BG66067B1

BG66067B1 - Средство с антитуморна активност на база бцж ваксина, метод за неговото получаване и използването му

Info

Publication number: BG66067B1
Application number: BG109160A
Authority: BG
Inventors: Спартак ХАДЖИЕВ; Нася ХАДЖИЕВА; Михаил ПЕТРОВ; Дора ХАДЖИЕВА; Зоя РАЧКОВСКА
Original assignee: Спартак ХАДЖИЕВ; Нася ХАДЖИЕВА; Михаил ПЕТРОВ
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2005-05-18
Publication date: 2011-01-31
Also published as: EP1881838A1; SI1881838T1; BG109160A; EP1881838B1; WO2006122380A1

Abstract

Изобретението се отнася до средство с антитуморна активност на база БЦЖ ваксина, до метод за неговото получаване и до използването му за лечение на онкологични заболявания при хора, при всички форми на злокачествени новообразувания, във всички стадии на развитие на заболяването. То представлява смес от две отделни фракции: фракция 1 - живи БЦЖ бактерии, и фракция 2 - извлек-филтрат от БЦЖ ваксина. Съотношението между двете фракции може да варира от 1:0.01 до 0.01:1. Средството съгласно изобретението създава максимална възможност за проява на противотуморния фактор на БЦЖ ваксината с цел спиране на бързото и безконтролно размножаване на туморните клетки, при намалена токсичност и блокиране на потискащия ефект на туморните клетки върху нормалните клетки на организма.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до средство с антитуморна активност, на база БЦЖ ваксина, метод за неговото получаване и използването му за лечение на онкологични заболявания при хора.

Предшестващо състояние на техниката

От множество научни изследвания, публикувани през последните години е установено, че антитуморната активност на сем. Mycobacteriacea се дължи на съдържащи се в нея или продуцирани от нея активни агенти.

Така от US 6,274,356 е известен въглехидратен комплекс, представляващ смес от полизахарид, екстрахиран от Mycobacterium vaccae, който е с висока антитуморна активност при лечение на различни онкологични заболявания. Описан е и метод за получаването на въглехидратния комплекс, представляващ поредица от операции за получаване на преципитати, диализа, екстрахиране и пречистване.

Техническа същност на изобретението

Проблем на изобретението е да се създаде средство с антитуморна активност на база БЦЖ ваксина, което да дава максимална възможност за проява на противотуморния фактор на БЦЖ ваксината с цел спиране на бързото и безконтролно размножаване на туморните клетки, при намалена токсичност и блокиране на потискащия ефект на туморните клетки върху нормалните клетки на организма, както и метод за получаване на средството с антитуморна активност на база БЦЖ и използването му.

Този проблем съгласно изобретението се решава със средство на база БЦЖ ваксина (BCG с активна субстанция Mycobacterium bovis, която се контролира от производителя съгласно изискванията на СЗО по отношение на физическите, химическите и биологичните свойства на изходните щамове и на крайния продукт), което има мощен потискащ ефект върху тумор ните клетки, при отсъствие на нежелани странични реакции.

Средството съгласно изобретението представлява смес от две отделни фракции, съотношението между които може да варира от 1:0.01 до 0.01:1.

Фракция 1, обозначена като “Живи БЦЖ бактерии” съдържа стандартно разтворена БЦЖ ваксина, разредена веднъж с физиологичен разтвор или дестилирана вода до концентрация от 100 до 10 microg/ml и втори път разредена с физиологичен разтвор от 10 до 0.001 microg/ml.

Под стандартно разтворена БЦЖ ваксина се разбира 1 ампула БЦЖ ваксина, съдържаща 500 microg сухо вещество, разтворена с 1 ml дестилирана вода като стандартен разтворител.

Фракция 2, означена като “Извлек-филтрат от БЦЖ ваксина”, съдържа стандартно разтворена БЦЖ ваксина, разредена с 4-6 ml дестилирана вода или 3-5 ml физиологичен разтвор.

Друг обект на изобретението е метод за получаване на средството с антитуморна активност съгласно изобретението. Същността на метода се състои в това, че се получават две отделни фракции, обозначени като Фракция 1 “Живи БЦЖ бактерии” и Фракция 2 - “Извлекфилтрат от БЦЖ ваксина”, които след специфична обработка се смесват в определено съотношение.

Фракция 1 се приготвя от стандартна ампула, съдържаща 500 microg/ml сухо вещество от ваксина БЦЖ обезателно в срок на годност. Ампулата се разтваря според упътването със стандартен разтворител при спазване на правилата за стерилност в бокс за разливане на хранителни среди, който е предварително облъчен с UV-лампи за 18-24 h. Получената суспензия се разрежда допълнително с физиологичен разтвор или дестилирана вода до концентрация от 100 до 10 microg/ml. Така получената суспензия се разрежда още веднъж до концентрация от 10 до 0.001 microg/ml (съгласно изобретението приемани за 10 условни единици).

Съдържанието на живи БЦЖ бактерии се контролира чрез периодични посявки на средата на Льовенщайн-Йенсен за туберкулозни бактерии, която има следния състав (в g/Ι към двойно дестилирана вода):

L-Аспаргин 3.6

Монокалциев фосфат 2.4

66067 Bl

Магнезиев сулфат	0.24
Магнезиев цитрат	0.6
Картофено брашно	30.0
Малахитово зелено	0.4
Глицерол	12.0 ml
Яйца	11
pH 7.2 ± 0.2 а 25°С
Растежът се контролира чрез наличие на

характерни колонии и чрез специфичната морфология на бактериите на микроскопски препарат, оцветен по Цил-Нилсен.

Фракция 2 се получава от стандартна БЦЖ ваксина, като към нея се добавят от 3 до 5 ml физиологичен разтвор или от 4 до 6 ml дестилирана вода и се обработва с ултразвук от 8 до 12 min. Получената суспензия се оставя за 2 до 60 дни, за предпочитане от 2 до 20 дни в хладилник, при температура 4-8°С.

Съдържанието на живи БЦЖ бактерии се контролира чрез периодични посявки на средата на Льовенщайн-Йенсен за туберкулозни бактерии, а растежът се доказва чрез наличието на характерни колонии и чрез специфичната морфология на туберкулозните бактерии на препарати по Цил-Нилсен.

Между 2-тия и 60-тия ден суспензията се филтрира през стерилен филтър и полученият филтрат се съхранява в хладилник, при температура 4-8°С, като изходен извлек-филтрат, в който няма живи БЦЖ бактерии.

Фракция 2 представлява бистър разтвор, без видими примеси, без цвят и без мирис. Химичният състав на извлека съдържа белтъци, нуклеопротеиди, свободни аминокиселини, полизахариди и малко количество маста, като съотношенията между посочените компоненти варират неконтролируемо.

След проведения контрол за наличие на живи бактерии двете фракции се смесват при съотношение на Фракция 1 към Фракция 2 от 0.01:1 до 1:0.01.

Един следващ обект на изобретението е използването на средството с антитуморна активност на база БЦЖ ваксина. Средството съгласно изобретението се използва при всички форми на злокачествени новообразувания, във всички стадии на развитие на заболяването.

Средството с антитуморна активност съгласно изобретението се прилага за лечение на различни форми на рак и по-специално при рак на гърлото, на гърдата, на стомаха, на черния дроб, на пикочния мехур, на дебелото черво, на кожата и при всички други форми на солидни тумори, включително тумори на мозъка, при малигмен меланом, както и при метастази, произхождащи от различни солидни тумори във всички системи на човешкия организъм.

Непосредствено след смесването на двете фракции в определеното съгласно изобретението съотношение, полученото средство с антитуморна активност на база БЦЖ ваксина се прилага интрадермално на болни от рак в количество от 0.1 до 0.2 ml.

За трайна употреба, средството съгласно изобретението се пренася в ледена баня, където се разлива във вакуумни ампули от по 0.2 ml.

Предимства на изобретението

Предимствата на средството с антатуморна активност съгласно изобретението са:

1) Оказва мощен ефект върху туморните клетки като спира бързото им и безконтролно размножаване;

2) Има мощен ефект върху метастазите като спира растежа им и води чрез регресия до пълното им изчезване;

3) Блокира потискащия ефект на туморните клетки върху нормалните клетки на организма;

4) Има ниска токсичност;

5) Действа вероятно като клетъчен растежен фактор, контролиращ недеференцираната пролиферация на раковите клетки;

6) Методът за получаване на средството е опростен.

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се илюстрира със следващите примери, които го поясняват без да ограничават обхвата му на закрила.

Пример 1

Получаване на Фракция 1 - живи БЦЖ бактерии

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина (BCG ваксина произведена от “БУЛ БИО” НЦЗПБ ЕООД, София) в срок на годност, съдържаща 500 microg сухо вещество, се отваря стерилно в бокс за разливане на хранителни среди,

66067 Bl предварително облъчван с UV-лампа в продължение на 18 г. Прибавя се 1 ml дестилирана вода и получената суспензия се разрежда с физиологичен разтвор до концентрация 100 microg БЦЖ в 1 ml физиологичен разтвор. Получената суспензия допълнително се разрежда до 10 microg/ ml. Съдържанието на живи БЦЖ бактерии се контролира чрез периодични посявки на средата на Льовенщайн-Йенсен за туберкулозни бактерии. Растежът се контролира чрез наличие на характерни колонии и чрез специфичната морфология на бактерия на микроскопски препарат, оцветен по Цил-Нилсен.

Получаване на Фракция 2 - извлек-филтрат от БЦЖ ваксина

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина се отваря стерилно в предварително облъчен с UVлампа бокс за разливане на хранителни среди. Прибавя се 1 ml стандартен зададената ваксина разтворител. Към получената суспензия се прибавят 3 ml физиологичен разтвор, след което резултантната суспензия се обработва с ултразвук в продължение на 8 min и се оставя в хладилник при температура 4-8°С в продължение на 2 дни. На 1-вия и 2-рия ден периодично се осъществява контрол за наличие на живи бактерии чрез посявки върху средата на Льовенщайн-Йенсен, след което суспензията се филтрува през стерилен филтър Фалкон® с големина на порите < 0.1 mm, като полученият филтрат представлява готова за употреба Фракция 2.

Получаване на средството с антитуморна активност

Получените както е описано по-горе две фракции се смесват стерилно в стерилен съд при съотношение на Фракция 1: Фракция 2, тъй както 1 : 0.01 и резултантната смес представлява готово за незабавна употреба средство съгласно изобретението.

Средството с антитуморна активност съгласно изобретението се прилага на болни строго интрадермално на воларната страна на ръката, като Манту в количество 0.1 ml.

Пример 2

Получаване на Фракция 1 - живи БЦЖ бактерии

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина в срок на годност, съдържаща 500 microg сухо вещество, се отваря стерилно в бокс за разливане на хранителни среди, предварително облъч ван с UV-лампа в продължение на 20 h като се прибавя 1 ml дестилирана вода. Получената суспензия се разрежда с дестилирана вода до концентрация 50 microg/ml. Резултантната суспензия допълнително се разрежда с физиологичен разтвор до концентрация 0.1 microg/ml.

Съдържанието на живи БЦЖ бактерии се контролира чрез периодични посевки, както е описано в Пример 1.

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина се отваря стерилно в бокс предварително облъчен с UV-лампа. Прибавя се 1 ml стандартен зададената ваксина разтворител. Към получената суспензия се прибавят 4 ml дестилирана вода, след което резултантната суспензия се обработва с ултразвук в продължение на 9 min и се оставя в хладилник при температура 4-8°С в продължение на 10 дни като през това време периодично се осъществява контрол за наличие на живи бактерии, както е описано в Пример 1. На 10тия ден суспензията се филтрува през стерилен филтър Фалкон® с големина на порите <0.1 mm, като полученият филтрат представлява готова за употреба Фракция 2.

Получените както е описано по-горе две фракции се смесват стерилно в стерилен съд при съотношение на Фракция 1: Фракция 2, тъй както 1:0.1. Сместа представлява годно за употреба средство съгласно изобретението.

Пример 3

Получаване на Фракция 1 - живи БЦЖ бактерии

В бокс за разливане на хранителни среди, предварително облъчван с UV-лампа в продължение на 22 h се разтваря със стандартен разтворител една стандартна ампула БЦЖ ваксина както е описано в Пример 1. Получената суспензия се разрежда с физиологичен разтвор до концентрация 10 microg/ml. Резултантната суспензия допълнително се разрежда с физиологичен разтвор до концентрация 0.001 microg/ml.

Съдържанието на живи БЦЖ бактерии се

66067 Bl контролира чрез периодични посевки, както е описано в Пример 1.

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина се отваря стерилно в бокс предварително облъчен с UV-лампа и се прибавя 1 ml дестилирана вода. Получената суспензия се разрежда с 5 ml физиологичен разтвор, след което се обработва с ултразвук в продължение на 10 min и се оставя в хладилник при температура 4-8°С в продължение на 20 дни като периодично се осъществява контрол за наличие на живи бактерии, както е описано в Пример 1. На 20-тия ден суспензията се филтрува през стерилен филтър Фалкон® с големина на порите < 0.1 mm. Полученият филтрат не съдържа живи БЦЖ бактерии и представлява готова за употреба Фракция 2.

Получените както е описано по-горе две фракции се смесват стерилно в стерилен съд при съотношение на Фракция 1: Фракция 2, тъй както 1:1. Сместа се пренася в ледена баня, където се разлива във вакуумни ампули от по 0.2 ml и се съхранява в хладилник при температура 48°С. Така полученото средство с антитуморна активност може да се използва до 1 месец от производството му.

Пример 4

Получаване на Фракция 1 - живи БЦЖ бактерии

В бокс за разливане на хранителни среди, предварително облъчван с UV-лампа в продължение на 24 h се разтваря със стандартен разтворител една стандартна ампула БЦЖ ваксина както е описано в Пример 1. Получената суспензия се разрежда с дестилирана вода до концентрация 10 microg/ml. Резултантната суспензия допълнително се разрежда с физиологичен разтвор до концентрация 0.001 microg/ml.

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина се отваря стерилно в бокс предварително облъчен с UV-лампа и се прибавя 1 ml дестилирана вода. Получената суспензия се разрежда с 6 ml дестилирана вода, след което се обработва с ултразвук в продължение на 12 min и се оставя в хладилник при температура 4-8°С в продължение на 40 дни като периодично се осъществява контрол за наличие на живи бактерии, както е описано в Пример 1. На 40-тия ден суспензията се филтрува през стерилен филтър Фалкон® с големина на порите < 0.1 mm. Полученият филтрат не съдържа живи БЦЖ бактерии и представлява готова за употреба Фракция 2.

Получените както е описано по-горе две фракции се смесват стерилно в стерилен съд при съотношение на Фракция 1: Фракция 2, тъй както 0.1 : 1.

Пример 5

Получаване на Фракция 1 - живи БЦЖ бактерии

В бокс за разливане на хранителни среди, предварително облъчван с UV-лампа в продължение на 23 h се разтваря със стандартен разтворител една стандартна ампула БЦЖ ваксина както е описано в Пример 1. Получената суспензия се разрежда с дестилирана вода до концентрация 20 microg/ml. Резултантната суспензия допълнително се разрежда с физиологичен разтвор до концентрация 0.01 microg/ml.

Една стандартна ампула БЦЖ ваксина се отваря стерилно в бокс предварително облъчен с UV-лампа и се прибавя 1 ml дестилирана вода. Получената суспензия се разрежда с 4 ml физиологичен разтвор, след което се обработва с ултразвук в продължение на 10 min и се оставя в хладилник при температура 4-8°С в продължение на 60 дни като през този период периодично се осъществява контрол за наличие на живи

66067 Bl бактерии, както е описано в Пример 1. На 60тия ден суспензията се филтрува през стерилен филтър Фалкон® с големина на порите < 0.1 mm. Полученият филтрат не съдържа живи БЦЖ бактерии и представлява готова за употреба Фракция?.

Получените както е описано по-горе две фракции се смесват стерилно в стерилен съд при съотношение на Фракция 1: Фракция 2, тъй както 0.01 : 1.

Средството с антитуморна активност съгласно изобретението се прилага на болни строго интрадермално на воларната страна на ръката, като манту в количество 0.2 ml.

Примери за клинични изпитания на средството с антитуморна активност съгласно изобретението

При мозъчни тумори

Пример 6

Пациент Б.В., 57-годишен мъж с диагноза: Craniopharingeoma (Краниофарингеом), на когото е направена частична резекция. По това време пациентът е имал силно главоболие, нарушения в съзнанието, зрителни нарушения и моторна слабост. Последващото лъчелечение е било прекратено, поради влошаване на симптомите. Скоро след първото инжектиране със средство съгласно изобретението се наблюдават видими подобрения в състоянието на пациента, до постепенно пълно изчезване на симптомите. Сега пациентът е в добро здраве и живее нормален и пълноценен живот.

Пример 7

Пациент М.Г., 24-годишен мъж с диагноза: Meduloblastoma (Медулобластом), водещ до еластична парализа на левия крак и пълна иммобилация на пациента. До 6 месеца след първото инжектиране със средството съгласно изобретението парализата изчезва, постепенно се постига пълно възстановяване.

Пример 8

Пациент С.Т., 21 -годишна жена с диагноза Ewing’s sarcoma (Саркома на Юинг). Терапията със средството съгласно изобретението започва след проведено оперативно лечение и химиотерапия. Към този момент при наличие на пълзяща парализа на краката пациентката е била неподвижна в инвалидна количка. Постепенно в курса на лечение със средството съгласно изобретението тя възвръща способността си да ходи самостоятелно, без нужда от чужда помощ.

При рак на пикочния мехур

Пример 9

Пациент Д.К., 51-годишен мъж с диагноза рак на пикочния мехур се подлага на ТУР всеки 3-4 месеца, а впоследствие се оперира заради масивна хематурия. Няколко месеца след прилагането на средството съгласно изобретението болният се чувства добре, симптоми няма и живее нормален живот.

Пример 10

Пациент А.А., 46-годишен мъж с рак на пикочния мехур се намира в лошо общо състояние поради профузна хематурия. Скоро след прилагане на средството съгласно изобретението състоянието се подобрява и няма хематурия. Множеството последващи цистоскопии са негативни за туморни клетки.

Пример 11

Пациент С.С., 57-годишен мъж, по професия лекар, с рак на пикочния мехур. В продължение на две години всеки 2-3 месеца му се прави ТУР. След прилагане на средството съгласно изобретението хематурията изчезва, а последващите цистоскопии са негативни.

При тумори на кожата

Пример 12

Пациент Н.Т. с диагноза: melanom malignum. След терапия със средството съгласно изобретението петното изчезва.

Пример 13

Пациент Г.Г. с диагноза Angio Sa с голяма туморна маса в областта на мишницата, която след инжектиране със средството съгласно изобретението постепенно изчезва като остава круста.

Пример 14

Пациент Д.Д. с диагноза Саркома и голяма туморна маса на ръката. След няколкомесечно лечение със средството съгласно изобретението туморната маса изчезва и остава само белег.

При рак на белия дроб

Пример 15

Пациент И.Т., мъж с диагноза Са pulmonum

66067 Bl

Пример 16

Пиши···.! М.Г.. мьж. ν лиагшла Са pu’ir.nnum

Пример (7

Пациент Н.Р.Д., жена, е диагноза Са pulmoni.m

Claims

1. Средство е антитуморна активност на база БЦЖ ваксина, съдържащо стандартно разтворена БЦЖ ваксина е активна субстанция Mycobacterium bovis, характеризиращо се е това, че представлява смес от две отделни фракции, където фракция 1 - живи БЦЖ бактерии, включва стандартно разтворена БЦЖ ваксина, разредена веднъж с физиологичен разтвор или дестилирана вода до концентрация от 100 до 10 microg/ ml и втори път с физиологичен разтвор от 10 до 0.001 microg/ml, а фракция 2 - извлек-филтрат от БЦЖ ваксина, съдържа стандартно разтворена БЦЖ ваксина, разредена с 4-6 ml дестилирана вода или 3-5 ml физиологичен разтвор при количествено съотношение на фракция 1 -.фракция 2 в сместа от 1 : 0.01 до 0.01 : 1.

2. Метод за получаване на средство с антитуморна активност, при който се изхожда от суспензия на стандартно разтворена БЦЖ ваксина с активна субстанция Mycobacterium bovis, характеризиращ се с това, че се получават две отделни фракции, обозначени като фракция 1 живи бактерии, получена след двукратно разреждане с физиологичен разтвор или дестили

66067 Bl рана вода, и фракция 2 - извлек-филтрат от БЦЖ ваксина, получена чрез добавяне на физиологичен разтвор или дестилирана вода към стандартно разтворена БЦЖ ваксина, след което получената суспензия се обработва с ултразвук, преди да се остави да престои от 2 до 60 дни, за предпочитане от 2 до 20 дни, през което време се осъществява контрол за съдържанието на живи бактерии в двете фракции, след което те се смесват в съотношение фракция 1 : фракция 2 от 0.01:1 до 1: 0.01.

3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че фракция 1 се получава като стандартно разтворена БЦЖ ваксина се разрежда веднъж с физиологичен разтвор или дестилирана вода до концентрация от 100 до 10 microg/ml и втори път с физиологичен разтвор от 10 до 0.001 microg/ml.

4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че фракция 2 се получава след като към стандартно разтворената БЦЖ ваксина се добавят от 3 до 5 ml физиологичен разтвор или от 4 до 6 ml дестилирана вода и получената суспензия, след обработка с ултразвук от 8 до 12 min, се оставя за 7 до 60 дни, за предпочитане от 2 до 20 дни в хладилник, при температура 4-8°С, като през това време периодично се осъществява контрол за съдържанието на живи БЦЖ бактерии, след което суспензията се филтрува през стерилен филтър и се съхранява в хладилник при температура 4-8°С.

5. Използване на средство с антитуморна активност на база БЦЖ ваксина, прилагано интрадермално на болни в количество от 0.1 до 0.2 ml за лечение на солидни тумори и метастази, произхождащи от тях във всички системи на човешкия организъм, както и за предпазване от рецидиви след оперативно лечение, лъчелечение и химиотерапия.

6. Използване съгласно претенция 5, за лечение на различни форми на солидни тумори и по-специално рак на гърлото, на гърдата, на стомаха, на черния дроб, на пикочния мехур, на дебелото черво, на кожата, тумори на мозъка, малигмен меланом и метастази, произхождащи от тях във всички системи на човешкия организъм.