量（反映蛋白多糖量）进行定量。此外，测定各馏分的280nm的吸光度，并作为反映其所包含的蛋白质量的值。然后，根据这些结果，绘制蛋白多糖糖醛酸量色谱图及蛋白多糖蛋白质量色谱图。将结果示于图4。

〔凝胶过滤色谱法〕

色谱柱：Sepharose CL－4B填充色谱柱（以Sepharose CL－4B为载体填充到Φ1cm×38.5cm的色谱柱中而成。Sepharose CL－4B例如可从GE Healthcare公司等获得。

Sepharose CL－4B为4%交联琼脂糖、粒径为40－165μm（由激光衍射散射法得到）、CAS注册号为61970－08－9。）

缓冲液：0.1M磷酸缓冲液（pH7.0，含有0.2M的NaCl）

应用样品量：回収上清液约0.5mL（糖醛酸量约1mg）

流速：约0.15mL/min

馏分量：1mL/试管

分子量校正曲线：对于下述各种葡聚糖分子量标记物，在与上述同样的条件（其中，应用样品量为1mg）下进行凝胶过滤色谱法处理，利用苯酚·硫酸法对各洗脱馏分所包含的糖量（即葡聚糖量）进行定量，制作出校正曲线。

<葡聚糖分子量标记物>

Dextran Standard 1400000（SIGMA）···1400kDa

Dextran Standard 670000（SIGMA）···670kDa

Dextran Standard 410000（SIGMA）···410kDa

Dextran Standard 270000（SIGMA）···270kDa

按照Hodge,J.E.and Hofreiter,B.T.,Method in CarbohydrateChemistry,1338（1962）中记载的方法，如下所述进行葡聚糖的定量。

〔3〕加入2.5mL的浓硫酸，立即剧烈搅拌10秒钟。

〔4〕在室温下放置20分钟。

〔5〕使用分光光度计测定490nm的吸收。

如图4所示，馏分No.10～25均观察到糖醛酸及蛋白质的峰（即，糖醛酸及蛋白质的峰重叠），因此可以确认这些馏分中包含蛋白多糖。其原因在于，蛋白多糖具有在成为一个核的蛋白质（核心蛋白质）上键合有多个糖链（包含大量的糖醛酸作为结构糖（constituent sugar））的结构，所以认为检验出糖醛酸及蛋白质两者的馏分中包含蛋白多糖。此外，根据分子量校正曲线，认为馏分No.20中包含的成分的分子量约90万，馏分No.30中包含的成分的分子量约为15万。因此，可知由冷冻鲑鱼鼻软骨小片得到的回收上清液中，包含分子量约为90万以上的高分子量蛋白多糖。需要说明的是，在图中将“馏分No.”记为“试管No.”，但两者同义。

此外，通过下述条件的阴离子交换色谱法分，将包含提取自冷冻鲑鱼鼻软骨小片的蛋白多糖的回收上清液分离为各馏分，进行与上述相同的操作，绘制蛋白多糖糖醛酸量色谱图及蛋白多糖蛋白质量色谱图，糖醛酸的峰与蛋白质的峰重叠（图5，←→部分）。由此，也可以证明该回收上清液中包含蛋白多糖。

〔阴离子交换色谱法〕

色谱柱：DEAE Sephacel填充色谱柱（以DEAE（二乙氨乙基）Sephacel为载体而填充到Φ2.5cm×10cm的色谱柱而成。DEAE Sephacel例如可从GE Healthcare公司等获得。）

缓冲液：7M尿素/50mM Tris－HCl缓冲液（pH7.4）（使用0.1MNaCl，进行线性浓度梯度洗脱）

馏分量：10mL/试管

Claims

1.一种蛋白多糖提取方法，其为从鱼类软骨中提取蛋白多糖的方法，包含：

（A）在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序。

2.根据权利要求1所述的蛋白多糖提取方法，其中，每1小片的冷冻鱼类软骨小片为0.001～0.5g。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白多糖提取方法，其中，冷冻鱼类软骨小片是将鱼类软骨冷冻后小片化而成。

4.根据权利要求3所述的蛋白多糖提取方法，其中，鱼类软骨是经脱脂处理的鱼类鼻软骨。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其中，提取的蛋白多糖中包含分子量为90万以上的蛋白多糖。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其中，在水中进行长于3小时的加热。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的蛋白多糖提取方法，加热时的水的温度在80℃以上。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，供于加热的冷冻鱼类软骨小片总体的质量与水的质量之比为1：1～1：10。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的蛋白多糖提取方法，其特征在于，一直加热至加热后回收的残渣质量达到供于加热的冷冻鱼类软骨小片的质量以下为止。

10.根据权利要求9所述的蛋白多糖提取方法，其中，加热后回收的残渣是加热后在5000rpm、20分钟、4℃下通过离心分离处理而得到的沉淀。

11.一种提高来自鱼类软骨的蛋白多糖的提取效率的方法，其包含在水中加热冷冻鱼类软骨小片的工序。