KR20150057664A - 신종균 크리세오박테리움 ｔｈｇ-ｃ4-1 및 이를 이용한 지페노사이드 17 생산 방법 - Google Patents

신종균 크리세오박테리움 ｔｈｇ-ｃ4-1 및 이를 이용한 지페노사이드 17 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신종균 Chryseobacterium sp. THG-C4-1 및 이를 이용하여 진세노사이드 Rb1으로부터 지페노사이드 17을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신종균 Chryseobacterium sp. THG-C4-1 및 이로부터 추출된 세포내 효소는 인삼에 포함된 고분자 사포닌인 진세노사이드 Rb1을 효과적으로 지페노사이드 17으로 전환할 수 있다. 지페노사이드 17은 뛰어난 지방세포 분화 억제 및 콜레스테롤 생합성 억제 효과를 가지므로 콜레스테롤 저하 및 항비만 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신종균 크리세오박테리움 ＴＨＧ-Ｃ4-1 및 이를 이용한 지페노사이드 17 생산 방법{A novel bacterium Chryseobacterium sp. THG-C4-1, and a method for producing gypenoside 17 using the same}
본 발명은 신종균 Chryseobacterium sp. THG-C4-1 및 이로부터 추출된 세포내 효소를 이용하여 진세노사이드 Rb1으로부터 지페노사이드 17을 생산하는 방법에 관한 것이다.
인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer. Ginseng radix)은 오갈피나무과 (Araliaceae) 인삼속 (Panax)에 속하는 다년생 초본류로서 오래 전부터 한방에서는 약용으로 사용되어 왔으며, 현대에 이르러서는 자양강장, 항암 등의 각종 약리작용으로 인해 세계적으로 우수한 건강식품으로 평가받고 있다. 인삼의 화학성분은 사포닌 성분, 정유 성분, polyacetylene 성분, phenol 성분, 알칼로이드 성분, 다당체, 아미노산, 유기산, 유리당, 비타민 및 무기성분 등으로 이루어져 있다. 인삼의 유효성분으로 인삼 사포닌이 알려져 있는데, 인삼 사포닌은 비당부의 구조에 따라 프로토파낙사디올 (protopanaxadiol, PPD계), 프로토파낙사트리올 (protopanaxatriol, PPT)계 및 올레아난(oleanane)계 사포닌으로 분류된다. 이 중 PPD와 PPT계는 인삼 특유의 사포닌으로 면역력 강화, 항암 효과 등의 강력한 효능을 가진 것으로 알려져 있다. 이러한 인삼의 화학성분들은 각각 효능을 지니기도 하지만 여러 성분들의 조합이 특정한 의약용도에 대하여 현저히 뛰어난 효능을 나타내기도 하는 것으로 보고되어 있다.
또한 인삼에는 존재하지 않지만 인삼의 화학성분들이 저분자화된 산물이 뛰어난 효과를 갖는 경우도 있다. 일 예로 뇌기능 증강, 간손상 보호, 항염증 작용 등 다양한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 compound-K가 있다. 저분자화된 산물들은 체내에 흡수가 잘 된다는 장점도 있다. 따라서 이러한 산물들을 얻기 위하여 인삼의 화학성분들을 저분자화 시키는 방법이 활발히 연구되고 있는데, 현재까지 산 또는 알칼리처리에 의한 화학적 방법, 열처리에 의한 물리적 방법, 미생물 및 효소에 의한 생물학적 변환방법 등이 보고되어 있다. 그 중 산 또는 알칼리 처리에 의한 화학적 방법은 대체로 수율이 낮아 이용에 한계가 있으며, 열처리에 의한 물리적 방법은 잘 알려진 바와 같이 홍삼 제조에 이용되고 있으나, 이 경우 특정 사포닌은 증가되지만 그 외의 다양한 사포닌은 얻을 수 없고 중간산물을 회수하기가 어려운 단점이 있다. 미생물 및 효소에 의한 생물학적 변환방법은 아직 널리 이용되고 있지는 않으나 다양한 사포닌의 전환산물을 생산할 수 있다는 장점이 있어 주목받고 있다.
인삼의 화학성분들이 저분자화되어 생성되는 산물로서 여러가지 효능을 갖고 있는 것으로 알려진 화합물의 또 다른 예로 지페노사이드(gypenoside)가 있다. 지페노사이드는 인삼, 돌외, 덩굴차 등에 극히 소량으로 포함되어 있으며, 산 또는 알칼리로 처리한 경우 및 열처리한 경우에는 얻을 수 없는 중간산물에 해당한다. 지페노사이드에도 수십 종이 있으나, 각각의 효능에 대해서는 제대로 규명되지 않은 것들이 많다.
본 발명은 신종균인 Chryseobacterium sp. THG-C4-1 및 이로부터 추출된 세포내 효소를 이용하여 지페노사이드 17을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신종균인 Chryseobacterium sp. THG-C4-1을 제공한다. 상기 균주는 2011년 8월 8일, 농촌진흥청 국립농업과학원 부설 농업유전자원정보센터(KACC)와 일본 RIKEN Biosource center Japan Collection of Microorganism (JCM)에 기탁되어 수탁번호 KACC 16985, JCM 18745를 각각 부여받았다. 상기 균주는 베타-글루코시다제 활성을 갖고 있다. 크리세오박테리움 (Cryseobacterium) 속의 균은 토양에서 주로 분리되는 그람음성 균주로, 노란색 군락을 형성하는 것이 특징이며 세포의 크기는 0.5-1.0μm 로서 생육 적정 온도는 20-30℃에 해당한다.
또한 본 발명은 상기 균주 또는 상기 균주로부터 추출된 세포내 효소(endoenzyme)를 이용하여 진세노사이드 Rb1을 지페노사이드 17로 전환하는 방법을 제공한다. 지페노사이드 17은 PPD 계에 속하며, 인삼에는 극히 적은 양만이 포함되어 있는 희귀 사포닌이다. 상기 진세노사이드 Rb1은 그 자체만이 분리된 것을 사용할 수도 있고, PPD 등 진세노사이드 Rb1을 포함하는 혼합물을 사용할 수 있다. 이러한 진세노사이드 Rb1 또는 진세노사이드 Rb1을 포함하는 혼합물은 인삼, 돌외, 덩굴차 등으로부터 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인삼에서 추출된 것일 수 있다. 진세노사이드 Rb1은 가수분해되면 지페노사이드 17로 전환되는 중간 단계를 거쳐 compound K로 전환되는데, 본 발명의 균주는 진세노사이드 Rb1을 중간 산물인 지페노사이드 17로 전환시킨다(도 1 참조).
본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은 진세노사이드 Rb1을 포함하는 배지에서 상기 균주를 배양하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은
1) 상기 균주를 배양하는 단계;
2) 상기 배양된 균주의 세포벽을 파괴하여 세포내 효소를 추출하는 단계; 및
3) 상기 세포내 효소와 진세노사이드 Rb1을 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서 상기 균주의 생육 및 지페노사이드 17의 생산을 최대화하기 위하여, 상기 균주는 바람직하게는 TSB 배지에서 배양될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 TSB 배지는 카제인의 췌장 소화물(pancreatic digest of casein), 대두의 효소 소화물(enzymatic digest of soya been), 염화나트륨(sodium chloride), 인산수소이칼륨(di-potassium hydrogen phosphate) 및 포도당(glucose)을 포함할 수 있다.
또한 상기 방법에 있어서, 상기 균주로부터 세포내 효소를 추출하여 진세노사이드 Rb1과 반응시킬 수 있다. 이 때 반응 온도는 바람직하게는 39℃일 수 있다. 반응 pH는 바람직하게는 pH 7.0일 수 있다. 또한 반응 시간은 바람직하게는 10분간이 될 수 있다. 그러나 효소의 반응 조건은 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공한다. 상기 지페노사이드 17은 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고 콜레스테롤의 생합성을 억제하여 뛰어난 항비만 효과를 나타낸다. 따라서 항비만용 약학적 조성물, 항비만용 건강기능식품 또는 항비만용 화장료 조성물에 적용될 수 있다.
본 발명은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공한다. 상기 지페노사이드 17의 콜레스테롤 생합성 억제 효과는 현재 시판되고 있는 대표적인 고콜레스테롤혈증 약물인 Atorvastatin 및 Rosuvastatin보다 뛰어나다. 또한 Atorvastatin 및 Rosuvastatin은 장기 복용시 간독성이 있는 것으로 보고되어 있으나, 본 발명의 지페노사이드 17은 안전성이 입증된 물질로서 시판중인 약물을 대체할 수 있는 유력한 후보물질에 해당한다.
상기 조성물은 지페노사이드 17을 0.05 μg/ml 내지 0.9 μg/ml, 바람직하게는 0.1 μg/ml 포함할 수 있다. 그러나 지페노사이드 17의 함량은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지페노사이드 17은 항비만 용도 및 콜레스테롤 저하 효과를 갖는 약학적 조성물, 건강기능식품, 및 화장료 조성물에 적용될 수 있다. 본 발명의 용도, 조성물, 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
약학적 조성물
본 발명의 약학적 조성물은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함한다.
유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물 중 지페노사이드 17은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 60 %로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 0.02 mg/kg~50 mg/kg의 범위 내에서 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제, 분산액, 에멀젼, 분말, 크림, 로션, 연고, 겔, 패취, 분무제, 반창고 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 콜레스테롤 저하 효과, 비만 개선 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
건강기능식품
본 발명의 건강기능식품은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함한다.
유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물 중 지페노사이드 17은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 60 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 약학적 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품을 정제로 제조하는 경우, 지페노사이드 17과 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
본 발명의 건강기능식품을 음료 형태로 제조하는 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트릴톨 등의 당알콜이다. 또한, 상술한 것 이외의 향미제(사카린, 아스파르탐 등)을 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 콜레스테롤 저하 효과, 비만 개선 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
화장료 조성물
본 발명은 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 '화장료' 란 화장품 또는 의약외품이 될 수 있는 물질을 말한다.
화장품이란 인체를 청결·미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부·모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 말한다. 또한 기능성화장품이란 피부의 미백에 도움을 주거나, 피부의 주름개선에 도움을 주거나, 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품으로 보건복지가족부령이 정한 것을 포함하며, 피부를 개선시켜주는 모든 것을 통칭한다.
의약외품은 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다는 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 지칭한다. 약사법에 따르면 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 포함된다. 의약외품의 대표적인 예로는 치약, 기능성 비누, 기능성 샴푸 등이 있다.
유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물 중 지페노사이드 17은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 60 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분과 배합될 수 있다. 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 화장료 조성물은 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유액, 현탁액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 및 분무제에서 선택된 제형인 것일 수 있다.
이들 제형의 제조방법은 통상의 화장료 제형의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
개선 또는 치료방법
본 발명은 또한 사람 또는 그 외 동물에게 치료학적으로 유효한 양의 지페노사이드 17을 투여하여 비만 또는 고콜레스테롤혈증 등 콜레스테롤 증가로 인한 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 "치료학적으로 유효한 양"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 신종균 Chryseobacterium sp. THG-C4-1 또는 이로부터 추출된 세포내 효소는 인삼에 포함된 고분자 사포닌인 진세노사이드 Rb1을 효과적으로 지페노사이드 17로 전환할 수 있다. 지페노사이드 17은 뛰어난 지방세포 분화 억제 및 콜레스테롤 생합성 억제 효과를 가지므로 콜레스테롤 저하 및 항비만 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 진세노사이드 Rb1에서 지페노사이드 17로의 전환을 나타낸 도이다.
도 2는 Chryseobacterium sp. THG-C4-1의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3는 RP-HPLC를 이용한 Chryseobacterium sp. THG-C4-1에 의한 PPD의 사포닌 전환 능력에 대해 나타낸 도이다.
도 4는 Chryseobacterium sp. TLC를 이용한 THG-C4-1로 추출한 세포외 효소 및 세포내 효소의 사포닌 전환 능력에 대해 나타낸 도이다.
도 5는 Chryseobacterium sp. THG-C4-1의 세포내 효소의 온도에 따른 지페노사이드 17 생산 활성에 대해 나타낸 도이다.
도 6은 Chryseobacterium sp. THG-C4-1의 세포내 효소의 pH에 따른 지페노사이드 17 생산 활성에 대해 나타낸 도이다.
도 7은 Chryseobacterium sp. THG-C4-1의 세포내 효소의 반응시간에 따른 지페노사이드 17 생산 활성에 대해 나타낸 도이다.
도 8은 지페노사이드 17의 지방전구세포 분화 억제 효과를 Oil Red O 염색으로 확인한 도이다.
도 9는 지페노사이드 17의 지방전구세포 분화 억제 효과를 Oil Red O 염색으로 확인하고 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 지페노사이드 17의 콜레스테롤 생합성 억제 활성 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신종균의 분리 및 동정
전라도 장흥에서 수집한 녹차잎의 분쇄물 1g을 9mL의 멸균 식염수(NaCl 0.85%)에 희석하였다. 상기 희석물을 멸균 식염수로 1/10씩 단계적으로 희석하여 10-1~10-9배까지 희석하였고, 10-6~10-9배의 희석된 시료를 TSA 배지에 도말하고, 28℃에서 7일간 배양한 다음, 독립된 집락의 크기, 색깔, 모양, 표면구조 등을 관찰하여 후보 균주를 일차적으로 선발하였다.
β-glucosidase 활성이 있는 균주는 esculin agar에서 검은 환을 형성한다. 따라서 선발한 후보 균주들을 esculin agar에 도말하여 검은 환을 형성하는 균주를 확인하여 분리하였고, 이를 THG-C4-1로 명명하였다.
상기 THG-C4-1을 16s rRNA 염기서열로 동정한 결과, Cryseobacterium 속에 속하는 Cryseobacterium taiwanense BCRC 17412T와 98.22%의 유전적 상동성을 가지는 것으로 판명되었다. THG-C4-1의 16s rRNA 염기서열(서열번호 1)은 도 2에 나타내었다.
상기 THG-C4-1의 그람염색 결과, 형태학적 특성, 및 API kit (50CHL, Zym, Biomrieux Co., France)를 이용한 생화학적 특성을 관찰하였고, 카탈라아제 어세이를 실시하였다. THG-C4-1의 특성에 대해서는 하기 표 1에 정리하였다.
[표 1]
Figure pat00001
실시예 2. THG- C4 -1을 이용한 인삼 사포닌의 전환 산물 생산
2-1. THG- C4 -1의 인삼 사포닌의 전환 활성 확인
상기 THG-C4-1의 인삼 사포닌 전환 활성을 확인하기 위하여, 중국 대련대에서 구입한 protopanaxadiol(이하 PPD)을 500ppm 포함하는 TSB 액체배지에 THG-C4-1를 1 %(v/v) 접종하고, 39℃에서 10분간 배양하였다. PPD는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등이 포함되어 있는 혼합물이다. 그 후 하기 조건으로 RP-HPLC (Reversed Phase HPLC, 역상 HPLC)를 이용하여 배지에 포함된 사포닌 성분들을 분석하였다.
<RP-HPLC 조건>
검출기: waters 996 photodiode array(PDA) detector(waters, USA) 203 nm
칼럼: C18 column(250*4.6mm, ID5μm, waters, USA)
이동상: 증류수(solventA)와 아세토니트릴(solventB)의 혼합액 (40:60(v/v))
유속: 1.2 ml/min
주입량: 50 μl
도 3의 상단은 THG-C4-1과 함께 배양하기 전에 PPD를 RP-HPLC로 분석한 결과를 나타내며, 도 3의 하단은 THG-C4-1과 함께 배양한 후의 분석 결과이다. 도 3의 상단에서 진세노사이드 Rb1이 많은 양으로 함유되어 있고 지페노사이드 17은 극미량만이 함유되어 있는 것으로 나타나나, 도 3의 하단에서 진세노사이드 Rb1의 양은 감소하고 진세노사이드 F2 및 지페노사이드 17의 양이 증가한 것을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 THG-C4-1이 고분자 인삼 사포닌을 저분자화하고 다른 사포닌 성분으로 전환하는 활성이 있으며, 특히 진세노사이드 Rb1을 희귀 사포닌인 지페노사이드 17로 전환하는 활성이 있음을 알 수 있다.
2-2. THG- C4 -1의 세포외 효소 및 세포내 효소의 인삼 사포닌의 전환 활성 확인
(1) 세포외 효소 및 세포내 효소 추출
상기 THG-C4-1를 28℃에서 TSB 배지에서 배양한 후, 배양액을 180 rpm으로 원심분리하였다.
상기 원심분리한 배양액에서 상층액을 수득하여 4배 부피의 아세톤을 첨가하여 침전시키고 난 후, 아세톤 추출 세포외 효소(exoenzyme)가 포함된 상층액을 수득하였다.
또한 상기 원심분리한 배양액에서 상층액을 수득하여 4배 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시키고 난 후, 에탄올 추출 세포외 효소(exoenzyme)가 포함된 상층액을 수득하였다.
그리고, 상기 원심분리한 배양액을 4 ℃, 8000 rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 포함하는 pellet을 수득한 후, potassium phosphate buffer(pH 7)에 희석하고, sonicator를 이용하여 세포벽을 파괴하였다. 그 후 4℃, 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후, 세포내 효소(endoenzyme)가 포함된 상층액을 수득하였다.
(2) 세포외 효소 및 세포내 효소의 인삼 사포닌의 전환 활성 확인
중국 대련대에서 진세노사이드 Rb1을 다량 포함하는 진세노사이드 혼합물을 구입하여 사용하였다. 상기 혼합물에 상기 THG-C4-1의 아세톤 추출 세포외 효소, 에탄올 추출 세포외 효소 및 세포내 효소를 각각 첨가한 후 39℃의 인큐베이터에서 5분간 반응시킨 후, TLC (Thin Layer Chromatography, 박층 크로마토그래피)를 이용하여 생성된 물질을 확인하였다. TLC는 silica gel 60 F254 (Merck, Germany) plate를 이용하여 CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10, v/v/v, lower phase)의 전개 용매를 이용하여 전개한 후, 충분히 건조시킨 다음 10% (v/v) 황산 (H2SO4) 용액을 분사시킨 후 110도, 5분 동안 열을 가하여 발색시키는 방법으로 수행하였다.
그 결과, 아세톤으로 추출한 THG-C4-1의 세포외 효소 및 에탄올로 추출한 THG-C4-1의 세포외 효소는 둘 다 지페노사이드 17 생산 능력이 거의 없었으나, THG-C4-1의 세포내 효소는 진세노사이드 Rb1을 진세노사이드 Rd 및 지페노사이드 17로 전환시킨 것을 확인하였다. 따라서 THG-C4-1이 고분자 인삼 사포닌을 지페노사이드 17로 전환할 수 있는 능력이 있으며, 이러한 능력은 THG-C4-1의 세포내 효소에 의한 것임을 알 수 있었다 (도 4).
실시예 3. THG- C4 -1의 최적 배양 조건 결정
3-1. 최적 배양 배지 결정
신종균 THG-C4-1을 배양하기 위한 최적의 배지를 선발하고자, 상용 배지인 PDB, LB, YM, NB, TSB 배지에 각각 THG-C4-1을 접종하여 생육 정도를 확인하였다. 그 결과 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에서 THG-C4-1이 가장 높은 생육을 보이는 것으로 확인되었다.
또한 TSB 배지에 pancreatic digest of casein, enzymatic digest of soya been, sodium chloride, di-potassium hydrogen phosphate, glucose가 포함되는 경우에 THG-C4-1이 가장 높은 생육을 보이는 것으로 확인되었다.
각 물질의 함량은 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pat00002
3-2. 최적 반응 조건 결정
신종균 THG-C4-1의 지페노사이드 17 생산 활성을 최적화하는 온도, pH, 및 사포닌과의 반응시간을 결정하기 위하여, 다양한 온도, pH 및 사포닌과의 반응시간 하에서 생성된 지페노사이드 17의 양을 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 2의 물질들을 포함하는 배지를 이용하여 THG-C4-1을 생장시키고, 상기 실시예 2의 방법대로 세포내 효소를 추출하여 각 조건에서 지페노사이드 17로 전환되는 정도를 확인하였다. 이 경우 RP-HPLC 조건은 2-1과 동일하였다. 각 조건하에서의 RP-HPLC 결과를 비교하여 도 5 내지 도 7의 그래프를 작성하였다.
상기 THG-C4-1의 세포내 효소를 진세노사이드 Rb1과 각각 28, 30, 37, 39, 42℃에서 5분간 반응시킨 결과, 39℃에서 대부분의 진세노사이드 Rb1이 지페노사이드 17로 전환이 이루어진다는 것을 알 수 있었다(도 5).
THG-C4-1의 세포내 효소를 각각 39℃, pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0에서 5분간 반응시킨 결과, pH 7.0에서 전환률이 가장 높았다 (도 6).
THG-C4-1의 세포내 효소를 39℃, pH 7.0에서 0, 3, 5, 6, 10, 15, 20분간 각각 반응시킨 결과, 10분간 반응시켰을 때 지페노사이드 17과 진세노사이드 F2로 전환되었고, 15분 이후에는 진세노사이드 F2, Compound-K로 전환됨을 알 수 있었다 (도 7).
실시예 4. 지페노사이드 17의 항비만 및 콜레스테롤 저해 활성 확인
4-1. 지방전구세포의 준비
설치류의 지방전구세포인 3T3-L1를 American type culture collection, manassas, VA, USA에서 구입하여 Dulbecco`s modified eagle medium (DMEM) 배양액에 10% Bovine calf serum (BCS)와 1% penicillin/streptomycin 을 첨가하여 배양하였다. 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하여 3T3-L1 세포가 배지의 80∼90%를 채우는 정도로 생장하였을 때, 0.25% trypsin-EDTA를 배지에 처리하여 세포를 분리하고 원심분리를 통해 세포를 포함하는 pellet을 수득한 후 DMEM에 현탁시킨 현탁액을 24-well plate에 배양하였다. 배양된 세포를 3개 군으로 나누어, 제1군은 음성대조군으로 하고, 세포가 post-con-fluent하게 되었을 때 24-well plate의 배지를 10% Fetal bovine serum (FBS) 및 0.5mM 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX), 1μM dexamethasone, 5μl/ml insulin이 첨가된 분화유도제를 포함하는 DMEM 배양액을 2ml 씩 첨가하였다. 제2군 및 제3군은 양성대조군으로 하여, 제2군에는 Atorvastatin 10μM 용액 2ml 및 상기 분화유도제를 처리하고, 제3군에는 Rosuvastatin 10μM 용액 2ml 및 상기 분화유도제를 처리하였다. 제4군은 다시 4개의 군으로 나누어 각각에 0.01, 0.1, 1 및 10 μg/ml의 농도의 지페노사이드 17 및 상기 분화유도제를 처리하였다.
4-2. 지방세포 분화 억제 활성 평가
지방전구세포가 지방세포로 분화되면 세포내에 다량의 지질이 축적되므로 Oil Red O로 염색했을 때 붉게 나타난다.
상기 4-1에서 준비한 제1 내지 제4군의 세포들에 분화를 유도한지 8일째에 Oil Red O 염색을 수행하였다.
Oil Red O 염색을 위한 working solution은 다음의 방법으로 제조하였다. 0.35g의 Oil Red O 시약을 100ml의 isopropanol 에 녹여 여과하여 Oil Red O stock solution을 제조하고, 이로부터 Oil Red O stock solution 60% 및 증류수 40%로 이루어진 Oil Red O working solution을 제조하였다.
Oil Red O working solution으로 염색된 세포는 현미경으로 관찰하였으며, 그 후 100% isopropanol을 가하여 세포내에 축적된 lipid를 용출하여 96 well plate에 옮긴 후 500nm에서 흡광도를 측정하여 지질 축적(lipid accumulation) 정도를 평가하였다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 음성대조군인 제1군은 매우 붉게 염색되었고, 양성대조군인 제2군 및 제3군에서도 약간 붉게 염색된 반면, 지페노사이드 17을 처리한 제4군에서는 붉게 염색된 세포가 매우 적었다.
상기 염색을 동일한 시료에 3회 처리하여 흡광도를 측정하고, 각 값들의 평균 %와 표준편차를 계산하였다.
결과는 도 9에 나타내었다. 음성대조군인 제1군에 축적된 지질은 880.60±12.41%로 증가하였고, Atorvastatin을 처리한 제2군에서는 179.93±4.71%, Rosuvastatin을 처리한 제3군에서는 174.79±4.67%로 각각 증가하였다.
지페노사이드 17을 처리한 제4군에서는, 지페노사이드 17을 각각 0.01, 0.1 μg/ml 처리한 경우 축적된 지질이 각각 132.08±5.75%, 159.46±5.73%로 증가하여 양성대조군에 비해 40% 이상의 유의적인 차이를 보였다. 이 중 0.01μg/ml이 가장 유의적인 효과가 있는 것으로 확인되었고, 지페노사이드 17이 지방세포 분화 억제 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
4-3. 지페노사이드 17의 콜레스테롤 저해 활성 평가
HepG2 세포 (human hepatoma cell line, 15세 백인남성에서 분리수립한 상피유사 형태를 나타내는 간암유래의 세포)를 한국 세포주 은행 (KCLB, Korean celll line bank, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. HepG2 세포는 10% FBS와 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 2~3일에 한 번씩 계대배양 하였다. 배양된 세포를 4개 군으로 나누어, 제1군은 음성대조군으로 하고, 제2군 및 제3군은 양성대조군으로 하여, 제2군에는 Atorvastatin 10μM 용액 2ml 및 상기 분화유도제를 처리하고, 제3군에는 Rosuvastatin 10μM 용액 2ml 및 상기 분화유도제를 처리하였다. 제4군은 다시 4개의 군으로 나누어 각각에 0.01, 0.1, 1 및 10 μg/ml의 농도의 지페노사이드 17 및 상기 분화유도제를 처리하였다.
콜레스테롤 저해 활성은 Apolipoprotein 분비능을 측정하여 확인하였다. Apolipoprotein은 지방질의 운반과 지단백 구조유지 기능이 있고, 지단백 대사에 관여하는 효소들의 활성인자가 되며, 지단백 내 지질이 간, 혈관벽, 지방조직이 대사되는데 필요한 성분으로, 이 성분이 분비되면 혈액에 지방과 콜레스테롤이 잔류하지 않게 된다.
Apolipoprotein의 분비능은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent, 효소면역측정법) 분석법으로 검색하였다. 상기 제1군 내지 제4군의 HepG2 세포를 high glucose DMEM 배지에 5×105 cell/ml로 분주하고 4℃에 방치하였다. 12시간 후 5% skim milk 에 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 1차 항체와 2차 항체를 반응시켰다. 마지막으로 발색시약인 1,2-pheylenediamine (100μl/well)에 30분 동안 반응시킨 후 492nm 흡광도를 측정하여 Apolipoprotein의 분비를 확인하였다. 동일한 과정을 3회 수행하여 흡광도를 측정하고, 각 값들의 평균 %와 표준편차를 계산하였다
그 결과, 음성대조군인 제1군에서 분비된 Apolipoprotein은 100±2.95%였고, 이를 기준으로 비교하였을 때 양성대조군 중 Atorvastatin을 처리한 제2군에서는 109.31±1.53%, Rosuvastatin을 처리한 제3군에서는 112.37±2.35%로 나타났다.
지페노사이드 17을 처리한 제4군을 양성대조군과 비교하였을 때, 0.1μg/ml,
1μg/ml 처리한 농도에서 122.37±6.59%, 121.45±4.89%로 양성대조군에 비해 약 10% 이상의 유의적인 차이를 보였다. 이 중 특히 0.1μg/ml는 양성대조군에 비해 콜레스테롤 저해 효과가 가장 뛰어난 것으로 확인되었다. 따라서 지페노사이드 17은 콜레스테롤 저해 효능이 있는 것으로 확인되었다 (도 10).
농업생명공학연구원 KACC16985 20121022 Japan Collection of Microorganism JCM18745 20121228
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A novel bacterium Chryseobacterium sp. THG-C4-1, and a method for producing gypenoside 17 using the same <130> P13-082-KHU <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1415 <212> DNA <213> Chryseobacterium sp. THG-C4-1 16S ribosomal RNA gene <400> 1 gaannnnggg agctaccatg caagctgagc ggtagagatc tttcgggatc ttgagagcgg 60 cgtacgggtg cggaacacgt gtgcaacctg cctttatcag ggggatagcc tttcgaaagg 120 aagattaata ccccataata tattaagtgg catcatttga tattgaaaac tccggtggat 180 agagatgggc acgcgcaaga ttagatagtt ggtgaggtaa cggctcacca agtcgatgat 240 ctttaggggg cctgagaggg tgatccccca cactggtact gagacacgga ccagactcct 300 acgggaggca gcagtgagga atattggaca atgggttagc gcctgatcca gccatcccgc 360 gtgaaggacg acggccctat gggttgtaaa cttcttttgt acagggataa acctatttac 420 gtgtaaatag ctgaaggtac tgtacgaata agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgg agggtgcaag cgttatccgg atttattggg tttaaagggt ccgtaggcgg 540 atgtgtaagt cagtggtgaa atctcacagc ttaactgtga aactgccatt gatactgcat 600 gtcttgagta aggtagaagt ggctggaata agtagtgtag cggtgaaatg catagatatt 660 acttagaaca ccaattgcga aggcaggtca ctatgtctta actgacgctg atggacgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgctaactc 780 gtttttgggt tttcggattc agagactaag cgaaagtgat aagttagcca cctggggagt 840 acgttcgcaa gaatgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggattatg 900 tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct taccaaggct taaatgggaa ttgatcggtt 960 tagaaataga ccttccttcg ggcaattttc aaggtgctgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020 ccgtgaggtg ttaggttaag tcctgcaacg agcgcaaccc ctgttactag ttgctaccat 1080 taagttgagg actctagtaa gactgcctac gcaagtagag aggaaggtgg ggatgacgtc 1140 aaatcatcac ggcccttacg ccttgggcca cacacgtaat acaatggcag gtacagaggg 1200 cagctacaca gcgatgtgat gcgaatctcg aaagcctgtc tcagttcgga ttggagtctg 1260 caactcgact ctatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa 1320 tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcaagccatg gaagtctggg gtacctgaag 1380 tcggtgaccg taaaaggagc tgcctaggta aacag 1415

Claims (19)

  1. Chryseobacterium sp. THG-C4-1(수탁번호 KACC 16985).
  2. 제1항의 균주를 이용하여 진세노사이드 Rb1을 지페노사이드 17(gypenoside 17)로 전환하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 진세노사이드 Rb1을 포함하는 배지에서 제1항의 균주를 배양하는 방법.
  4. 제1항의 균주로부터 추출한 세포내 효소(endoenzyme)를 이용하여 진세노사이드 Rb1을 지페노사이드 17(gypenoside 17)로 전환하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은
    1) 제1항의 균주를 배양하는 단계;
    2) 상기 배양된 균주의 세포벽을 파괴하여 세포내 효소를 추출하는 단계; 및
    3) 상기 세포내 효소와 진세노사이드 Rb1을 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1은 인삼, 돌외 또는 덩굴차로부터 추출된 방법.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 TSB (Tryptic Soy Broth) 배지에서 배양되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 TSB 배지는 카제인의 췌장 소화물(pancreatic digest of casein), 대두의 효소 소화물(enzymatic digest of soya been), 염화나트륨(sodium chloride), 인산수소이칼륨(di-potassium hydrogen phosphate) 및 포도당(glucose)을 포함하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포내 효소를 진세노사이드 Rb1과 39℃에서 반응시키는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포내 효소를 진세노사이드 Rb1과 pH 7.0에서 반응시키는 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포내 효소를 진세노사이드 Rb1과 10분간 반응시키는 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 세포내 효소는 베타-글루코시다제(beta-glucosidase)인 방법.
  13. 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 항비만용 약학적 조성물.
  14. 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 항비만용 건강기능식품.
  15. 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 항비만용 화장료 조성물.
  16. 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  17. 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 건강기능식품.
  18. 지페노사이드 17을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 화장료 조성물.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 건강기능식품은 지페노사이드 17을 0.05 μg/ml 내지 0.9 μg/ml 포함하는 조성물 또는 건강기능식품.
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