CN106562963A - 粉蝶霉素类化合物Piericidin A在制备抗肾癌药物中的应用 - Google Patents

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方伟
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Abstract

本发明公开了粉蝶霉素类化合物Piericidin A在制备抗肾癌药物中的应用。结构如式(Ⅰ)所示的粉蝶霉素A(Piericidin A)，对三株人肾癌细胞株具有不同强度的抑制作用，尤其对人肾上腺癌细胞ACHN的抑制活性最强，半数抑制率IC50达到0.40μM。细胞凋亡实验显示Piericidin A可明显诱导人肾上腺癌细胞ACHN的晚期凋亡，抑制抗凋亡蛋白Bcl‑2是其抗肾癌的作用机理之一。因此先导化合物Piericidin A可以作为Bcl‑2抑制剂用于为抗肾癌药物的开发。本发明为研制微生物来源新型抗癌药物提供了新的先导化合物。

Description

粉蝶霉素类化合物Piericidin A在制备抗肾癌药物中的应用
技术领域：
本发明属于天然产物领域，具体涉及粉蝶霉素类化合物Piericidin A在制备抗肾癌药物中的应用。
背景技术：
长期以来，恶性肿瘤已成为严重危害人类生命和生活质量的主要疾病之一[1]。据报道，恶性肿瘤已经成为我国居民首要死因。对于恶性肿瘤的治疗，天然产物及其衍生物药物发挥着重要作用。据报道，1981年到2008年间，天然产物来源的抗肿瘤药物占上市抗肿瘤药物的60％以上，而且，新型天然产物及其衍生物作为新的抗肿瘤药物所占数量还在不断增加[2]。肾癌是世界十大致死癌症之一，在我国泌尿系肿瘤中发病率仅次于膀胱癌。研究发现，肾癌患者中30％发生转移，另有30％在10年内有发生转移的危险，并且转移性肾癌对放化疗及系统性治疗具有较高的耐受性[3]。
粉蝶霉素类(Piericidins)是微生物来源的α-pyridone类抗生素，现已发现39个piericidins天然产物，均由陆地和海洋来源的放线菌产生。粉蝶霉素类报道有杀虫、抗菌等活性，对部分肿瘤细胞也有抑制活性，但是作用机制研究非常薄弱，抗肿瘤潜力有待进一步挖掘[4]。
参考文献：
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粉蝶霉素A(Piericidin A)，其结构如式(Ⅰ)所示：
发明内容：
本发明的目的是提供粉蝶霉素类化合物Piericidin A或其药用盐在制备抗肾癌药物中的应用。
本发明通过对Piericidin A的抗肿瘤活性评价，首次发现Piericidin A对三株人肾癌细胞株(ACHN,786-O和OS-RC-2)具有不同强度的抑制作用，尤其对人肾上腺癌细胞ACHN的抑制活性最强，半数抑制率IC50达到0.40μM，显著强于阳性对照药顺铂(IC50 7.54μM)。细胞凋亡实验显示Piericidin A可明显诱导人肾上腺癌细胞ACHN的晚期凋亡。因此Piericidin A可以做为抗肾癌(尤其是肾上腺癌)药物开发的先导化合物。
因此，本发明提供了粉蝶霉素类化合物Piericidin A或其药用盐在制备抗肾癌药物中的应用；
所述的化合物Piericidin A，其结构如式(Ⅰ)所示：
所述的抗肾癌药物为抗人肾上腺癌或肾细胞癌的药物。
进一步实验显示Piericidin A可显著抑制ACHN细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而诱导ACHN的细胞凋亡。抑制抗凋亡蛋白Bcl-2是Piericidin A对肾癌细胞抑制活性的作用机理之一。
因此，本发明的第二个目的是提供化合物Piericidin A在制备抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制剂中的应用。
优选，化合物Piericidin A作为抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制剂在制备抗肾癌药物中的应用。
一种抗肾癌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的如式(Ⅰ)所示的化合物Piericidin A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
一种抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制剂，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的如式(Ⅰ)所示的化合物Piericidin A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
本发明首次发现粉蝶霉素类化合物Piericidin A对肾癌细胞具有显著抑制作用，且首次发现其具有Bcl-2抑制活性，可以作为Bcl-2抑制剂用于制备抗肾癌药物，因此本发明为开发新的抗癌药物提供了备选化合物。
本发明的粉蝶霉素类化合物Piericidin A，公众可以通过市售途径获得Piericidin A。
附图说明：
图1是不同浓度Piericidin A作用下肾癌ACHN细胞不同时间的光镜照片；
图2是Piericidin A作用下肾癌细胞ACHN细胞凋亡情况；
图3是Piericidin A对肾癌细胞ACHN细胞凋亡率的影响；
图4是Piericidin A对ACHN细胞中Bcl-2蛋白表达的影响。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：粉蝶霉素A(Piericidin A)对三株肾癌细胞的抑制活性
三株人肾癌细胞株订购于中科院上海细胞资源中心：786-O人肾癌细胞株(Cat#TCHu186)；ACHN人肾癌细胞株(Cat# TCHu199)；OS-RC-2人肾癌细胞株(Cat# TCHu40)。
肾癌细胞抑制活性实验采用CCK-8检测法。收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育24小时。用完全培养基将待测化合物稀释至合适的作用浓度，按25μl/孔加入细胞。对于ACHN细胞，PA和阳性对照药(顺铂)的作用终浓度从20μM开始，4倍梯度稀释，9个浓度点；对于786-O和OS-RC-2细胞，PA和顺铂的作用浓度从100μM开始，4倍梯度稀释，9个浓度点。细胞置于37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育72小时。吸弃培养基，加入含10％CCK-8的新鲜完全培养基置于37℃培养箱中孵育2-4小时。轻轻震荡后在SpectraMax M5 Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。
按下式计算化合物对癌细胞生长的抑制率：
癌细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As:样品的吸光度OA(细胞+CCK-8+待测化合物)
Ac:阴性对照的吸光度OA(细胞+CCK-8+DMSO)
Ab:阳性对照的吸光度OA(培养基+CCK-8+DMSO)
运用软件Graphpad Prism 5并采用计算公式log(inhibitor)vs.normalizedresponse进行IC50曲线拟合并计算出IC50值。
粉蝶霉素A(Piericidin A)对三株肾癌细胞株的增殖抑制作用见表1：
表1.Piericidin A(PA)对三株肾癌细胞株的增殖抑制作用(IC50,μM)
a阳性对照药
Piericidin A对肾癌细胞ACHN和OS-RC-2具有显著的增殖抑制活性，特别是对ACHN细胞增殖抑制的IC50达到0.4μM，显著强于阳性药顺铂。对肾癌细胞的抑制活性具有较强的选择性。
实施例2：Piericidin A对三株肾癌细胞ACHN细胞凋亡的作用
取对数生长期的ACHN细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，接种于50mL培养瓶内，分三批，每批分四组，1组为空白对照，2、3、4组分别加入Piericidin A，使其终浓度为50,200和400nM。细胞贴壁后,更换培养液并加药,其中两批分别培养24h和48h,光镜观察照相后进行消化并收集细胞，第三批培养至72小时光镜观察照相。收集的细胞4℃预冷PBS洗涤,离心1 000r/min,2×5min。缓冲液重悬细胞后,取100μL细胞悬液于流式管内,加入5μLAnnexin-V和10μL PI溶液,室温避光15min后,流式细胞仪进行检测。
Piericidin A作用下肾癌ACHN细胞的形态学变化如图1。光镜照片显示ACHN凋亡细胞在Piericidin A作用下体积变小、变形，剂量一效应关系良好。细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期(48-72h)可见凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
不同浓度Piericidin A作用下肾癌细胞ACHN的细胞凋亡图和凋亡率见图2和图3。结果显示Piericidin A在200nM和400nM剂量下可明显诱导ACHN细胞的晚期凋亡。
实施例3：Piericidin A抑制Bcl-2蛋白表达的实验
取对数生长期ACHN细胞,分别加入Piericidin A,使其终浓度为0,10,50和200nM,作用48h。①总蛋白的提取:PBS洗涤两次后,每个样品加入蛋白裂解液RIPA200μL,PMSF 5μL/mL,置于冰盒中,放置40min；15 000r/min,4℃,离心20min；取上清,即为所需蛋白提取液,100μL管分装。微量紫外分光仪检测蛋白浓度后,-80℃保存备用。②聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳):取蛋白样本100μL加入4×loading buffer,100℃变性10min；上样,电泳约1.5h。③转膜:采用半干电转移法将蛋白转印到硝酸纤维素膜(PVDF)上。④封闭:10％脱脂牛奶(体积分数)室温下封闭2h。⑤孵育一抗:抗体按1∶200,4℃孵育过夜。⑥孵育二抗:次日晨复温2h后,分别加入HRP标记的抗兔或抗鼠抗体(1∶2 000),常温孵育2h。⑦化学发光摄像:TBST洗3次,每次10min,TBS洗膜2次,每次15min,置于成像拍摄系统内,加入新鲜配制发光液,显色、拍照。
实验结果见图4所示，结果显示，Piericidin A在浓度200nM下可以显著抑制ACHN细胞中Bcl-2蛋白的表达，抑制率达到18％。
上述实验结果表明，Piericidin A对三株人肾癌细胞株具有不同强度的抑制作用，尤其对人肾上腺癌细胞ACHN的抑制活性最强，半数抑制率IC50达到0.40μM，显著强于阳性对照药顺铂(IC50 7.54μM)。细胞凋亡实验显示Piericidin A可明显诱导人肾上腺癌细胞ACHN的晚期凋亡。抑制抗凋亡蛋白Bcl-2是Piericidin A对肾癌细胞抑制活性的作用机理之一。因此先导化合物Piericidin A可以作为Bcl-2抑制剂用于为抗肾癌(尤其是肾上腺癌)药物的开发。
综上，本发明为研制新的抗癌药物提供了新的先导化合物，对中国自主知识产权的新药开发具有重要的意义。

Claims (7)

1.粉蝶霉素类化合物Piericidin A或其药用盐在制备抗肾癌药物中的应用；
所述的化合物Piericidin A，其结构如式(Ⅰ)所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肾癌药物为抗人肾上腺癌或肾细胞癌的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，化合物Piericidin A作为抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制剂在制备抗肾癌药物中的应用。
4.化合物Piericidin A在制备抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制剂中的应用。
5.一种抗肾癌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的化合物Piericidin A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
6.根据权利要求5所述的抗肾癌药物，其特征在于，所述的抗肾癌药物为抗人肾上腺癌或肾细胞癌的药物。
7.一种抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制剂，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的化合物Piericidin A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
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