JP6081633B2 - コウゾ抽出物 - Google Patents

Description

本発明は、コウゾ抽出物に関する。

メラニンは、黒褐色の色素で、一定量以上の紫外線を遮断する機能があり、紫外線から皮膚を保護する作用をする。したがって、皮膚が紫外線に露出される場合、皮膚を保護するために身体からメラニンが多量に生成される。メラニンの量によって色が決定され、メラニンの量が多くなるほど皮膚は黒色を帯びるようになるので、メラニンの多量生成は、シミ、ホクロ、ソバカス、シミ等の原因となる。したがって、メラニンの生成を阻害する物質は、皮膚美白効果を有することができる。

チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）をドーパ（ｄｏｐａ）に変化させて、それをドーパキノン（ｄｏｐａ ｑｕｉｎｉｎｅ）に酸化させる酵素である。ドーパキノン分子は、引き続き重合してメラニンを形成する。すなわち、チロシナーゼは、メラニン生成触発酵素として作用するため、これを阻害する物質は、皮膚美白効果を有することができる。

国際公開第２０１０／０６２０８７号 韓国特許第１０−０８５８９１７号公報 韓国公開特許１０−２００６−０１２１４９６号公報

本発明は、有効成分を高い純度で含むとともに、優れた安定性を示すコウゾ抽出物の製造方法を提供しようとする。また、前記コウゾ抽出物の製造方法によって製造される、高い純度の皮膚美白有効成分を含むとともに、優れたメラニン生成及びチロシナーゼ活性阻害効果を有する皮膚美白用コウゾ抽出物を提供しようとする。そして、前記コウゾ抽出物を含んで優れた美白効果を有する皮膚外用剤組成物を提供しようとする。

本発明の一側面は、コウゾ（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａ ｋａｚｉｎｏｋｉ）を溶媒抽出するステップ；前記ステップで抽出したコウゾ抽出物を放置するステップ；及び、前記ステップで放置したコウゾ抽出物を結晶化するステップ、を含むコウゾ抽出物の製造方法を提供する。

本発明の他の一側面は、前記コウゾ抽出物の製造方法により製造された皮膚美白用コウゾ抽出物を提供する。

本発明のさらに他の一側面は、前記コウゾ抽出物を含む皮膚外用剤組成物を提供する。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、有効成分を高い純度で含むともに、優れた安定性を示すコウゾ抽出物を製造することができる。

本発明の他の一側面によるコウゾ抽出物は、前記コウゾ抽出物の製造方法により製造さ
れるため、皮膚美白効果に優れるとともに、優れた安定性を示す。

本発明のさらに他の一側面による皮膚外用剤組成物は、前記コウゾ抽出物を含むため、優れた皮膚美白効果を有する。

コウゾ抽出物のカジノールＣ含量（％）とチロシナーゼ阻害効果（％）との関係を示したグラフである。 ＨＳＣＣＣ分別物にカジノールＣが含まれていることを示すＨＰＬＣ分析結果のグラフである。

本明細書において、「抽出物」とは、天然物からその中の成分を抜き出すことにより得られた物質であれば、抜き出す方法や成分の種類に関係なく、すべて含む。たとえば、水や有機溶媒を利用して天然物から溶媒に溶解される成分を抽出した物、天然物の特定成分、たとえば、オイルといった特定成分のみを抽出して得られた物等をすべて含む広義の概念である。

本明細書において、「皮膚」とは、動物の体表を覆う組織を意味するものであって、顔又はボディ等の体表を覆う組織だけでなく、頭皮や毛髪を含む最広義の概念である。

以下において、本発明について詳細に説明する。

コウゾ抽出物は、カジノール（ｋａｚｉｎｏｌ）Ｆという皮膚美白有効成分を含むことにより、チロシナーゼを阻害して皮膚美白効果を示すものと知られている。コウゾ抽出物に含まれたカジノールＣもまた、チロシナーゼを阻害する効果に優れ、これは、コウジ酸よりもチロシナーゼ阻害効果に優れるものと知られている。しかし、前記皮膚美白有効成分は、不安定な力価を有するため、製品化することが難しいという短所を有する。したがって、皮膚美白有効成分が高い純度で含まれるとともに、優れた安定性を示すコウゾ抽出物を製造する方法があるならば、さらに向上したチロシナーゼ阻害効果を有するコウゾ抽出物を製造することができ、ひいては製品化することが容易であろう。

本発明の一側面は、コウゾを溶媒抽出するステップ；前記ステップで抽出したコウゾ抽出物を放置するステップ；及び、前記ステップで放置したコウゾ抽出物を結晶化するステップ、を含むコウゾ抽出物の製造方法を提供する。

前記コウゾ（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａ ｋａｚｉｎｏｋｉ）は、イラクサ目クワ科に属する植物である。本発明の一側面において、前記コウゾは、ヒメコウゾ、ガンピ又はミツマタを含む。本発明の他の一側面において、前記コウゾは、１〜３年生のコウゾであってよい。本発明のさらに他の一側面において、前記コウゾは、コウゾのすべての部位のうち一つ以上を含む。たとえば、前記コウゾは、コウゾの葉、花、幹、枝、根、実及び種子のうち一つ以上を含んでよい。本発明のさらに他の一側面において、前記コウゾは、コウゾの根皮であってよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記コウゾを溶媒抽出するステップの前に、コウゾを洗浄、乾燥、切断して準備するステップをさらに含んでよい。具体的に、前記コウゾを準備するステップは、コウゾを採取した後、根の部分を切断し、根皮を剥がす過程；剥がした根皮を水で洗い、風通しのよい所で５〜７日間乾燥する過程；乾燥したコウゾの根皮を約１０〜２０ｃｍの長さに切断する過程を含んでよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、コウゾを溶媒抽出するステップを含む。本発明の一側面において、前記溶媒は、有機溶媒、具体的に、アルコール、エーテル、酢酸エチル、アセトン又はクロロホルムを含むが、これらに制限されるものではない。前記アルコールは、Ｃ_１〜Ｃ_５の低級アルコールを含み、Ｃ_１〜Ｃ_５の低級アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ‐プロピルアルコール、ｎ‐ブタノール及びイソブタノールにより構成される群より選択されるいずれか一つ又は二つ以上の混合溶媒を含むが、これらに制限されるものではない。本発明の一側面において、前記溶媒は、コウゾ重量の５〜２０倍に該当する重量で含まれてよい。

本発明の一側面において、前記抽出は、５０〜１００℃で１〜１０時間行われてよい。本発明の他の一側面において、前記抽出は、６０〜９０℃で３〜８時間行われてよい。本発明のさらに他の一側面において、前記抽出は、６０〜８０℃で４〜６時間行われてよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、コウゾを溶媒抽出するステップの後、前記コウゾ抽出物を濾過して不溶性成分を除去するステップをさらに含んでよい。本発明の一側面において、前記濾過は、濾過紙を使用して行われてよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記コウゾ抽出物を濾過するステップの後、濾過したコウゾ抽出物を濃縮するステップをさらに含んでよい。本発明の一側面において、濃縮時の温度は、８０℃、具体的に、６０℃を超えないようにし、抽出物の体積が濃縮前の体積に比べて１０分の１〜２０分の１以下となるまで進行されてよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、抽出したコウゾ抽出物を放置するステップを含む。本発明の一側面において、前記放置は、低温で進行されてよい。本発明の他の一側面において、前記放置は−５〜２５℃で１〜４０時間進行されてよい。本発明のさらに他の一側面において、前記放置は、０〜２０℃で５〜３０時間進行されてよい。本発明のさらに他の一側面において、前記放置は、０〜１５℃で１０〜２５時間進行されてよい。かかる低温での放置を通じて不純物を沈殿させることができ、また、このとき沈殿される成分は溶媒に対する溶解度の低い物質であって、コウゾ抽出物の効果、たとえば、メラニン生成阻害又はチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）阻害効果には影響を及ぼさない物質である。これを通じて、コウゾ抽出物の効果、たとえば、メラニン生成阻害又はチロシナーゼ阻害効果がより向上され得る。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、抽出したコウゾ抽出物を放置するステップの後、前記コウゾ抽出物を濾過して、沈殿された不溶性成分を除去するステップをさらに含んでよい。本発明の一側面において、前記濾過は、濾過紙を使用して行われてよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記濾過したコウゾ抽出物を再濃縮するステップをさらに含んでよい。本発明の一側面において、再濃縮時の温度は、８０℃、具体的に、６０℃を超えないようにし、抽出物の体積が再濃縮前の体積に比べて２分の１〜３分の１以下となるまで進行されてよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、コウゾ抽出物を結晶化するステップを含む。本発明の一側面において、前記結晶化は、コウゾ抽出物を−５〜１５℃の水に入れ、１〜２０時間攪拌しながら進行されてよい。本発明の他の一側面において、前記結晶化は、コウゾ抽出物を０〜１０℃の水に入れ、１〜１５時間攪拌しながら進行されてよい。本発明のさらに他の一側面において、前記結晶化は、コウゾ抽出物を０〜７℃の水に入れ、１〜１０時間攪拌しながら進行されてよい。本発明のさらに他の一側面において、水
は、コウゾ抽出物の体積の５〜３０倍、具体的に、１０〜２０倍の体積を有する精製水であってよい。添加される水の量が多いほど、そして温度が低いほど結晶化が十分に起こり、また、かかる結晶化過程を通じて、コウゾ抽出物の効果、たとえば、チロシナーゼ阻害効果がより向上され得る。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記コウゾ抽出物を結晶化するステップの後、コウゾ抽出物を放置するステップをさらに含んでよい。本発明の一側面において、前記放置は、０〜１０℃で１０〜３０時間進行されてよい。かかる過程を通じて、沈殿がより十分に生成され得る。本発明の他の一側面において、コウゾ抽出物の製造方法は、放置後に沈殿が形成されると、上層部の溶液を除去し、結晶化されたコウゾ抽出物を収得するステップを含んでよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記結晶化されたコウゾ抽出物を収得するステップの後、前記コウゾ抽出物を乾燥して粉末に製造するステップをさらに含んでよい。前記において乾燥は、通常的な乾燥法をすべて使用してよく、具体的に、冷凍乾燥（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｄｒｙｉｎｇ）法を使用してよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記コウゾ抽出物を結晶化するステップの後、コウゾ抽出物を担体に担持するステップをさらに含んでよい。かかる手順を通じて、コウゾ抽出物内の有効成分の力価安定度を向上させ得る。前記有効成分は、皮膚美白効果を示す成分を含む。具体的には、前記有効成分は、カジノールＣであってよい。

本発明の一側面において、前記担体は、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ，
ＰＬＡ）、ポリエチレンアジペート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｄｉｐａｔｅ， ＰＥＡ）、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ，
ＰＭＭＡ）、ポリブチルメタクリレート（ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ， ＰＢＭＡ）、トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ， ＴＭＡＥＭＡ）、固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ， ＳＬＮ）及びシリカ（ｓｉｌｉｃａ）からなる群より選択された一つ又は二つ以上の混合を含んでいる。本発明の他の一側面において、前記担体は、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ， ＰＬＡ）、ポリ乳酸及びポリブチルメタクリレート／トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート（ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ／ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ， ＰＢＭＡ／ＴＭＡＥＭＡ）共重合体、ポリエチレンアジペート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｄｉｐａｔｅ， ＰＥＡ）、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ， ＰＭＭＡ）、ポリエチレンアジペートとポリメチルメタクリレート、固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ， ＳＬＮ）又はシリカ（ｓｉｌｉｃａ）を含む。コウゾ抽出物を前記のような担体に担持することにより、効率的かつ容易に安定度を高め得る。

本発明の一側面において、前記コウゾ抽出物は、担体重量に対して０．０１〜３０重量％であってよい。本発明の他の一側面において、前記コウゾ抽出物は、担体重量に対して０．１〜２０重量％であってよい。本発明のさらに他の一側面において、前記コウゾ抽出物は、担体重量に対して１．０〜１０重量％であってよい。前記範囲で使用する場合、本発明の意図した効果を示すのに適切であるだけでなく、抽出物の安定性及び安全性をともに満足し得、また、費用対効果の側面においても、前記範囲で使用することが適切であり得る。

本発明の一側面において、コウゾ抽出物を担体に担持する方法は、通常的に知られてい
る方法によるものであってよい。

本発明の一側面によるコウゾ抽出物の製造方法は、前記コウゾ抽出物を結晶化するステップの後、二相溶媒系のＨＳＣＣＣ（Ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して、コウゾ抽出物から皮膚美白有効成分を収得するステップをさらに含んでよい。本発明の他の一側面において、前記皮膚美白有効成分は、カジノールＣ（ｋａｚｉｎｏｌ Ｃ）を含む。前記方法は、各成分の分配係数の差を利用して皮膚美白有効成分を分離、収得してよい。

より正確な分離のために、皮膚美白有効成分が十分に溶解され得る溶媒のうち、混合時に二相に分離されるが皮膚美白有効成分の分配係数が１に近い二相溶媒系を選定してよい。このとき、他の成分の分配係数が皮膚美白有効成分の分配係数と重ならないようにする。

本発明の一側面において、前記二相溶媒系に対する皮膚美白有効成分の分配係数は、０．９０〜１．１０であってよい。本発明の他の一側面において、前記二相溶媒系に対する皮膚美白有効成分の分配係数は、０．９５〜１．０５であってよい。本発明のさらに他の一側面において、前記二相溶媒系に対する皮膚美白有効成分の分配係数は、０．９７〜１．０３であってよい。

本発明の一側面において、前記二相溶媒系は、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール及び水を含んでよい。本発明の他の一側面において、前記二相溶媒系は、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール及び水を、１〜１０：１〜１０：１〜１０：１〜１０、具体的に１〜５：１〜５：１〜５：１〜５、より具体的に１〜３：１〜３：１〜３：１〜３の比率で含んでよい。前記において各溶媒の比率は、各溶媒の重量比又は体積比を意味してよい。

本発明の一側面は、前記コウゾ抽出物の製造方法によって製造された皮膚美白用コウゾ抽出物を提供する。前記コウゾ抽出物は、既存の抽出方法と異なり、低温で放置するステップ、及び低温で撹拌しながら結晶を誘導する結晶化ステップを含む本発明の一側面による方法によって製造されるため、より高い純度の皮膚美白有効成分を含み得る。前記皮膚美白有効成分は、カジノール（ｋａｚｉｎｏｌ）Ｃを含む。前記コウゾ抽出物は、既存の皮膚美白効果を示すと知られている物質よりも向上したメラニン生成阻害及びチロシナーゼ阻害効果を有し得、また非常に優れた美白効果を示し得る。

さらに、コウゾ抽出物を担体に担持する安定化過程を通じて、不安定な力価を有する皮膚美白有効成分、たとえば、カジノール（ｋａｚｉｎｏｌ）Ｃの力価安定度を高めることができるため、より向上したメラニン生成阻害、チロシナーゼ阻害効果、ひいては皮膚美白効果を有し得る。また、担体に担持したコウゾ抽出物は、優れた皮膚安全性を示すので、皮膚外用剤組成物に使用され得る。

本発明の一側面は、前記コウゾ抽出物を含む皮膚外用剤組成物を提供する。前記皮膚外用剤組成物は、高い純度と力価安定度の皮膚美白有効成分を含むコウゾ抽出物を含むことにより、優れたメラニン生成阻害、チロシナーゼ阻害効果、ひいては皮膚美白効果を示す。また、前記皮膚外用剤組成物は、皮膚異常反応を惹き起こさないため、使用に安全である。

本発明の一側面において、コウゾ抽出物を含む皮膚外用剤組成物は、化粧品組成物を含む。

前記化粧品組成物は、局所適用に適したあらゆる剤形で提供されてよい。たとえば、溶
液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（ｆｏａｍ）又はエアロゾル組成物の剤形で提供されてよい。こうした剤形の組成物は、当該分野の通常的な方法によって製造されてよい。

前記化粧品組成物は、前述した物質以外に、主効果を損なわない範囲内で、好ましくは主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含有してよい。本発明に係る化粧品組成物は、ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖及びスフィンゴ脂質からなる群より選択された物質を含んでよい。また、本発明に係る化粧品組成物は、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機及び無機顔料、香料、冷感剤又は制汗剤を含んでよい。前記成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で、当業者が容易に選定可能である。

本発明の一側面において、コウゾ抽出物を含む皮膚外用剤組成物は、薬学組成物を含む。

本発明の一側面による薬学組成物の剤形は、固体、溶液剤、懸濁剤、乳液剤、ゲル、パッチ又は噴霧剤であってよいが、これに制限されるものではない。前記剤形は、当該分野の通常的な方法により容易に製造されてよく、界面活性剤、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、浸透圧調節のための塩又は緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤又はその他常用する補助剤を適当に使用してよい。

本発明の一側面による薬学組成物の有効成分は、投与を受ける対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路、又は処方者の判断に応じて異なるであろう。こうした因子に基づいた適用量の決定は、当業者の水準内にあり、その１日投与量は、たとえば、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日とされてよいが、これに制限されるものではない。

以下、実施例、比較例、製造例及び試験例を挙げつつ、本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。しかし、かかる実施例、比較例、製造例及び試験例は、本発明に対する理解を助けるために、例示の目的でのみ提供されたものであるに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がそれによって制限されるものではない。

［試験例１］コウゾ抽出物の有効成分の確認
１．カジノールＣの同定
コウゾをエタノールで抽出したコウゾ抽出物に対し、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ）及びＮＭＲ分析を通じてカジノールＣ（分子量４６４）を同定し、コウゾ抽出物に８〜１５％存在することを確認した。

２．チロシナーゼ阻害効果の評価方法
チロシナーゼの阻害の程度を評価しようとする試料５０ｍｇを秤量して、エタノールに溶かして１００ｍｌとする。作製された溶液１０ｍｌを取った後、エタノールをさらに添加して１００ｍｌとして検液とする。緩衝液５００μｌに、基質液５００μｌ、精製水４５０μｌ及び検液５０μｌを入れ、混合した後、酵素（チロシナーゼ）液５０μｌを入れ、混合する。３７℃で１０分間反応させてから、すぐに氷の上で５分間放置した後、４９０ｎｍで吸光度を測定する。空試料の吸光度に対する試料の吸光度を利用して、試料のチロシナーゼ阻害効果を評価する。

３．カジノールＣとチロシナーゼ阻害効果との関係
コウゾ抽出物内カジノールＣの含量をＨＰＬＣで分析し、その含量によるチロシナーゼ
阻害効果の程度を比較した。その結果は、図１に示す。図１から見られるように、コウゾ抽出物内カジノールＣの含量が高いほど、チロシナーゼ阻害効果も高くなることを確認することができる。

［試験例２］チロシナーゼ阻害効果の評価
１．抽出溶媒によるチロシナーゼ阻害効果の評価
コウゾの根皮を洗浄、乾燥及び切断した３つの試料を準備して、それぞれエタノール（実施例１）、酢酸エチル（比較例１）及びアセトン（比較例２）に入れ、６０〜８０℃で４〜６時間抽出した後、その収率を評価した。その後、前記試験例１．２の方法で、３つの抽出物のチロシナーゼ阻害効果を評価した。その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、エタノールを溶媒として使用した場合、抽出収率に最も優れ、チロシナーゼ阻害効果にも優れる。また、エタノールを溶媒として使用すると、容易な生産工程を図ることができるという点で好ましいものと判断される。これを通じ、アルコールを溶媒として使用して抽出する場合、高い収率でチロシナーゼ阻害効果に優れたコウゾ抽出物を容易に得ることができることを知ることができる。

２．抽出方法によるチロシナーゼ阻害効果の評価
コウゾの根皮を洗浄、乾燥及び切断した後にエタノールに入れた４つの試料を準備して、それぞれ８０℃で４時間（実施例２）、常温で１日間（比較例３）、常温で７日間（比較例４）及び常温で３週間（比較例５）抽出し、その収率を評価した。前記試験例１．２の方法で４つの抽出物のチロシナーゼ阻害効果を評価した。その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、高温（８０℃）で抽出した場合、常温で抽出する場合に比べて抽出収率が高く、チロシナーゼ阻害効果にも優れる。また、高温で抽出する場合、優れたチロシナーゼ阻害効果を有するコウゾ抽出物を短い時間内で製造することができるという点において好ましい。

３．低温放置によるチロシナーゼ阻害効果の評価
前記試験例２．１で得られた実施例１のエタノール抽出物を、４℃で１２〜２４時間放置した。不純物を沈殿させた後、これを除去して実施例３とした。前記試験例１．２の方
法で、実施例３のチロシナーゼ阻害効果を評価した。その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、抽出後に低温（４℃）で放置した場合、チロシナーゼ阻害効果が上昇した。すなわち、抽出後に低温で放置することを通じ、コウゾ抽出物のチロシナーゼ阻害効果を向上させることができる。一方、収率は、６．７％から５％水準に減少して、不純物が効果的に除去されることを知ることができた。これは、抽出過程の高い温度により、エタノールへの溶解度が低い物質もともに抽出され、こうした不純物が、低温放置過程において効果的に除去されることを示すわけである。この過程で沈殿する不純物は、チロシナーゼ阻害効果をほとんど示さなかった。これは、低温放置によって、チロシナーゼ阻害効果を有する物質はほとんど損失されないことを示す。

４．結晶化によるチロシナーゼ阻害効果の評価
コウゾの根皮を洗浄、乾燥及び切断してエタノールに入れ、６０〜８０℃で４〜６時間抽出した。その後、抽出物を、４℃で１２〜２４時間放置して不純物を沈殿させ、これを除去した。抽出物を、温度０〜４℃、抽出物の体積の２０倍の精製水に入れ、２〜６時間、徐々に攪拌しながら結晶を誘導した。結晶化された抽出物を収得して実施例４とし、前記試験例１．２の方法で、チロシナーゼ阻害効果を評価した。対照群として、コウジ酸（ｋｏｊｉｃ ａｃｉｄ）のチロシナーゼ阻害効果を評価して比較した結果を、下表に示した。

前記結果から見られるように、コウゾ抽出物を冷却精製水で攪拌して結晶化を誘導する場合、チロシナーゼ阻害効果が向上されて、非常に優れたチロシナーゼ阻害効果を有するということを知ることができる。すなわち、コウゾ抽出物を低温で浸漬すると、結晶化によってチロシナーゼ阻害効果が顕著に上昇する。一方、結晶化過程を通じて、最終的に３％水準の抽出物が収得され、これは、結晶化過程が不純物を効果的に除去することができる過程でもあることを示すものである。本過程において結晶化されなかった上澄み液は、チロシナーゼ阻害効果をほとんど示さなかった。これは、結晶化過程においても、チロシナーゼ阻害効果を示す物質はほとんど損失されないことを示す。

［製造例１〜７］担体組成物の製造
１．５重量％コウゾ抽出物を含むポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ， ＰＬＡ）カプセルの製造
ＰＬＡ１０ｇとステアリルアルコール（Ｓｔｅａｒｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）０．２〜０．３ｇを、メチレンクロライド（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）４０ｍｌに溶かし、実施例４のコウゾ抽出物粉末０．５ｇをさらに入れて溶かした後、ポリビニルアル
コール（ＰＶＡ）１重量％が溶けている水４００ｍｌに添加して攪拌した。常温減圧下でメチレンクロライドを除去した後、濾過、乾燥して、コウゾ抽出物が担持されたＰＬＡカプセル（製造例１）を作製した。

２．４重量％コウゾ抽出物を含むＰＬＡ及びポリブチルメタクリレート／トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート（Ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ／ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ， ＰＢＭＡ／ＴＭＡＥＭＡ）共重合体カプセルの製造
本製造方法は、前記１の５重量％コウゾ抽出物を含むＰＬＡカプセルの最外層上に、ＰＢＭＡ／ＴＭＡＥＭＡ共重合体でもう一度カプセル化する方法である。まず、ＰＢＭＡ／ＴＭＡＥＭＡ共重合体１０ｇをエタノール２５０ｍｌに溶かし、ＰＶＡ１重量％が溶けている水５００ｍｌに、前記ＰＬＡカプセル５５ｇを均一に分散させた。エタノール相を水相にゆっくりと注ぎながら、ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）５０００ｒｐｍで攪拌した。４０℃減圧下でエタノールを除去した後、濾過、乾燥して、コウゾ抽出物が担持されたカプセル（製造例２）を製造した。

３．５重量％コウゾ抽出物を含むポリエチレンアジペート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｄｉｐａｔｅ， ＰＥＡ）カプセルの製造
ＰＥＡ４７．５ｇをメチレンクロライド２００ｍｌに溶かし、実施例４のコウゾ抽出物粉末２．５ｇをさらに入れて溶かした後、ＰＶＡ１重量％が溶けている水４５０ｍｌに添加して、ホモジナイザー５０００ｒｐｍで攪拌した。常温減圧下でメチレンクロライドを除去した後、濾過、乾燥して、ＰＥＡカプセル（製造例３）を製造した。

４．２．５重量％コウゾ抽出物を含む固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ， ＳＬＮ）の製造
蜜蝋（Ｂｅｅｓｗａｘ）１５ｇ、水添レシチン２ｇを入れて、７０℃に加温して溶かした後、実施例４のコウゾ抽出物粉末２ｇを入れて溶かした。前記蝋相を６０℃に加温した水６０ｇに徐々に添加しながら、ホモジナイザーで攪拌してＳＬＮ（製造例４）を製造した。

５．５重量％コウゾ抽出物を含むポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、ＰＭＭＡ）カプセルの製造
ＰＭＭＡ１０ｇを、メチレンクロライド４０ｍｌに溶かし、実施例４のコウゾ抽出物粉末０．５ｇを入れて溶かした後、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７ ０．５重量％が溶けている水４００ｍｌに添加して攪拌した。常温減圧下でメチレンクロライドを除去した後、濾過、乾燥して、ＰＭＭＡカプセル（製造例５）を作製した。

６．５重量％コウゾ抽出物を含むポリエチレンアジペート／ポリメチルメタクリレート（ＰＥＡ／ＰＭＭＡ）カプセルの製造
ＰＥＡ２３．７５ｇとＰＭＭＡ２３．７５ｇをメチレンクロライド２００ｍｌに溶かし、実施例４のコウゾ抽出物粉末２．５ｇを入れて溶かした後、ＰＶＡ１重量％が溶けている水４５０ｍｌに添加して、ホモジナイザー５０００ｒｐｍで攪拌した。常温減圧下でメチレンクロライドを除去した後、濾過、乾燥して、ＰＥＡとＰＭＭＡが混合されたカプセル（製造例６）を製造した。

７．５重量％コウゾ抽出物を含むシリカ（Ｓｉｌｉｃａ）パウダーの製造
コウゾ抽出物をエタノールに完全に溶解させた後、メソ多孔性シリカを、実施例４のコウゾ抽出物が溶解しているエタノール溶媒に混合し、１〜３時間十分に攪拌した。濾過した後、常温で真空乾燥して、コウゾ抽出物が担持されたメソ多孔性シリカパウダー（製造例７）を製造した。

［実施例５〜１１及び比較例６］
コウゾ抽出物を担体に担持した場合における有効成分の安定化の程度を評価するために、製造例１〜７を利用して、通常的な方法で、下表のような組成を有する実施例５〜１１及び比較例６のｏ／ｗ型エマルジョン製剤を製造した。

前記実施例５〜１１及び比較例６すべてのエマルジョン組成物の重量全体を基準に、０．０４重量％のコウゾ抽出物を含む。

［試験例３］コウゾ抽出物の有効成分の安定化程度の評価
コウゾ抽出物を担体に担持する場合に、代表的な有効成分であるカジノールＣが安定化するかどうかを評価するために、前記製造例１〜７の担体組成物、実施例５〜１１及び比
較例６のｏ／ｗ型エマルジョンに含まれているカジノールＣの含量をＨＰＬＣで分析した。

分析開始時点、及び１月周期で４ヶ月間、それぞれのカジノールＣ含量を測定した。分析開始時点のカジノールＣ含量を１００％とし、これに対する相対的な含有量％を計算した結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、製造例１〜７及び実施例５〜１１のすべてが、比較例６に比べて、カジノールＣの含量が時間の経過後も高く維持された。すなわち、コウゾ抽出物を担体に担持する場合、その有効成分の安定化度が高く、これは、化粧品組成物に剤形化しても同様であることを知ることができる。

［試験例４］皮膚安全性評価
前記実施例の皮膚安全性を確認するために、成人女性１８名及び男性１２名（平均３２．５歳）を対象に、パッチテストを実施した。

パッチを付着した後、２８時間経過後にパッチを除去し、３０分後に最初の判読を施行し、９６時間経過した後に２回目の判読を実施した。実施例及び比較例の皮膚刺激の強度を調べるために、皮膚の陽性反応の程度に応じて加重値を与えて皮膚平均反応を求め、実施例及び比較例の皮膚刺激を肉眼判定して、その等級を決定した。その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、実施例５〜１１のすべてが、皮膚に刺激を与えなかった。したがって、本発明に係る化粧品組成物は、皮膚に対して安全であるものと判定することができる。

［試験例５］コウゾ抽出物の美白効能の評価（細胞レベル）
１．細胞毒性の測定
（１）細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｂｌａｃｋ， ａ／ａ）マウスのメラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ）から由来した細胞株であるＢ１６メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞を細胞株バンクから入手して使用した。１０％ウシ血清セラム（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＬＯＮＺＡで入手）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン２００ｎＭを添加したＤＭＥＭ培地において、３７℃、１０％ＣＯ_２の条件下で細胞を培養した。

（２）細胞毒性測定（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
Ｂ１６メラノーマ細胞を９６‐ウェルプレートにそれぞれ１×１０^４細胞となるようにした後、１日間培養した。アルブチンと製造例６の各濃度毎に入っている新たな培地に交換した後、さらに２４時間培養した。２ｍｇ／ｍｌの濃度で細胞培養培地に溶かしたＭＴＴ溶液を各ウェルあたり５０μｌずつ入れ、最終体積が２００μｌとなるように培地を満たした後、３〜４時間培養した。培地を除去し、生成されたホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ）にＤＭＳＯ１５０μｌを加えて溶解させた後、溶解されたホルマザン染色を５４０ｎｍで測定した。測定された吸光度を、物質を処理しなかった対照群を基準に比較して、細胞毒性の程度を評価した。その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、製造例6の場合、２００μｇ／ｍｌ以下の濃度で細胞毒
性が観察されず、アルブチンの場合、１００μｇ／ｍｌの濃度で細胞毒性が観察されなかった。前記結果を基に、製造例６は１５０μｇ／ｍｌ以下の濃度で、アルブチンは１００μｇ／ｍｌの濃度で試験を行った。

２．メラニン生成阻害の評価
Ｂ１６メラノーマ細胞を２４‐ウェルプレートに４×１０^４細胞／ウェルとなるようにした後、細胞がプレートに十分に付くように一晩培養した後、各ウェルあたりのメラニン生成を促進させるためにα‐ＭＳＨ１μＭを含め、試験試料である製造例６及びアルブチンを各濃度毎に含む培地を入れた。７２時間処理した後、細胞培地の中から２００μｌを取り、４０５ｎｍで吸光度を測定してメラニン量を計算した。計算されたメラニン量の差を、試験物質を処理しなかった対照群を基準に比較し、その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、製造例６を１５０μｇ／ｍｌ処理した場合、対照群に比べてメラニン生成を４０．４％抑制し、１００μｇ／ｍｌ処理した場合は、対照群に比べてメラニン生成を３１．９％抑制した。アルブチンを１００μｇ／ｍｌ処理した場合は、メラニン生成を２１．２％抑制した。これを通じ、本発明によって製造されたコウゾ抽出物は、メラニン生成を抑制する効能に優れることを知ることができる。

３．チロシナーゼ活性阻害の評価
反応バッファー（０．１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．８）、０．０３％Ｌ‐チロシン基質溶液（Ｌ‐ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、反応バッファー中０．３ｍｇ／ｍｌ）、マッシュルームチロシナーゼ溶液（ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、反応バッファー中２ユニット／μｌ）を含む反応液を準備した。まず、試験試料として各濃度別にアルブチン及び製造例６を準備し、１０ユニットに該当する量の酵素を入れた後、０．１Ｍリン酸バッファーで最終体積が１００μｌとなるようにした。０．０３％Ｌ‐チロシン基質溶液１００μｌを入れた直後に４７５ｎｍで吸光度を測定し、３７℃で１０分間反応させた後、氷で反応を停止させてから再び吸光度を測定した。１０分間に変化した吸光度の差を対照群と比較した。その結果を下表に示した。

前記結果から見られるように、製造例６は、試験試料を処理しなかった対照群に比べて統計的に有意なチロシナーゼ活性阻害効果を示し、これは、チロシナーゼ活性阻害効果に優れると知られているアルブチンよりも優れた効果であった。また、チロシナーゼ活性を５０％阻害する濃度、すなわちＩＣ_５０値が、製造例６は２３．７μｇ／ｍｌ、アルブチンは２０９．６μｇ／ｍｌと測定された。

これを通じ、本発明によって製造されたコウゾ抽出物は、チロシナーゼ活性を阻害する効果に非常に優れることを知ることができる。

本発明によって製造されたコウゾ抽出物は、メラニン生成及びチロシナーゼ活性を阻害する効果に優れるため、優れた美白効果を有することを確認することができる。

［試験例６］コウゾ抽出物の美白効果の評価（臨床評価）
１８歳〜６０歳の成人女性２３名を選別した（平均年齢４２．１７歳）。３００Ｗキセノンアークランプ（Ｘｅｎｏｎ ａｒｃ ｌａｍｐ）が装着された人工紫外線照射器（Ｍｕｌｔｉ‐ｐｏｒｔ Ｓｏｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ ６０１‐３００Ｗ Ｓｏｌａｒ
Ｌｉｇｈｔ、米国）を利用して、被験者の腕の２ヶ所の部位に、２．５ＭＥＤに該当する紫外線を照射することにより、皮膚の色素沈着を誘導した。それから１０日後、前記２つの部位に、それぞれ実施例１０のｏ／ｗ型エマルジョン及びコウゾ抽出物を含まない対照群を、紫外線照射部位に塗布するようにした。塗布後、２２〜２４℃、湿度４０〜６０％の条件で、1回目の皮膚科専門医による肉眼評価及び機器的評価を実施した。それから
４週、６週及び８週経過後、同一の条件で、皮膚科専門医による肉眼評価、機械的評価及び設問調査を実施した。

１．専門医による肉眼評価
皮膚科専門医による肉眼評価は、皮膚科専門医が、皮膚の色素沈着の程度について、０点〜７点の８段階で評価する方法により実施された。前記点数が高いほど、皮膚の色素沈着の程度が高いことを意味する。その結果は、下表のとおりである。

前記結果から見られるように、塗布４週、６週及び８週経過後、実施例１０を塗布した場合が、対照群を塗布した場合よりも皮膚の色素沈着の程度が低かった。また、実施例１０が、対照群に比べて塗布直後に皮膚の色素沈着の程度が高かったという点を勘案すると、前記結果は、実施例１０が非常に優れた皮膚の色素沈着阻害効果があることを意味する。したがって、本発明によって製造したコウゾ抽出物を含む組成物は、優れた美白効果を有することを知ることができる。

２．機器的評価
機器的評価は、クロマメーター（Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ）ＣＲ‐４００（ミノルタ、日本）により紫外線照射部位のＬ＊値を測定する方法により実施され、その結果は、下表のとおりである。以下の結果は、計５回測定した後の、最大値と最小値を除いた３つの値の平均値である。

また、メグザメーター（Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ）ＭＸ１８（ドイツ）を利用して、メラニンインデックス（Ｍ.Ｉ）を測定する方法により機器的評価が実施された。その結果は、
下表のとおりである。以下の結果は、計５回測定した後の、最大値と最小値を除いた３つの値の平均値である。

前記結果から見られるように、塗布４週、６週及び８週経過後、実施例１０を塗布した場合が、対照群を塗布した場合よりも皮膚の明るさの程度が高かった。したがって、本発明によって製造したコウゾ抽出物を含む組成物は、優れた美白効果を有することを知ることができる。

３．設問調査
被験者を対象に、試験期間にわたって塗布部位の皮膚の色が薄くなったかどうか、色素沈着部位の面積が減少したかどうか、及び皮膚が滑らかになったかどうかを、０点〜４点の５段階で評価した。点数が高いほど、好ましいことを意味する。各点数に該当する被験者の割合を下表に示した。

前記結果から見られるように、実施例１０を塗布した場合が、対照群を塗布した場合よりも、紫外線照射部位の皮膚の色が薄くなり、色素沈着部位の面積が減少し、かつ皮膚のキメが滑らかになる効果に全般的に優れていた。

４．異常反応の有無
試験の全期間にわたって、実施例１０の塗布部位に、接触皮膚炎の症状及びその他の異常反応は現れなかった。これを基に、実施例１０の組成物は、皮膚への使用に適することを知ることができる。

本発明により製造されたコウゾ抽出物を含む皮膚外用剤組成物を人体に適用する場合、皮膚の色素沈着を改善する効果、ひいては優れた美白効果を示すことを確認することができる。

［試験例７］カジノールＣの分離
１．二相溶媒系（ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）の選定
多様な組成のヘキサン／酢酸エチル／メタノール／水混合液を試験した結果、前記溶液が５／５／５／２の比率で含まれている場合、カジノールＣの分配係数が１に非常に近接した０．９９７と示されただけでなく、他の成分の分配係数と重ならないということを確認した。

前記において分配係数を測定する方法は、次のとおりである。まず、前記実施例３（１ｍｇ）を１０ｍｌ試験管に入れ、平衡に到達した二相溶媒系の上層液と下層液を各２ｍｌ
ずつ加えて１分間激しく振った。二相平衡に達した後、上層液と下層液を各１００μｌずつ取って乾燥した後、１ｍｌのエタノールに溶かしてＨＰＬＣで分析した。上層液に存在するカジノールＣの量を下層液に存在するカジノールＣの量で割った値を、分配係数として決定した。

２．ＨＳＣＣＣを利用した分離
ＨＳＣＣＣ（Ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ＴＢＥ‐１０００Ａを利用した。まず、コイルカラムを、１０ｍｌ／分の流速で、固定相として使用される上層液を満たし、機器を４００ｒｐｍで回転させながら、コイル内部に移動相として使用される下層液を５ｍｌ／分の流速でポンピングした。移動相が流出し始めれば、液‐液平衡に到達したものと判断した。平衡に達すると、実施例３（０．５ｇ）が含まれた５０ｍｌ溶液を注入した。分離温度は、常温に維持した。コイルカラムの出口から出てくる液を、２８０ｎｍのｕｖ検出器に通過させて分画した。

３．ＨＰＬＣ分析
前記ＨＳＣＣＣ分画物をＨＰＬＣ分析し、その結果を図２に示した。図２から見られるように、ＨＳＣＣＣ分画物には、非常に高い純度のカジノールＣのみが含まれており、カジノールＣが分離されたことを確認することができる。

Claims (5)

1. カジノールＣ（kazinol C）を含有するコウゾ抽出物であって、結晶化していることを特徴とするコウゾ抽出物と、
   ポリエチレンアジペート（polyethyleneadipate, PEA）及びポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate, PMMA）の混合物からなる担体とを有し、
   カジノールＣ又はカジノールＣを含有するコウゾ抽出物が前記担体に担持されている、組成物。
2. 前記コウゾがコウゾの根皮を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記コウゾ抽出物が担体質量に対して0.01質量％以上30質量％以下である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記コウゾ抽出物がメラニン生成を阻害し、チロシナーゼ（tyrosinase）を阻害する、請求項１に記載の組成物。
5. 皮膚外用剤である請求項１に記載の組成物。