CN103145867B - 一种抗肿瘤生物多糖 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤生物多糖，所述多糖是通过从鸡胚尿囊液和鸡胚中分离纯化得到，本发明还公开了多糖的具体的纯化工艺，所述工艺是通过使用盐析和膜技术相结合的方法来提取生物多糖。本发明所述工艺大幅度提高了鸡胚尿囊液和鸡胚多糖分离纯化的纯度和回收率。本发明临床前药效学实验证明，所述生物多糖在裸鼠体内对移植性人体肿瘤-人类原发性肝癌，卵巢癌具有确切的杀伤能力，给以足够的剂量及时间可将裸鼠体内的移植性人体肿瘤细胞完全清除。本发明所述的多糖是一种无毒性、副作用小、十分安全的生物活性物质；并且给药途径广泛，生产工艺简单，回收率高，是一种可以产生巨大社会效益和经济效益的抗肿瘤新药。

Description

一种抗肿瘤生物多糖

技术领域

本发明涉及生物提取领域，提取物质是一种来源于SPF鸡胚的多糖组分，具体的方法包括SPF鸡胚培养，收获，多糖物质的分离提取的全部过程，以及这种多糖物质的分析检测和用途。

发明背景

肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。2010年全球将有超过800万人死于癌症，取代心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。因此，癌症治疗药物的研究关系到肝癌患者和全社会切身利益，一直是医药行业的研究热点，具有重要的社会意义。从治疗手段上来说，癌症的治疗主要是外科治疗、放射、化疗、生物与综合治疗等。癌症外科主要是癌切除、局部栓塞治疗等。切除和栓塞的治疗方法适用于界限清楚、远离大血管的肿瘤，而且手术切除的预后差、五年存活率低。移植需要解决的主要问题在于免疫排斥反应，后者往往成为患者和社会重大的经济负担，成功率也只有50％左右，5年存活率也很低。放疗和化疗对正常细胞也有杀伤作用，其特点是专一性差、副作用巨大，在杀伤肿瘤细胞的同时也极大地干扰机体的正常功能，不利于长期用药。正由于癌症缺乏有效控制方法，患者的预后极差。平均5年存活率低。因此，寻找肿瘤细胞特异性的药物是科学界始终关注的焦点。

生物大分子包括核酸、蛋白质以及多糖。尤其是多糖，成为近些年研究的热点。目前，已经有包括香菇多糖、枸杞多糖、黄精多糖、大豆多糖被广泛的研究其在肿瘤治疗中的作用。并对其抗肿瘤机制进行了深入的研究和探讨。

我们研制的鸡胚尿囊液和鸡胚提取的多糖属于免疫调节类产品。

免疫调节是指在免疫反应中，各种免疫细胞及其亚群间，细胞与各种细胞因子间存在着的刺激与抑制，或正相与负相两方面作用构成的互相制约的调节网络，完成对抗原的识别和反应。这种调节作用对维护机体免疫功能的稳定和动态平衡十分重要。免疫调节共分成如下几类：

免疫细胞间的调节作用。免疫反应过程涉及多种免疫细胞间的相互作用，如T-M，T-BTh-Ts和Ts-Tc等细胞间的相互作用，而其中Ts与Th在免疫调节中起关键作用。活化的Th细胞辅助B细胞产生抗体，辅助Tc细胞杀伤靶细胞，诱导M，表现迟发型超敏反应。而Ts细胞反过来对Th、Tc、B细胞和M的功能产生抑制作用。同样B细胞和M也可以通过多种机制对T细胞以及互相之间发挥促进和抑制的调节作用。

细胞因子的免疫调节作用。在免疫反应中，免疫细胞的相互作用，除细胞间的直接接触外、免疫细胞释放的可溶性因子也参与免疫反应的调节。就目前所知，这些因子包括干扰素(interferon，IFN)，白细胞介素-1(interleukin1，IL-1)，集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)等。这些细胞因子在介导机体多种免疫反应如肿瘤免疫、感染免疫、移植免疫、自身免疫等过程中发挥着重要的、甚至是中心的作用。它们各自具有多种生物学活性，彼此之间还在诱生、受体调节及生物效应等三个水平上相互作用，构成内容丰富、关系复杂的细胞因子网络(cytokinenetwork)。

免疫调节剂就是作用于免疫反应的不同环节，发挥其作用，使机体的免疫反应处于所需要的范围内，达到防治疾病的目的。

肿瘤免疫治疗的方法有非特异性免疫治疗和特异性免疫治疗。过去，人们在肿瘤免疫研究中过于强调特异性抗原和特异性免疫系统，免疫学的进展加深了人们对免疫系统抗肿瘤功能及免疫治疗作用重要性的认识。近年的研究表明，非特异性免疫系统的重要性开始得到了认同。现在，人们认识到，与不能对自身组织产生良好免疫应答的特异性免疫系统形成鲜明对照的是，非特异性免疫系统具有很强的能力来消除单个畸变的自身细胞。这意味着非特异性免疫系统具有在单个细胞水平消除可能发展成为肿瘤细胞的早期遗传变异的潜能。迪威立克抗肿瘤作用主要是通过对单核巨噬细胞系统强大而持久的刺激，引起巨噬细胞增生、活化、吞噬功能增强、诱导分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)、自细胞介素(IL-2)、活性氧(H2O2、NO)等癌细胞杀伤因子及增强NK细胞杀伤活性，达到抑制和杀伤肿瘤细胞及病原微生物的目的，且可通过促进造血多能干细胞分化为单核巨噬细胞，进一步调动机体免疫系统蕴藏抗癌、杀菌潜力。由于免疫调节的全身作用强，副作用少且轻特异性强的特点，适用范围逐渐增加，安全性较其他类别的药物具备明显的提高。

首先，在作用机理上该药物激活体液免疫与细胞免疫，直接作用于癌细胞，具有特异性，这明显优于现有抗肿瘤药物。此外，大量的实验，包括临床前药效学试验和临床试验的结果证实，对于多种肿瘤具有良好的治疗作用。第三，生物提取法不但易于进行放大实现工业化，还有利于环境保护等工业化需要面对的严重问题，与化学合成相比优势明显。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有提取技术的不足，针对原有的提取技术-冻干、有机溶剂沉淀的繁琐步骤入手，对鸡胚尿囊液多糖和鸡胚多糖的分离纯化的手段的创新，使用盐析和膜技术相结合的方法来提取生物多糖。来大幅度提高鸡胚尿囊液和鸡胚多糖中具备生物活性的多糖分离纯化后的纯度和回收率。

本发明解决的技术问题所采用的技术方案是在纯化工艺中采用了盐析和膜技术的分离纯化步骤。包括步骤：a、SPF鸡胚的培养；b、活鸡胚尿囊液或鸡胚培养物低温预冷；c、离心法和过滤法的使用对鸡胚尿囊液或鸡胚培养物进行澄清；d、盐析法沉淀生物大分子；e、超滤法(高分子量的超滤膜包)除高分子量的生物大分子；f、超滤法(低分子量的超滤膜包)截流活性多糖。

本发明提取所述多糖的工艺的优选的工艺步骤如下：

1.将SPF鸡胚在温度为36-38℃的恒温条件下培养9-13天。

2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4℃-18℃的环境下，放置8-48小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。

3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取：

1)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理：使用10mM～100mM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为2-10∶1，8000g-12000g，18℃以下，离心10-60分钟，收集上清液，弃去沉淀；

2)上清液的进一步澄清处理：用0.22μm的微孔滤膜过滤上清液；

3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清：固体硫酸氨的质量比为5-20∶1，混匀后放置于4℃-18℃储存，时间不低于6小时；

4)8000g-12000g，18℃以下，离心10-60分钟，取上清液；

5)用10-30KD的超滤膜以0.1-0.5mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；

6)用1KD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。

同原有的化学提取相比较，采用本专利的盐析和膜技术分离，目标多糖的回收率＞80％，远高于步骤繁琐的化学法的不足10％的回收率，具有明显的优势。此外，在全部的纯化工艺中，没有使用有机溶剂，不存在生物危害性，更有利于环保。可见，采用本发明的纯化下艺，可以大幅度的提高鸡胚尿囊液中具备生物活性的多糖的回收率。

本发明获得的多糖用于小鼠体内移植性人体肿瘤的杀伤能力试验，结果显示活性多糖对人类原发性肝癌，卵巢癌具有确切的杀伤能力。临床试验用于食管癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、非何杰金淋巴瘤、急性粒细胞白血病和乳腺癌等治疗，发现能够明显改善病人的生存质量，毒副作用小、有效率高等特点。

附图说明

图1尿囊液提取的生物多糖的高效液相色谱分析结果，色谱柱为凝胶排阻色谱柱，检测器为视差折光检测器，结果显示提取的物质为单一组分；

图2鸡胚培养物提取的生物多糖的高效液相色谱分析结果，色谱柱为凝胶排阻色谱柱，检测器为视差折光检测器，结果显示提取的物质为单一组分；

图3尿囊液提取的生物多糖的OD_260nm检测结果；

图4尿囊液提取的生物多糖的OD_280nm检测结果；

图5鸡胚培养物提取的生物多糖的OD_260nm检测结果；

图6鸡胚培养物提取的生物多糖的OD_280nm检测结果；

图7尿囊液提取的生物多糖紫外区和可见光区全波段扫描(扫描波长200nm-760nm)分析；图8鸡胚培养物提取的生物多糖紫外区和可见光区全波段扫描(扫描波长200nm-760nm)分析。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

实施例1抗肿瘤生物多糖的制备

本发明提取所述多糖的工艺的步骤如下：

1.将SPF鸡胚在温度为36-38℃的恒温条件下培养9-13天。

2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4℃的环境下，放置8小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。

3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取：

1)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理：使用10mM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为2∶1，8000g，18℃以下，离心60分钟，收集上清液，弃去沉淀；

2)上清液的进一步澄清处理：用0.22μm的微孔滤膜过滤上清液；

3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清：固体硫酸氨的质量比为5∶1，混匀后放置于4℃-18℃储存，时间不低于6小时；

4)8000g，18℃以下，离心60分钟，取上清液；

5)用10-30KD的超滤膜以0.1mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；

6)用1KD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。

实施例2抗肿瘤生物多糖的制备

本发明提取所述多糖的工艺的步骤如下：

1.将SPF鸡胚在温度为36-38℃的恒温条件下培养9-13天。

2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，放置于4℃冰箱冷藏，放置12-16小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。

3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取：

1)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理：使用20mM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物5倍，混合均匀，12000g，4℃离心20分钟，收集上清液，弃去沉淀；

2)上清液的进一步澄清处理：用0.22μm的微孔滤膜过滤上清液；

3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清：固体硫酸氨的质量比为10∶1，混匀后放置于4℃储存，时间不低于6小时；

4)12000g，4℃离心20分钟，取上清液；

5)用30KD的超滤膜以0.1mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；

6)用1KD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。

实施例3抗肿瘤生物多糖的制备

本发明提取所述多糖的工艺的步骤如下：

1.将SPF鸡胚在温度为36-38℃的恒温条件下培养9-13天。

2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4℃的环境下，放置48小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。

3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取：

1)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理：使用100mM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为10∶1，12000g，18℃以下，离心10分钟，收集上清液，弃去沉淀；

2)上清液的进一步澄清处理：用0.22μm的微孔滤膜过滤上清液；

3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清：固体硫酸氨的质量比为20∶1，混匀后放置于4℃-18℃储存，时间不低于6小时；

4)12000g，18℃以下，离心10分钟，取上清液；

5)用10-30KD的超滤膜以0.5mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；

6)用1KD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。

实施例4抗肿瘤多糖的检测分析

方法1：双缩脲反应

原理：

双缩脲反应是指具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应，生成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。双缩脲试剂就是指能与具有两个以上肽键的化合物发生红紫色显色反应的试剂。除-CONH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。糖类物质的双缩脲反应为阴性。

试剂双缩脲试剂。取硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)3.0g、酒石酸钾钠(KNaC₄H₄O₆·4H₂O)9.0g、碘化钾5.0g、氢氧化钠24g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。

标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量，用水定量稀释成每1ml含50mg的溶液。

供试品溶液的制备精密量取适量的供试品，加水制成每1ml约含50mg的溶液。

测定法分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0.05ml置玻璃试管中，分别加双缩脲试剂4.0ml，混匀，置37℃水浴中30分钟，照紫外-可见分光光度法(附录IIA)，在波长540nm处测定吸光度。另精密量取水0.05ml，自“加双缩脲试剂4.0ml”起，同法操作，作为空白对照。

按下式计算

蛋白质含量 $(\mathrm{mg}/\mathrm{ml})=\frac{A_1\×c\×n}{A_2}$

式中A₁为供试品溶液的吸光度；

A₂为标准蛋白质溶液的吸光度；

c为标准蛋白质溶液的浓度，mg/ml；

n为供试品稀释倍数。

【附注】本法的测定范围为1～10mg。

试验结果为阴性。

方法2：Fehling试验法

一、试剂准备：

1、Fehling试剂母液的配制

Fehling试剂I：溶解34.6g五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)于足量蒸馏水中，然后稀释至500ml。

Fehling试剂II：溶解173g酒石酸钾钠(KNaC₄H4O₆·4H₂O)及50gNaOH于足量蒸馏水中，然后稀释至500ml。

二、实验步骤

1.样品处理：取样品1ml加入浓硫酸1ml，充分振荡混匀。

2.取试管分别加入1mlFehling试剂I和1mlFehling剂II，摇动，使混合均匀，水浴加热至沸腾。

3.加入样品(液体样品0.1ml～0.15ml，相当于2滴～3滴；固体样品则加0.1g，研细后加入)，充分振荡，置于沸腾水浴中加热3min。4.观察结果。

生成砖红色沉淀者表明为阳性反应。

结果：阳性。

方法3：高效液相色谱分析

将从鸡胚培养物和尿囊液提取的生物多糖做高效液相色谱分析，色谱柱为凝胶排阻色谱柱，检测器为视差折光检测器，结果见图1和图2，结果显示提取的物质为单一组分；

对从鸡胚培养物和尿囊液提取的生物多糖做高效液相色谱分析，色谱柱为凝胶排阻色谱柱，检测器为DAD二极管阵列检测器，紫外检测波长OD_280nm和OD_260nm，检测结果见图3、图4、图5和图6，结果显示没有蛋白质和核酸。

方法4：提取物使用进行紫外区和可见光区全波段扫描

对从鸡胚培养物和尿囊液提取物进行紫外区和可见光区全波段扫描，扫描波长200nm-760nm，检测结果见图7和图8，结果显示未见到吸收峰。

方法5：葸酮法测多糖含量测定方法

原理：

糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区6200nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定。

操作方法：

样品：

精确量取1ml的供试品于试管中，平行测定2份，立即加入蒽酮试剂4.0ml，迅速浸于冰水浴中冷却，混匀，80℃水浴30分钟，管口加盖，防止蒸发。水浴结束后取出试管置于冰水中冷却至室温，波长620nm处测定吸光度。

标准曲线：

精确量取标准葡萄糖溶液(100μg/ml)，0(空白对照)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8ml分别置于试管中，补纯化水至1.0ml，其余操作同供试品。以标准葡萄糖浓度为横坐标(X)，以相应浓度的吸收度为纵坐标(Y)作图，建立标准曲线。

结果计算：

(1)将供试品OD值代入回归方程中，计算出稀释后供试品的多糖含量；

(2)根据供试品的稀释倍数计算出供试品的多糖含量；

多糖含量(ug/ml)＝供试品稀释倍数×稀释供试品多糖浓度。

实施例6对移植性人体肿瘤的杀伤能力试验

一、试验目的：观察在裸鼠体内活性多糖对移植性人体肿瘤的杀伤能力；

二、试验动物：裸鼠(20G左右，每组10只，中国医科院肿瘤所实验动物中心提供)；

三、瘤源：

1卵巢癌：sK-OV-3(女，64岁，卵巢癌，腹水，上皮样)

2原发性肝癌：smmc-7721(男，56岁，原发性肝癌，上皮样)

四、实验方法：将经原代细胞株传代的肿瘤组织块接种于裸鼠右肩胛皮下，四日后红肿消退，癌细胞正常生长，开始尾静脉给药，每天一次，每次0.02mg，连续给药10天，记录瘤体大小变化，停药观察。25天将裸鼠断颈处死，剖出瘤体分析。

五、结果：

治疗前后裸鼠体内肿瘤组织块的大小如表1和表2所示(平均值)：

表一卵巢癌瘤体大小(平均值，mmxmm)

表二原发性肝癌瘤体大小(mmxmm)

上表第0天为治疗前一天，统计结果显示：活性多糖对人类原发性肝癌，卵巢癌具有确切的杀伤能力，给以足够的剂量及时间可将多数裸鼠体内的移植性人体肿瘤细胞完全清除。

实施例7治疗恶性肿瘤临床实验25例

临床资料：

1、性别和年龄：

本组25例中，男性16例，女性9例。年龄7～80岁，平均43.5岁。

2、病种及诊断：

依据1989年《中国常见恶性肿瘤诊治规范》，以下简称《规范》，其中原发性肝癌(III期)6例：女性一例、男性五例，I级A2例、II级B4例；食管癌3例：I级1例、II级B2例；胃癌2例：II级B2例。依据1985年成都淋巴瘤会议制订的分类方案及1971年AnnArbor会议淋巴瘤国际分期修正案，非何杰金淋巴瘤3例：I级B1例，II级B2例，其中I期2例，IV期1例；何杰金氏2例：I级A1例，I级B1例，I期1例，IV期1例；胰腺癌并腹腔内广泛转移，II级B1例；肺癌4例：I级B1例，II级B3例；白血病4例。急性淋巴细胞型白血病(ALL)1例(L)，急性粒细胞型白血病(AML)1例(M3)，慢性粒细胞型白血病(CML)2例。

3、治疗方法：

3.1给药途径：依据肿瘤性质及病人一般状况，分别采用肌肉、瘤体内、浆膜腔内、椎管内、静脉注射及动脉灌注等方法。给药剂量0.8mg/天，连续给药1个月为一个疗程。

3.2疗效及毒副反应观察方法：根据肿瘤性质，分别对症状体征，影像学、细胞、病理学、特异性生化指标等定期复查。白血病每3天复查外周血常规及细胞形态学。骨髓象每15天复查一次。每周监测一次心肝肾等脏器功能。

结果

1、症状及生存质量：25例患者用药后的第2～3天即出现不同程度的食欲增加，精神改善，乏力缓解，睡眠增加，癌性疼痛消失，症状缓解达90％，生存质量(Karnofsky记分)平均增加30～40分。

2、疗效评定：

原发性肝癌6例：CR4例，PR2例，有效率为100％；

白血病4例：CR3例。其中ALLI例，CML2例，NC1例(治疗期间出血死亡)为AML，总有效率为75％；

淋巴瘤5例：CR3例，PR2例，有效率为100％；

食管癌及胃贲门癌所致的完全性梗阻3例，经应用活性多糖治疗后的第二天均能进食流质，一周内能进食软食或普食，吞钡点片显示病情改善；

食管癌CR2例，PR1例，有效率100％；

胃癌CR1例，PR1例，有效率100％；

胰腺癌NCI例。

肺癌CR1例，PR1例，NC2例，有效率50％。其中1例肺癌术后髂骨、椎骨、肝脏转移的患者经应用活性多糖治疗三周后复查、骨质破坏修复，肝脏转移灶消失。

3、毒副反应：本组25例患者在应用活性多糖的治疗过程中，均未出现心肝肾及造血系统的毒性作用。主要副作用为发热反应，发烧率为80％，热度为37～39℃。

Claims (4)

1.一种抗肿瘤生物多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)SPF鸡胚的培养；2)活鸡胚尿囊液或鸡胚培养物低温预冷；3)对鸡胚尿囊液或鸡胚培养物进行澄清处理；4)澄清处理后的上清通过盐析法沉淀生物大分子；5)超滤法去除高分子量的生物大分子，得到含活性多糖的过滤液；6)低分子量的超滤膜截流活性多糖；

所述的SPF鸡胚的培养的条件为：在温度为36-38℃中鸡胚培养时间为9-13天；

所述的活鸡胚尿囊液或鸡胚培养物低温预冷的具体条件为：收获后的鸡胚经过灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4℃-18℃的环境下，放置8-48小时；

所述的鸡胚尿囊液或鸡胚培养物进行澄清处理的具体条件为：使用10mM～100mM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为2-10∶1，8000g-12000g，18℃以下，离心10-60分钟，收集上清液，弃去沉淀，得到的上清液进一步用0.22μm的微孔滤膜过滤；

所述的盐析法沉淀生物大分子的具体条件为：向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，上清和固体硫酸氨的体积比为5-20∶1，混匀后放置于4℃-18℃储存，时间不低于6小时；

所述的超滤法去除高分子量的生物大分子的具体条件为：8000g-12000g，18℃以下，离心10-60分钟，取上清液，用10-30KD的超滤膜以0.1-0.5mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；

所述的低分子量的超滤膜截流活性多糖的具体条件为：用1KD的超滤膜过滤第5)步去除高分子量生物大分子的过滤液。

2.根据权利要求1所述的方法制备的多糖。

3.权利要求2所述的多糖在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、非何杰金淋巴瘤、急性粒细胞白血病。