CN1064690C - 鲨鱼软骨血管生成抑制因子及其分离纯化方法 - Google Patents
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一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子及其分离纯化的方法。该鲨鱼软骨血管生成抑制因子SCAIF-I其SDS-PAGE电泳结果银染显示一条带，分子量为18000。它以鲨鱼软骨为原料，经盐酸胍溶液抽提，有机溶剂分级沉淀，Resource Q离子交换层析，Sephacryl S-300分子筛层析，制备电泳获得。经对其关于血管内皮细胞生长、新生血管生成、小鼠肿瘤生长的抑制效应研究，表明其纯度高、活性强、特异性好，是一种很有研究开发前景的蛋白质。
Description
本发明属医药技术领域，是一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子及其分离纯化的方法。
成人血管生成通常只限于伤口愈合与女性的生殖周期过程，已经证明成人所有其他的血管生成都是病态的，并能导致广泛的病变，如肿瘤的生长、糠尿病性视网膜增生、内皮细胞恶变(如血管瘤)、动脉粥样硬化、以及关节炎等。
1971年哈佛大学教授波斯顿儿童医院研究员Judah Folkman提出“肿瘤生长是依赖血管的”，20多年的研究结果充分证明了这一理论。大部分正常人体内均有处于休眠状态的肿瘤，只有1mm3大小，不对人体构成威胁；只有当其生成新生血管，获得营养供应及转移途径，肿瘤才能生长和转移，威胁人体健康。
肿瘤的生长存在着无血管期和有血管期，在开始的无血管阶段，肿瘤组织以慢速线性方式生长，体积不会超过1mm3，在这一时期肿瘤细胞的增殖与凋亡处于一个动态平衡状态。在向有血管期过渡的开始阶段，肿瘤组织会释放出一种可溶性的血管生成刺激因子，诱导毛细血管内皮细胞增殖与迁移，以及血管内皮芽的形成与新生血管生成，致使肿瘤组织以指数方式生长。抑制血管生成可切断肿瘤的营养供应及血道转移途径，从而抑制肿瘤的生长和转移。
国外，特别是Folkman实验室对抑制新生血管进行多年研究，发现了一些细胞因子具有抑制新生血管．生成的效应，同时合成了一些能抑制血管生成的有机化合物，但大部分由于毒性较大而受到限制。后来，科学工作者将研究重点转到了天然存在的生物大分子，发现天然动植物和微生物中都可能存在有血管生成抑制因子(angiogen-esis inhibitory factor，AIF)。1994年Folkman实验室发现38KD的纤溶酶原片段一angiostatin能够特异抑制血管内皮细胞的增殖及新生血管生成，并能显著抑制Lewis肺癌转移灶的生长(O’Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al．Angiostatin：A novelangiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lungcarcinoma．Cell，1994；79：315-328)。1997年他们又报道胶原XVIII的20KD的C-末端片段-endostatin具有同样的活性(O’Reilly M S，Boehm T，Shing Y，et al． En-dostatin：An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth．Cell，1997；38：277-285)。
软骨是动物机体的主要无血管组织，含有较丰富的血管生成抑制因子，早在80年代中期，人们就发现软骨能够抵抗肿瘤细胞的侵入，很少长肿瘤。1990年Moses报道从小牛气管软骨纯化均一的小牛软骨血管生成抑制因子，分子量为27650(Moses AM，Sudhalter J，Langer R．Identification of an inhibitor of neovascularization fromcartilage．Science，1990248：1408-1410)。后来他们也从培养的软骨细胞中获得分子量为35550的同功蛋白。由于牛软骨含量较少，加工困难，一直未见其产品进入临床或市场的报道。
鲨鱼属于软骨鱼类，1983年Lee报道鲨鱼软骨含有丰富的AIF。Lane博士将鲨鱼软骨粗提物及鲨鱼软骨粉大量应用于肿瘤病人的治疗，取得了较好的疗效。九十年代初以来，美国、新西兰、加拿大、澳大利亚、日本等国批准鲨鱼软骨粉或粗提物以保健食品进入市场用于肿瘤病人的治疗，兴起了国际上的鲨鱼软骨抗癌热潮。美国FDA于1994年批准鲨鱼软骨粉进入II期临床实验，加拿大1997年批准鲨鱼软骨粗提物进入III期临床实验。我们于80年代末开始对鲨鱼及小牛软骨的抗肿瘤作用进行研究，在国内率先获得了鲨鱼软骨粗提物的食品、保健食品和内部制剂批准文号，并率先进行临床应用研究。几年来的研究结果表明鲨鱼软骨粗提物对实体瘤患者具有一定的疗效。但鲨鱼软骨粉及鲨鱼软骨粗提物仍有其缺点。软骨含有丰富的血管生成抑制因子，同时其中也含有血管生成刺激因子，软骨粉或粗提物未经纯化，未能去除其中的血管生成刺激因子，会影响其抑制血管生成作用。此外，软骨中含有丰富的钙，服用鲨鱼软骨粉或粗提物会引起肿瘤病人的高钙血症。因此，近年来许多实验室尝试从鲨鱼软骨中分离纯化鲨鱼软骨血管生成抑制因子(shark cartilage angiogenesis inhibitory fac-tor，SCAIF)，但到目前为止，仍未见获得成功的报道。
本发明的目的在于提供一种从鲨鱼软骨获得的血管生成抑制因子及其分离纯化的方法。
本发明从鲨鱼软骨制备获得了一种新的蛋白质-鲨鱼软骨血管生成抑制因子-I(简记为SCAIF-I)，能显著抑制血管生成以及小鼠肿瘤的生长，经纯度鉴定及其分子量测定，其SDS-PAGE电泳结果银染显示一条带，如图1所示。说明SCAIF-I达到电泳纯。测得其分子量为18000。
本发明中SCAIF-I由下述分离纯化方法获得，将鲨鱼软骨经盐酸胍(Gu．HCl)溶液抽提，用有机溶剂分级沉淀，再用Resource Q进行离子交换层析，得到3个洗脱峰(如图3)，收集第3峰，浓缩后进行Sephaeryl S-300分子筛层析，同样得到3个明显的洗脱峰(如图4)，再收集第3峰，浓缩后进行SDS-PAGE制备电泳，得到4个洗脱峰(如图5)，再收集第3峰，浓缩冻干，即得白色粉末状物质SCAIF-I。
对由上述方法分离纯化得到的SCAIF-I，本发明进行了一系列实验研究。
1．SCAIF-I对血管内皮细胞生长的抑制效应研究。
参考Mosmann的MTT方法进行(Mosmann T．Rapid colorimetric assay for cel-lular growth and survival：application to prolifereation and cytotoxicity assays．J Im-muno Met，1983；65：55-63)，以小牛主动脉血管内皮细胞为研究对象，以皮肤成纤维细胞为正常对照。结果如表1所示。其中，μg／ml表示SCAIF-I的浓度，BaEc为小牛主动脉血管内皮细胞，FC为成纤维细胞，P为显著性。
结果表示SCAIF-I对小牛主动脉血管内皮细胞的生长具有明显的抑制效应，并有明显的剂量依赖关系；当剂量为0．1μg／ml时，抑制率仍达47．71％；而对正常的皮肤成纤维细胞无抑制作用，在高浓度时反有促进作用，提示SCAIF-I能较特异抑制血管内皮细胞的生长。
表1 SCAIF-I对血管内皮细胞生长的抑制效应
| 浓度(μg/ml) | BaEC | P | FC | P |
| 501020.50.1生理盐水 | 0.115±0.0050.201±0.0380.291±0.0130.313±0.0390.217±0.0330.415±0.119 | ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01- | 2.500±0.0012.500±0.0012.500±0.0011.716±0.0761.714±0.0381.721±0.125 | ＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05- |
2．SCAIF-I对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制效应研究。
参考付生法等的方法加以改进(付生法，陆应麟，张朝山等。军事医学科学院院刊，1993；17(4)：294-296)。将孵化第9天加样改为第4天加样，以生理盐水为试剂对照，ANG为阳性对照，SCAIF-I处理浓度为0．5mg／L，加样量为10μl，照相记录结果(见图6所示)。
结果表明，生理盐水组血管生长旺盛，管径粗且分支多；而SCAIF-I处理组则相反。说明SCAIF-I能显著抑制新生血管生成。
3．SCAIF-I对小鼠肿瘤生长的抑制效应研究。
参考王衡文等方法(王衡文，程立主编。实验肿瘤学基础。北京：人民卫生出版社，1992。296-297)。C57BL／6小鼠接种Lewis肺癌，接种第2天开始给药，给药剂量为1mg／kg．d，每天1次，皮下或腹腔注射，连续18天后称瘤重，计算抑瘤率。结果如表2和图7所示。SCAIF-I显著抑制C57BL／6小鼠Lewis肺癌的生长，实验组肿瘤明显比对照组小。皮下注射组抑瘤率达96．25％，腹腔注射抑瘤率达92．76％，均几乎完全抑制了肿瘤的生长，显示了良好的研究开发价值。
表2 SCAIF-I对C57BL／6小鼠Lewis肺癌的抑制效应
| 组别 | 瘤重(g)(x±s) | 抑瘤率(％) | P |
| 生理盐水SCAIF-I/ipSCAIF-I/si | 3.73±0.810.27±0.230.14±0.14 | -92.7696.25 | -＜0.01＜0.01 |
本发明的研究结果说明，SCAIF-I为纯度较高、活性强、特异性好的血管生成抑制因子，能通过抑制新生血管生成非常显著抑制肿瘤的生长，是很有研究开发前景的一种蛋白质。
SCAIF具有一般抗血管增生药物的优点，同时也具有自己突出的优点：
1．SCAIF-I作为抗血管增生药物，其作用靶为遗传物质相当稳定的血管内皮细胞，在人体内血管内皮细胞的寿命仅次于寿命最长的神经细胞，不易产生药物耐受性，而现有的细胞毒类化疗药物大都作用于肿瘤细胞，其遗传物质极不稳定，容易产生多药抗药性。
2．与其他抗血管增生药物一样，SCAIF-I只作用于正在生长繁殖的血管内皮细胞，而不作用于已有的“静止的”血管内皮细胞，不对人体正常血管产生作用。人体在正常的生理条件下，除了女性的生理周期、伤口愈合及胎儿与儿童的生长发育过程，没有新生血管生成。已有的血管内皮细胞代谢缓慢，处于相对静止状态。因此，抗血管增生药物没有明显的毒副作用。
3．SCAIF-I直接从动物组织纯化获得，无一般化疗药物的毒性。
4．SCAIF-I可能在有机体中存在较高的保守性，在动物实验中未发现明显的过敏反应。
5．鲨鱼在各大海洋中均大量存在，其繁殖能力很强，作为软骨的丰富来源，保证了SCAIF-I的原料供应。
附图说明：
图1为SDS-PAGE SCAIF-I的银染结果，其中图1-1和图1-2为SCAIF-I，图1-3为Marker。
图2为SCAIF-I的质谱分析
图3 Resource Q离子交换层析(1．6×20cm)
图4 Sephacryl S-300分子筛层析(1．6×30cm)
图5 SDS-PAGE制备电脉洗脱图谱
图6 SCAIF-I对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制效应
其中图6-1为生理盐水对照组，图6-2为SCAIF-I处理组，图6-3为ANG阳性对照组
图7 SCAIF-I处理组及对照组小鼠肿瘤大小比较
实施例：
采用我国东海鲸鲨软骨300g，经过1mol／1 Gu HCl溶液抽提45-50小时，8000rpm离心25-35分钟，用45％-65％的丙酮分级沉淀，用Resource Q离子交换层析，得到3个洗脱峰P11、P12、P13(如图3所示)，其中buffer A：20mM Tris-Cl，pH8．5 Buffer B：1M NaCl，20mM Tris-Cl，pH7．6，收集第3峰；浓缩后进行SephacrylS-300分子筛层析，同样得到3个明显的洗脱峰P21、P22、P23，如图2所示；再将第3峰收集浓缩后进行SDS-PAGE制备电泳洗脱，得到4个峰P31、P32、P33、P34，如图5所示；再收集第3峰，浓缩冻干后得到0．5mg白色粉末状物质即SCAIF-I。对其进行纯度鉴定，参考Sambrook等的方法进行(Sambrook J，Friescn E F，Maniatis T．Moleoular Cloning-a laboratory manual．2nd ed，cold Spring Harbor laboratotryPress，1989．)，用5％的浓缩胶，12％的分离胶，采用垂直平板电泳，SDS-PAGE电泳银染显示一条带，如图1所示，说明SCAIF-I达到电泳纯，根据标准蛋白质的迁移率，测得其分子量为18128。另外，采用质谱法进一步测得SCAIF-I的分子量为18415，如图2所示。
Claims (2)
1．一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子，其特征在于该因子由鲨鱼软骨经分离纯化制得，其SDS-PAGE电泳银染显示一条带，其分子量为18000。
2．一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子的分离纯化方法，其特征在于将鲨鱼软骨经盐酸胍溶液抽提45-50小时，800rpm离心25-35分钟，用45-65％的丙酮有机溶剂分级沉淀；用ResourceQ离子交换层析，得到3个洗脱峰，其中，buffer A：20mM Tris-Cl，pH8．5．Buffer B：1M NaCl，20mM Tris-Cl，pH7．6，收集第3峰，浓缩后进行Sephacryl S-300分子筛层析，得到3个洗脱峰，收集第3峰，浓缩后进行SDS-PAGE 制备电泳，洗脱得到4个峰，再收集第3峰，浓缩干冻，即得白色粉末状物质SCAIF-I。
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