KR20130085106A - 장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항염증용 조성물 - Google Patents
장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장미(Rosa hybrida) 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균활성 조성물 및 항염증 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 및 여드름균(Propionibacterium acnes)을 사멸시킴으로써 상기 원인균에 의한 위장질환 또는 피부질환의 치료, 예방 또는 개선 용도로 사용될 수 있으며, 항염증 용도로도 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항염증용 조성물, 및 위장질환 또는 피부질환의 예방, 치료 또는 개선 용도의 조성물에 관한 것이다.
식물은 의약품개발에 있어서 매우 유용한 자원으로서 제공되어 왔으며, 많은 나라의 연구자에 의해 건강에 유효한 식물을 동정하는 연구가 계속되고 있다. 지난 수십년간 많은 과학자들에게 합성 또는 반합성 유도물질을 찾아내는데 있어서 화학 합성 화합물이 아닌 식물 화학물질을 식물로부터 찾아내어 의약품, 치료보조물질, 또는 음식물에 이용하는 연구가 흥미를 끌었다. 식물은 매우 다양한 범위의 이차 대사산물로 알려진 저분자량 천연 물질, 예를 들어, 아스코르브산, 글루타치온, 요산, 토코페롤, 카로티노이드, 폴리페놀 등을 생산할 수 있으며, 이들 화합물들은 활성산소종으로부터 보호하는 활성을 갖고 있다. 다양한 자극물질 또는 신호분자들을 포함하는 스트레스를 받은 식물에 축적되어 존재하는 이러한 물질들은 식물에서 다양한 기능을 수행할 수 있지만, 그들의 생태학적 기능은 독특한 의약품 자원으로서 제공되어질 뿐만 아니라 인간에게 유익한 의약적 특징을 가질 수 있다.
장미(genus Rosa)는 향수산업에서 방향성 오일을 제공하는 원천으로 사용되어 왔으며, 최근 당뇨, 통증 및 염증성 질환을 치료하기 위한 약물 후보로서도 거론되고 있다(Cho et al., 2003, Phytomedicine 10, 544-551; Ng et al., (2005) Biochem. Cell Biol. 83, 78-85). 본 발명자들은 이전의 연구결과를 통해 백장미로부터 추출한 갈산 및 휘발성 성분(1-부탄올, 도데실아크릴레이트 및 시클로데칸)이 풍부한 핵산 분획이 항산화활성, 항균활성 및 항알러지 활성을 포함한 다양한 활성을 갖는다는 것을 보고하였다(Jeon, et al., 2009, Arch. Pharm. Res. 32, 823-830; Park, et al., 2009, Biochem. Cell Biol. 87, 943-952; Joo et al., 2010, Plant Pathol. J. 26, 57-62).
디스크 확산법은 특정 미생물에 대한 항균활성 측정에 사용되는 방법으로서 시간과 노력이 적게 소모되면서도 정확한 결과를 얻을 수 있어 널리 사용되고 있다. 디스크 확산법은 발육 억제대의 크기가 최저 발육억제 농도(minimal inhibitory concentration: MIC)와 상관관계를 유지하고 있다는 원리를 이용한다. 또한, 임상적으로 알고 있는 내성 및 감수성균들과의 반응을 조사함으로써 그 실용성이 입증되어 있다. 디스크 확산법에 의한 항균제 검사에 있어서 일관성 있고 믿을만한 결과를 얻기 위해서는 검사방법과 기술이 표준화되어야 하며 엄격한 품질관리가 따라야 한다. 대한민국에서 주로 사용하고 있는 방법은 Bauer-Kirby 디스크 확산법을 기준해서 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute) 가이드라인에 의해서 표준화된 방법이 사용되고 있다. 한편, 장미의 꽃잎으로부터 다양한 용매에 의해 추출된 추출물에 대한 생리학적 활성이 연구되어 보고되어 있으나, 현재까지 항균활성 및 항염증활성에 대해서는 보고되어 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 천연물로부터 안전하고 효과적인 항균활성과 항염증활성을 갖는 물질을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물이 세균에 대한 항균 효과가 매우 우수하고, 항염증 활성이 뛰어남을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환 또는 피부질환의 예방, 치료 또는 개선 용도의 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물(fraction)을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 천연물로부터 안전하고 효과적인 항균활성을 갖는 물질을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 장미의 꽃 추출물이 세균에 대한 항균 효과가 매우 우수하고 항염증활성도 뛰어남을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서에서 장미의 꽃을 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 장미의 꽃에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 장미 꽃 자체를 대상자(subject)에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 장미 꽃 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 장미의 꽃 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 장미의 꽃 추출물을 장미에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ⅱ) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (ⅲ) 아세트산, (ⅳ) DMFO (dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO (dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF (tetrahydrofuran)를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 에탄올을 장미에 처리하여 수득한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 용매 분획물은 헥산(hexane) 분획물 또는 부탄올 분획물이다.
본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 장미 꽃 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 장미의 꽃으로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 장미 꽃 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 장미 꽃 추출물 또는 분획물은 미생물에 대한 항균활성을 보유하며, 바람직하게는 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 및 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 갖는다.
본 발명의 장미 꽃 추출물 또는 이의 분획물은 헬리코박터균 및 여드름균을 사멸시킴으로써 항균활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터균(Helicobacter pylori)에 의한 위장질환 또는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 용매 분획물은 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 위장질환은 위궤양, 위염 또는 위암이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 피부질환은 여드름 또는 여드름에 의한 2차 감염 염증이다.
상기 본 발명의 조성물은 헬리코박터균(Helicobacter pylori)에 의한 위장질환 또는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있으며, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10,000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 헬리코박터균(Helicobacter pylori)에 의한 위장질환 또는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환의 개선용 기능성 식품 조성물 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환 개선용 화장품학적 조성물 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 추출물은 물 또는 에탄올 추출물이며, 상기 용매 분획물은 헥산(hexane) 분획물 또는 부탄올 분획물이다.
본 발명의 장미 꽃 추출물 또는 이의 분획물은 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, RAW264.7 세포에서 NO(Nitiric oxide)의 생성을 억제하며, 염증관련인자인 iNOS, IL-1β 및 COX-2의 mRNA 발현을 억제함으로써, 항염증 활성을 나타낸다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 장미의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.
(ⅱ) 또한, 본 장미의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물은 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 및 여드름균(Propionibacterium acnes)을 효과적으로 사멸시킴으로써 위염, 위궤양 또는 위암과 같은 위장질환 또는 여드름과 같은 피부질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있으며, 항염증 용도로도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 백장미(white rose)의 꽃 추출 및 분획과정의 도식화이며, 수율을 나타낸다.
도 2는 백장미 꽃의 물추출물 및 에탄올 추출물의 적용량별 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 사멸효능을 나타낸 결과이다.
도 3은 백장미 꽃의 물추출물, 부탄올분획 및 헥산분획의 여드름균(Propionibacterium acnes) 사멸효능을 나타낸 결과이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 백장미 꽃 추출물 및 분획의 NO(Nitric oxide) 생성 억제 활성을 확인한 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트에 배양한 세포에 백장미 꽃 헥산 분획(hWRF)을 0.1 내지 10 ㎍/㎖으로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 아스코빈산(Ascorbic acid, 100 μM)을 양성대조군으로 하였고, LPS (Lipopolysaccharide, 1 ㎍/㎖)를 세포 자극제로 사용하였다. NO의 존재를 그리스(Griess) 시약을 사용하여 검출하고 540 ㎚에서 측정하였다. 실험은 3차례 실시되었으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, ***은 대조군과 비교하여 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다.
도 5는 RAW264.7 세포에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현을 확인한 결과이다. 세포를 24시간 동안 실시예에서 기재된 방법에 따라, 처리한 후 양성 대조군으로 아스코르빈산을 사용하여 mRNA 발현을 분석하였다. iNOS, IL-1β, COX-2 및 β-액틴의 mRNA 발현 정도를 정량 실시간 PCR로 분석하였다. 결과는 표준유전자로 사용되는 β-액틴에 대해 상대적 Ct(cycle number threshold)값으로 산출하였다. LPS-자극군을 각 군의 상대 비교군으로 사용하였다. 실험은 3차례 실시하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, ***은 대조군과 비교하여 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다.
도 2는 백장미 꽃의 물추출물 및 에탄올 추출물의 적용량별 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 사멸효능을 나타낸 결과이다.
도 3은 백장미 꽃의 물추출물, 부탄올분획 및 헥산분획의 여드름균(Propionibacterium acnes) 사멸효능을 나타낸 결과이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 백장미 꽃 추출물 및 분획의 NO(Nitric oxide) 생성 억제 활성을 확인한 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트에 배양한 세포에 백장미 꽃 헥산 분획(hWRF)을 0.1 내지 10 ㎍/㎖으로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 아스코빈산(Ascorbic acid, 100 μM)을 양성대조군으로 하였고, LPS (Lipopolysaccharide, 1 ㎍/㎖)를 세포 자극제로 사용하였다. NO의 존재를 그리스(Griess) 시약을 사용하여 검출하고 540 ㎚에서 측정하였다. 실험은 3차례 실시되었으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, ***은 대조군과 비교하여 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다.
도 5는 RAW264.7 세포에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현을 확인한 결과이다. 세포를 24시간 동안 실시예에서 기재된 방법에 따라, 처리한 후 양성 대조군으로 아스코르빈산을 사용하여 mRNA 발현을 분석하였다. iNOS, IL-1β, COX-2 및 β-액틴의 mRNA 발현 정도를 정량 실시간 PCR로 분석하였다. 결과는 표준유전자로 사용되는 β-액틴에 대해 상대적 Ct(cycle number threshold)값으로 산출하였다. LPS-자극군을 각 군의 상대 비교군으로 사용하였다. 실험은 3차례 실시하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, ***은 대조군과 비교하여 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 식물재료 및 화학물질
2010년 5월 대한민국 충북 진천에서 수집한 신선한 백색 장미(white rose; Rosahybrida Colorado)의 꽃을 햇빛 아래서 완전히 건조하였다. 완전히 건조된 꽃잎을 로터 고속 제분기(rotor speed mill, Laval Lab Inc., Laval, Que)로 분쇄하고 70% 에탄올 스프레이를 이용하여 멸균한 후, 80℃ 건조하여 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.
2. 추출물의 분리
분쇄된 5㎏의 건조 백장미를 0.7㎏과 4.3㎏의 두 부분으로 나누었다. 주정추출물은 0.7kg의 분말을 70% 에탄올(30 L)에 침적하고 실온에서 24시간 동안 추출하였다(도 1). 추출하여 나온 현탁액은 여과지(Whatman No.1, 미국)로 걸러내고, 이 여과액을 50℃ 진공 하에서 농축시킨 다음, 동결 건조하여 155 g의 추출물을 수득하였다. 여분의 4.3㎏의 건조 백장미를 멸균정제수(50 L)에 침적하고 95℃에서 2-3시간 동안 추출하였다. 추출하여 나온 현탁액을 여과지로 걸러내고, 진공 하에서 농축시킨 다음, 동결건조하여 물추출물을 수득하였다. 약 20g의 물추출물을 덜어 낸 다음, 나머지를 2등분하여 각각 180L의 헥산(hexane)와 180L의 부탄올에 침적하고 실온에서 24시간 동안 추출하였다. 추출하여 나온 현탁액을 여과지로 걸러내고, 진공 하에서 농축시킨 후, 동결건조하여 각각 287㎎의 헥산 분획 및 418.7 g의 부탄올 분획을 수득하였다.
3. 헬리코박터균(
Helicobacter pylori
)의 사멸효능
헬리코박터균을 혈액한천평판배지(Blood agar plate: BAP)에 72 시간 동안 배양하여 탁도계인 맥파랜드(McFarland)를 이용하여 탁도 2.0의 균액을 준비하였다. 헬리코박터균 배양액을 새로운 혈액한천평판배지에 골고루 바른 후 각 평판배지마다 4개의 페이퍼 디스크(Paper disc, 직경 6 ㎜)를 적당한 간격을 두고 놓았다. 백장미 물추출물과 에탄올추출물을 배지에 0.3 ㎎/㎖의 농도로 녹여 각 디스크에 5, 10, 15 및 20 ㎕씩 적하하여 최종용량을 1.5, 3.0, 4.5 및 6.0 ㎍/디스크로 조절하여 캠피 파우치(Campy pouch, BD sceinces, 미국)에 배치하였다. 물에 적신 거즈로 습기를 제공하는 조건으로 5일간 배양한 다음 헬리코박터균의 성장억제대(직경)을 측정하였다. 표 1은 백장미 물추출물 및 에탄올추출물의 적용량별 헬리코박터균 사멸면적을 나타낸다. 시험결과 물추출물의 헬리코박터 사멸효능은 1.5, 3.0, 4.5 및 6.0 ㎍/디스크의 농도에서 각각 8, 14, 21 및 25 ㎜로 나타났다(도 2 및 표 1). 이에 비해 에탄올추출물의 성장억제대는 각각 26, 30, >>30 및 >>30 ㎜로 강력한 사멸효능을 보여 주었고, 특히 4.5 ㎍ 이상에서는 억제대를 측정하기 어려울 정도의 강력한 사멸효능을 나타내었다.
물질/용량 | 1.5 ㎍ | 3.0 ㎍ | 4.5 ㎍ | 6.0 ㎍ |
물추출물 | 8 | 14 | 21 | 25 |
에탄올추출물 | 26 | 30 | >>30 | >>30 |
4. 여드름균(
Propionibacterium
acnes
)의 사멸효능
여드름균을 혈액한천평판 배지에 72시간 배양하여 탁도 2.0의 균액을 준비하였다. 여드름균 배양액을 새로운 혈액한천평판배지에 골고루 바른 후 각 평판배지마다 4개의 페이퍼 디스크(직경 6 ㎜)를 적당한 간격을 두고 놓았다. 백장미 물추출물, 부탄올분획물 및 헥산분획물을 배지에 0.3 ㎎/㎖의 농도로 녹여 각 디스크에 5, 10, 15 및 20 ㎕씩 적하하여 최종용량을 1.5, 3.0, 4.5 및 6.0 ㎍/디스크로 조절하여 혐기성배양기에 3일 동안 배양한 후 억제대를 측정하였다. 표 2은 백장미 물추출물, 부탄올분획물 및 헥산분획물의 여드름균 사멸면적을 나타낸다. 시험결과 물추출물의 헬리코박터 사멸효능은 1.5, 3.0, 4.5 및 6.0 ㎍에서 각각 16, 20, 28 및 25 ㎜로 나타났다(도 3 및 표 2). 이에 비해 부탄올분획물의 성장억제대는 각각 32, 34, 36 및 40 ㎜로, 헥산분획물은 30, 34, 36 및 40 ㎜로 강력한 사멸효능을 보여주었다.
물질/용량 | 1.5 ㎍ | 3.0 ㎍ | 4.5 ㎍ | 6.0 ㎍ |
물추출물 | 16 | 20 | 28 | 25 |
부탄올분획물 | 32 | 34 | 36 | 40 |
헥산분획물 | 30 | 34 | 36 | 40 |
5.
NO
생성 억제를 통한 항염증 효능
RAW264.7 세포(1×106 세포/㎖)를 24-웰 플레이트상에 접종하고, 37℃에서, 12시간 동안 전-배양(pre-incubation)하여 안정하게 부착시켰다. 전-배양 후에, PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 샘플로서, 각각 LPS(lipopolysaccharide), Asc(Ascorbic acid, 아스코르빈산) 또는 백장미 꽃의 헥산분획물(hWRF)을 포함하는, 1% FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 첨가하고, 24 시간 동안 배양하였다. NO(Nitric oxide)의 생성은 Griess (Promega, 미국) 시약을 사용하여 배지안의 아질산염(nitrite)의 수준을 측정하여 모니터링 하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 백장미 꽃 헥산분획물은 1 내지 10 ㎍/㎖의 농도 범위에서 NO(Nitric oxide) 생성을 상당한 정도로 억제하였으며(p<0.001), 특히, 아스코르빈산(ascorbic acid)과 비교하여 이 보다 더 효과적으로 NO 생성을 억제하였다(p<0.01).
6. 염증성 사이토카인 발현 억제를 통한 항염증 효능
백장미 꽃 추출물의 항염증 효능을 확인하기 위해, 염증관련 인자의 발현 억제 활성을 측정하였다. 먼저, LPS로 자극된 RAW264.7 세포로부터 총 RNA를 트라이졸(Trizol, Invitrogen, 미국) 방법으로 추출하였다. 20 ㎕ 총 부피에서, 임프롬(Improm)-Ⅱ 역전사 시스템 및 올리고 dT 프라이머을 사용하여, 1 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 하기 표 3의 프라이머(바이오니어, 대한민국)를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다.
SYBR 그린 PCR 마스터믹스(Qiagen, 미국)을 이용하여 20 ㎕ 반응 혼합물을 로터-진 6000(Corbett, 호주)로 실시간 PCR을 실시하였다. 각 실시간 PCR 마스터 믹스는 2 X 효소 마스터믹스, 7.0 ㎕ RNAase 프리워터, 1 ㎕ 각 프라이머(각 10 pM) 및 1 ㎕ 희석 주형(template)으로 구성하였다. 초기 전-반응단계로 95℃/10분 및 45 사이클(95℃/15초 - 52℃/15초 - 72℃/10초)의 조건으로 PCR을 실시하였다. 용융 커브(melting curve)분석을 통해 예상되는 PCR 산물의 형성을 확인하였다. 1.2% 아가로즈 젤 전기영동을 통해 산물의 길이를 확인하였다. 인터런(interrun) 눈금측정기를 이용하여 PCR 효율성을 얻기 위한 각 유전자의 표준 곡선을 측정하였다. 로터-진 6000 시리즈 소프트웨어 1.7을 이용하여 상대 샘플의 발현 정도를 계산하였다. 실험 샘플에 대한 결과값은 내부 조절 유전자의 백분율로 나타내었다.
도 5의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 백장미 꽃의 헥산분획물이 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 iNOS, IL-1β 및 COX-2의 발현을 전사 수준에서 하향-조절함으로써, 친-염증성 매개인자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation
<120> Anti-bacterial or Anti-inflammatory Composition Comprising
Extracts from Flower of Rosa hybrida as Active Ingredient
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
tgcccctgga agtttctctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
actgccccag tttttgatcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
agctgtggca gctacctgtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
gctctgcttg tgaggtgctg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 5
ctgacccact tcaagggagt ct 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
ccatccttga aaaggcgcag tt 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 7
ctaggcacca gggtgtgatg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 8
ctacgtacat ggctggggtg 20
Claims (14)
- 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 또는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대해 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 용매 분획물은 헥산(hexane) 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터균(Helicobacter pylori)에 의한 위장질환 또는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 위장질환은 위궤양, 위염 또는 위암인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 피부질환은 여드름 또는 여드름에 의한 2차 감염 염증인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 용매 분획물은 헥산(hexane) 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터균(Helicobacter pylori)에 의한 위장질환 또는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환의 개선용 기능성 식품 조성물.
- 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 여드름균(Propionibacterium acnes)에 의한 피부질환의 개선용 화장품학적 조성물.
- 장미(Rosa hybrida)의 꽃 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 용매 분획물은 헥산(hexane) 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |