CN102946894A - 用于制备构树提取物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于制备构树提取物的方法，其包括以下步骤：用溶剂对构树进行提取；将从上一步中提取的构树提取物进行分离的步骤；和使从上一步中分离出的构树提取物进行结晶的过程。通过上述制备构树提取物的方法，可以制备具有显著的美白皮肤的效果和良好的稳定性的构树提取物。

Description

用于制备构树提取物的方法
技术领域
本发明涉及用于制备构树（Broussonetia kazinoki）提取物的方法。
背景技术
黑色素是一种黑褐色的色素，起阻挡紫外线的作用，从而具有从紫外线中保护皮肤的功能。因此，当皮肤被暴露于紫外线中时，体内将产生大量的黑色素，以保护皮肤。肤色取决于黑色素的含量。黑色素的含量越多，皮肤则越黑。因此，黑色素的大量生成将引发疹斑、色斑、雀斑、黑斑等。因此，能够抑制黑色素生成的物质将具有美白皮肤的效果。
酪氨酸酶（Tyrosinase）是一种酶，其能使酪氨酸转化成多巴（dopa），相继被氧化成多巴奎宁（dopa quinine）。然后，多巴奎宁被聚合而形成黑色素。换言之，酪氨酸酶起能够催化黑色素生成的酶的作用，从而能抑制酪氨酸酶的物质可以具有美白皮肤的效果。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的在于提供用于制备构树提取物的方法，所述构树提取物含有高纯度且展示出显著的稳定性的活性成分。本发明的另一个目的在于提供通过上述方法制得的构树提取物，所述构树提取物含有高纯度的、用于美白皮肤的活性成分，而且对黑色素生成和酪氨酸酶的活性有显著的抑制效果。此外，本发明的另一个目的在于提供皮肤外用组合物，所述组合物含有所述构树提取物，并且具有显著的美白皮肤的效果。
技术方案
在一方面，本发明提供用于制备构树提取物的方法，所述方法包括如下步骤：（1）用溶剂对构树进行提取；（2）将来自步骤（1）的构树提取物静置；和（3）使来自步骤（2）的构树提取物进行结晶。
在另一方面，本发明提供通过上述方法制得的、用于美白皮肤的构树提取物。
在另一方面，本发明提供含有所述构树提取物的皮肤外用组合物。
有益效果
根据本发明的一方面，用来制备构树提取物的方法可以制备含有一种活性成分的构树提取物，所述活性成分展示高浓度和显著的稳定性。
根据本发明的另一方面，通过上述方法可以制备构树提取物，而且所述构树提取物具有显著的美白皮肤的效果，同时展示显著的稳定性。
根据本发明的另一方面，皮肤外用组合物含有所述构树提取物，并且具有显著的美白皮肤的效果。
附图说明
图1为展示构树提取物的构树醇（kazinol）C的含量（%）与抑制酪氨酸酶的效果（%）之间关系的图表。
图2为展示能用来表明在高速逆流色谱法（HSCCC）分离物中含有构树醇C的高效液相色谱分析法（HPLC analysis）的结果。
具体实施方式
这里使用的术语“提取物”是指，用任何方法从自然物质中提取成分而获得的任何物质。所述提取物包括，通过使用水或有机溶剂从天然物质中提取的可溶于所述溶剂的成分，以及从天然物质中提取的特定成分（如油类）中获得的物质。
这里使用的“皮肤”不仅包括覆盖动物的脸或身体表面的组织，而且还包括头皮和毛发。
下面将详细地描述本发明。
众所周知，构树提取物包含作为美白皮肤的活性成分的构树醇F，所述构树醇F将通过抑制酪氨酸酶的活性来展示其美白皮肤的效果。已知，构树提取物所含的构树醇C与曲酸（kojic acid）相比具有显著的抑制酪氨酸酶的效果。然而，所述用于美白皮肤的活性成分具有不稳定的活性，这使得所述提取物难以用于商业化。因此，如有能够用来制备构树提取物的方法，所述构树提取物含有高纯度的且具有稳定性的、美白皮肤的活性成分，便能制备对抑制酪氨酸酶的活性具有更为良好的效果的构树提取物，并且易于实现商业化。
在一方面，本发明提供用于制备构树提取物的方法，所述方法包括如下步骤：（1）用溶剂对构树进行提取；（2）将来自步骤（1）的构树提取物静置；和（3）使来自步骤（2）的构树提取物进行结晶。
本发明的方法所用的构树是属荨麻目桑科植物。在本发明的一个实施例中，构树包括小构树（Broussonetia kazinoki Siebold）、白花荛花（Wikstroemia trichotoma）或黄瑞香（Edgeworthiapapyrifera）。在本发明的另一个实施例中，构树可以为1～3年生的构树。在本发明的另一个实施例中，构树包括构树的任何部位中的一个或多个部位。例如，本发明中所用的构树可以包括构树的叶、花、茎、枝干、根部、果实和种子。在本发明的另一个实施例中，构树可以为构树的根皮。
根据本发明的一个实施例，用所述溶剂提取构树的步骤之前，用于制备构树提取物的方法可以进一步包括，通过清洗、干燥并切割来制备构树的步骤。具体地，用于制备构树的步骤可以包括如下过程：收集构树，切割收集的构树中的根部并剥离根皮；用水清洗所剥下的根皮；在通风良好的地方，将清洗过的根皮进行干燥5～7天；和以10～20cm的长度切割所述干燥过的根皮。
根据本发明的一个实施例，所述用于制备构树提取物的方法包括用溶剂提取构树的步骤。在本发明的一个实施例中，所述溶剂包括有机溶剂，特别地，包括乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮或氯仿，但不限于这些溶剂。所述乙醇包括C1-C5低级醇，其包括选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇和异丁醇中的任意一种物质或者其中两种或两种以上物质的混合物，但不限于这些溶剂。在本发明的一个实施例中，所用的所述溶剂的用量可以为相当于构树重量的5～20倍。
在本发明的一个实施例中，在50～100℃之间所述提取可以进行1～10小时。在本发明的另一个实施例中，在60～90℃之间所述提取可以进行3～8小时。在本发明的另一个实施例中，在60～80℃之间所述提取可以进行4～6小时。
根据本发明的一个实施例，用所述溶剂提取构树的步骤之后，用于制备构树提取物的方法可以进一步包括，过滤所述构树提取物的步骤，以去除不溶性成分。在本发明的一个实施例中，所述过滤可以用滤纸来实现。
根据本发明的一个实施例，过滤构树提取物的步骤之后，用于制备构树提取物的方法可以进一步包括，将过滤所得的构树提取物进行浓缩的步骤。在本发明的一个实施例中，可以在不超过80℃的温度下进行所述浓缩，具体为不超过60℃，直至所述提取物的体积达到浓缩前体积的1/10～1/20。
在本发明的一方面，所述用于制备构树提取物的方法可以包括，将所述构树提取物处于静置的步骤。在本发明的一个实施例中，将所述构树提取物处于静置的步骤可以在-5～25℃之间进行1～40小时。在本发明的另一个实施例中，将所述构树提取物处于静置的步骤可以在0～20℃之间进行5～30小时。在本发明的另一个实施例中，将所述构树提取物处于静置的步骤可以在0～15℃之间进行10～25小时。通过在低温下使所述构树提取物处于静置来沉淀杂质，而且所沉淀的成分是在所述溶剂中溶解度低的物质且不会影响所述构树提取物的效果，如抑制黑色素生成或抑制酪氨酸酶的效果。从而，会进一步提高所述构树提取物的效果，如抑制黑色素生成或抑制酪氨酸酶的效果。
根据本发明的一个实施例，将所述构树提取物处于静置的步骤之后，用于制备所述构树提取物的方法可以进一步包括，过滤所述构树提取物的步骤，以去除所沉淀的不溶性成分。在本发明的一个实施例中，所述过滤可以用滤纸来实现。
根据本发明的一个实施例，用于制备所述构树提取物的方法可以进一步包括，将所过滤的构树提取物进行再浓缩的过程。在本发明的一个实施例中，可以在不超过80℃的温度下进行所述再浓缩，具体为不超过60℃，直至所述提取物的体积达到再浓缩之前体积的1/2～1/3。
在本发明的一方面，用于制备所述构树提取物的方法可以包括，使所述构树提取物进行结晶的步骤。在本发明的一个实施例中，通过将所述构树提取物置于5～15℃的水中搅拌1～20小时来实现所述结晶。在本发明的另一个实施例中，通过将所述构树提取物置于0～10℃的水中搅拌1～15小时来实现所述结晶。在本发明的另一个实施例中，通过将所述构树提取物置于0～7℃的水中搅拌1～10小时来实现所述结晶。在本发明的另一个实施例中，水可以为相当于所述构树提取物体积的5～30倍的纯净水，具体为10～20倍。当添加的水越多且水温越低，所述构树提取物越容易形成结晶。通过实现上述结晶的过程，将进一步提高所述构树提取物的效果，如抑制酪氨酸酶的效果。
根据本发明的一个实施例，将所述构树提取物进行结晶的步骤之后，用于制备所述构树提取物的方法可以进一步包括，将所述构树提取物处于静置的步骤。在本发明的一个实施例中，在0～10℃的温度下所述静置可以进行10～30小时。此过程能促进所述提取物中沉淀物的生成。在本发明的另一个实施例中，用于制备所述构树提取物的方法可以包括，将所述构树提取物处于静置后形成沉淀物时，去除上层溶液并收集所述结晶的构树提取物的步骤。
根据本发明的一个实施例，收集所述结晶的构树提取物的步骤之后，用于制备所述构树提取物的方法可以进一步包括，将所述构树提取物进行干燥以获得粉末的步骤。通过用任何常用的干燥方法进行所述干燥，优选为冷冻干燥法。
根据本发明的一个实施例，使所述构树提取物进行结晶的步骤之后，用于制备所述构树提取物的方法可以进一步包括，将所述构树提取物加载至载体上的步骤。通过实现上述加载步骤，可以提高所述构树提取物中活性成分的活性的稳定性。所述活性成分包括能展示美白皮肤的效果的成分。具体地，所述活性成分可以为构树醇C。
在本发明的一个实施例中，所述载体包括选自聚乳酸（PLA）、聚己二酸乙二醇酯（PEA），聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），聚甲基丙烯酸丁酯（PBMA），三甲胺甲基丙烯酸乙酯（TMAEMA），固体脂质纳米粒（SLN）和二氧化硅中的一种物质或者其中两种或两种以上物质的混合物。在本发明的另一个实施例中，所述载体包括聚乳酸（PLA）、聚甲基丙烯酸丁酯/三甲胺甲基丙烯酸乙酯（PBMA/TMAEMA）共聚物、聚己二酸乙二醇酯（PEA）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、固体脂质纳米粒（SLN）或二氧化硅。通过将所述构树提取物加载至上述载体上，可以有效并容易地提高其稳定性。
在本发明的一个实施例中，所加载的所述构树提取物的量占所述载体重量的0.01～30wt%。在本发明的另一个实施例中，所加载的所述构树提取物的量占所述载体重量的1.0～20wt%。在本发明的另一个实施例中，所加载的所述构树提取物的量占所述载体重量的1.0～10wt%。在上述指定的范围内使用所述构树提取物时，不仅可以充分地展现本发明所预想的效果，并能同时满足所述提取物的稳定性和安全性，而且从成本效益方面来讲，最好在上述指定的范围之内使用所述构树提取物。
在本发明的一个实施例中，通过本领域所熟知的任何常用方法，将所述构树提取物加载至所述载体上。
根据本发明的一个实施例，使所述构树提取物进行结晶的步骤之后，用于制备所述构树提取物的方法可以进一步包括，用两相溶剂体系通过高速逆流色谱法（HSCCC）从所述构树提取物中收集美白皮肤的活性成分的步骤。在本发明的另一个实施例中，所述美白皮肤的活性成分包含构树醇C。通过所述方法，利用组合物之间分配系数的不同，分离并收集所述美白皮肤的活性成分。
为了更精确地进行分离，可以从能易于溶解所述美白皮肤的活性成分的溶剂中选取两相溶剂体系，所述两相溶剂体系为当混合时能分离成两相且其中美白皮肤的活性成分的分配系数接近1的两相溶剂体系。此时，其他组合物的分配系数不能与美白皮肤的活性成分之间的分配系数重叠。
在本发明的一个实施例中，所述两相溶剂体系中的美白皮肤的活性成分的分配系数可以为0.90～1.10。在本发明的另一个实施例中，所述两相溶剂体系中的美白皮肤的活性成分的分配系数可以为0.95～1.05。在本发明的另一个实施例中，所述两相溶剂体系中的美白皮肤的活性成分的分配系数可以为0.97～1.03。
在本发明的一个实施例中，所述两相溶剂体系可以包括己烷、乙酸乙酯、甲醇和水。在本发明的另一个实施例中，所述两相溶剂体系可以包括比例为1-10:1-10:1-10:1-10的己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，具体为1-5:1-5:1-5:1-5，优选为1-3:1-3:1-3:1-3。此时，所述溶剂间的比例可以为重量比或体积比。
在另一方面，本发明提供通过上述方法制得的用于美白皮肤的构树提取物。所述构树提取物将通过本发明的方法制得，所述方法与传统的提取方法不同，包括在低温下静置所述提取物并通过搅拌而诱导结晶的步骤。因此，所述构树提取物可以包含高纯度的美白皮肤的活性成分。所述美白皮肤的活性成分包括构树醇C。所述构树提取物与已知具有美白皮肤效果的现有物质相比具有更好的抑制黑色素生成和酪氨酸酶活性的效果，而且展示显著的美白皮肤的效果。
进一步，通过将所述构树提取物加载至所述载体上的稳定化过程，提高具有不稳定活性的用于美白皮肤的活性成分如构树醇C的稳定性，从而所述构树提取物具有更好的抑制黑色素生成及酪氨酸酶活性的效果，进而具有更好的美白皮肤的效果。此外，被加载至载体上的构树提取物展示出显著的皮肤安全性，从而可以在皮肤外用组合物中所使用。
在另一方面，本发明提供含有所述构树提取物的皮肤外用组合物。所述皮肤外用组合物包含所述构树提取物，所述构树提取物含有具有高纯度且稳定活性的美白皮肤的活性成分，从而所述皮肤外用组合物展示出显著的抑制黑色素生成及酪氨酸酶活性的效果，进而具有显著的美白皮肤的效果。此外，所述皮肤外用组合物不会引起皮肤的异常反应，因此可以安全使用。
在本发明的一个实施例中，含有所述构树提取物的皮肤外用组合物包括化妆品组合物。
所提供的化妆品组合物可以为适于局部涂抹的任何剂型。例如，所述化妆品组合物可以为溶液、水包油型乳液、油包水型乳液、悬浮液、固体、凝胶、浆糊、泡沫或喷雾形式的组合物。这些剂型可以通过本领域所熟知的任何常用方法来制备。
除上述成分外，所述化妆品组合物可以包含其他能提高所述组合物的主效果的且不影响其主效果的成分。本发明的化妆品组合物可以包括选自维生素、多肽、多糖和鞘脂中的一种物质。此外，本发明的化妆品组合物可以包含保湿剂、润肤剂、表面活性剂、紫外线吸收剂、防腐剂、消毒剂、抗氧化剂、pH调节剂、有机和无机颜料、调味剂、冷却剂或止汗剂。在不影响本发明的目的及效果的前提下，本领域的技术人员可容易地选择所述化妆品组合物中的上述组成物的含量。
在本发明的一个实施例中，含有所述构树提取物的皮肤外用组合物包含药物组合物。
在本发明的一个实施例中，所述药物组合物的剂型可以为固体、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、浆糊或喷雾剂，但不限于这些剂型。根据本领域所熟知的任何常用方法，可以通过使用表面活性剂、赋形剂、保湿剂、乳化剂、悬浮剂、用于渗透压的盐或缓冲剂、着色剂、调味剂、稳定剂、防腐剂或其他常用的添加剂来制备所述药物组合物的剂型。
本发明的药物组合物的活性成分的剂量将根据受试者的年龄、性别和体重、疾病的病理情况或严重程度、给药途径或医生的诊断而有所不同。根据上述因素，本领域的技术人员可以确定所述活性成分的剂量，而且所述活性成分的每天哦剂量可以为，例如0.001～50mg/kg/天，优选为0.1～5mg/kg/天，但不限于这些剂量。
下面，将通过实施例、对比实施例、剂型实施例和测试实施例来更为详细地描述本发明。然而，这些实施例、对比实施例、剂型实施例和测试实施例仅以说明为目的，不会限制本发明的范围。
测试实施例1：构树提取物的活性成分的确定
1.构树醇C的确定
在构树的乙醇提取物中，通过质谱分析法和NMR分析法确定构树醇C（分子量：464），而且所述构树提取物中的构树醇C的含量为8～15%。
2.用于评估抑制酪氨酸酶的效果的方法
在乙醇中，溶解50mg的用来评估抑制酪氨酸酶活性的试样，以制成100mg的溶液。取10ml的所述溶液，其中加入乙醇，制成100ml的试样溶液。加入500μl的基质溶液、450μl的纯净水和50μl的所述试样溶液，并与500μl的缓冲液进行混合，然后在所述混合物中加入50μl的酶（酪氨酸酶）溶液。在37℃下，将所得混合物反应10分钟，然后随即在冰上静置5分钟，最后在490nm下测量吸光度。根据所述试样相对于空白试样的吸光度，评估所述试样的抑制酪氨酸酶的效果。
3.构树醇C与抑制酪氨酸酶的效果的关系
通过高效液相色谱法（HPLC）分析在所述构树提取物中构树醇C的含量，然后按照所述构树醇C的含量的函数来评估抑制酪氨酸酶的效果。所述评估结果在图1中展示。如图1所示，当所述构树提取物中的构树醇C的含量在增加时，所述抑制酪氨酸酶的效果也在提高。
测试实施例2：对抑制酪氨酸酶的效果的评估
1.根据提取溶剂对抑制酪氨酸酶的效果的评估
通过清洗，干燥以及切割构树根皮而制备3个试样且分别加入到乙醇（实施例1）、乙酸乙酯（对比实施例1）以及丙酮（对比实施例2）中，并在60～80℃下进行提取4～6小时，然后评估所述提取物的产率。下一步，根据测试实施例1.2的方法，评估所述3个提取物的抑制酪氨酸酶的效果。下面表1中展示所述评估的结果。
[表1]
Figure BDA00002649785400061
如上述表1的结果中所示，当使用作为溶剂的乙醇时，展示最高的提取物的产率和显著的抑制酪氨酸酶的效果。此外，从而得出，由于作为溶剂的乙醇能简化生产过程，可以优先使用乙醇。这表明，将乙醇用作所述提取溶剂时，可容易地获得高产率的、具有抑制酪氨酸酶的效果的构树提取物。
2.根据提取物方法对抑制酪氨酸酶的效果的评估
通过清洗，干燥以及切割构树根皮并将所述切割的根皮加入于乙醇中而制备4个试样，并分别地在80℃下提取4小时（实施例2），在室温下提取1天（对比实施例3），在室温下提取7天（对比实施例4）以及在室温下提取3周（对比实施例5），然后评估所述提取物的产率。根据测试实施例1.2的方法，评估所述4个提取物对抑制酪氨酸酶的效果。在下面表2中展示所述评估结果。
[表2]
Figure BDA00002649785400071
如上述表1的结果中所示，在高温（80℃）下进行的提取与室温下进行的提取相比展示出高提取率和显著的抑制酪氨酸酶的效果。此外，由于能在短时间内制备具有抑制酪氨酸酶的效果的构树提取物，因此优选在高温下进行提取。
3.通过低温静置进行提取时对抑制酪氨酸酶的效果的评估
在4℃下，将测试实施例2.1中获得的实施例1的乙醇提取物静置12～24小时。待沉淀完杂质后，去除所述杂质，从而获得实施例3的提取物。根据测试实施例1.2的方法，评估实施例3的提取物的抑制酪氨酸酶的效果。
[表3]
  实施例1   实施例3
  抑制酪氨酸酶的效果(%)   25.1%   31.6%
如上述表3的结果中所示，当进行提取后在低温（4℃）下将所述提取物处于静置时，所述提取物的抑制酪氨酸酶的效果会提高。换言之，待进行提取后，通过在低温下静置所述提取物，可以提高所述构树提取物的抑制酪氨酸酶的效果。同时，所述产率从6.7%降低至5%，这表明从所述提取物中能有效地去除杂质。这将显示，在提取过程中，由于高温，也会提取乙醇中溶解度低的物质，然后通过低温下静置所述提取物的过程，又可以有效地去除这些杂质。在低温下静置所述提取物的过程中所沉淀的杂质将展示极少或没有抑制酪氨酸酶的效果。这表明，在低温下静置所述提取物的过程中，几乎没有损失具有抑制酪氨酸酶的效果的物质。
4.根据结晶对抑制酪氨酸酶的效果的评估
通过清洗，干燥以及切割构树的根皮来制备试样，然后在乙醇中加入该试样并在60～80℃下提取4～6小时。紧接着，在4℃下将所述提取物静置12～24小时，以沉淀并去除杂质。然后，在0～4℃的温度下，将所述提取物在相当于其体积的20倍的纯净水中慢慢搅拌，以使所述提取物形成结晶。收集所述形成结晶的提取物，从而获得实施例4的提取物。根据实施例1.2的方法，评估实施例4的提取物的抑制酪氨酸酶的效果。此外，评估作为对照组的曲酸的抑制酪氨酸酶的效果。所述提取物的结果将在下列表4中展示。
[表4]
  实施例4   对照组
  抑制酪氨酸酶的效果(%)   95%   80%
如上面表4的结果中所示，通过在冷纯净水中搅拌使所述构树提取物形成结晶时，它具有非常显著的抑制酪氨酸酶的效果。换言之，在低温下浸泡所述构树提取物时，所述抑制酪氨酸酶的效果通过结晶而被显著提高。同时，经过结晶过程后，所述提取物的产率为3%，这表明通过结晶过程能有效地去除杂质。在这过程中未形成结晶的上清夜展示极少或没有抑制酪氨酸酶的效果。这表明，在结晶过程中几乎没有损失具有抑制酪氨酸酶的效果的物质。
剂型实施例1～7：载体组合物的制备
1.包含5wt%的构树提取物的聚乳酸（PLA）胶囊的制备
在40ml的二氯甲烷中，溶解10g的PLA和0.2～0.3g硬脂醇，然后在其中加入并溶解0.5g的实施例4的构树提取物粉末。在400ml的溶有1wt%的聚乙烯醇(PVA)的水中搅拌所述溶液。在室温、减压条件下，去除二氯甲烷，然后过滤并干燥残余物，从而制备含有所述构树提取物的PLA胶囊（剂型实施例1）。
2.包含4wt%的构树提取物的PLA和聚甲基丙烯酸丁酯/三甲胺甲基丙烯酸乙酯（PBMA/TMAEMA）共聚物的胶囊的制备
本剂型实施例的方法是，在剂型实施例1中制得的含有5wt%的所述构树提取物的PLA胶囊的最外层上用PBMA/TMAEMA共聚物进行涂层的方法。首先，在250ml的乙醇中溶解10g的PBMA/TMAEMA共聚物，然后在500ml的溶有1wt%的PVA的水中均匀地分散55g的所述PLA胶囊。将乙醇相慢慢地加入到所述水相中，同时用均质器在5000rpm下搅拌所述溶液。在40℃、减压条件下，去除乙醇，然后过滤并干燥残余物，从而制备包含所述构树提取物的胶囊（剂型实施例2）。
3.包含5wt%的构树提取物的聚己二酸乙二醇酯（PEA）胶囊的制备
在200ml的二氯甲烷中溶解47.5g的PEA，而后在其中加入并溶解实施例4的构树提取物粉末。然后，将所述溶液加入到450ml的溶有1wt%的PVA的水中，并用均质器在5000rpm下进行搅拌。在室温、减压条件下，去除二氯甲烷，然后过滤并干燥残余物，从而制备PEA胶囊（剂型实施例3）。
4.包含2.5wt%的构树提取物的固体脂质纳米粒（SLN）的制备
溶解15g的蜂蜡和2g的氢化卵磷脂（hydrogenated lecithin）并加热至70℃，然后在其中加入并溶解2g的实施例4的构树提取物。在60℃下，将所述蜡相慢慢地加入到60g水中，同时用均质器搅拌所述溶液，从而获得SLN（剂型实施例4）。
5.包含5wt%的构树提取物的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）胶囊的制备
在40ml的二氯甲烷中溶解10g的PMMA，然后在其中加入并溶解0.5g的实施例4的构树提取物粉末。在400ml的溶有0.5wt%的泊洛沙姆（poloxamer）407的水中搅拌所述溶液。在室温、减压条件下，去除二氯甲烷，然后过滤并干燥残余物，从而制备PMMA胶囊（剂型实施例5）。
6.包含5wt%的构树提取物的聚己二酸乙二醇酯/聚甲基丙烯酸甲酯（PEA/PMMA）的制备
在200ml的二氯甲烷中溶解23.75g的PEA和23.75g的PMMA，然后在其中加入并溶解2.5g的实施例4的构树提取物粉末。在450ml的包含1wt%的PVA的水中加入所述溶液，并用均质器在5000rpm下进行搅拌。在室温、减压条件下，去除二氯甲烷，然后过滤并干燥残余物，从而制备PEA/PMMA胶囊（剂型实施例6）。
7.包含5wt%的构树提取物的二氧化硅粉末的制备
在乙醇中完全溶解所述构树提取物，然后其中加入介孔二氧化硅并充分地搅拌1～3小时。过滤所述搅拌溶液，并在室温下进行真空干燥，从而制备包含所述构树提取物的介孔二氧化硅粉末（剂型实施例7）。
实施例5～11和对比实施例6
根据常用方法，通过使用剂型实施例1～7中的胶囊制备具有表5中的组合物的实施例5～11以及对比实施例6的O/W型乳液剂型，以评估加载至载体上的所述构树提取物的活性成分的稳定性。
[表5]
Figure BDA00002649785400091
Figure BDA00002649785400101
实施例5～11以及对比实施例6的剂型包含占所述乳液组合物总重量的0.04wt%的所述构树提取物。
测试实施例3：对构树提取物的活性成分的稳定性的评估
当所述组合物被加载至所述载体上时，为了评估所述构树提取物的作为代表性活性成分的构树醇C稳定与否，通过HPLC分析每个剂型实施例1～7的载体组合物以及实施例5～11和对比实施例6的o/w型乳液中的构树醇C的含量。
测量分析开始时的起点以及测量4个月时每隔一个月的构树醇C的含量。将分析开始时起点的构树醇C的含量设为100%时，计算构树醇C的相对含量，计算结果将在下面表6中展示。
[表6]
Figure BDA00002649785400111
从上述表6的结果中所示，即使时间在流逝，剂型实施例1～7和实施例5～11中的构树醇的含量与对比实施例6中构树醇的含量相比都保持在高水平上。换言之，可以得知，将所述构树提取物加载至所述载体上时，其活性成分会具有高稳定性，即使将所述构树提取物制成化妆品剂型，也能维持这种高稳定性。
测试实施例4：对皮肤安全性的评估
对18名成年女性和12名成年男性进行贴片测试（平均年龄：32.5），以检测上述实施例的组合物对皮肤的安全性。
待贴片经28小时后，去除贴片，然后过30分钟后进行第一次判断。经过96小时后，进行第二次判断。根据皮肤的阳性反应的程度，通过对其赋予权重来确定皮肤的平均反应的程度，以检测所述实施例和对比实施例的组合物对皮肤刺激的强度。此外，用肉眼判断所述实施例和对比实施例的组合物对皮肤的刺激，并确定其等级。其结果将在下面表7中展示。
[表7]
 测试物质   平均反应程度   等级
 实施例5   0   无刺激
 实施例6   0   无刺激
 实施例7   0   无刺激
 实施例8   0   无刺激
 实施例9   0   无刺激
 实施例10   0   无刺激
 实施例11   0   无刺激
 对比实施例6   0   无刺激
如上述表7的结果中所示，实施例5～11的组合物不会刺激皮肤。因此，可得出本发明的化妆品组合物对皮肤是安全的。
测试实施例5：对构树提取物的美白皮肤效果的评估
1.细胞毒性的检测
（1）细胞培养
从细胞株银行购买取自C57BL/6J（黑色，a/a）小鼠黑素瘤中的B16黑素瘤细胞。在37℃和10％的CO2的条件下，在含有10％的胎牛血清（LONZA）、50U/ml的青霉素和50μg/ml的200nM链霉素的DMEM培养基（LONZA）中培养所述细胞。
（2）细胞毒性的检测（MMT实验法）
将B16黑素瘤细胞接种于96孔板内并培养1天，每孔的密度为1x104个/孔。用新培养基更换所述培养基，所述新培养基中分别含有熊果苷以及各种浓度的剂型实施例6的组合物，然后将所述细胞培养24小时。在每个孔中加入50μl的浓度为2mg/ml的MTT溶液，所述MTT溶液是通过将MTT溶解到细胞培养基内而制得的，而且使加入于每个孔中的培养基的最终体积达到200μl，然后将所述细胞进行培养3～4小时。去除所述培养基，在150μl的DMSO中溶解所生成的甲臜晶体，然后在540nm下测量所述甲臜溶液的吸光度。
[表8]
Figure BDA00002649785400121
如上述表8的结果中所示，剂型实施例6的组合物在低于200μg/ml的浓度下没有细胞毒性，并且熊果苷在低于100μg/ml的浓度下没有细胞毒性。根据这些结果，在低于150μg/ml的浓度下测量剂型实施例6的组合物，在低于100μg/ml的浓度下测量熊果苷。
2.对抑制黑色素生成的评估
为了将细胞粘帖至孔板之上，在24孔板内接种B16黑素瘤细胞，每孔的密度为1x104个/孔，并培养一夜。然后，在每个孔中加入含有1μM的用于促进黑色素生成的α-黑素细胞刺激素(α-MSH)以及各浓度的剂型实施例6或熊果苷的测试试样。将所述板培养72小时后，取200μl的所述细胞培养基并在405nm下测量其吸光度。通过所述检测，计算黑色素的含量。将计算的相对于对照组（未经所述测试物质处理）的黑色素的含量用百分比表示，所述结果将在下面表9中展示。
[表9]
Figure BDA00002649785400131
如上述表9的结果中所示，用150μg/ml的剂型实施例6的测试试样进行处理时，与对照组相比展示出40.4%的对黑色素的生成的抑制率，而用100μg/ml的剂型实施例6的测试试样进行处理时，与对照组相比展示出31.9%的对黑色素的生成的抑制率。用100μg/ml的熊果苷的测试试样进行处理时，展示出21.2%的对黑色素的生成的抑制率。这表明，通过本发明制得的构树提取物具有良好的抑制黑色素生成的效果。
3.对抑制酪氨酸酶活性的评估
制备一种反应溶液，所述反应溶液含有反应缓冲液(0.1M的磷酸钾缓冲液,pH为6.8)、0.03%的L-酪氨酸基质溶液(L-tyrosine substrate solution，在反应缓冲液中含有0.3mg/ml)和蘑菇酪氨酸酶溶液（mushroom tyrosinase solution，在反应缓冲液中含有2unit/μl）。首先，制备作为测试试样的各种浓度的熊果苷和剂型实施例，其中加入相当于10单位的酶后，再加入0.1M的磷酸缓冲液，使其最终体积成为100μl。将100μl的0.03%的L-酪氨酸基质溶液加入到其中后，随即在475nm下测量吸光度。然后，在37℃下使所述混合物反应10分钟，之后置于冰上使之停止反应，而后再测量其吸光度。将10分钟内吸光度的变化与对照组进行比较。其结果将在下面表10中展示。
[表10]
如表10的结果中所示，剂型实施例6的组合物与对照组（未经所述测试试样处理）相比在统计学上展示出显著的抑制酪氨酸酶活性的效果，而且其效果比熊果苷的效果更优秀，已知熊果苷具有良好的抑制酪氨酸酶活性有效果。能够抑制50%的酪氨酸酶活性的浓度(IC50)为，剂型实施例6的组合物为23.7μg/ml，熊果苷为209.6μg/ml。
这表明，通过本发明所制得的构树提取物具有良好的抑制酪氨酸酶活性的效果。
因此，可得知通过本发明所制备的构树提取物具有良好的抑制黑色素生成及酪氨酸酶活性的效果，从而具有显著的美白皮肤的效果。
测试实施例6：对构树提取物的美白皮肤效果的评估（临床评估）
选取23名18～60岁的成年女性（平均年龄：42.17）。通过使用配有300W的氙弧灯的多端口太阳模拟器601-300W（Solar Light，美国），将相当于2.5MED的UV光照射到每位受试者的手臂的两个部位上，从而诱导皮肤的色素沉淀。待10天后，将实施例10的O/W型乳液和对照组（无构树提取物）分别涂抹于所述两个部位上。涂抹后，在温度22～24℃和湿度40～60％下，进行皮肤科医生的视觉评估和仪器评估。经过4、6和8周后，进行皮肤科医生的视觉评估、仪器评估和问卷调查。
1.由皮肤科医生作出的视觉评估
通过将皮肤色素沉淀的程度分为8个等级（0～7级；7=皮肤的色素沉淀的最高等级），由皮肤科医生进行视觉评估。所述评估的结果将在下面表11中展示。
[表11]
Figure BDA00002649785400142
如上述表11的结果中所示，经过4周、6周和8周后，涂抹过实施例10的乳液的皮肤色素沉淀的程度低于涂抹过对照组的皮肤色素沉淀的程度。此外，实施例10的乳液比对照组展现出更高的皮肤色素沉淀的程度。这个结果能表明，实施例10的乳液具有非常显著的抑制色素沉淀的效果。
因此，可得知通过本发明制得的构树提取物具有良好的美白皮肤的效果。
2.仪器评估
通过用比色计CR-400（Minolta，日本）测量UV辐射部位的L*值来进行仪器评估，其评估结果将在下面表12中展示。在5个测量值中去掉最大值和最小值后，对剩余三个测量值进行平均。
[表12]
此外，通过用皮肤黑色素及血红素测试仪MX18（Mexameter MX18，德国）测量黑色素指数来进行仪器评估。其评估结果将在下面表13中展示。在5个测量值中去掉最大值和最小值后，对剩余三个测量值进行平均。
[表13]
Figure BDA00002649785400152
如上述表12和表13的结果中所示，经过4周、6周和8周之后，涂抹过实施例10的乳液的皮肤光泽度比涂抹过对照组的皮肤光泽度更亮。从而可知，通过本发明制得的构树提取物具有良好的美白皮肤的效果。
3.问卷调查
在测试期间，由受试者用5个等级对涂抹部位的肤色变亮与否，色素沉淀部位的区域变小与否以及皮肤纹理变柔滑与否进行评价，等级越高，则表明改变得越好。以下表中展示每个等级所占的受试者的百分比。
[表14]
肤色变亮与否
Figure BDA00002649785400161
[表15]
色素沉淀部位的区域变小与否
Figure BDA00002649785400171
[表16]
皮肤纹理变柔滑与否
Figure BDA00002649785400181
如上述表14～16的结果中所示，与对照组相比，当涂抹实施例10的乳液时，所述UV辐射部位的肤色变得更亮，所述色素沉淀部位的区域变小且皮肤纹理变得更柔滑。
4.异常反应
在测试期间，涂抹过实施例10的乳液的部位未出现接触性皮炎症状或其他异常反应。这表明，实施例10的乳液适用于皮肤上。
此外，从而得知，将含有通过本发明制得的构树提取物的皮肤外用组合物涂抹于人体上时，其表现出能改善皮肤色素沉淀及美白皮肤的效果。
测试实施例7：构树醇C的分离
1.两相溶剂体系的选择
对包含各种组合物的己烷/乙酸乙酯/甲醇/水的混合物进行测试。从而可知，当己烷/乙酸乙酯/甲醇/水的比例为5/5/5/2时，构树醇C的分配系数展示为0.997（非常接近于1），并且不会与其他组成物的分配系数重叠。
通过以下方法，测量构树醇C的分配系数。首先，将1mg的实施例3的提取物放入10ml的试管内，在其中各加入2ml的已达到平衡的两相溶剂体系的上层溶液和下层溶液，然后将所述混合物剧烈摇动1分钟。当所述两相达到平衡后，各取100μl的上层溶液和下层溶液并进行干燥，溶解于1ml的乙醇中，然后用HPLC进行分析。将上层溶液中构树醇C的含量除以下层溶液中构树醇C的含量来确定分配系数。
2.通过HSCCC的分离
采用HSCCC（高速逆流色谱法）TBE-1000A。首先，将作为固定相的上层溶液以10ml/分钟的流速填充于线圈列中，并且当设备旋转400rpm时将作为流动相的低层溶液以5ml/分钟的流速用泵打入线圈列中。当流动相流出，可以确定达到液-液平衡。当达到平衡时，注入50ml的含有0.5g的实施例3的提取物的溶液。分离温度将保持在室温。从线圈列出口流出的液体经过280nm的UV检测器而得到分馏物。
3.HPLC分析
分析所述HSCCC分馏物，其分析结果在图2中展示。如图2所示，所述HSCCC分馏物含有高纯度的构树醇C，这表明构树醇C从所述提取物中被分离而出。

Claims (15)

1.用于制备构树提取物的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）用溶剂对构树进行提取；
（2）将来自步骤（1）的构树提取物静置；和
（3）使来自步骤（2）的构树提取物进行结晶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构树包括构树的根皮。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂包括乙醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取的步骤在50～100℃的温度下进行1～10小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将构树提取物静置的步骤在-5～25℃的温度下进行1～40小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述构树提取物进行结晶的步骤包括，在-5～25℃的温度下将所述构树提取物在水中搅拌1～20小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述构树提取物进行结晶的步骤之后，所述方法进一步包括，将所述构树提取物加载至载体上的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述载体为选自聚乳酸（PLA）、聚己二酸乙二醇酯（PEA）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚甲基丙烯酸丁酯（PBMA）、三甲胺甲基丙烯酸乙酯（TMAEMA）、固体脂质纳米粒（SLN）和二氧化硅中的一种物质或者其中两种或两种以上物质的混合物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所使用的构树提取物占所述载体重量的0.01-30wt%。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述构树提取物进行结晶的步骤之后，所述方法进一步包括，用两相溶剂体系通过HSCCC（高速逆流色谱法）从所述构树提取物中获取美白皮肤的活性成分的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述美白皮肤的活性成分包含构树醇C。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述两相溶剂体系包括己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，其比例为1-10∶1-10∶1-10∶1-10。
13.用于美白皮肤的构树提取物，该提取物是通过权利要求1～12中任何一项所述的方法制得的。
14.根据权利要求13所述的构树提取物，其特征在于，所述构树提取物具有抑制黑色素生成和酪氨酸酶的效果。
15.一种皮肤外用组合物，其含有权利要求13中所述的构树提取物。
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