CN112516183B - 一种针对外伤具有修复作用的提取物制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种针对外伤具有修复作用的提取物制备方法及应用。该技术方案是以新鲜松茸为原料，经加热回流提取后减压浓缩，再利用真空冷冻干燥的方法制备成冻干粉，接下来采用TBE‑300C逆流色谱进行分离，冷冻干燥，得到松茸提取物冻干粉。体外实验表明，随着松茸提取物浓度的增加，对细胞的促进作用明显增强，即对细胞有促进增殖的作用；体内实验表明，本发明经过皮肤给药作用于小鼠，同时利用商品药进行对照，发现其具有促进小鼠损伤皮肤愈合的功效，并且其效果优于对照的商品药。本发明原料来源于药食同源的药用真菌，其作用平稳，毒副作用较小，安全可靠，可用于制成不同皮肤损伤修复的剂型，如口服给药(片剂、丸剂、颗粒剂)和透皮给药(膏剂)。

Description

一种针对外伤具有修复作用的提取物制备方法及应用

技术领域

本发明涉及创伤药领域，具体涉及一种针对外伤具有修复作用的提取物制备方法及应用。

背景技术

松茸，学名松口蘑，别名松蕈、合菌、台菌，隶属担子菌亚门、口蘑科，是松栎等树木外生的菌根真菌，具有独特的浓郁香味，是世界上珍稀名贵的天然药用菌，我国二级濒危保护物种。宋代《经史证类备急本草》有过记载。研究证明，松茸富含蛋白质，有18种氨基酸，14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸，核酸衍生物，肽类物质等稀有元素。另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和松茸醇，是世界上最珍贵的天然药用菌类。

据文献报道，松茸具有抗癌、抗衰老养颜、提高免疫力、治疗糖尿病及心血管疾病、促进肠胃蠕动、保护肝脏、抗辐射、抗突变和抑菌等功效。据文献中报道，松茸主要化学成分有1-辛烯-3-醇、2-辛烯醇、抗毒嘧啶、羧基蛋白，还有蒎烯和肉桂酸甲酯等物质，并且松茸提取物松茸多糖在体外具有明显的抑制病原菌(金黄色葡萄球菌)的作用，随着浓度的增大，抑菌的效果越明显。

皮肤作为人体最大的器官，它既是保护机体免受外部的侵害的第一道天然屏障，同时它还有其他的生物学功能如免疫监视和自我治愈的作用。由于在某些外部因素的作用下如机械外伤、组织切除手术、糖尿病性溃疡损伤和烧烫伤等，使皮肤失去了第一道天然屏障，容易造成细菌感染、皮下血管的损伤、组织坏死和皮肤溃烂等并发症。而皮肤损伤修复是一个非常复杂的过程，包括创面的止血、炎症反应的发生、细胞的迁移和增殖、血管和组织的再生和重构等。

目前西药作为疗效较好、使用频繁的治疗皮肤损伤的药物，绝大多数属于抗生素类，如氧氟沙星凝胶、红霉素软膏等对机体有一定的刺激性，并可能产生耐药性和一些不良反应。随着人们对传统中医药的研究越来越深入，中药制剂现在也受到了很多的关注。中药主要来源于自然界的天然产物，其作用平稳、毒副作用较小，在某些疾病的治疗方面有着西药无法比拟的优势，而中草药药膏作为传统中药剂型中的一种，一般应用于皮肤损伤的修复。目前未见文献报道松茸对皮肤损伤修复的研究，本发明利用药食同源的真菌松茸为原料，用有机溶剂提取法从松茸中提取有效成分，配成对皮肤损伤有修复作用的配方。

发明内容

本发明技术解决问题：本发明旨在针对抗生素促进伤口愈合所产生的不良反应，提供一种针对外伤具有修复作用的提取物制备方法及应用，用来解决现有的药物对机体易产生刺激的危害。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

通过将新鲜的松茸粉碎，用有机溶剂和逆流色谱将松茸中的有效成分提取出来制成冻干粉的形式，提供一种有助于皮肤损伤修复的组方。通过建立小鼠皮肤损伤模型，同时进行阴性和阳性对照，将松茸提取物作用于小鼠损伤皮肤，通过阴性及阳性对照证明松茸对小鼠皮肤损伤的修复作用。

松茸提取物冻干粉的制备方案包括以下步骤：

1)将新鲜松茸洗净后切成2mm见方的小块；

2)用溶剂进行加热回流提取，提取溶剂为乙醇，得到提取液A；

3)将提取液A减压浓缩，回收乙醇，剩余的浸膏于-110℃冻干得到提取物B；

4)提取物B用逆流色谱进行分离，以正丁醇-冰醋酸-水系统的上层为固定相，下层为流动相，流速10mL/min；

5)收集10-15min的流出物，减压浓缩，冷冻干燥，得到组分C。

作为优选，步骤2)加热回流提取时间为2h。

作为优选，步骤2)提取溶剂乙醇的浓度为45％-60％。

作为优选，步骤4)固定相为正丁醇-冰醋酸-水(35:1:65)系统。

本发明进一步提供了上述提取物用于制备针对外伤具有修复作用的药物。

作为优选，所述药物的给药方式分为口服给药和透皮给药。

作为优选，所述药物剂型为片剂、丸剂、颗粒剂和膏剂。

本发明是通过将新鲜的松茸粉碎，用有机溶剂和逆流色谱将松茸中的有效成分提取出来制成冻干粉的形式，提供一种有助于皮肤损伤修复的组方。通过建立小鼠皮肤损伤模型，同时进行阴性和阳性对照，将松茸提取物作用于小鼠损伤皮肤，通过阴性及阳性对照证明松茸对小鼠皮肤损伤的修复作用。体外实验证明，本发明提取物可以促进HaCaT细胞增殖，并且随着药物浓度的增加，细胞生存力增强；体外实验证明，本发明提取物可以促进小鼠损伤皮肤的修复，并且效果优于对照组。

本发明的有益效果是：本发明采用的松茸作为一种药食同源的真菌，提取物提取工艺简单，提取方法高效环保，对机体无毒副作用，治疗效果良好，安全可靠，作用平稳，可制成不同的药物剂型应用于患者损伤皮肤的修复，加快患者创面愈合的时间，很大程度上降低患者的痛苦，为开发松茸药理作用提供了一个新的研究方向。

附图说明

图1松茸提取物对HaCaT细胞增殖的影响。a：45％乙醇提取松茸的冻干粉；b：50％乙醇提取松茸的冻干粉；c：60％乙醇提取松茸的冻干粉。

图2第0天，5天和15天昆明小鼠创伤伤口的愈合情况。A：空白对照组；B：氧氟沙星凝胶；C：松茸提取物。

图3治疗后各时间的伤口愈合率统计分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。A：空白对照组；B：红霉素软膏；C：松茸提取物。

具体实施方式

实施例1 45％乙醇提取松茸冻干粉的制备：

取50g的新鲜松茸切成2mm见方，大小均一的小块，放入装有滤纸的索氏提取器中，提取瓶中加入45％乙醇500mL，通过80℃油浴锅加热提取2h，提取液过滤，在60℃减压浓缩至50mL，并冷冻干燥48h。得到的提取物用TBE-300C逆流色谱进行分离，以正丁醇-冰醋酸-水(35:1:65)系统的上层为固定相，下层为流动相，流速10mL/min；收集10-15min的流出物，在60℃减压浓缩，于-80℃预冻2h，然后放入冻干机，-110℃干燥48h，称重，得松茸提取物冻干粉2.5g，收率为5％。

实施例2 50％乙醇提取松茸冻干粉的制备：

取50g的新鲜松茸切成2mm见方，大小均一的小块，放入装有滤纸的索氏提取器中，提取瓶中加入50％乙醇500mL，通过80℃油浴锅加热提取2h，提取液过滤，在60℃减压浓缩至50mL，并冷冻干燥48h。得到的提取物用TBE-300C逆流色谱进行分离，以正丁醇-冰醋酸-水(35:1:65)系统的上层为固定相，下层为流动相，流速10mL/min；收集10-15min的流出物，在60℃减压浓缩，于-80℃预冻2h，然后放入冻干机，-110℃干燥48h，称重，得松茸提取物冻干粉2.6g，收率为5.2％。

实施例3 60％乙醇提取松茸冻干粉的制备：

取50g的新鲜松茸切成2mm见方，大小均一的小块，放入装有滤纸的索氏提取器中，提取瓶中加入60％乙醇500mL，通过80℃油浴锅加热提取2h，提取液过滤，在60℃减压浓缩至50mL，并冷冻干燥48h。得到的提取物用TBE-300C逆流色谱进行分离，以正丁醇-冰醋酸-水(35:1:65)系统的上层为固定相，下层为流动相，流速10mL/min；收集10-15min的流出物，在60℃减压浓缩，于-80℃预冻2h，然后放入冻干机，-110℃干燥48h，称重，得松茸提取物冻干粉2.4g，收率为4.8％。

实施例4促进细胞增殖作用：

称取适量实施例2制成的松茸冻干粉，用培养基溶解，配成含松茸冻提取物冻干粉0、62.5、125、250、500和1000μg/mL的药液。将人永生化表皮细胞(HaCaT细胞株)按照4×10³/孔接种在96孔板中放入培养箱培(5％CO₂，37℃)养12h，培养基为DMED(含10％FBS，1％双抗)。把配成不同浓度的松茸药液加入到相应的96孔板的各孔中，放入培养箱继续培养48h。48h培养结束后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液(噻唑蓝)20μL，在培养箱中继续培养4h。终止培养后吸去各孔内培养液，每孔加入150μL DMSO溶液(二甲基亚砜)，振摇10min。待结晶充分溶解后使用酶标仪测定其490nm波长的吸光度值，此实验重复3次，实施例2和3的样品按同法实验(见图1)。实验结果表明，随着药物浓度的增加，OD值也随之变大，说明随着松茸冻干粉浓度的增加，HaCaT细胞增殖速度加快，并成良好的剂量依赖关系，其中50％乙醇提取的松茸冻干粉的效果最明显。

实施例5小鼠皮肤损伤修复实验：

将体重30g左右雄性昆明小鼠随机分成3组，标记为A、B和C，每组6只。用10％水合氯醛注射到小鼠腹腔进行麻醉(3mL/kg)，将脱毛膏均匀涂抹在小鼠背部，待5min后刮去背部的毛发，用75％医用酒精进行背部皮肤消毒，用手术剪在小鼠背部两侧分别剪出两个直径为15mm的圆形创面。待小鼠完全苏醒后分笼，每笼一只，防止互相撕咬舔食。A为阴性对照组(生理盐水，剂量为100μL)，B为阳性对照组(红霉素软膏)和C为实验组(浓度为1.5g/mL实施例2制成的松茸提取物，剂量为100μL)。每天上药一次，用肉眼观察、直尺测量，通过拍照记录创面愈合情况，然后计算出创面愈合率。结果表明，实验组的效果优于阳性组和阴性组(见图2和3)。

Claims (2)

1.一种针对外伤具有修复作用的提取物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将新鲜松茸用自来水清洗干净，放在室内，待表面无水后，将其切成2mm见方的小块；

(2)将切好的松茸按1kg:10L的比例与乙醇混合，加热回流提取，提取温度为80℃，提取时间为2h，过滤，得到提取液A，乙醇的浓度范围在45％-60％；

(3)将得到的松茸提取液A利用旋转蒸发仪在60℃减压浓缩至原液的10％，然后冻干得提取物B；

(4)提取物B用TBE-300C逆流色谱进行分离，以正丁醇：冰醋酸：水＝35:1:65系统的上层为固定相，下层为流动相，流速10mL/min；收集10-15min的流出物，减压浓缩，冷冻干燥，得到组分C；

将得到的组分C制成不同的药物剂型，包括片剂、丸剂、颗粒剂和膏剂；应用于皮肤损伤修复的治疗。

2.根据权利要求1所述方法制备的一种针对外伤具有修复作用的提取物，其特征在于，

通过皮肤损伤修复实验发现，促进皮肤损伤的修复作用强。

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