KR101095608B1

KR101095608B1 - 초임계 유체를 이용한 노루오줌 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101095608B1
Application number: KR1020090132282A
Authority: KR
Inventors: 박세연; 최민희; 안기웅; 조병기
Original assignee: (주)더페이스샵
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2011-12-19
Also published as: KR20110075741A

Abstract

본 발명은 초임계 유체 추출법 (Supercritical Fluid Extraction)에 의해 제조된 노루오줌(Astilbe chinensis var. davidii) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 초임계 유체 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물이 일반적으로 용매를 이용하는 기존의 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물에 비해 피부 세포의 증식을 현저히 촉진하고 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진 및 분해를 억제 하며 인테그린의 발현을 증진 시키고 뛰어난 항산화 효과를 가져 피부 주름을 개선 시키고 피부의 탄력을 증진시키는 효과를 가진다.

초임계 유체 추출법, 노루오줌 추출물, 주름 개선, 화장료

Description

초임계 유체를 이용한 노루오줌 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for improving skin wrinkles containing Astilbe chinensis Extracts by using the supercritical fluid process}

최근 외모에 대한 관심이 높아지면서 피부노화를 지연시키고 예방하기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서 주름에 대한 관심이 증가하면서 탄력있는 피부를 유지하기 위해 후천적으로 높은 관심과 노력에 따라 개선 될 수 있는 화장품의 필요성이 절실해 지고 있다.

원래 노화 현상에 의한 주름은 피부 진피층의 콜라겐과 탄력 섬유의 소실로 인해 피부 표면에 생기는 골이라고 정의 할 수 있다. 피부 주름은 진피층에 존재하는 콜라겐 교원섬유에 의해 결정되는데, 콜라겐 분자는 섬유 아세포에서 생성되어 진피층으로 분비 된 후, 자동회합에 의해 콜라겐 섬유로 형성된다(Implant dentistry. 2002. 11(3):280-285). 콜라겐 섬유는 피부 진피층에서 피부의 기계적 견고성, 조직의 결합력, 세포와의 부착 및 세포 분화 등에 관여한다 (Journal of the American Academy of Dermatology, 2001, 17(4):610-613). 이러한 콜라겐이 내적 요인 및 외적 요인에 의해 생성이 감소하거나 변형이 지속적으로 축적되게 되면 주름생성의 원인이 된다 (Clinics in geriatric medicine, 2001, 17(4):617-630).

콜라겐은 연령이 증가할수록, 그리고 자외선에 노출이 많이 될수록 양적 감소를 보인다.　콜라겐은 형태와 구조적 특징에 따라서 분류되는데 이들 중에서, 가장 특징이 잘 알려진 것은 타입 I, II, III 그리고 IV이다.　콜라겐 타입 I과 III는 진피층의 세포간질의 구성성분을 이루고 콜라겐 타입 IV는 DEJ (Dermal Epidermal Junction)의 주요 구성물질이 된다.　DEJ는 피부의 표피층과 진피층 사이에 위치하여 두 층간의 물질 투과와 수송을 조절해주며 인접한 피부세포의 분화를 조절하며 피부의 견고성을 유지시켜준다.　피부의 주요 구조적 성분인 콜라겐과 엘라스틴은 자연적 또는 외부 자극에 의해 구조가 변성되거나 생합성량이 감소하게 되는데 이로 인해 피부 노화가 가속화된다. 또한 콜라게네이즈의 발현량과 활성 역시 피부 노화를 가속화 시키는 주요 요인이다.

주름 생성 및 피부 탄력의 저하는 진피층 내의 매트릭스 구조를 형성하고 있는 콜 라겐 및 엘라스틴 등의 양뿐만 아니라 상기 성분의 조직화된 상태 또는 매트릭스와 피부 세포간의 상호 작용 정도에 의해서 영향을 받는다.

피부 세포에 존재하는 막 단백질의 한 종류인 인테그린은 피부 세포간 접착 및 세포-단백질간의 상호 작용에 중요한 역할을 하며, 결과적으로 피부 탄력에 영향을 미친다. 인테그린의 발현 정도가 세포 접착 정도, 즉 피부 탄력과 연관되어 있다는 것이 보고되어 있는데, UV-A 및 UV-B 조사를 통해 노화가 유도된 섬유아세포 표면의 인테그린의 발현 정도를 측정하면 조사된 세포의 인테그린 발현 정도가 조사되지 않은 세포의 인테그린 발현 정도보다 떨어진다고 한다(Laetitia Moreau, Cosmetics ＆ Toiletries, 118(1):75-84 2003).

콜라겐 합성 촉진물질로 기존에 레티노인산(retinoic acid), 표피성장인자(Epidermal growth factor: EGF), TGF(trans- forming growth factor, 형질전환성장인자; Cardinale G. et al., Adv. Enzymol., 41, p. 425, 1974), 동물 태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid(JP8-208424)), 클로렐라 추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 알려져 있다. 특히 표피성장인자는 상피세포, 내피세포 및 섬유아세포 세포증식의 강력한 촉진제로 작용하며, 상피세포 결손 시 상피세포의 이동과 증식을 촉진시키기 때문에 상처치유 효과가 우수하다. 또한 레티놀은 콜라겐 합성과 분해억제에 매우 효과적으로 피부주름 개선 효과는 미국 특허 제4,603,146호 및 제4,877,805호 등에 명시되어 있다. 그러나 레티노인산의 경우 불안정하고, 피부 적용 시 자극, 발적 등의 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피 부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능 개선 효과를 기대할 수 없다. 따라서, 생체에 안전하고 기존의 콜라겐 합성능 촉진 물질보다 효과가 높은 새로운 콜라겐 합성 촉진제의 개발이 절실히 요망되고 있다.

본 발명자들은 물질이 임계점보다 높은 온도와 압력하에 있을 때, 즉 초임계점 이상의 상태에 있을 때의 초임계 유체를 용매로 사용하여 물질을 분리하는 기술인 초임계 유체 추출법을 이용하여 효과적인 피부 노화 방지 화장료 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 기존의 용매 추출법을 이용하여 제조한 노루오줌 추출물에 비해 초임계 유체 추출법을 통해 제조된 노루오줌 추출물이 피부 세포의 증식을 촉진 시키고 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진 및 분해를 억제하며, 인테그린의 발현을 증진시키고 뛰어난 항산화 효과를 가짐으로서 효과적으로 피부 주름을 개선시키고 피부 탄력을 증진 시키는 것을 발견하게 되었다. 더욱이, 초임계 유체 추출법은 용매 추출법에서 나타나는 피부 자극을 최소화 하여, 보다 안전하게 피부 개선을 촉진 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 초임계 유체 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물을 이용하여 주름개선 및 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다음과 같은 수단을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부주름 개선용 화장료 조성물은 초임계 유체 추출법에 의하여 제조된 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 초임계 유체 추출법은 35 내지 100℃와 100 내지 500 기압에서 이산화 탄소를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 한다.

상기 초임계 유체 추출법은 이산화탄소에 추가적으로 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르 중에서 선택되는 1또는 2이상을 혼합한 혼합유체를 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 노루오줌 추출물의 함량은 상기 조성물의 총 중량에 대해서 0.0001-10 중량%인 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 항산화용 화장료 조성물은 초임계 유체 추출법에 의하여 제조된 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명은 초임계 유체 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부노화 방지 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 초임계 유체 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물은 기존의 일반적인 용매 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물에 비해 피부세포 증식 효과가 우수하고 콜라게네이즈를 저해하고 콜라겐 합성을 증진 시키는 효과가 뛰어나다. 또한, 인테그린의 발현을 증진시키고 뛰어난 항산화 효과를 가짐으로서 효과적으로 피부 주름을 개선시키고 피부 탄력을 증진 시키는데 탁월한 효과를 가진다.

이하 본 발명을 상세히 설명하다.

본 발명자들은 주름 개선에 뛰어난 효과를 보이는 성분을 함유한 천연에서 자생하는 동식물을 탐색 하였고, 유효 성분을 안전하게 추출해 낼 수 있는 방법을 연구하던 중 초임계 유체 추출법을 이용하여 제조된 노루오줌 추출물이 주름 개선에 유의한 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

노루오줌 추출물은 피부 세포의 증식 촉진, 콜라겐 합성 촉진 및 분해 억제, 인테그린의 발현 증진 및 항산화 효능이 뛰어나 피부 주름 개선에 탁월한 효과를 나타낸다.

노루오줌(Astilbe chinensis var. davidii)은 범의귀과에 속하는 여러해 살이풀로서 전국의 산골짜기에서 흔히 볼 수 있고 높이는 30-70cm이고 긴 갈색털이 있으며, 근경은 굵고 옆으로 짧게 뻗는다. 잎은 3개씩 2-3회 갈라지며, 작은잎은 타원형, 길이 3-8cm 나비 2-4cm, 종이처럼 얇고 가장자리에 겹톱니 또는 결각상의 톱니가 있고 잎자루가 길다. 꽃은 7-8월에 피고 홍자색, 줄기 끝의 원추꽃차례에 길이 30cm 정도로서 많은 꽃이 달리고, 화축에는 갈색 털이 많고, 꽃받침은 5개로 갈라지고 갈라진 조각은 달걀모양이며 꽃잎은 5개로서 선형이고 수술은 10개이며 암술대는 2개이고 삭과는 길이 3-4mm이다.

이 생약의 전초(全草)를 소승마((小升麻), Astilbes Herba)라하고 뿌리는 적승마((赤升麻), Astilbe Radix)라고 해서 약용에 이용되는데 혈액순환을 좋게 하고, 어혈(瘀血)을 풀어주며, 열을 내리고, 독을 풀어주며, 경련을 멎게 하고, 통증 을 멎게 하는 효능이 있어서 과로로 오는 병, 근육과 뼈마디가 시리고 아픈 증상, 타박상, 관절통, 수술 후 통증, 뱀에게 물린 독을 푸는 데 사용한다(한국의 약용식물, 교학사, 2000, p204, 배기환저). 민간에서는 적승마(赤升麻)라 불리는 이것의 근경을 해열, 진통, 소염 등에 사용하였고 소승마(小升麻)라고 불리는 땅 위에서 자라는 부분은 해열, 진해 작용이 있으므로 감기로 인한 열, 기침, 두통과 몸살 기운이 있을 때 처방하고 사용되었다. 현재 보고 된 바에 의하면 전초에는 시안화수소산, 꽃에는 케르세틴 그리고 근경에는 베르게닌과 탄닌 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이 속(屬)에 속하는 식물로는 그 밖에 진퍼리노루오줌(A. divaricata), 숙은노루오줌(A. koreana), 외잎승마(A. simplicifolia) 등이 있다.

본 발명에서 제공하는 화장료 조성물은 초임계 유체 추출법을 이용해 제조된 노루오줌 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있다 (J. Chromatogr., 479, 200-205, 1998). 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다. 초임계 유체를 이용한 예로는 토양에서 석유탄화수소 화합물 및 폴리염소 화합물의 추출 (J. Chromatogr.A., 845, 357-363, 1999), 식용 지방중 방향족 탄화수소 화합물의 추출 (J. Chromatogr.A., 882, 245-253, 2000), 우유 지질성분중 지용성 비타민의 추출 (J. Chromatogr.A., 874, 275-283, 2000) 등이 있다.

본 발명에서 사용된 초임계 유체 추출법 (supercritical fluid extraction) 은 초임계 이산화탄소를 이용하여 효과적으로 지용성 물질을 추출한다. 본 발명에서 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다.

지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매, 예를 들면 에탄올이 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 또는, 처음부터 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다.

추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

추출의 재료가 되는 노루오줌 풀은 이를 건조하여 사용하거나 또는 그대로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 건조하여 사용하는 것이다. 건조법으로는 자연 건조 또는 열풍 건조법을 이용할 수 있다.

본 발명의 하기 특정 제조예를 참조하여 초임계 유체 추출법에 의한 노루오줌 추출물의 제조방법을 설명하면 다음과 같다: 노루오줌의 근경을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 시료 초임계 추출용기에 놓고 액체크로 마토그래피 펌프를 이용하여 순수한 이산화탄소를 적당한 온도 및 압력에서 초임계 상태로 만들어 흘려보내면서 추출물을 시험관에 받는다. 또는, 공용매 예를 들면, 에탄올을 이산화탄소와 함께 흘려 보내 추출한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 초임계 유체 추출법은 바람직하게는 35 내지 100℃ 및 100 내지 500 기압에서 이산화탄소를 이용하여 수행되며, 보다 바람직하게는 50 ℃내지 70 ℃및 200 내지 400 기압에서, 가장 바람직하게는 60 ℃ 및 300 기압에서 이산화탄소를 이용하여 수행한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 초임계 유체 추출법은 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용하여 수행한다.

상기 공용매는 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르 중 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 80% 내지 100% 에탄올이며, 가장 바람직하게는 95% 에탄올이다.

상기 혼합유체는 총 부피를 기준으로 하여 공용매를 3 내지 40 부피% 포함하며, 가장 바람직하게는 10 부피% 포함한다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출법에 의한 추출물뿐 만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 노루오줌 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 노루오줌 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같 은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 세포의 증식을 촉진시키고 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진 및 분해를 억제하며 인테그린의 발현을 증진시키고 뛰어난 항산화 효과를 가져 피부 주름을 개선시키고 피부의 탄력을 증진시키며, 이와 같은 사실은 하기의 실시예에 명시되어 있다.

상기 노루오줌 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 에센스, 팩 등 그 제형에 있어 특별히 한정되지 않고 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.　이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 배합량은 중량%로 나타낸다.

제조예 1: 초임계 유체 추출법을 이용한 노루오줌 추출물의 제조

노루오줌의 근경을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 시료 1 그램을 초임계 추출용기 (Supercritical fluid extractor, Jasco, Japan)에 넣고 액체크로마토그래피 펌프 (Supercritical fluid chromatograph, Jasco, Japan)를 이용하여 순수한 이산화탄소를 온도 60℃ 및 압력 300 기압 조건에서 초 임계 상태로 만들고 95% 알코올을 10 부피% 혼합하여 흘려보내면서 매 4분씩 40분까지 추출물을 10 ㎖ 용량의 유리 시험관에 받았다. 예비 실험에서 초임계 추출을 위해서는 60℃ 및 300 기압이 최상의 결과를 보여 주어 본 발명에서는 이 조건을 실험에 이용하였다. 상기 추출액을 회전감압 증발기로 건조하여, 건조중량 48 ㎎/g을 얻었다. 건조된 노루오줌 추출 파우더를 50% 1,3-부틸렌 글리콜에 용해하여 사용하였다.

제조예 2. 기존의 유기용매추출법을 이용한 노루오줌 추출물의 제조

노루오줌의 근경을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조 중량의 1-10배의 70% 저급알코올을 가하였다. 15-35℃에서 5일간 추출한 후 300메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압증발기로 건조하여, 건조 중량 47 g/㎏을 얻었다. 건조된 노루오줌 추출 파우더를 50% 1,3-부틸렌 글리콜에 용해하여 사용하였다.

실험예 1: 피부 세포 증식 효과

노루오줌 추출물이 피부 세포 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 제조예1에서 얻어진 초임계 유체 추출법을 이용한 노루오줌 추출물과 제조예2에서 얻어진 기존 유기용매 추출법을 이용한 노루오줌 추출물을 이용하여 인체 정상 섬유아세포(한국세포주은행)를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰에 1 x 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma사)에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다.　이어, 상기 노루오줌 추출물이 최종 농도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% 및 1% 로 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 노루오줌 추출물이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다.　그런 다음, MTT 용액(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일) 2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드: 5 mg/㎖)을 각각 10 ㎕씩 첨가하고, 4시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, 각 웰 당 100 ㎕의 DMSO 용액을 가하여 20분 동안 진탕 시키고, 마이크로 플레이트 판독기 (microplate reader, Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570 nm에서 상층액의 흡광도를 측정하였다.　측정값을 하기의 수학식 1에 대입하여 세포 증식 효과를 산출하고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

세포증식효과 (%) = [(실험군 흡광도 - 대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도] x 100

농도	흡광도(570nm)
농도	0.01	0.05	0.1	0.5	1.0
대조군	0.527
제조예1	0.590	0.682	0.796	0.883	0.989
세포증식효과(%)	11.95	29.41	51.04	67.55	73.68
제조예2	0.573	0.659	0.723	0.781	0.822
세포증식효과(%)	8.73	25.05	37.19	48.20	55.98

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 노루오줌 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 볼 때, 노루오줌 추출물이 피부 세포 증식에 뛰어난 효과가 있으며, 나아가 초임계 유체 추출법을 이용하여 제조한 노루오줌 추출물이 기존 용매 추출법으로 제조된 노루오줌 추출물보다 높은 섬유아세포 증식 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

실험예 2: 콜라겐 합성 증진 효과

인체 정상 섬유아세포(한국세포주은행)를 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 2 x 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.　이어, 상기 제조한 제조예1과 제조예 2의 노루오줌 추출물을 최종 농도 0.01, 0.05 및 0.10%로 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 추출물이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 48시간 동안 추가로 배양하였다.　배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 키트 (Takara, 일본국)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다.　PICP 양은 ng/2x10⁴ 세포로 환산하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.

농도	콜라겐 합성량 (ng/2 x 10⁴)
농도	0.01	0.05	0.1
대조군	102
제조예1	133	171	259
제조예2	119	148	192

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 초임계 유체 추출법으로 제조된 제조예1의 노루오줌 추출물의 농도가 증가함에 따라 콜라겐의 합성이 증가함을 알 수 있고, 이에 본 발명의 초임계 노루오줌 추출물이 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 3: 콜라게네이즈 억제 효과

상기 노루오줌 추출물의 콜라게네이즈 생성 저해능을 측정하였다. 시험은 2.5 %의 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 함유된 96웰 평판배양기 (96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 2x10⁴ 세포/웰(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그리고 노루오줌 추출물을 농도별로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채위하였다. 채위한 세포배양액을 상업적으로 이용 가능한 콜라게네이즈 측정기구 (미국 아머샴파마샤 사. Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 콜라게네이즈 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게네이즈 항체가 균일하게 도포된 96-웰 평판 (96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-웰 평판 (96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타난다. 노란색을 띈 96-웰 평판 (96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고 콜라게네이즈의 합성 정도를 계산하였다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군의 채위된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. 세포에서의 콜라게네이즈 발현의 저해를 측정한 결과 in vitro 에서 상기 물질은 표 3과 같이 콜라게네이즈 발현을 저해함을 확인하였다. 발현 저해능은 비처리군의 합성능을 100으로 하여 대비한 것이다.

농도	콜라게네이즈 발현 정도 (%)
농도	0.01	0.05	0.1
대조군	100
제조예1	79	67	58
제조예2	85	75	69

상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 피부노화를 가속 시키는 콜라게네이즈의 발현 정도를 측정해 본 결과, 본 발명의 초임계 유체 추출법으로 제조된 제조예1의 노루오줌 추출물의 농도가 증가함에 따라 콜라게네이즈의 발현 정도가 감소함을 알 수 있고, 기존 유기용매 추출법에 의해 제조된 노루오줌 추출물에 비해 본 발명의 초임계 노루오줌 추출물이 탁월한 콜라게네이즈 발현 억제능을 가짐을 알 수 있다.

실험예 4: 인테그린 β1 발현 증진 효과

인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 x 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 노루오줌 추출물이 최종 농도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% 및 1%로 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 노루오줌 추출물이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, EIA(Enzyme immnoassay)법에 따라 인테그린 β1의 발현 정도를 측정하였다(MK008 키트, Takara, 일본). 상술하면, 원심분리로 세포를 회수하고 세포추출액을 제조한 후 항-인테그린 β1 항체가 코팅되어있는 웰에 상기 세포추출액을 처리하였다. 이차 항체를 첨가하고 4℃에서 45분간 반응시킨 후 OPD(ο-Phenylenediamine-HCl)로 검출하였다. 염색되어있는 OPD를 OPD 용해액으로 용해한 후 530nm에서 엘라이자 리더로 흡광도를 측정하였다.

농도	흡광도(530nm)
농도	0.01	0.05	0.1	0.5	1.0
제조예1	0.623	0.648	0.692	0.766	0.891
제조예2	0.593	0.612	0.649	0.737	0.843

표 4에 나타난 바와 같이 초임계 유체 추출법을 이용한 노루오줌 추출물과 기존 유기 용매 추출법을 이용한 노루오줌 추출물 모두 농도 의존적으로 세포의 접착에 중요한 작용을 수행하는 인테그린 β1의 합성을 촉진하는 것을 확인하였다.

실험예 5 : 항산화 효과

본 발명의 제조예에 따라 얻어진 노루오줌 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위하여 자유라디칼 소거활성 실험(Free Radical Scavenging Activity Test)을 실시하였다.　자유라디칼 소거활성 실험은 Kim 등(Kor. J. Pharmacogn., 24(4), 299-303(1993))의 방법을 변형한 것으로써, 안정한 자유라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl, 시그마사) 시약을 사용하였다.　0.2mM DPPH 용액(Blank인 경우는 에탄올) 150 ㎕에 상기 추출물을 다양한 농도로 제작하여, 이들을 각각 150 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 실온에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하는 실험군을 설정하였으며, 이에 대한 대조군으로는 정제수를 이용한 경우로 설정하였다.　상기 실험군과 대조군에 대한 흡광도 측정 후, 하기 수학식 1를 이용하여 자유라디칼 소거활성 효과를 구하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

<수학식 1>

자유라디칼소거효과 (%) = 100 - [(실험군 흡광도 - Blank 흡광도)/대조군의 흡광도] x 100

농도	자유라디칼소거효과(%)
농도	0.01	0.05	0.1	0.5	1.0
제조예1	20.6	33.8	51.2	74.6	89.8
제조예2	18.4	29.9	48.7	69.4	85.9

상기 표 5에 나타낸 결과를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제조예1과 제조예 2에서 제조된 추출물은 자유라디칼 소거능력이 매우 탁월하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 및 비교 실시예

하기 [표 6]의 조성비를 가지는 화장료 조성물에 상기의 초임계 유체 추출방법에 의한 노루오줌 추출물과 기존 유기 용매를 함유하는 실시예 및 비교 실시예를 다음의 조성으로 제조하였다.

성분	실시예 (중량%)	비교예1 (중량%)	비교예2 (중량%)
초임계 유체 추출법에 의한 노루오줌 추출물	3.0	-	-
유기 용매 추출법에 의한 노루오줌 추출물	-	3.0	-
글리세린	5.0	5.0	5.0
유동파라핀	10.0	10.0	10.0
폴리솔베이트60	2.0	2.0	2.0
솔비탄세스퀴롤올레이트	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0
밀납	10.0	10.0	10.0
트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5
프로필렌 글리콜	1.0	1.0	1.0
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5	1.5
향	미량	미량	미량
방부제	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

실험예 1: 피부탄력효과

본 발명의 초임계 유체 추출법을 이용한 노루오줌 추출물과 기존 유기 용매 추출법을 이용한 노루오줌 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 탄력 증진효과를 비교 측정 하였다. 온도 24-26℃, 습도 75의 조건에서 20세 이상의 건강한 여성 30명(평균연령 37세)을 3 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예를, B 그룹에는 비교 실시예 1을, C 그룹에는 비교 실시예 2의 제형을 눈가를 중심으로 하루 2회씩 (아침 및 저녁) 12주간 도포한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer MPA580, Conrage + Khazaka사, 독일연방국)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다.　시험결과는 cutometer MPA580의 R5(R5(12주)-R5(0주)) 값으로 기재하였는데, R5 값은 순수탄성도 (Net elasticity)의 성질을 나타내며, 결과는 하기 표 7에 기재되어 있다.

실험 제형	피부탄력효과
실시예	0.19
비교예 1	0.15
비교예 2	0.02

표 7의 결과에서와 같이, 초임계 유체 추출법을 이용하여 제조된 노루오줌 추출물을 이용한 실시예가 기존 유기용매 추출법을 이용하여 제조된 노루오줌 추출물에 비해 피부 탄력 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 피부 안전성 시험

과거력상 피부자극에 과민반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20-30대 여성 20명을 대상으로 본 발명의 피부안전성을 확인하기 위하여 상기 [표 6] 에서의 화장료에 대해 인체 피부 첩포시험을 하였다. 우선 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 준비된 시험물질을 15㎍씩 핀챔버 (Finn chamber, 100x10, EPITEST, 핀란드) 내에 적하시킨 후 시험대상자의 전박 (forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고 첩포를 제거한 후 펜으로 시험부위를 표시하였다. 표시 후 각각 1시간 및 24시간 후에 확대경 (8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험 부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다. 피부반응은 국제접촉피부염연구회 (ICDRG, International Contact Dermaitis Research Group)의 규정에 따라 판정하고, <수학식 2>에 따라 평균피부반응도(mean response rate)를 구하였다. 그 결과는 하기 [표 9]에 나타낸다.

[피부반응의 평가 기준 및 점수]

기 호	점수	평가 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 또는 가벼운 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
+++	3	심한 홍반 및 대수포, 가피형성

[수학식 2]

평균피부반응도(%)=(점수×반응수×100×1/2)/[3(최대점수)×총피검자수(n)]

시험물질	1 시간 후			24 시간 후			반응도 (%) (n=20)
시험물질	±	+	++	±	+	++	반응도 (%) (n=20)
실시예	-	-	-	-	-	-	0.00
비교예 1	1	-	-	-	-	-	0.41
비교예 2	-	-	-	-	-	-	0.00

상기 [표 9]에서 알 수 있듯이, 피부에 자극 정도를 알 수 있는 피부 첩포 실험에서 상기 초임계 유체 추출물에 의한 노루오줌 추출물은 기존의 유기용매 추출법에 의한 노루오줌 추출물에 비해 피부 자극이 없는 안전성이 매우 우수한 물질 임을 알 수 있다.

하기 제형예에서 사용한 노루오줌 추출물은 상기 제조예 1에서 제조된 초임계 유체 추출방법에 의해 추출된 노루오줌 추출물을 사용하였다.

제형예 1. 유연화장수 (스킨로션)

하기의 표 10와 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	1.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
PEG 1500	1.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	5.0
에탄올	10.0
옥틱도데세스-16	0.2
폴리솔베이트 20	0.2
향	0.02
유니사이드-유 13	0.01
그린 #13	0.001
증류수	잔량
합계	100

제형예 2. 수렴화장수

하기의 표 11과 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 수렴화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	1.0
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
알란토인	0.2
DL-판테놀	0.2
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	3.0
에탄올	15.0
폴리솔베이트 20	0.3
위치하겔 추출물	2.0
구연산	미량
향	0.02
유니사이드-유 13	0.01
그린 #13	0.001
증류수	잔량
합계	100

제형예 3. 영양화장수

하기의 표 12과 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	1.0
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5
세테아릴알콜	1.5
라놀린	1.5
폴리솔베이트 60	1.3
솔비탄스테아레이트	0.5
경화식물유	1.0
광물유	5.0
스쿠알란	3.0
트리옥타노인	2.0
디메치콘	0.8
초산 토코페롤	0.5
카르복시비닐 폴리머	0.12
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	5.0
트리에탄올아민	0.12
향	0.01
유니사이드-유 13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

제형예 4. 영양크림

하기의 표 13과 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	3.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
세테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
향	0.01
유니사이드-유13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

제형예 5. 맛사지 크림

하기의 표 14와 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	2.0
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.5
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테레이트	5.0
스쿠알란	5.0
광물유	35.0
디메치콘	0.5
히드록시에틸셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올아민	0.7
향	0.01
유니사이드-유13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

제형예 6. 에센스

하기의 표 15과 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	2.0
글리세린	10.0
베타인	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐 히아루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데칸올	0.3
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향	0.02
유니사이드-유 13	0.01
그린 #3	0.001
증류수	잔량
합계	100

제형예 7. 팩

하기의 표 16과 같이 노루오줌 추출물을 함유하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
노루오줌 추출물	1.0
폴리비닐알콜	15.0
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3.0
PEG 1500	2.0
시이크데스트린	0.15
DL-판테놀	0.4
알란토인	0.1
글리시리진산 모노암모늄	0.3
니코틴아미드	0.5
에탄올	6.0
PEG 40 경화피마자유	0.3
향	미량
유니사이드-유13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

초임계 유체 추출법에 의하여 제조된 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 초임계 유체 추출법은 35 내지 100℃와 100 내지 500 기압에서 이산화탄소를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 초임계 유체 추출법은 이산화탄소에 추가적으로 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르 중에서 선택되는 1또는 2이상을 혼합한 혼합유체를 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 노루오줌 추출물의 함량은 상기 조성물의 총 중량에 대해서 0.0001-10 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
초임계 유체 추출법에 의하여 제조된 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물.