KR100296016B1 - 상어연골추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골 추출물 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 항-혈관형성, 항-종양, 항-염증 및 항-콜라겐분해 활성을 갖는 상어 연골 추출물이 향상된 방법에 의해 얻어졌다. 상기 공정은 수용액내의 연골의 균질물을 얻는 단계를 포함하며, 상기 균질물은 고체 분획 (고체 추출물) 및 액체 분획으로 분리되고, 상기 액체 분획은 0 내지 500 KDa을 포함하는 분자량을 갖는 분자를 갖는 액체 추출물을 얻기 위해 더욱 분획되었다. 그 후, 상기 액체 추출물의 조성은 다양한 방법에 의해 조사되었다. 상기 액체 추출물을 더욱 분획하여 몇몇 그의 활성 성분들을 더욱 특징화하였다. 전체 액체 추출물의 다양한 생물학적 활성 때문에, 이는 종양 증식, 혈관형성증, 염증 및 콜라겐분해증으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분과 같은 다양한 질환 또는 상태에 사용될 수 있다. 피부 차단 기능을 향상시키는 상기 액체 추출물의 능력에 기초한 몇몇 미용학적 적용도 또한 본 발명의 목적이다. 상기 추출물들은 정상적인 몸의 기능에 어떠한 공격적인 효과도 갖지 않는다. 그러므로, 상기 상어 연어 추출물은 유망한 치료적 가치를 가진다. 상기 연골 추출물을 얻는 방법은 간단하고 효율적이다. 그러므로, 상기 공정에 의해 얻어진 매우 가치있는 제품은 신규하고 비자명한 공정의 지시물이다.

Description

[발명의 명칭]

상어 연골 추출물

[기술분야]

연골은 무혈관화된 조직이며, 항-혈관형성 인자(anti-angiogenic factor)를 포함하는 유력한 후보로서 연구되어져 왔다. 이는 또한 종양 전개에 대해 비교적 저항력이 있는 조직이다. 연골과 연관된 종양인 연골 육종(chondrosarcoma)은 최소한으로 혈관화된 충실성 종양(solid tumor)이다. 혈관형성은 종양의 전개에 있어서 중요한 인자 중 하나이다. 개개의 충실성 종양 집단은 마치 상기 종양 세포가 그들의 영양 요구를 충족시키기 위해 인접 혈관 망을 자극할 수 있는 것처럼 보인다. 그러므로, 종양의 전개에 있어서 그 역할에 대하여 혈관형성의 자극과 관련된 인자들이 연구되어져 왔으며, 혈관형성 억제 활성을 갖는 약물뿐만 아니라, 항-혈관형성 인자들도 또한 종양의 성장을 조절하거나 억제에 영향을 주기 위한 도구로서 조사되어져 왔다.

송아지의 견갑 연골이 충실성 종양의 혈관형성을 억제하는 물질을 포함하고 있음이 발견되었다. (Langer 등, 1976). 이의 항-종양제로서의 잠재적 작용 때문에, 연골의 더 좋은 공급원이 기대되어 왔다.

상어는 이들의 내골격이 전체적으로 연골로 구성(송아지의 0.6%에 비해 전체 중량의 6%)되어져 있기 때문에, 이러한 종류의 혈관형성 억제제의 유력한 원료인 동물이다. 상어는 또한 흥미롭게도 특징적인 낮은 종양 전개 경향을 가진다. 상어내의 종양 전개의 이러한 낮은 가능성을 설명하기 위한 많은 가설들이 주장되어 왔다. Marchalonis 등(1990)은 어떠한 공격제를 쉽게 공격할 수 있는 1gM 항체를 제시하였다. Mckinney 등(1990)은 상어가 신생 세포로부터 정상세포를 분화시키고, 신생 세포를 파괴시킬 수 있는 대식세포 (macrophage)를 가짐을 발견하였다. Rosen 및 Woodhead(1980)는 연골어 (상어 및 가오리를 포함하는 군)에서의 종양 희박성은 높은 체온과 동일한 이들 조직의 높은 이온 강도 때문인 것으로 가정하였다. 이러한 조건에서, 상기 저자들은 면역 시스템이 100% 면역학적 생존율에 가까운 것으로 판단하였다. Moore 등(1993)은 상어가 항-박테리아 및 항-원생동물의 특성을 갖는 아미노스테롤 (aminosterol)을 생산하는 것을 발견하였다. 마지막으로, Lee와 Langer(1983) 및 Folkman와 Klagsbrun(1987)은 상어가 신생혈관화를 억제하는 물질을 생산하는 것을 발견하였다. Lee 및 Langer(op.cit)는 변성 조건에서 상어 연골로부터 상기 물질을 추출하여 분리하였다 (구아니딘 추출물). 그러나, 이러한 추출 공정은 매우 길고(41일), 변성 인자를 갖는 추출물을 생성시킬 수 있으며, 활성 성분의 수율이 우수하지 않다. 송아지로부터 분리된 상기 활성 물질은 약 16 킬로달톤 (Kd)의 분자량을 갖는 반면에, 동일 연구 군은 상어에서 얻어진 것에 대하여 정확한 분자량을 얻지 못했다. 단지 정의상으로 상기 물질은, 3500 Da 이상의 분자량을 갖는다. Oikawa 등 (1990)은 Lee 및 Langer에 의해 기술된 것과 동일한 추출 방법을 적용하였으나, 더 짧은 시간이 걸렸다(41일 대신 2일). Oikawa 등에 의해 상어 연골로부터 분리된 항-혈관형성 물질은 1000 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 갖는 분자로 한정되었다. Schinitsky (미합중국 특허 제 4,473,551호)는 100,000 Da 이상의 분획이 단독 또는 글루코사민 (glucosamine)과의 결합으로 항-염증성 활성을 갖는 천연 분말 상어연골의 물 추출물을 개시하였다. 상기 특허에서는 항-혈관형성 또는 항-종양 활성을 상기 추출물의 성분에 대해서는 제시되지 않았다. Kuetner 등 (미합중국 특허 제 4,746,729호)은 소의 연골로부터 얻은 폴리모포뉴클리어 뉴트로필(polymorphonuclear neutrophil, PMN) 엘라스타아제 (elastase) 억제제를 분리하였다. 상기 억제제는 연골의 수용액 추출물로부터 얻어졌으며, 이로부터 50,000이하의 분자량을 갖는 분자를 얻었다. Sephacryl S-2000 상의 분획법으로 수많은 분획을 얻었으며, 이로부터 10-40 kDa 분획이 항-엘라스타아제 활성을 나타낸 후에 수집되었다. 상기 활성 성분은 9.5의 등전점을 가지며, 약 15,000 Da의 분자량을 가질 수 있다. Kuetner 등 (미합중국 특허 제 4,042,457호)은 또한 소의 연골이 내피 세포 성장에 대한 어떠한 활성도 없이 세포 증식 억제 활성을 갖는 50,000 Da 이하의 분자량의 성분을 가짐을 보였다. Balassa 등 (미합중국 특허 제 4,822,607호)은 수용액에서 항-종양 활성을 갖는 연골 추출물을 얻었다. 그러나, Balassa의 방법을 재 조작함으로서 얻어진 추출물 내에 항-혈관형성 활성은 발견되지 않는다. Spilburg 등 (미합중국 특허 제 4,243,582호)은 항-트립신(anti-trypsin) 활성 및 내피 세포 성장 억제 활성을 나타내는 소의 연골(구아니딘 추출)로부터 65 kda의 분자량 및 pI 3.8의 두 개의 당단백질을 분리하였다.

송아지 및 상어 연골은 프로(pro)-염증 활성, 항-염증 활성, 항-혈관형성 활성, 리소자임 (lysozyme) 활성, 세포 성장-촉진 활성, 타입 I 및 Ⅳ 콜라게나아제 (collagenase), 엘라스타아제 및 트립신, 키모트립신 (chymotrypsin) 및 플라스민(plasmin)과 같은 기타 프로테아제 (protease) 들에 대한 억제 활성과 같은 많은 생물학적 활성을 함유한다. 그러나, 임상적으로 가치 있는 활성 군을 포함하는 연골 추출물은 아직 얻어진 바가 없다.

상어 연골 항-혈관형성 성분(들)은 일반적으로 래빗 코니알 포켓 (rabbit corneal pocket) 검정 또는 칙 코리오알란토익 막 (chick chorioallantoic membrance, CAM) 검정으로 테스트되어 왔다. 최근까지, 전체 분말 연골은 그의 항-혈관형성 효과에 대하여 CAM 테스트 법으로 테스트되었을 뿐 아니라, 누드 마우스 (node mice)로 이식된 인간의 흑색종 이종이식편 (melanoma xenograft)상의 종양에 in vivo에서 직접적으로 테스트되어 왔다. 비록 항-종양 효과가 연골 추출물로 확인되었을 지라도, 상기 효과는 종종 상기 종양에 혈액공급을 저지시키는 상기 항-혈관형성 성분에 기여되었다. 지금까지는, 상어 연골이 종양 세포 증식에 대한 직접적인 효과를 갖는다는 어떠한 증거도 없다.

상어 연골 추출물 및 분획을 구하는 몇몇 방법들이 이미 알려져 있다. 그들 중 몇몇은 어떠한 추출도 없이 분말 천연 연골 제조에 관한 것이다.(미합중국 특허 제 5,075,112호). 다른 것들은 구아니딘과 같은 변성제를 이용한다 (미합중국 특허 제 4,243,582호). 다른 것들은 상기 연골을 둘러싸고 있는 어떠한 근육, 신경 또는 혈관 구조를 제거시키기 위해 효소적 소화법에 의해 연골을 전-처리하며, 이러한 전-처리 단계 후, 유기용매로 지방을 제거시키면, 활성 성분이 수용액 상에서 추출된다 (Balassa 등 미합중국 특허 제 3,478,146호, 제 4,350,682호, 제 4,656,137호 및 제 4,822,607호). 생물학적 활성 연골 성분을 그대로 보존하기 위한 상기 전-처리 효과는 알려져 있지 않다. 만일 너무 과하게 되면, 상기 효소 소화는 활성 단백질 성분을 가수분해시킬 수 있다. 예를 들면, Balassa의 방법 (미합중국 특허 제 4,822,607호)은 항-혈관형성 활성이 없는 액체 추출물을 얻었다; 이러한 실수는 상기 효소적 분해의 결과일 것이다. Balassa의 방법은 추출물에 활성 성분을 더욱 포함시키는 분획 단계를 포함하지 않는다. 다른 방법들은 단지 용해되지 않는 물질을 제거시킴으로써 연골의 수용액 추출물 (물 (미합중국 특허 제 4,473,551호) 또는 염 용액 (미합중국 특허 제 4,746,729호)내)을 얻는다. 후자중, 특정 분자량의 특정 분획이 부가적인 연구 및 정제법 (상기 참조)을 위해 특히 사용되었다.

상기 인용된 방법들은 몇몇 단점을 가진다. 이들은 몇몇 중요한 성분을 분해시킬 수 있다. 그렇지 않을 경우, 이들은 너무 길어서 비실용적인 단점을 가진다. 또한 상기 긴 방법은 필수적으로 충분한 양의 활성 성분을 생성시키는 것은 아니며, 상기 회수된 성분들 중 몇몇은 전혀 회수되지 않거나 검출 가능한 활성을 보이기에 불충분한 양으로 회수되거나, 몇몇은 특정 활성을 얻는 것에 초점을 맞춤으로 해서 무시된다.

혈관형성은 암 전개에만 관련된 것은 아니다. 많은 질환들 또는 다른 생리학적 시스템(괄호로 지시됨)에 영향을 주는 조건들은 혈관형성-의존적이며, 이들은 다음과 같다. 관절염 및 아테로마성 플라크 (atherosclerotic plaque) (뼈 및 인대), 당뇨성 망막병증, 신혈관 녹내장, 반점상 분해, 안구 포진, 크라코마 (trachoma) 및 각막 이식 신혈관형성증 (눈), 건선, 부종성 경화증, 주사, 혈관종 및 비후성 반흔화 (피부), 혈관 접착증 및 혈관 섬유종 (혈액 시스템). 그러므로, 어떠한 신규하고 특허성 있는 항-혈관형성성 "인자"는 암 치료 및 다른 혈관형성-의존성 질환에서 뿐만 아니라 상기 잘환들의 치료에서도 사용될 수 있다. 또한, 상기 언급된 많은 질환 및 상태들도 또한 염증성 성분을 가지고 있기 때문에, 어떠한 신규하고 독창적인 항-염증성 "인자"는 다른 염증성 질환들 또는 상태들에서 뿐 아니라 상기 질환 및 상태들의 치료에도 사용될 수 있다. 게다가, 그의 콜라겐분해 활성 때문에, 콜라게나아제와 같은 프로테아제들이 암 및 조기 노화와 같은 다양한 질환 및 상태에 연관되기 때문에, 신규하고 특허성 있는 항-콜라겐분해성 "인자"는 콜라겐분해 성분을 갖는 질환 또는 상태의 치료에 사용될 수 있다.

혈관형성, 염증 및 단백질 가수분해는 단독 또는 다양한 질환 또는 상태들과 결합하여 일어날 수 있기 때문에, 정상적인 신체 기능에 영향을 주지 않는 적어도 모든 상기 활성들에 반대로 작용할 수 있는 제품이 우수한 치료적 가치가 있는 것이다.

[배경기술]

본 발명은 치료상 중요한 다양한 활성들을 함유하는 장점을 가진 연골 추출물을 생산하는 신규한 방법을 제공한다. 상기 활성들 중 항-혈관형성, 항-염증, 항-콜라겐분해, in vivo 항-종양 증식 및 직접적인 in vitro 항-종양 증식 활성들은 상어 연골 추출물 내에 만족할 만한 농도로 존재하는 것으로 확인되었다. 다른 활성들은 검출 또는 확인 중에 있다. 상어 연골의 액체 추출물 내에서 모든 활성들이 얻어졌으며, 이들 중 일부는 상어 연골의 고체 추출물형태로 얻어지거나 확인되었다.

본 발명은 천연 연골 내에 존재하는 생물학적 활성의 수용성 성분의 실질적인 부분을 갖는 연골의 액체 추출물을 얻기 위한 신규한 방법에 관한 것이며, 이는 다음 단계를 포함한다:

a) 연골의 그 크기가 약 500㎛와 동일하거나 그 이하의 입자로 축소될 때까지 상기 생물학적 활성 성분들을 보존하는 조건으로 수용액상에서 상기 연골을 균질화시키고, 결과적으로 상기 생물학적 활성 성분들을 갖는 입자 혼합물 및 천연액체 추출물의 혼합물을 만드는 단계;

b) 상기 균질물을 원심분리시켜 상기 천연 액체 추출물로부터 입자들을 분리시키는 단계; 및

c) 약 500 kDa과 동일하거나 더 낮은 분자량을 갖는 연골 분자들을 함유하는 최종 액체 추출물을 구하기 위해 상기 천연 액체 추출물을 더욱 분리하는 단계.

이러한 신규한 공정은 수행하기 쉽고 효과적이라는 장점을 가진다. 고수율의 연골 추출물이 얻어졌으며, 특히, 상어 연골로부터 얻어진 추출물들은 적어도 모든 상기 언급된 생물학적 활성들을 함유한다. 미지의 물리화학적 특성을 갖는 화합물을 회수할 가능성을 극대화시키기 위해 상기 방법은 냉온 (약 0 내지 20℃)에서 비-변성 조건 (바람직하게는 순수한 물)하에서, 거의 중성 pH (약 5 내지 8)하에서 수행되었다. 상기 공정에 따라, 연골 성분은 작은 부피의 용액 (연골 1㎏당 1L 정도의 작은 부피)내에서 짧은 균질화 시간 (10 내지 20분 정도의 짧은 시간) 후 추출될 수 있다. 고체 추출물의 회수를 위해 상등액을 버리고, 상기 펠렛(pellet)을 회수하고 동결건조하는 것을 제외하고는 동일한 방법이 사용되었다.

본 발명은 연골 추출물, 특히 연골어, 더 특히 상어로부터 얻은 추출물에 관한 것이다. 상기 고체 추출물은 활성을 나타낸다. 이는 콜라겐 및 비-수용성 성분들을 포함할 수 있다. 이는 또한 전체 액체 추출물 내에서 추출된 잔류 활성을 포함할 수 있다. 상기 전체 액체 추출물은 매우 활성이 풍부하다. 이는 그대로 사용될 수 있거나 농축될 수 있다. 생물학적 활성의 유지를 촉진하는 농축 단계는 특별하다. 가열-증발과 같은 활성 성분을 저하시키는 방법을 쓰는 것은 주의하여 회피되었다. 약 1 kDa의 분자량 컷-오프 (cut-off)값을 갖는 막상에서의 울트라필터법 (ultrafiltration)이 본 발명의 상기 액체 추출물을 농축하는데 사용되었다. 약 100 Da의 분자량 컷-오프 값을 갖는 막상에서의 나노거름법 (nanofiltration)은 액체 추출물의 생물학적 활성 (항-혈관형성, 항-콜라겐분해성)을 농축시키는데 더 좋다. 결과적으로, 약 0.1과 약 500 kDa 사이의 분자량을 갖는 분자를 함유하는 농축된 추출물이 테스트되었다.

상기 액체 추출물 (0 내지 500 kDa)은 이들의 활성 성분을 특징화하기 위해 더욱 분획되었다. 수많은 활성 분획들이 다양한 방법으로 얻어졌다. 종양 셀 라인(cell line)상에서 이들의 항-종양 활성에 대해 테스트된 이들 중 일부는 이들의 분자량 및 등전점에 의해 대단히 특징화되었다. 다른 방법들로 활성, 특히 항-콜라겐분해성 또는 항-혈관형성성이 확인되었다. 상기 분획들은 완전한 특징화 및 확인중에 있다. 그러므로, 중요한 활성이 전체 액체 추출물 및 이들의 분획내에서 회수되었고, 이는 유리하게 사용될 수 있다. 많은 양의 분말화된 연골을 공급하는 것 대신에, 더 수용가능하고 풍부한 추출물이 현재 공급될 수 있다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 상기 연골 추출물 중 한 성분을 유효량으로 포함하고 있는 치료학적 또는 미용학적 조성물에 관한 것이다. 대부분의 관심은 피부과학 및 미용학에 사용하기 위한 제조물로부터 유출된다. 이러한 관심은 상기 연골 추출물에서 관찰된 활성으로부터 발생한다. 이러한 점에서, 상기 관찰된 항-혈관형성, 항-콜라겐분해 및 항-염증 활성, 및 각막세포 (keratinocyte) 내의 프로테인 키니아제 C (Protein Kinase C)와 같은 신호 경로에 의해 매개되는 세포 분화에 대한 반대작용 효과들이 조성물 내에 상어 연골 추출물을 사용하는 기초 방법 및 염증 또는 자극의 감소, 주름 또는 피부 위축 조절, 조기 노화의 지연, 여드름 감소, 피부 차단 기능의 향상, 안구 주변의 어두운 고리의 감소, 거미 정맥 및 정맥 노장의 감소, 혹 억제 및 피부 진정 효과를 위한 방법으로써 고려되었다. 상기 방법들은 본 발명의 목적 하에 있다. 또한, 상기 상어 연골 액체 추출물이 암, 관절염, 건선 및 여드름에 있어서 성공적으로 테스트되었기 때문에, 종양 증식, 혈관형성, 염증 및 콜라겐분해증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 갖는 상태들 또는 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법도 본 발명의 목적하에 있다.

[도면의 간단한 설명]

본 발명은 하기 도면들에 나타난 특정 실시예의 방법에 의해 더 잘 이해될 것이며, 이는 본 발명의 목적을 제한하지 않고 본 발명을 예시한다.

제1도는 상기 액체 추출물의 특정 아미노산 조성을 나타낸 그래프이다.

제2도는 ZR75-1 및 MCF-7 셀 라인상의 상어 연골 (고체 추출물)의 적량-감응억제 활성을 나타낸 그래프이다.

제3도는 두 개 농도의 고체 연골 추출물 존재 또는 부재 하에서 에스트라디올 (estradiol) 농도의 증가에 대한 MCF-7 세포량의 적량-감응을 나타낸 그래프이다.

제4a도 및 제4b도는 게비지 수 (gavage water)(A) 또는 고체 및 액체 연골 추출물 (B)의 결합물에 의해 투여된 쥐의 유선 종양 단면의 비교도이다.

제5도는 연골 처리된 쥐에서 이들 종양의 혈관형성 면적이 50% 감소됨을 나타낸 막대 그래프이다.

제6도는 액체 연골 추출물이 섬유 아세포 증식에 어떠한 영향도 나타내지 않음을 나타낸 그래프이다.

제7도는 HUVEC 증식에 대한 액체 연골 추출물의 적량-감응 억제 곡선을 나타낸 그래프이다.

제8도는 액체 연골 추출물이 TPA-유도된 각막세포 분화를 억제함을 나타내는 그래프이다.

제9도는 콜라게나아제 활성에 대한 액체 연골 추출물의 적량-감응 억제 곡선을 나타내는 그래프이다.

제10도는 상기 태아 혈관화 테스트 (Embryonic Vascularization Test (exovo))에 대한 액체 연골 추출물의 적량-감응 억제 곡선을 나타낸 그래프이다.

제11도는 마우스에서 종양 성장 억제에 대한 다양한 양의 액체 연골 추출물의 효과를 나타낸 그래프이다.

제12도는 상기 액체 연골 추출물의 복강내 투입이 종양 성장을 억제시키는 물질의 효능을 의미있게 증가시킬 수 있음을 나타낸 그래프이다.

제13도는 Rotofor상에서 분리된 액체 분획의 비-변성 조건하에서의 전기영동 프로파일(profile)이다; 분자량 표시제는 왼편에 나타내었고, 계속해서 상기 분리된 분획을 비교하기 위해 분획하기 전의 액체 추출물 시료를 나타내었다.

제14도는 10,000 Da보다 낮은 분자량을 갖는 본 발명의 전체 액체 추출물 분획의 HPLC 이동 상태를 나타낸 그래프로, 상기 분획은 5개의 서브(sub)-분획으로 농축되고 분리되었다.

제15도는 하나는, 10,000 Da보다 낮은 분자량을 갖고, 다른 하나는 10,000 Da보다 높은 분자량을 갖는 본 발명 (DUP)의 상어 연골의 액체 추출물의 두 분획에서 얻어진 EVT 결과를 나타낸 그래프이다.

제16도는 상어 연골의 새개의 다른 추출물의 FPLC 이동 형태를 나타낸 그래프이다. 패널 (panel) A에서, DUP는 본 발명에 따른 연골 액체 추출물을 나타낸 것이다. 패널 B 및 C에서, BAL 및 OIK는 각각 선행 기술인 Balassa 등 및 Oikawa 등의 추출물을 나타낸 것이다.

제17도는 제17도에서 정의된 동일 추출물의 HPLC 이동을 나타낸 그래프이다.

제18도는 상기 선행 기술과 본 발명의 액체 추출물의 CZE 비교를 나타낸 그래프이다. A=DUP; B=BAL; C=OIK.

제19도는 선행 기술과 본 발명의 상기 액체 추출물의 EVT 비교를 나타낸 그래프이다.

제20도는 상기 선행 기술과 본 발명의 아미노산 함량을 비교한 그래프이다.

제21도는 건선증에 걸린 두명의 환자의 상태의 의미있는 향상을 예시한 예시도로서, 각질 증식증이 있는 것과 (22a 및 b), 각질 증식증이 없는 (22c 및 d) 것은 유효량의 농축된 액체 연골 추출물 (사진 하부)을 함유하는 국소적 조성물로 처리될 때, 이들의 초기 상태 (사진 상부)로 비교된다.

제22도는 액체 연골 추출물로 처리된 인간의 얼굴에서 거미 정맥 발생의 향상도를 나타낸 그래프이다.

제23도는 액체 연골 추출물로 처리된 인간의 눈 주위의 어두운 고리의 발생의 향상도를 나타낸 그래프이다.

제24도는 액체 연골 추출물로 처리된 인간의 다리의 정맥류성 정맥의 발생의 향상도를 나타낸 그래프이다.

제25도는 이들의 초기 조건 (사진 상부)과 비교되는 액체 연골 추출물 (사진 하부)의 효과적인 양을 함유하는 국소적 조성물로 처리될 때 여드름이 있는 환자상태의 의미있는 향상을 예시한 사진이다.

제26도는 인간 피부에 대한 상기 액체 연골 추출물의 항-염증력을 나타낸 그래프이다.

제27도는 액체 연골 추출물로 처리된 인간의 피부의 차단 기능의 향상을 나타낸 그래프이다.

[발명의 상세한 설명]

특정 실시예에서, 연골은 건강한 상어인 Black Spiny Dog Fish 및 Common Spiny Dog Fish로부터 얻어졌다. 근육 및 결합 조직은 에탄올-처리된 외과용 메스 및 가위로 해체시킴으로써 제거되었다. 상기 연골은 그 후, 플라스틱 가방으로 진공-포장되었고, 더욱 사용하기 위해 -20℃로 냉동되었다. 본 방법의 실시예에서, 어떠한 연골 원료도 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 기술분야에서 기술된 이유 때문에 상어 연골을 선택하였다. 연골어(상어 및 가오리를 상기 군의 동물종으로서 포함함) 연골로부터 출발하면, 거의 동등한 제품이 얻어질 것으로 판단하였다. 만일 포유류 연골 원료가 사용된다면, 상기 제품들은 거의 대부분 천연 상태 및 활성 원소들 모두 다르게 될 것이다.

추출 이전에 연골의 준비에 있어서 어떠한 변형은 그것이 대상 제품 (예를 들면, 전체 액체 추출물 또는 이들의 특정한 분획)의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한 사용될 수 있다. 일부 활성 성분들은 Balassa 등 (미합중국 특허 제 4,822,607호)에 의해 지시된 바와 같이, 상기 연골로부터 어떠한 포위 조직들을 제거하기 위해 단백질 분해 소화법에 견딜 수 있는 반면, 다른 성분들은 상기 처리에 견딜 수 없다. 사익 전-처리를 견디는 것으로 나타나지 않은 상기 활성 중 하나는 항-혈관형성 활성이다 (도 19). 그러므로, 독립 활성들로 확인된 모든 수용성 활성 성분들을 가능한 한 많이 함유하고 있는 액체 추출물을 생성시키고자 한다면, 상기 추출 공정동안 상기 소화 단계를 피하거나, 강한 가수분해 또는 단백질 분해를 저지하기 위해 조심스럽게 다루어져야 한다.

[연골 추출물의 분리]

깨끗한 연골을 신선하게, 4℃로 해동시키거나 얼려서 사용되었다. 연골은 몇 시간(더 상세하게는 3시간) 동안 적절한 부피의 물(동일량 (중량/부피)은 거의 최소 부피이지만 중요한 성분의 수득율에 대하여 어떠한 영향도 받지 않고 증가될 수 있음)과 함께 에탄올-무균화된 미트 초퍼(meat chopper)의 구멍을 통과하였다. 실용적인 관점에서, 불필요한 많은 부피보다 작업하기 더 간편하기 때문에 적은 부피가 바람직하다. 실용적으로, 물은 0.1㎛ 필터(filter)의 역 필터법 및 역 삼투압에 의해 정제되었다. 물 대신 많은 수용액들 (예를 들면, 염을 함유하는 것)이 사용될 수 있다. 다양한 수용성 활성의 회수가 오염될 때, 거의 중성 pH (5.0 내지 8.0) 및 비-변성 조건에서의 작업에서는 상기 몇몇 연골 활성성분들의 분해 또는 변성을 피하는 것이 바람직하다. 수용액 용매 내에서 미지의 단백질의 특성은 검출 불가능하다; 몇몇은 산성 pH에서, 몇몇은 염기성 pH에서 더 "안정"할 수 있다. 또한, 몇몇 단백질들은 만일 상기 변성이 수용액내 상기 단백질들의 재생에 역으로 영향을 미치지 않는다면, 약한 변성 조건에서 추출될 수 있다. 분명하게 하기 위해, 생물학적 활성 수용성 연골 성분 그대로를 보존할 수 있는 어떠한 추출 조건이 본 발명의 목적이다. 그러므로, 상기 모든 인자들을 고려하면, 순수한 물에서 연골 활성 성분들의 추출 공정을 수행하는 것은 구조 및 특성이 아직 정의되지 않은 성분들을 매우 우수한 수율로 회수하기 위해 타당한 선택임이 발표되었다.

연골/물 혼합물은 그 후 약 4℃에서 20분 동안 주방용 혼합기내에서 최대 속도로 교반시킴으로서 균질화되었다; 상기 균질물을 균질화하는 동안 온도는 거의 20℃까지 상승한다. 물론, 수용액의 부피 뿐만 아니라 교반 속도도 또한 추출시간 및 수율에 영향을 줄 수 있다. 그러므로, 균질화 (500㎛보다 작은 입자 크기로 정의됨) 시간의 적절한 범위는 최단 약 10분 내지 최장 24시간일 수 있으며, 바람직하기로는 약 10분과 60분 사이이다. 상기 온도는 어떠한 효소 억제제도 사용되지 않을 때, 내세포 효소에 의한 활성 성분의 어떠한 분해를 피하기 위해, 약 10℃ 이하로 유지되어야 한다. 이상적으로는, 0℃에 가까운 온도가 바람직하다. 일반적으로 상기 실험은 냉장실에서 수행되며, 이곳에서 상기 온도는 4와 10℃ 사이로 유지될 수 있으며, 상기 온도 범위는 본 발명의 공정에 적용하기에 적합하다. 분명하고 간략하게 하기 위해, 이하, 용어 "약 4℃"는 상기 수용 가능한 온도범위를 지시하는 것으로 사용된다.

만일 상기 혼합기가 상기 입자의 크기를 충분히 감소시키지 않는다면, 약 4℃에서 10분간 이를 폴리트론 (Polytron) 분쇄기에 입자들을 제공함으로써 상기 균질물의 액화 (liquefaction)가 더욱 진행될 수 있다. 선택적으로, 혼합기-분쇄기를 더욱 수행함으로써 간단하게 균질화될 수 있으며, 이는 수동으로, 상기 액화 단계에서 10분을 단축시킨다. 완결된 균질화 단계의 말기에, 잔류 입자 크기는 약 500㎛보다 작다. 물론, 첫 번째로 분쇄된 연골을 얻기 위해 숙고된 시간 및 온도의 수용 가능한 동일 범위가 적용된다. 균질화 후 상기 입자의 크기는 대단히 작을 필요는 없다. 그러므로, 추출 전에 상기 연골을 가루로 만들어야 할 필요는 없다. 사실상, 수용액 추출 전에 가루 형태로 상기 연골을 가루화시키는 것은 상기 가루화가 특히 동결-건조 상태 및/또는 가열-건조 상태에서 수행될 때, 중요한 활성들을 역으로 변성시킬 수 있다.

상기 균질물은 13,600×g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리되었으며, 상기 단계는 펠렛으로부터 상등액을 빠르고 효과적으로 분리시키기 위한 한 방법이다. 상기 변수들의 변화 및 조정은 당업자에게는 공지된 것이며, 단지 사용되는 장치 및 균질물의 부피에 따라 다르다.

상기 결과적인 펠렛은 24 내지 48 시간동안 동결건조되었다. 상기 첫 번째 분획은 이하 동결건조물 또는 고체 추출물로 정의될 것이다.

상등액은 울트라필터 칼럼의 수행에 영향을 줄 가능성이 있는 입자를 제거하기 위해 필요하다면 24㎛ 왓트만 필터 (Whatman filter)상에서 걸러질 수 있다. 상기 걸러진 물질은 그 후, 약 500 kDa의 구멍을 갖는 접선 플로우 (tangential flow) 필터 칼럼상에서 약 4℃에서 울트라필터되어서 1차 천연 투과물이 약 0과 약 500 kDa 사이로 구성된 분자량을 갖는 수용성 분자를 포함하도록 한다. 상기 천연 투과 추출물은 0.22㎛ 필터 상에서 걸러졌으며, 더욱 사용하기 위해, 무균 병으로 등분되었다. 상기 분획은 이하 천연 투과물 또는 액체 추출물로서 언급될 것이다.

상기 펠렛 및 상등액을 얻기 위해 선택적이고 더 높은 원심분리 절차의 실행이 전개되었다. 왓트만 필터 상에서의 대략적인 필터법 전 13,600×g에서 15분동안 원심분리하는 단계는 3000-4000×g에서 1㎛의 다공성 나일론 주머니가 장착된 CEPA 원심분리기내에서 원심분리하는 것으로 대체되었다. 25㎏/25L 제조는 30분내에 상기 방법으로 원심분리될 수 있고 약 29리터의 상등액을 제공할 수 있다. 얻어진 수용액의 부피는 초기 물의 부피보다 더 크며, 이는 상기 연골 그 자체의 물 함량의 일부가 얻어졌음을 제시한다. 상기 동결건조물 및 전체 액체 추출물은 다른 물질을 사용할 때 및 벳치(batch)에 걸쳐 관찰되는 변화를 고려하여 하기 대략적인 조성을 가질 수 있다:

고체 추출물:

지질 7.35%¹

단백질 46.2%²

수분 20.4%

소듐 4.16 ㎎/g³

포타슘 2.64 ㎎/g

칼슘 114 ㎎/g

마그네슘 1.49 ㎎/g

아연 및 철 미량

액체 추출물:

지질 0.10 - 0.20%¹

단백질 8 - 25 ㎎/ml²

건조 중량 8 - 25 ㎎/ml

수분 97 - 99%

소듐 30 - 220 ㎎/100g³

포타슘 30 - 40 ㎎/100g

칼슘 2.0 ㎎/100g

마그네슘 1.1 ㎎/100g

아연 및 철 미량

¹,²는 각각 AOAC Offical (1994) 16.219-220 및 2.055 부분에 공개된 것을 따른 수치이다.

³은 상기 SAA 절차를 따르는 측정치이다.

상기 단백질 함량은 사실상 유기 질소 (N)를 측정하는 Kjeldahl법에 의해 측정된다. 유기 질소는 하기 식을 이용하여 동량의 단백질로 바뀐다:

단백질 함량 (㎎/ml) = (% N × 6.25) /100

탄화수소가 검출되지 않기 때문에, 이들은 프로테오글리칸 (proteoglycan) 및/또는 뮤코폴리사카라이드 (mucopolysaccharides)의 형태를 제외하고 하나 또는 또다른 추출물 형태로 있음을 가정할 수 있다. 상기 화합물들은 상기 OH- 기에 의해 측정된 수분의 측정치로 포함될 수 있다. 상기 20% 물 함량은 거의 연골내에 정상적으로 회수되는 탄화수소 퍼센트에 가까운 반면, 동결건조물의 수분은 0%에 가까워야 하며, 이러한 가설은 증명 중에 있다.

상기 액체 연골 추출물은 그의 아미노산 함량에 대해 분석되었다. 전체 아미노산의 평균량은 약 1.1㎎/ml이었으며, 자유 아미노산은 0.67㎎ (61%) 및 단백질 유래 아미노산은 0.44㎎ (39%)이었다. 각 아미노산의 분포는 도 1에 나타나 있다. 상당양의 타우린 (taurine)도 또한 검출되었다 (나타내지 않음).

상기 액체 추출물에 존재하는 주요 아미노산은 연골로부터 얻은 단백질과 펩티드 (peptide)로 대표된다. 예를 들면, 라이신 (Lysine), 글리신 (Glycine), 아스파틱산 (Aspartic acid) 및 글루타믹 산 (Glutamic acid)은 상기 액체 추출물의 아미노산 함량에서 큰 비율로 나타나며, 콜라겐내의 N-텔로펩티드(telopeptide) 분자간 교차-연결제의 주성분이다 (Hanson 등 (1992)의 J. Bone & Min. Res. 7: 1251-1258).

상기 액체 추출물의 미생물 한계는 미합중국 특허 XXIII <61> 표준물질을 적용하여 조절되었다.

[활성도 검정]

[고체 추출물]

[In vitro 검정법]

상기 검정법은 호르몬-의존성 암 셀 라인인 MCF-7 및 ZR75-1 (각각 ATCC (R) 제 22-HTB 및 1500-CRL)상에서 수행되었다.

[ZR75-1세포]

a. 기본 RPMI 배양액: 페놀 레드 (phenol red, Sigma R8755)가 없는 52g의 RPMI 1640, 17.875g의 Hepes (자유 산; Sigma H0763), 0.55g 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate, Sigma P5280) 및 10g의 NaHCO₃를 5L의 순수한 물에 혼합하여 NaOH로 pH 7.40으로 만들었다.

즉시 사용하지 않는다면, 상기 용액은 광분해성 물질을 보존하기 위해 빛으로부터 차단되어야 한다. 상기 용액을 걸러내고, 500ml의 멸균 병에 분배시켰며 이는 4℃에서 최대 3달 동안 저장된다.

b. 세포 배양 보존 배양액: 기본 RPMI 배양액에 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum), 100 U의 페니실린 G/50㎍의 스트렙토마이신 설페이트 (Sigma P0906)/ml 배양액, 2mM L-글루타민 (Sigma G1517) 및 1 nM E₂(β-에스트라디올 Sigma E8875)를 보충하였다.

c. 실험 배양액: 기본 RPMI 배양액에 5% FBSA (fetal bovine serum adsorbed on dextran-charcoal), 2mM의 L-글루타민, 100 U의 페니실린 G/50㎍의 스트렙토마이신 설페이트 (Sigma PO906)/ml 배양액 및 50ng/ml의 인슐린 (Sigma)을 보충하였다. 상기 배양액에 다른 농도 (10^-12내지^-5M)의 E₂뿐만 아니라, 상기 기술된 동결건조물의 증가시킨 농도를 첨가하였다.

[MCF-7 세포]

a. 기본 DME-F12 배양액: DME-F12 배양액 (바이카보네이트(bicarbonate) 및 레드 페놀 없음; Sigma)을 제조자의 지시에 따라 순수한 물에서 재구성하였다. 1리터에 대하여, 1.2g의 소듐 바이카보네이트를 첨가하고, NaOH/HCI로 pH 7.40으로 만들었다. 상기 용액을 거르고, 500ml의 멸균 병에 분배하였으며, 이는 4℃에서 최대 3개월간 저장된다.

b. 세포 배양 보존 배양액: 기본 DME-F12 배양액을 10% (v/v) FBS, 100 U의 페니실린 G/50㎍ 스트렙토마이신 설페이트/ml 배양액, 2mM의 L-글루타민 (Sigma)및 1mM E₂로 보충하였다.

c. 실험 배양액: 기본 DME-F12 배양액을 5% FBSA, 2mM의 L-글루타민(Sigma), 100 U의 페니실린 G/50㎍ 스트렙토마이신 설페이트/ml 배양액 및 50 ng/ml의 인슐린 (Sigma)을 보충하였다. 상기 ZR75-1 세포에 대하여 기술된 바와 같이, 동결건조물 및 E₂를 동일 농도로 첨가하였다.

d. FBSA의 제조: 태아 소 혈청을 1% (w/v)의 목탄(알칼린을 탈색시킨 탄소)과 혼합시켰다. 덱스트란 (dextran) T70을 상기 목탄-혈청 용액에 첨가시켜 0.1% (w/v)의 농도를 얻었다. 상기 혼합물을 4℃에서 하룻밤동안 교반시켰다. 4℃에서 30분간 10,000×g로 원심분리시킨 후, 상기 혈청을 이동시키고, 다시 동일한 비율의 목탄 및 덱스트란과 혼합시키고, 실온에서 3시간동안 교반시키고, 재-원심분리시켰다. 그후 상기 혈청을 56℃에서 20분간 가열-불활성화시키고, 멸균 필터시키고, 멸균 코니칼 Falcon 튜브 (conical falcon tube)에 등분시켰다.

[실험 배양 검정 및 결과]

ZR75-1 및 MCF-7 세포들을 24-웰(well) 판상에서 20,000 세포/웰 또는 6-웰판 상에서 150000 세포/웰의 밀도가 되도록 성장시키고, 상기 제조된 바와 같이 다른 농도의 동결건조물의 존재 또는 부재 하에서 처리하였다. 상기 효과에 대해, 상기 고체 연골 추출물은 이들의 수용성 성분이 회수되고 테스트되도록 배양액으로 재현탁시키고, 멸균필터시켰다. 모든 실험은 3번 반복 시행되었다. 매 2일마다 배양액들을 거두고, 새 배양액으로 교체시켰다. 세포들을 계속적으로 습윤화된 5% CO₂를 함유하는 분위기 하에서 37℃에서 17, 7, 3 또는 3일 동안 인큐베이터 (incubator) 내에서 성장시켰으며, 이는 각각 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 실험과 같다. 세포 성장 억제는 웰의 전체 DNA 함량을 측정하거나 세포의 수를 셈으로써 측정하였다.

세포 성장 억제의 백분율은 상기 고체 연골 추출물이 상기 두 개의 셀 라인의 세포 성장을 적량-의존적 방법으로 억제시킬 수 있음을 지시한다.

도 2은 상기 50 및 100㎎/ml의 고체 추출물이 처리 3일 후 상기 셀 라인들에서 명백하게 이상증식을 일으킴을 보여준다.

도 3은 10^-12내지 10^-9M의 에스타라디올의 존재 하에서, 처리된 세포들이 상기 호르몬 투여 속도에 의해 자극받지 않음으로써 조절 세포처럼 반응함을 보여준다. 그러나, 상기 1nM의 조절 세포들은 강하게 자극받으며, DNA 농도는 10^-7M의 에스트라디올의 존재 하에서 3.75㎍ (에스트라디올이 없는 대조구는 0.69㎍)에 달하였다. 30 및 50mg/ml의 동결건조물로 처리된 세포에서, 최대 자극에서 측정된 DNA는 각각 1.9와 1.8㎍이다. 도 3은 에스트라디올에 대하여 상기 처리된 세포의 친화도 상수 (Km)는 각각 30 및 50mg/ml의 존재 하에서, 대조구 세포의 Km 값 (11.7nM)보다 3 및 16배 더 높았다. (31.3 nM 및 174.0 nM). 이는 고체 연골 추출물이 존재할 때 더 높은 농도의 에스트라디올이 상기 세포의 동일한 성장을 성취하는데 필수적임을 의미한다. 그러므로, 상기 추출물은 최대 반응 (이들의 90%억제)을 감소시키고, 에스트라디올에 처리된 세포의 친화도 상수를 증가시킨다.

[In vivo 검정법]

[DMBA 유도된 쥐의 유선 암 모델]

a. 테스트 시스템의 설명: 400 마리의 40일된 암컷 Sprague-Dawley 쥐 (Charles River Co., St-Constant, Quebec에서 구입)를 12일간 그들의 환경에 적응시켰다. 그 시점에서, 20mg DMBA/1ml 콘 오일 (corn oil, 9,10-디메틸-1,2-벤즈안트라센; Sigma Chemical Co.로부터 구입)을 위관영양법 (gavage)으로 투여하였다. 상기 처리 후 3달에, 전개된 유선 암을 가진 240마리의 쥐를 선택하여 2 군으로 나누었다. 제 1 군은 5개의 서브-군으로 이루어졌다. 상기 처리된 군의 쥐들은 8주 동안 3ml의 물에 상기 동결건조 추출물의 농도를 증가시키면서 매일 일정량을 준 반면, 대조 군은 동일 부피의 물을 주었다. 제 2군은 4개의 서브-군의 쥐들로 이루어졌다. 상기 처리된 군의 쥐들도 또한 액체 추출물의 존재 또는 부재 하에서 3ml의 물내에 10주 동안 매일 일정량의 상기 동결건조물을 준 반면 대조 군은 동일 부피의 물을 주었다. 3000mg/Kg/일의 상기 동결건조물 및 3ml의 상기 액체 추출물로 처리된 제 2 군의 쥐들의 한 서브-군에만 또한 적은 량의 상기 액체 추출물(1ml의 물 내의 약 8mg의 단백질)의 복강내 (i.p.) 주사로 주었다. 쥐들의 무게는 두 실험의 초기에 151-175g이었고, 먹이와 물인 ad libitum을 쥐에게 주었다. 제 1군의 쥐들은 0.9cm의 평균 지름을 갖는 종양을 가진 반면, 제 2군의 쥐들은 0.6cm 평균 지름을 갖는 종양을 가진다.

b. 항-종양 활성도: 상기 결과는 하기 표에 요약된다.

상기 결과들은 상기 동결건조물이 위장 관내에 흡수되며, 종양 전개를 느리게 하는 활성 성분을 함유하고 있음을 나타낸다. 상기 억제는 상기 종양 세포에 대한 직접적인 효과 또는 종양 성장을 방해하는 항-혈관형성 매개 효과일 수 있다.

상기 액체 추출물은 또한 그의 투입이 약 6%의 종양크기의 부가적인 감소의 원인이 되기 때문에 억제 활성을 포함한다.

상기 결과는 또한 상기 동결건조물이 잔류 수용성 활성 성분을 함유하거나 및/또는 수용성이 아닌 활서 성분을 함유할 수 있음을 제시한다. 그러므로, 최종적으로 우연히, 만일 상기 수율이 여전히 향상될 수 있다면, 상기 펠렛은 수용성 성분을 최대로 회수하도록 수용성 용액 내에서 재-추출될 수 있다.

c. 조직 병리학: 상기 고체 연골 추출물의 무-독성을 평가하기 위해, 상기 in vivo 실험에서 사용된 동물들을 참수로 희생시키고, 하기 조직들을 분석하였다: 간, 폐, 신장, 심장, 뇌, 근육 및 유선. 상기 조직들로부터 지방을 제거시킨 후, 이들을 2일 동안 Bouin 액체에서 고정시켰다. 에탄올 내에서 탈수시킨 후, 상기 고정된 조직을 파라핀 (paraffin)내에 삽입시켰다. 이들의 단면을 얻어서, 유리 슬라이드 위에 놓고, 헤마톡실린 (haematoxylin)으로 염색시키고, 현미경으로 관찰하였다.

상기 조직 병리학적 검사는 가장 큰 투입량의 고체 추출물을 단독으로 사용할 때 또는 상기 액체 추출물과 혼합한 고체 추출물을 이용할 때 (나타내지 않음) 어떠한 유해한 효과도 관찰되지 않음을 알 수 있었다.

이는 상기 동결건조물 및 액체 추출물이 선택적인 종양 크기 억제 활성을 가짐을 제시한다.

유선 종양 (도 4a 및 b 참조)에서, 혈관의 면적상의 중요한 감소 (55%)가 고체 및 액체 추출물을 받은 쥐들의 군에서 관찰되었다 (도 5).

상기 종양 크기의 감소는 그의 혈관화의 중요한 감소, 종양 세포상의 직접적인 효과에 기인하거나 양 현상의 결합에 의해 기인될 수 있다. 상기 추출물의 항-혈관형성 효과는 상기에 잘 도시되어 있다. 상기 직접적인 형성부전증 효과는 in vitro에서 호르몬-의존 세포 상에서 관찰되었고, 이는 in vivo에서 여전히 확인되었다.

상기 언급된 결과에서 상기 액체 추출물이 ZR75-1 세포상의 상기 고체 연골추출물의 효과를 능가하는 증가 효과를 가진 것으로 나타났기 때문에, 이들 성분을 더욱 조사하였다.

[액체 추출물]

[In vitor 검정법]

[종양 셀 라인]

상기 고체 추출물 (상술됨)로 관찰된 상기 형성부전성 활성도가 존재하는지 검사하기 위해 몇몇 종양 셀 라인을 액체 연골 추출물의 존재 하에서 성장시켰다.

간략하게, 세포들을 96 웰 판에 넣고, 배양액 (각 세포 타입에 대해 특이적임; 예를 들면, MCF-7 세포는 상술된 바와 같이 성장됨) 내에서 다양한 농도의 액체 추출물의 존재 또는 부재 하에서 성장시켰다. 3 내지 5일간 배양한 후 MTT 검정법을 이용하여 세포 증식을 측정하였다. 상기 종양 셀 라인은 다음과 같다:

CHANG: 종양성 간세포

Hep-G2: 종양성 간세포

A2780: 난소 선압종 세포

MCF-7: 유선 선암종 세포 (에스트로겐 의존성)

MCF-7-ADR: 유선 선암종 세포 항 아드리아마이신 (Adriamicin resistant)

상기 액체 연골 추출물은 모든 종양 셀 라인에서 항증식성 활성도를 보였다. MCF-7 및 A2780 세포상의 8.5mg/ml의 농도 (액체 추출물의 건조중량/배양액 ml)에서 각각 가장 강력한 억제, 50 및 80%를 얻었다.

비-동결건조된 및 동결건조된 액체 연골 추출물은 종양 세포 증식 억제력 면에서 동등하다. 이는 상기 억제 인자(들)은 상기 농축 절차에 의해 변성되지 않음을 지시한다.

[1차 배양된 세포]

a. 신 혈관성 녹내장으로부터 얻은 섬유 아세포: 종양 세포상의 특정 활성도를 평가하기 위해, 울트라필터법 후 얻어진 통과물을 정상 섬유 아세포인 간엽 원세포인 인간의 TENON 섬유 아세포 (HTF)상에서 테스트하였다. 두명의 환자 (한명은 신혈관성 녹내장인 NVG를 앓고, 다른 한명은 일차 개방각 녹내장인 POAG를 앓음)로부터 얻은 HTF만이 사용되었다.

2차 배양 및 HTF의 유지: 37℃에서 5-10분간 0.5ml의 0.05% 트립신/0.5mM EDTA (Gibco 610-5300 AG)로 각 전면배양을 세척하고 탈리 (detaching) 시켰다. 그 후, 트립신/EDTA를 중화시키기 위해 15% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 1.5ml의 DME/F-12 배양액을 첨가시켰다.

연화시키고 25㎠ T-플라스크 (flask)로 옮기고, 10% (FBS)를 함유하는 부가적인 배양액을 첨가시켜 상기 세포를 연합시켰다. 전면배양 후, 상기 HTF를 75㎠ 및 결과적으로는 180㎠ T-플라스크로 옮겼다. 충분한 세포가 얻어졌을 때, 하기 기술된 실험을 위해 일부 세포를 이용하였고, 부가적인 실험에 대한 동일한 결과를 얻기 위해 다른 세포들을 순간적으로 냉각시켰다.

실험적 방법: 전면배양이 되었을 때, 두 개 또는 세 개의 동일한 180㎠ T-플라스크내에 성장시킨 한 환자로부터 얻은 세포를 상술된 방법에 의해 분해시켰다. 짧고 낮은 속도의 원심분리 후, 256-채널라이저 (channelyzer)가 장착된 ZMI 콜터카운터 (Coulter Counter) 216013로 이들을 셈하였다.

모든 in vitro 실험을 위해, 1% FBS를 함유하는 1ml의 DME/F-12 배양액내에서 각각 16mm 접시 및 12-웰 판으로 약 5만개의 세포들을 주입시켰다. 공급한 후 17 시간후, 1% FBS로 보충된 1ml의 신선한 동일 배양액 ("절대" 대조구)을 첨가시켰다. 실험 설계 (상기 및 하기 참조)에 의존하여, 상기 1% FBS 배양액에 GF (성장 인자)를 보충 또는 보충시키지 않거나, 상기 액체 연골 추출물을 보충시키거나 보충시키지 않고, 멸균필터시켰다. 이 시점 (0 일)에서, 평판배양 효율 (95%와 같거나 그 이상이어야 함)을 결정하기 위해 세포의 일부분도 셈하였다.

실험 시작 48 시간 후, 상기 세포를 다시 담그고, 분해시키고 셈하였다. 상기 세포의 수는 상기 "절대" 대조구에서 얻어진 백분율로서 표현되었다.

각각 1% 또는 5% FBS를 함유하는 각 "절대" 대조구 및 각 실험 군은 1% FBS로 보충되고, 각각 GF 또는 세 번 중복 시료로 이루어진 액체 연골 추출물로 보충되었다.

동시에 한명 또는 두명의 환자의 세포 상에서 각 실험을 수행하였고, 적어도 두 번 반복하였다. 상기 실험에서, GF들인 돼지의 혈소판-유도 성장 인자(pPDGF) 및 인간의 재조합 기초 섬유 아세포 성장 인자 (hr bFGF) (Farmitalia Carlo Erba, Milan, 이태리의 P. Brazeau로부터 기증)를 1% FBS내에서 각각 10 내지 100ng/ml의 농도로 첨가시켰다. 실험 시작 48 시간 후, 상기 세포를 트립신-EDTA로 분산시키고, 콜터 카운터로 셈하였다. 하기 나타난 모든 세 번 중복 값(세로 1, 2 및 3)들은 웰 당 세포수의 20분의 1이다.

결과: 상기 결과는 도 6에 요약한다. 53세의 노인(남)의 녹내장으로부터 HTF를 얻었다. PDGF 및 bFGF와 같은 성장 인자들은 HTF에 대해 자극 활성 (^*P<0.02,^**P<0.01; Student-Fisher Test법으로 측정함)을 보인 반면, 상기 세포들을 액체 연골 추출물 (1 Kg/2L)의 존재 하에서 성장시켰을 때에는 어떠한 효과, 음성 또는 양성도 없었다. 이는 종양 세포에 대한 상기 액체 연골 추출물의 형성부전성 활성도는 보편적이지 않으며, 섬유 아세포의 성장에 어떠한 영향도 미치지 않음을 지시한다. 동일한 연골 추출물도 또한 또다른 형태의 섬유 아세포인 HSF (인간 피부의 섬유.아세포; 나타내지 않음)에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 테스트되지 않았을 지라도, 상기 고체 추출물도 또한 정상 세포상에 어떠한 영향도 미치지 않음을 추측할 수 있다.

b. 인간의 제정맥으로부터 얻은 내피 세포 (HUVEC): Jaffe 등 (1973)에서 기술된 바와 같은 콜라게나아제-조절된 소화로 HUVEC를 추출하였다. 네 번째 절차 (각 절차에서 트립신-EDTA) 전에 순수한 내피세포를 사용하였다. 인자 VIII로 라벨 (label)되고, 디-아세일 (di-aceyl) LDL을 삽입시키는 이들의 능력에 대해 상기 세포들의 질을 분석하였다.

내피 세포를 젤라틴 (gelatin)으로 코팅한 멸균 접시로 25000 세포/㎠의 밀도로 평판배양시켰다. 24시간 후 및 격일로 배양액을 교환하였다. 배양 168시간 후, 각 배양액에 BrdU (10mM 최종)를 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션 시켰다. 그 후, 짧은 트립신-EDTA 소화로 상기 세포들을 떼내고, BrdU의 ELISA 검출을 가능하게 하기 위해 96 웰 판으로 옮겼다. Boehringer Mannheim kit 및 방법으로 ELISA를 수행하였다. 한 대조구는 배경의 기본 수준을 결정하기 위해 세포없이 수행되었다. 또다른 대조구는 상기 액체 연골 추출물이 세포의 부착에 영향을 주는지를 구별하기 위해 인큐베이션 기간 후반에 상기 배양액내의 DNA 함량을 측정함으로써 수행되었다.

또한, 세포 증식은 페트리 접시 (petri dish)에 존재하는 DNA의 양으로 평가되었다. 각 실험은 세 번 중복으로 수행되었고, 통계 분석이 비교를 위해 수행되었다. 배양액은 매일 교환되었다. 배양 168 시간 후, Na-시트레이트 (Citrate)-SDS 용액으로 세포를 용균시키고, Hoescht 33358로 인큐베이션시켰다. 분광형광계 (spectrofluorometer)로 365nm에서 시료를 읽었다.

또한, 최종적으로 페트리 접시에 존재하는 세포의 양은 에시드 포스파타제 (acid phosphatase) 활성도를 측정함으로써 평가되었다. 각 실험은 세 번 중복하여 수행되었고, 비교를 위해 통계 분석이 수행되었다. 상기 효소의 활성도는 페트리 접시내의 내피 세포의 수와 강한 상관관계를 보였다(BrdU 삽입 및 Hoescht 라벨링; 나타내지 않음). 에시드 포스파타제 활성도는 Sigma Chemical Company로부터 구입한 키트 (kit)로 측정되었다 (제조 방법을 약간 변형하여 측정됨).

상기 결과는 상기 액체 연골 추출물로 내피 세포 증식이 억제됨을 나타낸다 (도 7). 얻어진 상기 ED50은 약 90㎍의 액체 추출물이다 (상기 액체 추출물에 존재하는 약 1.5mg 건조중량과 동일).

c. 각막세포: 액체 연골 추출물은 프로테인 키나아제 C (Protein Kinase C, PKC)가 상기 세포의 전달 경로의 공지된 작용물질 (agonist)인 트리포볼 아세테이트 (triphorbol acetate, TPA)에 의해 활성화된 각막세포로 테스트되었다. 정상인간의 표피성 각막세포는 1차 배양으로 형성되었다 (Matsui 등 (1992)의 J. Invest. Dermatol. 99:565-571). 배양은 표피의 성장 인자 (10ng/ml), 인슐린 (5㎍/ml), 하이드로코르티손 (hydrocortisone, 0.5㎍/ml) 및 소의 뇌하수체 추출물 (70㎍/ml)을 변형된 MCDB 153 형태로 함유하는 혈청-프리 정의된 배양액 (KGM)내에서 이루어졌다.

각막세포를 70% 전면배양까지 성장시키고, 신선한 배양액으로 재공급한 후 48시간에 200ng/ml의 TPA의 2㎍/ml의 DMSO를 어떠한 부가적인 재공급 없이 처리하였다. 다양한 농도의 액체 연골 추출물을 상기 배양액에 첨가하거나 첨가하지 않았다. 상기 결과는 각막세포 증식에 대한 상기 액체 추출물의 어떠한 효과도 보이지 않았다; 또한 증식의 TPA-유도 억제에 대한 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 그러나, 액체 연골 추출물은 TPA-유도 각막세포 분화를 억제할 수 있었다 (도 8). 상기 각막세포의 분화 수준은 TPA에 의해 5배 증가되었다. 액체 연골 추출물은 그 자체로는 각질화된 표면 형성에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 그의 존재는 TPA-유도 각질화된 표면 형성을 약 60% 이상 억제하였다.

최근 공보들에서는 PKC 활성화가 정상 각막세포를 염증의 매개자인 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8)의 증가량을 생산한다는 것이 발표되었다 (Chabot-Fletcher 등 (1994)의 J. Invest. Dermatol. 103: 509-515). 또한, 건선 각막세포는 매우 많은 양의 IL-8을 생산하여서, 건선 플라크 (plaque)에서 신혈관형성화를 더욱 촉진시킨다 (Nickoloff 등 (1994)의 Am. J. Pathol. 144:820-828). 또한, 다른 성장 인자 및 인티그린 (integrin) 들이 포함되며, 이는 관련될 수 있는 표적 분자 군 (I1-1, TNF 등)을 확장시키는데 중요하다. 본 발명자들은 TPA-유도화가 건선 각막세포를 모방하는지는 모른다. 만일 그렇다면, 상기 결과는 연골이 in vivo에서 정상 각막세포에 아무런 영향을 주지 않는 반면, 건선 (또는 활성화된) 각막세포에는 영향을 줄 수 있음을 제시한다. 건선 플라크 또는 각막세포에서 뿐만 아니라 TPA-활성 각막세포에서 상기 액체 연골 추출물에 의한 IL-8의 생성의 억제도 증명중에 있다. 감소된 IL-8 수준 및/또는 기타 성장 인자들은 상기 추출물의 항-염증성 및 항-혈관형성 효과를 설명하는데 흥미로운 가능성이다.

[콜라게나아제 검정법]

a. 검정 1: 본 검정법은 Knight 등 (1992)의 FEBS Let. 296, 263-266에 기술된 것이다. 상기 방법은 메탈로프로테이나아제 (metalloproteinase)의 활성 자리를 닮은 형광유전적 펩티드 기질 (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-HN₂)를 이용한다. 상기 기질은 한쪽 끝에 형광 그룹 (Mca)을 가지며, 다른 한쪽 끝에 형광중단 그룹 (Dpa)을 가진다. 상기 본 기질에서, 상기 중단 그룹은 형광을 효과적으로 차단한다. 상기 기질의 효소 절단시 테스트 튜브 내에서 형광이 증가한다.

콜라게나아제 활성화는 Weingarten 등 (1985)의 Biochemistry 24, 6730에 기술되어 있다. 1㎍을 50mM Tris-HC1, 10mM CaCl₂100㎍에 용해시킨다. 트립신 (1mM HC1내) 용액 10mg/ml에서 1㎍를 첨가하고, 20℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 10㎍의 Soybean 트립신 억제제 (SBTT, 5mg/ml)를 첨가시킴으로써 활성화를 중단하였다. 각 마이크로튜벳 (microcuvette)에 다음을 첨가하였다:

25 또는 50㎍의 억제제^*(물로 50㎍까지 제조됨);

40㎍의 50mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 10mM CaCl₂, pH 7.5;

8㎍의 활성화된 콜라게나아제^**(최종 67ng); 및

2㎍의 기질 (DMSO내 1mM 원용액, 최종 20μM).

형광도는 λex = 328nm λem = 393nm에서 측정되었다.

^*: 상기 억제제는 대조구 물질 (EDTA, 오르쏘-페난트롤렌과 같음) 또는 액체연골 추출물로 정의된다.

^**: 상기 콜라게나아제는 인간의 타입 I, 타입 IV 및 앰피비안 태드폴 (amphibian tadpole) 콜라게나아제로 정의된다; 겔라티나아제 (gelatinase)도 또한 사용되었다.

b. 검정 2: 본 검정은 Welgus 등 (1979)의 JBC 256, 9511-9516에 기술되어 있다. 상기 방법은 콜라게나아제 타입 I (MMP1)에 의한 절단을 검사하기 위해 SDS-PAGE를 이용한다. 콜라게나아제 타입 1은 원 콜라겐 분자에 단일 절단을 만들어서 원 콜라겐의 75% 및 25% 크기의 두 개의 단편을 제공한다. 몇 시간동안의 절단 후, 상기 반응은 SDS-PAGE에 의해 상기 기질로부터 생성물을 분리함으로써 관찰된다. 절단 대 비절단 콜라겐의 비율은 코마시 블루 (Comassie blue) (또는 실버 스테인 (silver stain))로 상기 겔을 염색시킨 후 가시적으로 평가된다.

21ng의 활성화된 콜라게나아제 (검정 1 참조)를 최종 부피 20㎍로 소 피부콜라겐 (Worthington) +/- 억제제 5㎍에 첨가시켰다. 반응을 35℃에서 16 시간동안 인큐베이션시킨 후, 40mM EDTA와 함께 SDS-PAGE 시료를 첨가시킴으로써 중단시키고, 가열하고, 8% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)상에 점적하였다.

c. 적량-감응 억제: 액체 연골 추출물로 얻어진 결과는 양 검정법과 함께 콜라게나아제 활성의 적량-감응 억제를 보였다. 도 9는 검정 1로 얻어진 결과는 나타낸다. 상기 ED50은 30㎕의 액체 추출물 (또는 30㎕의 액체 추출물 내에 존재하는 0.51mg 건조중량)로 얻어진다.

[In vivo 검정법]

[태아의 혈관형성화 테스트 (EVT)]

a. 상기 테스트-시스템의 정의: 병아리 태아의 정상적인 발육은 태아를 발육시키는 난황 (계란 노른자)으로부터 양분을 운반하는 난황 막내에 위치한 외부 혈관 시스템의 형성과 관련한다. 난황막상에 위치할 때, 항-혈관형성 물질은 상기 난황막에서 발생하는 혈관 발육을 억제시킬 수 있다. 난황막에의 접근을 촉진시키기 위해, 병아리 태아를 멸균 배양 박스 (페트리 접시)에 옮기고, 습도- 및 온도-조절 인큐베이터에 넣었다. 태아는 그 후 상기 ex ovo 조건하에서 며칠간 발육할 수 있다.

액체 연골 추출물의 등분액을 메틸셀룰로우즈 (methylcellulose) 용액과 혼합시키고, 공기-건조시켜 얇은 디스크 (disc)를 만들었다. 상기 공정 동안에 상기 액체 연골 추출물 내에 존재하는 내인성 NaCl은 농축하고, 디스크당 양이 25㎍을 초과할 때 상기 EVT로 저지시킨다. 그러므로, 상기 액체 추출물을 담수화시키는 것은 필수적일 수 있다; 100 Da보다 작게 절단된 막에 의한 투석 또는 전기투석 방법이 가능하다.

메틸셀룰로우즈는 상기 액체 추출물이 서서히 분산할 수 있는 불활성 매트릭스를 형성한다. 상기 액체 추출물을 함유하는 메틸셀룰로우즈 디스크를 상기 혈관형성 공정이 여전히 활성인 난황 막의 혈관 둘레의 외부 경계 상에 놓는다.

디스크-함유 액체 연골 추출물의 인접 혈관 발육에 미치는 효과는 항상 디스크-함유한 물 더하기 동등량의 NaCl의 효과와 비교된다. 상기 ex ovo 성장 공정의 0일 또는 1일에 상기 디스크를 상기 태아의 난황 막에 놓는다; 이 때, 주 혈관의 초기만이 상기 난황을 침입한다. 그 후, 혈관화가 평가될 때까지 (약 24 시간) 상기 태아를 배양 조건하에 놓는다. 물- 및 액체 추출물-함유 디스크는 항상 동일 태아의 난황 막상에 동시에 첨가된다. 대조구와 상어 연골 추출물을 비교할 때 상호간-개개의 변화를 최소화시키기 위해 상기 태아의 세팔로-카우달(cephalo-caudal)축에 대하여 대칭 형태로 모든 디스크들을 배치시킨다.

b. 항-혈관형성 활성도: EVT는 양성 대조구 또는 액체 연골 추출물로서 다른 농도의 프로타민 (protamine, 37, 75 및 150㎍)을 이용하여 수행되었다. 배양 1일 후, 상기 디스크에 의해 덮여진 면적에서의 혈관화 수준은 통상적인 감정 형태로 한 쌍의 과학자들에 의해 등급화되었다. 상기 디스크들의 배치를 촉진시키기 위해, 상기 난황 막상의 침전 직후 검정 0-고리를 그 주위에 놓는다. 상기 EVT-테스트에 대한 평가 범위는 1-2-3 스코어 (score)에 기초된다: (스코어 = 3) 반대 수평상 쿼드런트 (quadrant) 또는 대조구 태아의 일치 쿼드런트에 비교될 때의 정상 혈관화; (스코어 = 2=) 혈관이 상기 디스크에 의해 덮여진 면적에 나타나나 중간 경로에서 사라짐. 그 경로는 제외하고 상기 디스크에 의해 덮여진 면적에 걸친 주 혈관들은 명백히 영향받거나 측부 측쇄 밀도에서의 감소가 관찰된다; (스코어 = 1) 상기 디스크에 의해 덮여진 면적에서 어떠한 혈관도 관찰되지 않거나 이들이 경로가 상기 디스크에 의해 덮여진 면적으로부터 이탈되는 방식으로 빠르게 이탈된다. 혈관들은 이들이 뒤쪽을 관통하거나 이를 넘어선 경우를 제외하고는 상기 디스크에 의해 덮여진 면적을 초과하여 성장하지 않는다.

프로타민 (나타내지 않음) 및 액체 연골 추출물 (도 10)과 함께 적량-감응억제가 얻어졌다. 상기 ED50은 약 170㎍의 건조 액체 추출물 (상기 액체 추출물내에 존재하는 건조 중량)로 얻어졌다. 동일한 달걀에 놓은 두 개의 디스크 (물 및 연골 추출물) 사이의 차이점의 의미를 비교하는 데 윌콕손-지정 (Wilcoxon-signed) 순위 통계 테스트가 이용되었다.

[쥐의 유방의 선암종 모델]

a. 상기 테스트-시스템의 설명: 상기 액체 연골 추출물의 항-종양 능력은 쥐의 유방의 선암종 모델(동종이식)로 테스트되었다. 상기 테스트-시스템은 1×10⁶DA3 세포를 BALB/C 쥐에 피하주사 접종하는 것으로 이루어진다. 상기 세포들은 7,12-디메틸벤즈안트라센 (DMBA)에 의해 유도된 쥣과 (murine) 유방의 선암종으로부터 유래한다. 상기 모델은 Daniel Medina에 의해 만들어졌다 (J. Natl. Cancer Inst. (1969) 42: 303-310; ibid. (1976) 57: 1185-1189). 접종된 세포들은 in vivo에서 서서히 성장하였고, 낮은 전이성 예후를 갖는 충실성 종양을 형성한다.

DA3 세포는 1mM 머켑토에탄올, 1M Hepes 완충액, 100mM Na 피루베이트, 200mM L-글루타민, 10mM 불필수 아미노산, 1M 비타민, 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 RPMI 1640 배양액 내에서 37℃에서 5% CO₂와 함께 유지되었다. 종양 유도를 위하여, 전부 갖춘 배양액 내에서 상기 세포들을 70% 전면배양까지 성장시킨 후, 트립신-EDTA 용액을 이용하여 수집하였다. 그 후, 상기 세포들을 원심분리시키고, 인산 완충액으로 3번 세척하고, 1×10⁶세포/0.1ml의 희석액으로 재현탁시켰다.

DA3-세포 접종 쥐 (n=15)들은 상어 연골 액체 추출물 또는 플라세보 (placebo)(살린 용액)를 매일 경구투여 받았다. 상기 처리는 DA3 세포 접종 후 7일에 시작하였다. 다양한 농도의 액체 추출물이 테스트되었다. 투여된 액체 추출물의 양은 상기 액체 추출물에 존재하는 건조 중량으로 표현된다. 상기 테스트 제품은 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조되었다. 액체 추출물은 동결건조되고, 다양한 농도 (0.2, 1.5, 3, 10 및 20mg / 200㎍)로 물에 재현탁되었다. 매일 투여된 최종 량은 무게의 10, 75, 150, 500 및 1000mg/Kg이었다.

b. 항-종양 활성도: 결과로 종양 전개의 최대 저지가 약 75mg/Kg의 액체 추출물의 투여시 얻어졌음을 보인다 (도 11). 흥미롭게도, 더 많은 양에서는 더작은 능력을 보였다. 이는 상기 액체 추출물이 종양 전개를 억제할 수 있는 물질 및 상기 종양 억제제의 활성을 억제시킬 수 있는 다른 물질을 함유하고 있음을 제시한다. 이러한 현상은 이미 생물학적 약물에 대하여 보고된 바 있다.

최종적으로, 상기 액체 추출물의 복강내 투여는 종양 성장의 억제를 위한 최대 유효량을 매우 감소(×75)시킨다 (도 12).

c. 독성: 모든 처리에서 무게 손실 또는 액체 추출물-관련 치사는 없었다. 상기 처리 기간동안 쥐의 일간 검사를 통해 관찰된 어떠한 증상 또는 특성 변화도 없었다. 상기 처리 말기에, 쥐들을 희생시키고, 모든 기관의 전체 상태를 자격있는 병리학자에 의해 분석하였다; 비정상은 관찰되지 않았다. 혈액 분석은 어떠한 비정상 표시도 나타내지 않았다.

d. 조직병리학: 종양 조직병리학에서는 플라세보- 또는 액체 추출물-처리된 쥐들로부터 얻은 종양 사이에 어떠한 큰 차이도 나타나지 않았다. 종양의 생존정도는 모든 군에서 매우 높았다. 많은 기관 (폐, 간, 신장, 췌장, 위, 십이지장, 난소, 유방, 뇌 및 심장)의 분석에서도 상기 액체 추출물과 연관될 수 있는 어떠한 특이한 변화도 나타나지 않았다.

[쥐의 과민증 모델 (CHS)]

a. 테스트 시스템의 설명: 디나이트로플루오로벤젠 (dinitrofluorobenzene, DNFB)은 BALB/C 쥐에서 강한 염증 반응을 유도할 수 있는 강력한 피부 자극제이다. 0일에, 10마리의 쥐들을 DNFB로 이들의 복부를 칠함으로써 자극하였다. 자극 후, 5일에 10㎕의 DNFB를 칠해줌으로써 쥐들의 오른쪽 귀를 자극하였다. 조직자극 목록으로서 노출후 몇몇 시간에 걸쳐 귀의 부어오름을 측정하였다.

상기 액체 연골 추출물은 그것이 쥐에서 DNFB에 대한 염증 반응을 감소시킬 수 있는 검사하기 위해 테스트되었다. 배양액 단독 (0.2ml의 살린 용액; 쥐 5마리) 또는 상기 액체 추출물 (20mg/ml의 건조 중량을 포함하는 0.2ml의 액체 추출물; 쥐 5마리)을 자극 전 4일에 3일 연속적으로 경구투여하였다.

b. 항-과민증 활성도; 귀 자극후 1일에, 배양액 단독으로 처리된 쥐들은 8.2mm 두께까지 귀의 부어오름을 보였다. 흥미롭게도, 연골 액체 추출물로 처리된 쥐들은 단지 2.8mm의 귀 부어오름을 보였다. 이러한 데이터들의 통계적 의미는 p값 < 0.001이다. 이러한 결과는 액체 연골 추출물이 강력한 염증 억제제임을 나타낸다.

[활성 분자를 함유하는 액체 분획 구하기]

[In vitro 검정법]

[종양 셀 라인]

a. 테스트-시스템의 준비: 상어 연골을 수집하여 상술된 바와 동일한 공정을 거쳤다. 원심분리 후, 상기 펠렛을 버리고, 상등액을 상술된 바와 같이, 0.22㎛필터 상에서 멸균필터로 울트라필터시켰다. 그렇게 얻어진 액체 추출물을 다른 방법에 의해 더욱 분획하였다. 종양 셀 라인을 상술된 바와 같이 성장시켰다.

b. FPLC 조건: 칼럼 (column): Hiload 26mm×60cm Sephacryl S-300. FPLC 시스템: Pharmacia로부터 구입. 상기 칼럼에 점적시키기 전에 모든 시료들을 0.22㎛ 필터로 걸렸다. 용출 완충액은 필터되고, 15분간 디게이즈 (degazed)된 인산 완충 살린 (PBS)이었다. 점적된 시료의 부피는 통상적으로 3.2ml이었다. (13ml까지일 수 있음). 유속은 1ml/분이었다. 10ml 분획을 수집하였다. 용출된 성분은 이들의 U.V. 흡광 (280nm)으로 확인되었다. Sigma로부터 구입한 MW-GF-1000 보정 키트를 이용하여 보정 챠트 (chart)를 얻었고, 상기 보정 시료는 분석하기 위한 점적된 시료와 동일한 부피를 가진다 (3.2ml). 시료의 용출 부피는 보정 키트의 화합물의 분자량 대 상기 칼럼의 보이드 (void) 부피를 뺀 이들의 용출 부피를 도시함으로써 추정되었다. 상기 보이드 부피는 덱스트란 블루 (dextran blue, 분자량 = 2,000,000)를 주사함으로써 얻어진다.

ZR-75-1 세포에서 이들의 활성도에 대하여 상기 분획들을 테스트하였다. 대상군의 분획들을 확인하였고, 더욱 연구하여 이들의 특성을 확증하였다 (하기 참조).

상기 통과물의 활성 성분의 부가적인 특성은 Rotofor (Biorad 170-2950; 하기 등전초점화 (isoelectrofocalization) 참조) 및 10-30 kDa, 30-100 kDa 및 100 kDa 이상의 분자량의 분획을 얻기 위한 다른 절단 값의 Amicon 필터 상에서 수행되었다.

c. 등전초점화 조건: 상어 연골 액체 추출물 (통과물 1Kg/L의 46ml)의 준비로 Spectra Pore #7 MWCO 3500 kDa 막 (spectrum 132110)을 사용하여 4℃에서 5% 글리세린 (glycerin)을 함유하는 4리터의 순수한 물에 대하여 하룻밤동안 투석시켰다. 상기 투석된 용액을 2.75ml의 엠폴라이트 (ampholyte, Pharmacia #80-1125-87) pH 3.5-10.0 및 0.5g CHAPS (Sigma C3023; 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane-sulfonate)와 혼합하였다. 상기 부피는 55ml까지 순수한 물로 채워졌다. 상기 용액을 Rotofor상에 점적하였다. 등전초점화는 4℃에서 12 와트 (3000 xi 파워 서플라이 (power supply), Biorad 165-0554)의 계속적인 전력에서, 상기 온도의 유지를 위해 계속적으로 물을 순환시키면서 수행되었다. 상기 분리의 초기에, 전위는 380볼트였고, 전류는 31mA이었다. 상기 전류가 안정화될 때 (14mA), 상기 전위는 870볼트로 나타났다. 상기 등전초점화를 중단시키고, 20개의 분획물을 수집하였다.

상기 단백질의 확인은 전기영동 겔상에서 그들의 분자량을 추정함으로써 이루어졌다 (Laemmli, U. K. (1970) Nature (Lond.) 227:680).

상기 분획들은 점적 완충액 (Laemmli 참조)으로 4배 희석되었고, 8㎕ 등분액이 비-환원 조건으로 전기영동에 제공되었다. 도 13은 각 분획 및 등전초점화전 물질의 전기영동 프로파일을 나타낸다.

모든 분획들은 0.22㎛의 구멍을 갖는 멸균 Millipack-60 필터를 통과시킴으로써 충류 후드 (laminar flow hood)하에서 멸균-저장되었다.

d. 종양 세포에 대한 억제 활성도: 상기 분획들의 단백질 함량은 Lowry 적량법에 의해 평가되었다. 1Kg/2L의 용액 (통과물 리터 당 천연 연골 중량으로 표현됨)은 배양액내 다른 농도에서 ZR75-1 세포상에서 테스트되었다. 상기 결과는 하기에 요약된다:

제 1 테스트: Rotofor 분획상에서 수행되었다 (상기 통과물은 증발에 의해 농축됨). 단백질 확인:

제 2 테스트는 FPLC 분획상에서 수행되었다 (통과물들은 증발에 의해 농축되었다):

제 3 테스트는 Amicon 분자 필터 상에서 얻어진 100㎕ 분획들 상에서 수행되었다:

FPLC 분획 6 및 7은 매우 작은 분자량의 활성 성분을 함유한다 : 0.1 내지 2.5 kDa.

상기 분획들의 형성부전성 효과는 상기 동결건조물로 관찰된 것보다 33000배까지일 수 있다.

e. 용출물의 활성 성분의 부가 확인: 활성 분획들 (ZR75-1 세포에 대해 테스트됨)은 FPLC 및 상술된 Rotofor 방법을 이용하여 100mm 지름 × 30cm 길이의 Superose-12 칼럼 상에서 동일한 통과물 (1kg/L)로 출발한 또다른 타입의 정제법에 의해 결정된, 하기 분자량 범위에서 회수되었다. 1ml/분의 유속이 선택되었다. 1ml의 45개의 분획이 수집되었다.

[콜라게나아제 검정법]

a. HPLC 크로마토그래피: 980ml 액체 추출물 시료 (DUP)를 접선 흐름 울트라필터 유니트 (tangential flow ultrafiltration unit) (PELLICON, Millipore)내의 10 kDa 절단 막을 통하여 필터시켰다. 상기 유니트를 먼저 1L의 물에 담궜다. 최종 생성물은 480ml의 > 10 kDa 분획 및 1.8L의 < 10 kDa 분획이었다. 상기 < 10 kDa은 180ml (<10-10X)까지 콜드-핑거 (cold-finger) 증발법에 의해 농축되었다. <10-10X의 100㎕ 등분액 8배가 CDC-S 헥실 (hexyl), 5㎛ HPLC 칼럼 (25×0.94cm)상으로 점적되었고, 먼저 100% H₂O로 4ml/분에서 용출된 후, 8.5ml/분에서 100% MeOH로 용출되었다. OD₂₁₄피크 (peak)와 일치하는 분획을 수집하였다.

다섯 개의 분획들을 수집하였다 (도 14): 분획1, 분획2, 분획3, 분획4 및 분획5. 처음 세 개의 분획들은 적어도 주 피크를 포함한다.

b. 항-콜라겐분해 활성: 결과로부터 분획1은 콜라게나아제를 억제하는 가장 활성의 분획임을 알 수 있다; 모든 활성 분획들에 저 수준의 활성이 존재한다: 검정 1은 도 14에 나타낸다; 검정 2는 하기 표에 나타낸다:

EDTA 40mM는 콜라게나아제를 억제하였다. 전체 액체 추출물 DUP는 낮은 항-콜라겐분해 활성을 나타내었다. 분획 1 내지 5는 활성이었다; 가장 활성인 것은 분획1이었다. 10kDa보다 큰 분자량의 분획들은 어떠한 의미있는 억제 활성도 나타내지 않았다.

c. 항-콜라겐분해성 인자의 부가 확인: 접선 흐름 필터법 기구 및 10 kDa 필터 (Pellicon, Millipore)를 이용하여 액체 연골 추출물을 분획시켰다. 상기 필터물 (<10 kDa 분획)은 모든 항-콜라게나아제 활성을 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 다음과 같이 더욱 특징화되었다: 상기 <10 kDa 분획은 100 Da 명목상 분자량 절단막 (Spectra/Por_CE (셀룰로우즈 에스테르) MWCO: 100 Da, Cat# 131015)을 이용하여 더욱 투석되었다. 항-콜라겐분해성 활성도가 상기 필터물 (<100 Da 분획)에서 회복되었다. 상기 <100 Da 분획은 C8 역상 칼럼 (EM Science Lichroprep_RP-8, Cat# 9242)에 적용되었고, H₂O로 용출된 후, 60% 에탈올과 최종적으로는 100% 메탄올로 용출되었다. 상기 항-콜라겐분해성 활성도의 대부분(98%)은 상기 H₂O 용출물에서 회복되었고, 2%의 활성도는 60% 메탄올로 용출되었다.

요약하면, 상기 추출물내의 항-콜라겐분해 활성도는 투석하거나 Spectra/Por_CE (셀룰로우즈 에스테르) MWCO:100 막을 통과할 수 있고, H₂O에 적용될 때 C8 역상 칼럼 매트릭스 (Lichroprep_)에 흡착하지 않는 낮은 분자 화합물에 기인한다.

[In vivo 검정법]

[태아 혈관형성화 테스트 (EVT)]

상기 액체 연골 추출물은 접선 흐름 필터법 기구 및 10 kDa 필터 (Pellicon, Millipore)를 이용하여 분획되었다. 상기 액체 연골 추출물의 10 kDa 이상 및 이하의 분획들이 동일한 조건으로 테스트되었다. 이들은 신혈관형성화를 억제하는데 있어서 동일한 능력을 보였다 (도 15). 이는 10 kDa 이상의 분획에서 존재하지 않는 항-콜라겐분해 활성도와 대조된다.

a. <10 kDa 분획: 상기 분획내의 항-혈관형성 인자는 상술된 정제 단계동안에 항-콜라겐분해성 인자와 같이 행동하였다.

b. >10 kDa 분획: 상기 분획은 겔 투과 크로마토그래피 칼럼 (Sephacryl S-300, Pharmacia)상에서 크로마토그래피되었다. 항-혈관형성 활성도를 갖는 분획 (S300-4)은 SDS-PAGE상에서 특징화되었다. 상기 활성 분획 (S300-4)은 약 8과 18 kDa 사이의 분자량 (BioRad SDS-PAGE 표시 단백질과 비교함)을 갖는 몇몇 단백질 띠를 나타내었다. 상기 분획은 25mm Tris-HCl pH 8.0 및 0 내지 1.0M NaCl 그레디언트 (gradient)를 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피 (Mono-Q, Pharmacia)를 이용하여 더욱 분획되었다. 0.8-1.0M 사이의 NaCl에서 용출한 분획은 높은 항-혈관형성 활성도를 나타내었다. 0.3-0.6M 및 0.08-2.0M 사이의 NaCl에서 용출한 분획들은 더 작은 항-혈관형성 활성도를 나타내었다.

[선행 기술 제품과의 비교]

[선행 기술의 정의]

연골 추출물에 큰 관심을 가진 것이 본 발명이 처음이 아니기 때문에, 본 발명은 선행 기술, 즉, Balassa (미합중국 특허 제 4,822,607호) 및 Oikawa 등 (op.cit.)의 방법에 의해 제조된 제품으로부터 유도가능하거나 기술된 두 개의 제품과 나란히 비교 테스트로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 상어 연골 액체 추출물의 독특한 특성을 증명하였다.

Oikawa 등은 두 개의 주 분획을 얻는 방법을 기술하고 있는데, 한 분획은 1과 10 kDa 사이를 포함하는 분자량의 분자를 가지며, 두 번째 분획은 10 kDa 보다 더 무거운 성분을 가진다. 이들은 상기 첫 번째 분획에만 항-혈관형성성이 있으며, 다른 분획은 CAM 테스트에서 어떠한 항-혈관형성 활성도 나타내지 않음을 확인하였다. Oikawa의 제품과의 적절한 비교를 위해, 우리는 본 발명의 전체 액체 추출물을 두 개의 해당 분획으로 분획하였고, 0 내지 10 kDa을 갖는 하나를 보유하였다.

Balassasma 전체 액체 추출물을 추출하는 방법을 기술하고 있기 때문에, 우리는 출발 물질로서 소 연골을 상어 연골로 대치시켜, 본 발명의 전체 액체 연골 추출물 (0 내지 500 kDa)과 Balassa의 방법을 재실행함으로서 제조된 제품을 비교하였다.

우리는 만일 Balassa 및 Oikawa가 우리와 동일한 방법을 기술하고 있다면, FPLC, HPLC 및 CZE로 얻어진 패턴 (pattern)이 실질적으로 중복되어야 하며, 동일한 항-혈관형성 활성도가 ECT상에서 나타나야 함을 가정하였다. 모든 시료들의 최종 농도를 FPLC 및 HPLC 크로마토그래피 이전에 12㎍/㎕ (건조 중량/용액 부피)로 만들었다. Oikawa의 제품은 그것이 불용해성 물질을 함유하였기 때문에 크로마토그래피 전에 원심분리되고, 필터되었다.

[시료 제조]

상기 세가지 방법에 의해 추출된 상어 연골 시료들은 하기와 같이 라벨되었다 (용액 부피 당 추정된 건조 중량으로 표현됨):

1) DUP는 0 내지 500 kDa 사이의 분자를 함유하도록 분획된 본 발명의 제조물 (12㎍/㎕)이다;

2) BAL은 Balaassa 등의 방법에 따른 제조물 (12㎍/㎕)이다;

3) OIK는 Oikawa 등에 따른 분획 3의 제조물 (12㎍/㎕)이다. 모든 시료들은 분석전에 최종 농도가 12㎍/㎕이 되도록 하였다. 상기 OIK 시료는 많은 양의 불용해성 물질을 가졌으며, 이는 13,200 RPM에서 원심분리하거나 0.2㎛ 막을 통하여 필터시킴으로써 쉽게 침적될 수 있다. 상기 불용해성 물질의 필터에 의한 제거는 FPLC, HPLC 및 CZE 이전에 필수적이다 (도 16, 17, 18).

[FPLC 비교]

[조건]

Superose 12 (Pharmacia); 겔 투과 칼럼. 0.5ml/분 (챠트 속도 = 0.25cm/분)에서 용출액으로 인산 완충 살린 (PBS)을 이용하여 Superose 12 (10/30) 겔 투과 칼럼상에 시료들을 분석하였다. 상기 농도가 조정된 시료의 100㎕ 등분액은 주입 전 0.2㎛ 막을 통하여 필터되었다. OD₂₈₀를 읽었다.

상기 칼럼은 하기 표준물질 (Da 단위의 MW)로 보정되었다: 카탈라아제 (catalase, 232,000), 알돌라아제 (aldolase, 158,000), 알부민 (albumin, 56,000), 오브알부민 (ovalbumin, 44,000), 키모트립신 (25,700), 리보뉴클레아제 (rebonuclease, 13,700), 인슐린 (5,700), 인슐린 B 사슬 (3,500), 인슐린 A 사슬 (2,500), 바시트라신 (bacitracin, 1,450), 비타민 B-12 (1,355), 주 피크의 분자량은 하기 식으로 계산되었다: Log₁₀MW = 7.52 - 0.212×RT, 여기서 RT = ml 단위의 용출 부피이다. R²= 0.976이다. 전체 칼럼 부피 (V_t)는 시티딘 (cytidine, 246 Da)을 사용하여 측정된 것처럼 21.93ml이었다. 보이드 부피 (V_o)는 블루 덱스트란 (2×10⁶da)을 이용하여 8.38로 결정되었다.

[결과 요약]

도 16a에서, 본 발명의 시료 DUP는 약 3500 Da의 분자량을 제공하는 18.76ml에서 용출된 제 1 주 피크 (1)를 나타내었다. 22.7 (2) 및 27.3ml (3)에서의 계속적인 피크가 상기 전체 칼럼 부피(21.93ml, 시티딘에 의해 측정됨)를 벗어났다. 상기 피크들은 상기 칼럼 매트릭스에 대한 약간의 친화도를 갖는 것처럼 보인다.

도 16b에서, Balassa의 시표 BAL는 상기 칼럼의 V_o(8.4ml) 근처에서 용출하는 작은 피크 (1), 18.5ml (4000 da)에서 피크 (2) 및 V_t22.6분 후 (3) 및 28.2ml (4)에서 두 개의 피크를 보였다.

도 16c에서 Oikawa의 시료 OIK도 또한 (1) V₀에서의 작은 피크, (2) 18.9ml (3300 Da)에서의 피크, (3) 21.5ml (1000 Da)에서의 피크 및 (4) 27.3ml에서의 작은 피크를 보였다.

상기 시료들의 비교로, 상기 3500 Da 피크를 제외하고, 상기 DUP 시료의 주요한 띠가 다른 시료에서 동일한 강도로 관찰되지 않음을 알 수 있다. 상기 OIK 시료는 작은 양의 상기 27.3ml 피크를 갖는 것으로 보이지 않았다. 상기 BAL 시료는 상기 DUP 시료에서의 소수 피크중 하나와 관련할 수 있는 28.2ml에서 이동한 피크를 가졌다.

[HPLC 비교]

[조건]

CS-S-헥실 칼럼 5㎛, 25×0.94cm, CSC #059-085; 역상 칼럼.

[결과 요약]

헥실-역상 칼럼상의 HPLC를 위해, OD₂₁₀및 OD₂₈₀를 동시에 모니터하였다. 원심분리된 시료 (모두 12㎍/㎕)의 50㎕ 등분액을 점적시키고, 100% H₂O로 용출시켰다. OD₂₁₀(eg. 1)에 따라 라벨된 각 크로마토그램에 대한 피크 및 해당 OD₂₈₀피크는 (eg. 1)에 의해 나타난다. 상기 칼럼의 V_o는 5.5ml (1.4분)이었다.

도 17a에서, DUP는 OD₂₁₀(1,2,3)을 통해 관찰된 3개의 주 피크 및 두 개의 부 피크 (4,5)를 가졌다. 피크 1의 두 개의 부 피크가 관찰되었으며, 1a 및 1b로 표시하였다. 상당한 OD₂₈₀흡광도는 피크 1, 1a, 1b 및 3이 연합된 것이다. 비교하면, 피크 2에 대한 해당 OD₂₈₀흡광은 상기 OD₂₁₀에 비교하여 상당히 작다.

도 17b에서, BAL은 더 많은 OD₂₁₀피크를 나타내었으나, 그 강도는 상기 DUP 피크에 비교하여 더 낮았다. 피크들의 중복은 분자들의 확인을 지시할 수 있는한, Balassa 시료내의 피크 3 및 7만이 상기 DUP 시료내의 피크들 (각각 피크 1a 또는 1b 및 피크 4)의 보유시간과 관련있는 것처럼 보인다.

도 17c에서, 단지 세 개의 주 피크만이 OIK 추출물에서 관찰되었다 (1,2,3). 피크 1 및 3은 DUP 시료의 피크 1 및 3과 관련할 수 있으나, OIK 크로마토그램 내에서는 1의 어떠한 부 피크도 관찰되지 않았다. OIK 시료에서의 피크 높이는 상기 DUP 보다 낮다. 그러므로, FPLC 및 HPLC 패턴을 두드러진 제품의 특징이다.

[CZE 비교]

[조건]

장치: 고울 소프트웨어 (geol software, 버전 7.11 U)를 이용한 Beckman 시스템 (p/ace 시스템 2050); 모세관; Silice (TSPO 50375), 50㎛×97cm; 완충액; 2M 포름산; 코팅된 용액, 5% p/v 헥사디메트렌 브로마이드 (hexadimethrene bromide) 및 2% v/v 에틸렌글리콜 수용액; 검출기: UV (200nm); 전류; -30 kV; 주입: 0.5 psi, 20초; 온도; 22℃.

상기 모세관은 1M NaOH (20 psi, 20분), 물 (20 psi, 10분), 코팅된 용액 (20 psi, 20분) 및 완충액 (20 psi, 10분)으로 조건화되었다. 그 후, 실행을 위한 조건이 다음과 같이 세워졌다: 완충액 (20 psi, 2분), 시료 주입 (0.5 psi, 20초), 실행 (-30 kV, 45분), 1M NaOH (20 psi, 4분) 및 완충액 (20 psi, 4분).

각 시료들 (BAL, DUP, OIK 분획 3)을 16.5mg/ml에서 재현탁시켰다. BAL, DUP 및 OIK에서 각 용액의 pH는 각각 7.1, 6.8 및 8.2이었다. BAL, DUP 및 OIK에서 각 용액의 NaCl 농도는 각각 2.08, 4.37 및 0.71mg/ml이었다.

[결과 요약]

각 시료 (BAL, DUP 및 OIK-3)의 분자 프로파일은 도 18에 나타낸다. DUP 및 BAL 시료의 비교로, 상기 BAL 시료는 더 큰 비율의 1 미만이 %면적을 갖는 피크를 함유하고 있음을 알 수 있었다. BAL 및 DUP는 MT/EOF = 1.06, 1.54, 1.59, 1.66 및 3.22로 상기 피크들을 나눈다. 상기 1.06, 1.54 및 3.22 비율을 갖는 피크는 BAL 및 DUP에서 유사한 %면적을 갖는 반면, 비율 1.59에서의 피크는 BAL에서보다 8배 더 강하며, 비율 1.66에서는 그 반대가 관찰된다.

DUP 및 OIK 시료들은 매우 다른 전기크로마토그램을 보인다. OIK는 몇 개의 부 피크를 갖는 하나의 주 피크를 가진다. 상기 피크들 중 어떠한 것도 상기 DUP 시료의 하나와 연관될 수 없다.

[EVT 비교]

DUP, BAL 및 OIK의 항-혈관형성능은 EVT상에서 분석되었다 (도 19). Balassa의 추출물에서는 어떠한 항-혈관형성 활성도 나타나지 않았다. DUP 천연 추출물은 Oikawa OIK의 분획 3과 비교되었다. 그럼에도 불구하고 Oikawa 등은 본 발명과 관계가 없는데, 이는 이들이 10 kDa 이상의 분자량을 갖는 분획에서 어떠한 활성도도 관찰할 수 없음을 언급하였기 때문이며, 이는 도 15의 본 발명의 결과와 상반되는 것이다.

그러므로, Balassa의 방법과 본 발명의 방법 사이의 유사성에도 불구하고, 양 방법에 의해 얻어진 제품들은 분명히 같지 않다.

[아미노산 함량 비교]

BAL, DUP 및 OIK 시료 (모두 건조중량의 16.5mg/ml)의 단백질 함량은 Lowry 법에 의해 측정되었다; 결과로 BAL, DUP 및 OIK 시료에 대하여 각각 3.31, 0.27 및 4.15mg/ml의 값을 나타낸다. DUP 시료를 BAL 및 OIK 시료와 비교하면 그 단백질/건조중량의 비율은 매우 다르다.

각 액체 연골 제조물의 아미노산 함량을 더욱 분석하기 위한 분석법이 수행되었다. 도 20은 BAL, DUP 및 OIK 시료에서 각 아미노산의 비율을 도시한 것이다. 자유 아미노산의 비율은 각 연골 제조물 사이에서 매우 다르다: BAL, DUP 및 OIK 시료에서 각각 23%, 73% 및 4%. 분명하게는 원 단백질로부터의 아미노산의 비율도 또한 각 연골 제조물 사이에서 매우 다르다: BAL, DUP 및 OIK 시료에서 각각 77%, 27% 및 86%. 원 데이터에 대한 하기 표 참조:

[결론]

본 발명(DUP)과 비교된 두 개의 선행 기술 제품 (BAL, OIK)은 연골 추출물을 제조하기 위한 전통적인 공정으로 여전히 고려된다. 상기 결과로, 본 발명의 공정 (DUP)은 항-혈관형성, 항-종양, 항-염증 및 항-콜라겐분해 활성이 연관되는 한, 예상밖의 우수한 활성도를 갖는 제품을 제공함을 알 수 있다. 우리는 본 발명의 공정은 다양한 수용성 억제 인자들을 하나의 추출물로 회수하는데 성공적임을 추측할 수 있다.

BAL, DUP 및 OIK 분자 프로파일 및 단백질 함량의 직접적인 비교로 각 연골 제조물은 독특한 특성을 가짐이 주장되었다. 비록 이들이 몇몇 성분을 공유하는 것처럼 보일지라도, 이들의 하나 대 다른 하나의 비율이 다름은 분명하다. DUP가 약 75mg/Kg 이하의 적량 범위에서 경구로 투약될 때 항-종양적이며, 더 높은 적량에서 상기 효과를 점차적으로 감소시킴을 고려하는 것은 매우 중요하다. 상기 결과는 많은 양의 한 인자 이상이 상기 DUP 액체 연골 추출물에 부족함을 제시한다. 그러므로, BAL, DUP 및 OIK와 같은 다른 연골 제조물은 각 성분 비율이 다양하기 때문에 매우 다른 생물학적 특성을 보일 수 있다.

[임상 실험]

[임상 실험을 위한 액체 추출물의 준비]

본 발명의 상어 연골 액체 추출물로 예비 임상 실험을 수행하였다. 울트라필터법 후 얻어진 액체 추출물을 0.22㎛의 다공성 밀리포어(millipore) 필터로 필터시켰다. 상기 액체 추출물의 미생물 한계는 미합중국 특허 XXIII <61> 표준물질에 따라 조절되었다. 상기 액체 추출물을 7ml 등분액 (약 85mg의 단백질)으로 무균 플라스크에 분배시키고, -60℃에서 하룻밤동안 얼리고, -20℃에서 사용할때까지 더욱 저장시켰다.

[항-혈관형성 효과]

혈관형성-의존성 질환을 치료하기 위해 상기 액체 연골 추출물을 사용하였다. 세 개의 다른 타입의 대표적 혈관형성-의존성 질환이 인간에게 실질적으로 테스트되었다; 첫 번째 타입은 암 (전립선 암)이고, 두 번째 타입은 피부 질환 (건선)이며, 세 번째 타입은 관절염 (류머티양 관절염 및 골양관절염)이다. 하기 시료들은 적어도 상기 액체 추출물의 항-혈관형성 활성을 예시하고 지시할 것이다.

하기에 나타난 결과는 매우 유망하며, 특별하게 테스트된 것 뿐만 아니라, 모든 혈관형성-의존성 질환의 치료에 상기 천연 통과물 및 이들의 분획들의 유용성을 짐작하게 한다. 질환이 혈관형성 성분을 갖는 한, 본 발명의 상기 연골 추출물은 이들이 이들의 유효량을 포함하는 조성물의 시초가 되며, 상기 조성물은 적절한 투여를 위한 적절한 형태라는 것을 가정하면 효과적일 것으로 예상된다. 그러므로, 당업자는 표적이 되는 질환 조직 및 이들의 투여 형태에 의해 선택되는 많은 조성물을 유도할 수 있기 때문에, 본 발명은 혈관형성 질환의 치료에 사용하기 위한 하기 특정 조성물에 제한되지 않을 것이다. 조성물들은 예를 들면, 국부, 경구, 혀밑샘, 직장, 정맥내, 근육내, 안구내, 복강내, 확산 등과 같은 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다.

연골의 비린 맛 및 냄새 때문에, 조미료 및 방향제가 부가될 수 있거나, 다른 갈레닉 (gallenic) 조성물 (리포좀, 캡슐화, 경로, 등)이 환자의 승낙을 쉽게하기 위해 고안될 수 있다. 용어 "환자"는 인간 또는 동물 환자를 지시한다.

[암]

전립선 암을 앓고 있는 한 환자에게 상기 액체 연골 추출물을 음식에 첨가하였으며, 그 이래로 상당한 건강 향상을 보였다. 선암종은 1986년에 진단되었다. 그 때, 방사선 요법이 수행되었다. 1991년에, 정상의 수용 가능한 상한계가 4㎍/L일 때, PSA (전립성 혈청 항원) 수준은 138㎍/L이었다. 그 후, 환자는 항-안드로겐 치료법 (EUFLEX)과 결합된 거세술에 의해 완전히 다른 치료법을 경험하였다. 상기 치료법은 3년간 효과적이었고, 그 후, PSA 수준이 다시 올라가기 시작하였다. 1994년 6월 이래로, 상기 환자는 상기 연골 추출물을 음식으로 첨가하였다 (일당 경구 복용량은 약 75mg 건조중량/7ml의 추출물, 무게/일 단위로 약 1-1.5 mg/Kg와 같음). 상기 PSA 수준은 12에서 4.0㎍/ml (정상 한계)까지 점차적으로 감소하였고, 마지막 결과는 1996년 4월에 얻어진 것이었다. 상기 복용섭생법 (dose regimen)은 투여 경로, 활성 성분들의 신체이용 가능성 및 조직병리학을 조절하는 바람직한 공격성에 따라 수정되어져야 할 것이다. 이러한 경우에, 상기 액체 추출물은 위-십이지장 트랙에 실질적인 비율로 흡수될 수 있을 것이다. 하나는 DMBA-처리 쥐 및 접종된 마우스들 (상기 참조)에서 얻어진 결과에 의존할 수 있다. 이제, 쥐 및 마우스 (상기 실시예 참조), 및 원숭이 (나타내지 않음)에서 무-독성이 입증되었다.

DMBA-처리 쥐 및 DA3-이식 마우스들에서 상기 액체 추출물의 경구 투여는 무게의 1 내지 300mg/Kg 사이의 복용 속도를 제시하며, 이는 추정 가능하게 동물 모델에서 종양 전개 및 종양 혈관화의 억제에 크게 기여한다. 마우스 (DA3-모델)에서 상기 액체 추출물의 복강내 투여는 투여 경로가 종양 전개를 억제하는 유효량을 얻는데 중요함을 나타낸다. 이는 전립선 암에 효과적인 1mg/Kg의 복용 속도는 만일 비경구 투여 경로가 선택된다면, 거의 0.01mg/Kg까지 낮아질 수 있다. 그러므로, 일당 무게로 약 0.01 내지 약 200mg/Kg의 복용량 (ED₅₀)은 적어도 부분적으로 혈관형성증을 감소시키거나 제거시킴으로써 암을 치료하기 위한 의학적 복용량의 거의 적절한 범위이다.

몇몇 다른 환자들은 더 통상적인 치료법 (외과치료, 화학요법, 항호르몬치료법 등)과 함께 액체 연골 추출물을 이들의 음식에 첨가시켰다 (매일 경구 복용은 약 75mg 건조중량/7ml 추출물, 무게/일로 약 1-1.5mg/Kg와 동일). 몇몇 의학적인 경우의 요약은 하기 표에 제공된다. 상기 결과들은 액체 연골 추출물과의 복합 치료법이 생존율 및 충실성 종양을 앓는 환자의 생의 질을 증가시킴을 제안한다.

[건선]

하기 피부용 조성물을 만들고, 건선을 앓는 환자에게 그 효능을 입증하는 실험을 하였다.:

-EMULGADE CLB 29% (W/W)

-20X 천연 통과물 69.5% (W/W)

-GERMABEN II 1% (W/W), 및

-Lavandula Angustifolia 0.5% (W/W)

스테아레이트 에스테르, 지방 알코올 및 비이온성 유화제 (Henkel Canada Ltd.에서 구입)의 혼합물인 EMULGADE CLB를 교반하면서 65-70℃로 가열하였다. 가열을 중단하고 혼합물을 계속 교반하였다. 상기 혼합물이 45℃의 온도가 될 때, 필수 오일인 Lavandula Augustifolia 및 방부제인 GERMABEN II (다이아조니딜우레아 (diazonidyl urea) 30%, 메틸파라벤 (methylparaben) 11%, 프로필파라벤 3% 및 프로필렌 글리콜 56%; Sutton Laboratories, NJ, U.S.A.로부터 구입)을 첨가시켰다. 상기 혼합물의 온도가 30℃가 될 때, 상기 액체 연골 추출물을 첨가시켰다. 그렇게 얻어진 조성물은 매끄럽고 기름기 없는 크림 (cream) 이었다; EMULGADE의 퍼센트를 변화시킴으로써, 제조자의 의도 (밀크, 로션, 연고)에 따라 다양한 점도의 피부용 조성물을 갖는 다른 형태가 얻어질 수 있다. 페이스트 (paste), 겔 및 어떠한 다른 형태의 표면 제조물을 얻기 위해 다른 담체 또는 부형제가 사용될 수 있다.

상기 제제화 단계는 통상적인 치료법에 반응이 있었으나 얼마후 이에 대해 면역성이 생긴 건선을 앓고 있는 9명의 환자의 패널 (panel)에 12주 동안 매일 두번 시행 (국소 적용)되었다. 상기 연구를 위해, 양쪽편상에 유사하고 대칭적 정도의 건선을 갖는 환자들이 선택되었다. 상기 실험은 피부학자들 및 환자들 모두 영향을 받은 쪽은 연골 추출물을 함유하는 조성물로 처리되고, 한쪽은 대조구-조성물로 처리되었음을 알지 못하는 더블-블라인드 (double-blind) 방식으로 수행하였다. 건선이 과각화증에 의해 합병되지 않는 다섯명의 환자들에서 두드러진 향상이 관찰되었다; 과각화증을 갖는 군에 대하여는, 상기 결과는 적당히 좋았다. 두명의 환자의 몸의 일부의 사진이 도 21에 나타나있다. 도 21a 및 b에서, 그럼에도 불구하고, 과각화증을 수반하는 건선에 영향받은 환자는 홍반의 매우 의미있는 감소를 보였고, 단 한달의 치료 후 어떠한 가려움증도 수반하지 않았다. 그러나, 상기 과각화증은 여전히 중요하다. 과각화증과 합병되지 않은 건선을 앓고 있는 두 번째 환자의 사진 (도 21a 및 d)는 치료-3달 후 매우 큰 향상을 보였다. 건선이 다인성 질환으로 나타나기 때문에, 환자들의 반응은 혈관형성증 및 염증과 같은 성분들이 이러한 조건의 정착 및 영속에 영향을 미치는 정도에 의존한다. DMBA-처리 쥐 (도 5), 내피 세포 증식 (도 7) 및 EVT (도 10)에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물에 항-혈관형성 활성도가 실제로 존재한다. 항-염증 활성도 또한 확인되었다 (마우스의 CHS 모델). 만일 이러한 종류의 형성화가 다른 치료제 (각층 박리제, 부가적인 항-염증제, 항히스타민제, 면역억제제 등)로 보충되어 관련된 다른 인자들에게 전달된다면 더 좋은 결과가 얻어질 수 있을 것이다.

예를 들면, 유효량의 각층 박리제를 포함하도록 상기 형성화를 변형하는 형태가 보충될 수 있다. 또한, 이는 상기 상보적 치료제의 독립적인 투여, 동시 또는 본 발명의 국소적 형성화의 적용을 선택적으로 투여하여 성취될 수 있다. 또한, 보충적 약물 치료가 동일한 경로로 투여될 필요는 없다.

상기 제제화는 액체 연골 추출물의 높은 비율에도 불구하고 어떠한 전체적인 효과 (상기 효과는 치료 면적에 제한됨)및 어떠한 2차 효과도 나타내지 않았다.

[관절염]

관절염을 앓고 있는 환자들은 몇 달동안 일당 7ml의 전체 액체 추출물의 두개의 유니트로 자원자에 대해 실험되었다. 상기 환자들은 관절 기능의 회복, 고통 및 염증의 감소 (최대 약 60%)로 점차적으로 향상된 상태를 나타내었다. 관절염은 혈관형성 및 염증 성분을 가지고 있기 때문에, 상기 효과는 연골 추출물의 항-혈관형성 및 항-염증 활성에 영향받을 수 있다.

예비 임상 연구가 류마티양학 전문가들에 의해 수행되었다. 7명의 자원자 및 39 및 60세 사이의 나이로 류마티양 관절염을 앓고 있는 견식있는 대상 군이 본 발명에 등록하였다. Americal Rheumatism Association의 재편집판 (Arnett, F.C. 등(1988)의 Arthritis & Rheumatism, 31권, 315-325)에 있는 전통적인 방법에 기초하여 진단이 실시되었다.

치료는 30일간 지속되었고, 21ml의 액체 상어 연골 추출물 (건조중량의 12mg/ml)을 매일 적량투여하였다. 상기 치료의 효과는 관절 압통 (tenderness)의 평가에 대한 문헌 목록으로 결정하였다 (Ritchie, D.M. 등 (1968)의 Quaterly J. Med, New Series, XXXVII, 147권, 393-406). 상기 목록은 관절을 움직일 때 순간적으로 또는 관절 공간에 걸쳐 관절이 압력을 받을 때 상기 환자들이 겪는 고통의 정량적 평가의 수의 합에 기초된 것이다. 결과로부터, 7명 중 4명의 환자들은 액체 연골 추출물로 처리될 때 향상(하기 표 참조)되었음을 알 수 있고, 이는 상기 제품이 류마티양 관절염 또는 만성적 염증으로 합병된 다른 상태의 치료에 사용될 수 있음을 제시한다.

[거미 정맥]

전체 16명의 참여자 (panelist)가 본 연구를 위해 충원되었다. 상기 참여자들은 얼굴에 보이지만 심하지 않은 모세관확장증 (telangiectasia)를 보였다. 상기 참여자는 각 8명씩 두 개의 그룹으로 나뉘어졌다. 한 그룹 A는 5%의 액체 연골 추출물을 함유하는 콜레스테롤 리포조말 염기로 제공되는 반면, 두 번째 그룹은 콜레스테롤 리포조말 염기 단독으로 제공된다. 상기 제품은 3달 동안 하루에 2번 얼굴 전면에 사용되었다. 거미 정맥을 나타내는 얼굴 중 최소한 4 부분의 상을 얻기 위해 섬유 광 표면 현미경을 사용하였다. 상기 상들은 Zeiss Ibas Image Analyzer를 통하여 그레이 (grey) 값에 대하여 분석되었다. 각 참여자의 각 부분에 대하여 통합 광 밀도 (integrated Optical Density, IOD)가 계산되었다. 각 참여자의 4부분을 각 시점에 대하여 평균하였다.

상기 결과로, 4주 후에 상기 IOD상에 35% 감소가 있었으며, 상기 효과는 연구 과정동안 유지되었음을 알 수 있다 (도 22). 공 콜레스트레로 리포조말 염기는 8주 및 12주 사용 후, 각각 5% 및 8%의 배경 향상을 보였다.

[안와골막(petiorbital) 어두운 고리]

피부 착색은 멜라닌의 유무에만 기인하는 것이 아니라, 혈액 공급 및 혈장 함량에도 기인한다. 혈류가 느려지고, 매우 많은 양의 산소가 대사로 소모될 때, 피부는 푸른 빛을 띤 것처럼 보인다. 이러한 색상의 차이는 피부의 두께 때문에 눈 주위에서 극대화된다 (Oresajo 등 (1987)의 Cosmetics & Toiletries 102:29-34). 눈 아래에 존재하는 격막 (septa)내의 혈관 변화도 또한 어두운 고리의 발생을 악화시킨다. 또한 눈 주위의 어두운 고리는 지방 축적, 안검 아래의 부종 및 눈 주위 혈관의 누출에 기인하는 것으로 보인다. 눈 주위의 혈관형성을 조절함으로써 안와골막 어두운 고리의 발생을 감소시키는 것에 대한 상어 연골 액체 추출물의 효과를 평가하기 위해 임상 연구가 설계되었다.

18-65세의 전체 18명의 여자 자원자를 본 연구에 참여시켰다. 상기 참여자들은 눈 주위의 뚜렷한 어두운 고리를 보였다. 모든 참여자들은 피부상 또는 안구상 문제를 포함하는 급성 또는 만성 질환의 어떠한 증상도 갖지 않는 건강하였다.

테스트 결과의 평가를 방해할 수 있는 유행성 그을림, 뾰루지, 상흔, 태운 흔적 등을 보이는 대상 군들은 본 연구에서 제외시켰다. 임신 또는 수유부들도 또한 제외시켰다. 테스트 부위에는 사마귀, 점, 그을림, 선탠, 반흔 및 관칠시 관찰된 활발한 피부 병변등이 없었다.

참여자는 그룹 A 및 그룹 B에 10명씩, 각각 5% 액체 연골 추출물을 함유하는 담체 또는 담체 단독에 해당하는 두 군으로 나뉘어졌다. 참여자들에게 12주 동안 적어도 하루에 두 번씩 눈 주위에 적용되기에 충분한 제품을 제공하였다. 기저, 및 4, 8 및 12주 후에 측정치를 구하였다. 각 시각에서, 사진을 얻었고, Image Analysis를 통하여 분석하였다.

피부의 암/명 정도를 도시한 그레이 (grey) 값에 대하여 사진을 분석하였다. 액체 연골 추출물을 처리한 그룹은 그레이 값 (암 착색화의 밝은 정도를 나타냄)에서 바람직한 증가를 보였다. 4, 8 및 12주 후, 액체 연골 추출물로 처리된 그룹의 눈 아래 피부의 명도는 11%, 21% 및 14%이었다. 담체 단독 처리된 그룹은 어떠한 변화도 나타내지 않았다 (도 23).

[정맥류성 정맥]

전체 20명의 참여자가 본 연구에 참여되었다. 상기 참여자들은 다리에 보이지만 과하지 않은 모세관확장증을 보였다. 상기 참여자는 두 군으로 나뉘어졌다. 3달 동안 매일 두번 씩, 그룹 A (n=9)에는 크림을 함유한 액체 연골 추출물이 제공된 반면, 그룹 B (n=11)에는 전체 다리에 사용되는 담체 크림만이 제공되었다. 정맥류성 정맥을 나타내는 다리의 2-4 부위의 상을 얻기 위해 섬유 광 현미경을 사용하였다. 상기 상들은 Zeiss Ibas 분석기를 이용하여 그레이 값에 대해 분석되었다. 각 참여자들에 대해 각 부위에 대한 통합 광 밀도 (IOD)가 계산되었다. 각 참여자들 상의 모든 부위를 각 시점에 대하여 평균하였다.

결과는 도 24에 도시되어 있다. 4, 8 및 12주 사용 후에 각각 IOD의 21%, 17% 및 26% 감소가 있었다. 대조구 담체는 4, 8 및 12주 사용 후에 각각 5%, 0% 및 0%의 기본 향상 값을 나타내었다.

[기타 가능한 임상적이고 가축적 치료의 적용]

안과학: 시력의 감소 또는 장님은 비정상적인 혈관 성장 또는 신혈관형성에 의해 특징지어지는 많은 상태들에 의해 발생될 수 있다. 이들은 각막 신혈관형성 (화학적 물리적 자극에 의해 발생됨), 각막 감염, 각막 이식 거부반응, 신혈관성 녹내장, 반점상 변질, 포진 바이러스 각막염 및 당뇨병성 망막병증을 포함한다. 상기 액체 연골 추출물은 이러한 임상 상태에 대하여 신 혈관의 형성을 저지시키고, 모세관확장증을 감소시킴으로써 작용할 수 있다.

상처 치료: 상처 치료는 세포, 생화학적 전달자, 세포의 매트릭스 분자들 및 세포의 미세환경 사이의 복합 작용을 포함한다. 심한 두께의 상처 후, 입자화조직 (섬유 아세포, 모세관 및 염증 세포)이 먼저 특정 서열로 상처의 가장자리로부터 자란다. 섬유 아세포는 24시간 내에 상처 가장자리에서 결합 조직으로부터 상처 공간으로 이동하기 시작한다. 섬유 아세포들은 이들이 이동할 때, 세포의 매트릭스를 형성하는 매트릭스 분자들 (콜라겐 및 글리코스아미노글리칸)을 만든다. 첫 번째 모세관 돌기는 상처 후 18시간만큼 빠르게 상처 가장자리에서 관류된 미소순환 내에서 관찰될 수 있다. 상기 돌기들은 상처 공간으로 성장하며, 상처 결합 조직에 새로운 모세관 망을 제공한다. 섬유 아세포 증식 및 이동과 모세관 성장은 상기 상처 공간이 완전히 새로운 조직으로 채워질 때까지 하나의 유니트로 이어진다. 비후성 반흔화 및 심하게 화상입은 환자의 피부의 치료와 같은 입자화 인자의 과표현에 의해 복잡화된 몇몇 상처 치료 조건들은 액체 연골 추출물의 투여 (경구 또는 국소적 투여)에 유익할 수 있는데, 이는 혈관형성 과정을 감소시키는 것은 상처 치료 공정을 느리게 하기 때문이다.

구진인상 피부 질환: 건선 병변에 대한 액체 연골 추출물의 우수한 효과는 공통 특성을 갖는 다른 질환들도 또한 상기 액체 추출물의 부분적 또는 전체적 투여에 적합할 수 있음을 제시한다. 구진인상 피부 질환들은 내피의 비후화 및/또는 근원적 피부 염증으로부터 발생하고, 건선, Reiter 신드롬, 장미색 비강진, 편평 태선, 모공성 홍색 비강진, 2차 매독, 균상식 육종 및 어린선양 발진을 포함하는 붉은색 내지 보라색을 띤 여드름 및 플라크에 의해 특징화된다.

탈모증: 혈류를 두피로 유도하는 작은 측부 동백의 결찰은 안드로겐 과노출에 의해 발생한 모발 손상을 억제시키는데 성공적이었다. 상기 두피의 몇몇 영역 상에 액체 연골 추출물을 부분적으로 적용하여 혈관망 및 호르몬에 대한 계속적인 노출을 감소시킴으로써 두피 손실을 저지시킬 수 있다.

가축 치료의 적용: 고체 및/또는 액체 연골 추출물은 인간에 대하여 기술되었던 동일한 치료상 및 미용상 적용을 위해 동물에 투여될 수 있다.

[비-항-혈관형성 효과]

[여드름]

비록 여드름이 발명자의 지식으로는 혈관형성 성분을 갖는 질환으로서 분류되지 않을지라도, 그럼에도 불구하고 상기 액체 연골 추출물이 또한 항-염증성이라는 사실에 기초하여 영향받는 환자들에게 있어서 상기 연골 추출물을 테스트하는 것이 관심을 끌었다. 여드름 환자들에게 상기 액체 추출물을 실험하기 위해, 하기와 같이 겔 조성물이 제조되었다:

CARBOPOL 1.2%

증류수 77.2%

NaOH 0.3%

PHENOXETOL 0.3%

TWEEN 80 0.3%

액체 연골 추출물 20.0%

40X 알로에 추출물 0.5%

상기 액체 연골 추출물은 9-12mg/ml의 건조중량을 포함한다. 상기 형성화는 다소 심각한 여드름 환자 (염증성 여드름 및 질염 여드름)의 피부 상태의 두드러진 향상을 보인다. 도 25는 12주 동안 담체를 함유하는 국소적 액체 추출물을 처리할 때 여드름 환자의 상태의 의미있는 향상을 보인다.

상기 결과는 항-혈관형성 효과 (결과적으로 여드름내의 혈관형성 인자를 드러냄)에 기인될 수 있거나, 이들은 항-혈관형성과 다른 효과 (예를 들면, 항-염증성 효과)를 가진 활성 성분에 기인될 수 있다. 상기 임상적 실험에서 얻어진 모든 결과는 혈관형성-의존성 및/또는 염증성 질환의 치료에 상기 액체 연골 추출물의 매우 잠재적인 효과를 보여준다. 이들의 제형 뿐만 아니라 연골 추출물의 양은 특정 요구를 충족시킬 의지에 따라 변화될 수 있다.

단백질 함량에 기초하여, 국소적이며 모든 다른 조성물들은 넓은 범위의 연골 추출물의 적량을 함유할 수 있다. 테스트된 세 개의 특정 범위 사이에서, 매우 다른 적량 및/또는 제형이 사용되었다.

[피부 자극]

혈관형성이 종종 많은 질환들에서 염증과 연관되기 때문에, 상기 연골 추출물내의 각 활성도를 독립적으로 확인하는 것이 바람직하다. 이점에 대해서, 어떠한 혈관형성증도 일어날 것으로 의심받지 않는 피부 자극 모델이 항-염증성 및 진정 활성도에 대하여 상기 추출물을 테스트하기 위해 선택되었다. 페루 (Peru)의 발삼 (Balsam)에 대한 피부 민감성을 갖는 9명의 자원자들이 본 연구를 위해 선택되었다. 테스트 화합물은 하기와 같다:

1. D-MEN 메디아내 1X 상어 연골 50%

2. D-MEN 메디아내 1X 상어 연골 20%

3. D-MEN 메디아내 1X 상어 연골 10%

4. 콜라 니티다 (Cola nitida, Indena) 10% 하이드로-알코올 1:1

상기 4개의 테스트 화합물들은 참여자들의 복부 전완 (ventral forearm) 상에 적용되었다. 상기 물질은 20분간 흡수된 후, 자극제인 페루의 발삼을 테스트 부위에 적용하였다. 피부 자극은 피부 홍화의 증가로 측정되었다. 홍화 정도는 Minolta Chromameter로 측정되었고 양성 및 음성 대조구와 비교되었다. 양성 대조구는 페루의 발삼만으로 처리된 피부색이었으며, 음성 대조구는 콜라 용액으로 처리되고 테스트 제품과 같이 시도된 피부 부위이었다. 두 개의 꼬리를 무는 가능성 T-테스트로 통계적 의미가 계산되었다. 도 26은 10% 콜라가 70% 활성이 있음을 보여준다. 상어 연골은 20% 및 10% 농도에서 각각 항-자극제로서 58% 및 60%이었다. 적량-감응 효과는 없었다. 상기 결과는 상기 연골 추출물이 항-혈관형성 효과와 거리가 먼 진정 활성 및 항-염증 활성을 함유함을 제시한다.

[암]

53세의 여자 환자는 B형의 비대 세포 비-호지킨스 (Hodgkin's) 림프종으로 진단되었다. CAT 스캔 (scan) 분석법은 경동맥 및 경정맥 (지름 2.5cm) 주위의 선병증 및 오른쪽 망막 문 위의 용적이 큰 선병증을 드러낸다. 상기 환자는 화학요법을 사절하였고, 그녀의 음식에 상기 액체 연골 추출물을 첨가하였다 (1993년 10월) (약 75mg 건조중량/7ml 추출물로 매일 경구 복용, 무게/일로 약 1-1.5mg/Kg과 동일) 3달 후 (1994년 1월), CAT 스캔 분석법은 완전하게 흡수된 목에서 선병증을 드러냈다. 1994년 11월까지, 복부 선병증은 부피가 75%까지 감소하였다. 상기 질환은 그 이후로 안정하며, 환자는 건강함을 느꼈다.

상기 결과는 몇몇 비 충실성 암도 또한 액체 연골 추출물의 항-종양 활성에 반응할 수 있음을 제시한다.

[피부의 차단 보호]

여섯명의 건강한 자원 참여자를 본 연구에 참여시켰다. 상기 참여자들은 4주 동안 매일 두 번씩, 왼쪽 전완상에는 적용하기 위한 담체 단독과 오른쪽 전완상에는 적용하기 위한 상기 액체 연골 추출물을 함유하는 크림을 받았다.

상기 참여자들은 21-45세의 피부상 또는 안과학상 문제를 포함하는 급성 또는 만성 질환의 흔적이 없는 여자였다. 테스트 결과의 평가를 방해하는 심한 그을림, 사마귀, 탄 흔적 등을 나타내는 대상들은 본 연구에서 제외되었다. 테스트 부위에는 실험시 관찰되는 사마귀, 반점, 점, 그을림, 선탠, 반흔 및 활성 피부 병변이 없었다. 테스트 1일에, 상기 참여자들은 얼굴에 어떠한 로션, 크림 또는 다른 제품을 사용하는 것을 금지하도록 지시받았다. 측정과정 동안, 참여자들은 20-22℃ 온도 및 40% 상대습도의 조절된 환경에서 테스트하기 전에 적어도 30분간 평형되었다.

테스트 부위는 오른쪽 및 왼쪽 손바닥 전완이었다. 각 팔에 작은 면적 (3.5cm × 7cm)을 표시하고, 기초 표면 수분 손실 (TEWL)을 상기 면적 내의 세 부위로부터 구하였다 (Pinnagoda 등 (1990)의 Contact Dermatitis 22: 164-178; Grove (1994)의 The effects of aging in oral mucosa and skin, Squier & Hill 편집, CRC 출판, pp 124-125).

테스트 면적을 덮기 위해 접착성 (Tuck) 테이프를 사용하였으며, 양 방향으로 단단하게 붙인 후, 상기 테이프를 벗겨냈다 (Elias (1993)의 J. Invest. Dermatol, 80: 044s-049s). 전체 5개의 단편을 얻었다. TEWL을 다시 기록하였다. 5개의 그룹에서 TEWL 측정 이전의 벗겨짐화가 계속되었다. 상기 벗겨짐화는 TEWL이 18G/M²/Hr에 도달할 때 중단되었다. TEWL은 최종 벗겨짐화 순서의 후반에 다시 측정되었다. 피부 경계를 손상시키는데 요구되는 단편의 수는 18G/M²/Hr의 TEWL 또는 그 이상을 보이는 각 시점에서 각 팔에 대한 최대 벗겨짐화수를 인지함으로써 계산되었다. 상기 결과는 상기 하나의 테일드 랭크 (tailed rank) 상수 Z 테스트를 이용하여 다앙한 시간 대 기본라인에서의 처리 사이의 통계적 의미를 위해 분석되었다.

담체 처리된 팔은 단지 26% 및 21% 이상의 벗겨짐화가 각각 2주 및 4주 처리후에 피부를 손상시키는데 요구되기 때문에 더 향상도를 나타내는 것으로 보이지 않았다. 60% 및 55% 이상의 벗겨짐화가 피부 경계를 벗겨지게 하는데 요구될 때, 2 및 4주 동안 액체 연골 추출물 제품으로 처리한 후 상기 각 참여자들의 경계상태에는 상당한 향상이 있었다 (p<0.05) (도 27).

그러므로, 액체 연골 추출물은 물리적 손상에 대한 피부 경계를 강하게 하는데 유용한 것으로 증명되었다.

[습진]

액체 연골 추출물을 습진에 의해 발생하는 염증성 병변을 감소시킬 수 있는 능력에 대하여 미용실에서 테스트하였다. 상기 액체 추출물을 함유하는 크림을 적용하는 미용사들은 몇 년간 손에 만성 습진을 앓고 있다. 흥미롭게도, 연골을 함유하는 크림의 사용은 손의 습진의 발현을 의미있게 감소시켰다. 미용사들은 현재 습진의 발현을 저지하기 위해 성공적으로 연골을 함유하는 크림을 이용하고 있다.

[사마귀]

발바닥 사마귀가 있는 36세 중년 여성이 사미귀 전개 및 수반된 고통을 조절하기 위해 거의 3년간 피부학자에 의해 치료되었다. 치료법 중에서는 액체 니트로겐 (Nitrogen), 살리실릭산 (Salicilic acid, 40%), 미생물법, 질산, 및 황산이 있었다. 상기 치료법들은 일반적으로 3달의 기간동안 매주 실시되었고, 결과는 거의 없었다. 1996년 3월에, 그녀는 사마귀에 직접적으로 상어 연골 액체 추출물을 매일 적용하였다 (5분); 두주 후, 새로운 내피의 분홍색 영역이 사마귀 주위로 생성되었다; 그 다음주에 사마귀는 사라졌다. 그러므로, 상기 결과는 상기 액체 연골 추출물이 사마귀 치료를 도울 수 있음을 제시한다.

[기타 잠재적 임상 및 가축치료의 적용]

이식 거부: 염증은 이식된 세포의 사망과 관련된 주요 인자중 하나이다. 그러므로, 조직 이식은 본 발명의 상어 연골 액체 추출물에 존재하는 항-염증 성분으로 유리하게 될 수 있다.

복합적 경화증: 복합 경화증의 원인은 알려져 있지 않다. 조직 반응은 정맥 주위의 단일핵 세포 침윤을 가지며, 감염의 어떠한 명백한 병리학적 증거도 없는 면역병리학적 과정의 특징을 가진다. 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (matrix metalloproteinase)는 염증성 반응과 관련된 중요한 인자이다. 액체 연골 추출물은 매트릭스 메탈로프로테어나아제의 강력한 억제제이기 때문에, 복합적 경화증의 치료에 유용할 수 있다.

섬유증: 현 개념들은 섬유증이 정상적인 상처 치료와 유사하나, 끝마무리에 실패하여 정상 조직 대신 반흔을 초래함을 제시하고 있다. 대부분의 섬유증 반응은 정신적 외상, 감염, 염증에 대하여 간접적인 것처럼 보이나, 알려지지 않은 이유로, 유전적 성분을 가질 수 있다. 통상적으로 TGF-β이 과형성되고, 섬유아세포의 증식 및 콜라겐의 과생산을 유도한다. 과다한 콜라겐의 침적이 섬유종의 홀마크 (hallmark)이기 때문에, 우리는 입자화 조직의 형성을 지열시킬 수 있는 액체 상어 연골 추출물이 섬유증 반응을 억제하는데 오랜 기간 유리하게 작용할 수 있음을 제시한다.

염증성 장 질환: 염증성 장 질환의 병인은 알려져 있지 않으나, 복부 장관 면역성은 Crohn 질환 및 궤양성 대장염과 연관된다. 점막성 모노핵 세포들은 변형된 항체 생성, 증식, 세포독성 및 시토킨 (cytokine)의 합성 (FGF, PDGF, EGF, TNF)을 나타낸다. 액체 열골 추출물은 항-염증성 활성도를 나타내며, 그 후, 경구 투여는 염증성 장 질환의 치료에 도움을 줄 수 있는 것으로 판단된다.

심장 질환: 관상동맥 혈관의 내피성 기능장애는 관상동맥의 미세혈관의 이상 및 가능하게는 심근 축소빈혈 및 심장 통증 때문일 수 있다. 세포 수준에서, 내피성 기능장애는 내피종-유도 이완 인자인 일산회질소 (NO)의 감소된 발현과 관련한다. 어떠한 합성도 상기 혈관 시스템을 혈관 확장상태로 유지시켜서 동맥압을 조절하도록 할 수 없다. NO의 내부 합성에서 있어서의 불리한 조건은 동맥성 고혈압, 폐 고혈압증 및 심장 질환과 같은 상태에 기여한다. 우리는 배양된 내피세포로부터 상기 액체 연골 추출물이 NO 생성을 증가시킨다는 지배적인 결과를 가지고 있다. 그러므로, 상기 액체 추출물은, NO를 통하여, 폐 동맥성 고혈압증과 합병된 선천성 심장질환을 갖는 소아 환자에서 뿐만 아니라, 일부 심장 질환 상태에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단할 수 있다.

또한, 액체 연골 추출물은 아테로마증에서 염증-관련 합병증을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다.

경피증: 경피증 (굳은 피부)은 피부 및 종종 내장 기관의 섬유성 결합 조직의 증가에 의해 나타나는 드문 질환이다. 이는 종종 부분적 피부 반점의 과각질화 (hyperkeratinization)로 나타난다. 과각질화는 피부의 각막세포가 분화하고 견고한 각질 섬유를 축적시키는 세포 공정이다. 만일 관절 주변의 피부가 영향 받는다면 피부 상태는 제한된 관절 유동성을 초래할 수 있다. 각질세포 분화가 고무되는 실험적 시스템에 첨가될 때, 상기 액체 연골 추출물은 부분적으로 분화 또는 각질화 과정을 방해한다. 그러므로, 상기 액체 추출물은 전체적으로 분화된 각질 세포의 과축적을 저지시킴으로써 상기 피부 상태에 유리하게 작용할 수 있다.

가축 치료상 적용: 고체 및/또는 액체 연골 추출물은 사람에 대하여 기술된 바와 동일한 치료상 및 미용상 적용에 대하여 동물에게 투여될 수 있다.

[미용학적 적용 및 조성물]

상기 테스트 및 실험들은 본 발명의 연골 추출물이 다양한 의학적 적용을 발견할 수 있음을 보여준다. 본 발명의 추출물에서 회수된 다양한 활성들 중에서, 항-혈관형성, 항-콜라겐분해성, 항-염증성 및 PKC-유도 분화에 대한 억제 효과는 미용학적 적용에 특히 바람직하다. 본 발명의 상기 연골 추출물은 PKC로 매개되는 세포의 경과에 반대 효과를 보이며, 상기 반대 효과는 피부 차단 기능을 향상시키는 것으로 문헌에 기재되어 있기 때문에, 상기 피부에 연골 추출물 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 포유류 피부의 경계 기능을 향상시키는 방법 및 상기 조성물이 본 발명의 목적이다. 다르거나 유사한 조성물도 또한 포유류 피부의 염증을 감소시키거나 피부를 진정시키는 방법에 사용되는 것으로 생각될 수 있다. 염증은 화학적 자극, 물리적 마멸 및 자외선에 대한 노출과 같은 다양한 시약에 의해 발생될 수 있다. 피부에서 콜라게나아제를 억제하는 방법 및 조성물도 또한 고려될 수 있다. 콜라게나아제 및 염증은 조기 노화 (콜라겐의 분해)와 관련하며, 그러므로, 상기 연골 추출물에서 얻은 반대 활성들도 또한 포유류에서 조기 노화를 진정시키고, 주름 또는 위축을 조절하는 방법 및 조성물에 기여할 수 있다. 주름 또는 위축의 원인으로 예를 들면 노화, 자외선 또는 공해 환경에의 노출을 들 수 있다. 국소적 조성물은 특정 적용에 대해 결정되는 유효량의 상어 연골을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물들은 약 0.1 내지 75중량%의 액체 연골 추출물과 약 25 내지 99.9중량%의 약제학적으로 수용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 상기 조성물들은 피부에서 지질 퍼옥사이드 (peroxide)의 형성을 방해하는 시약과 같은 항-산화제를 함유할 수 있다. 상기 항-산화제의 예는 토코페롤, 토코페롤 유도체, 아스코빅산 (ascorbic acid), 아스코빅산 유도체 및 BHF이다. 상기 조성물은 포스포리파아제 A2 (phospholipase) 억제제 또는 야생종으로 유도된 항-자극제 콜라 및 녹차 추출물과 같은 항-염증제로 보충될 수 있다. 국소적 조성물은 용액, 현탁액, 로션, 팅크제 (tincture), 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼 (emulsion), 접착물, 연고 또는 리포좀 (적어도 액체 연골 추출물의 일부)과 같은 다양한 형태를 취할 수 있다. 다른 미용학적 적용은 눈 주위의 어두운 고리 및 피부 차단 기능을 포함한다.

[결론]

본 발명의 방법은 우수한 임상적 가치를 가진 연골 추출물의 생산을 제공하는 것으로 주장되었다. 상기 신규한 방법에 의해 생산되는 상어 연골 추출물은 우수한 수율로 회수되는 다양한 활성을 포함한다. 상기 연골 추출물, 특히 액체 추출물 및 이들의 기능은 이들이 정상 세포에 대해 무-독성인 반면, 매우 다양한 질환 또는 상태에 효과적이기 때문에 강한 잠재력을 지닌다.

모든 가상 적용 (안과용 약에서부터 피부 및 암 치료제의 제조까지)에 대하여, 전체 액체 추출물 중 최소한의 최종 단백질 농도는 매우 낮을 수 있는 (약 0.01mg/ml부터) 것으로 추정된다. 이러한 낮은 범위의 복용량은 접근성에 의존하며, 상기 성분들의 효과적인 포획 및 혈관형성 억제제에 대한 조직의 민감도 및 반응뿐만 아니라, 활성 부위에 대한 활성 성분의 투과에도 의존한다. 몇몇 적용을 위한 제조에서 최종 단백질 농도의 상한치는 현재 알려져 있지 않다. 실험된 가장 높은 최종 농도는 건선의 치료를 위한 조제에서 국소적 투여시 단백질 약 9mg/ml이었고, 경구 투여시 약 12mg/ml이었으며, 암의 경우에는 매일 7ml씩, 관절염의 경우는 21ml씩 투여하였다.

상어 연골 액체 추출물은 동결건조시 그의 활성을 일부 손실할 수 있다. 그러나, 동결건조화에 대한 선행 기술에서 공지된 안정화제 또는 방부제의 첨가로 민감성 활성을 보존할 수 있으며 건조 상태에서 상기 연골 추출물의 높은 적량의 투여를 가능하게 한다.

필요한 물질:

- 냉각제

- 외과용 기구

- 고기 다지기

- 플라스틱 가방

- 산업용 혼합기 (Fisher Scientific에서 구입한 3-속도 혼합기 제품)

- 물 정화 시스템 (역 삼투 및 0.1Em 필터법; Continental Water System, 모델 PRE 2202, 제품번호 91089, Fisher Scientific, 몬트리올, Quebec에서 구입한 Modulab Bioscience RQ/Polishing System). 상기 시스템은 고질의 비발열성 물을 제공한다.

- 정밀도 균형 메틀러 (Mettler), Fisher Scientific에서 구입한 AE 시리즈

- DuPont Canada에서 구입한 원심분리기 Sorvall RC-285

- 원심분리기 CEPA

- 1μM의 구멍을 갖는 나일론 주머니

- 멸균기 *자동 증기 멸균제 Sanyo, 모델 MAC 350P)

- 132℃에서 10분간 멸균되고, 35분간 건조된 Nalgene 500ml 컨테이너 (container)

- 24㎛ 구멍을 갖는 코니칼 (conical) 필터 Whatman Reeve Angel

- 울트라필터 칼럼 (분자량 컷-오프: 적용시 500 kDa 및 1 kDa; 표면: 25평방 피트; 흐름 130L/분; 내부 압력: 30psi; 외부 압력: 5psi; Koch Membrane System Inc., Wilmington, MA, USA에서 구입)

- 130 L/분의 흐름을 제공하기 위한 무균 원심분리 펌프 (Manrch Industries, 모델 ACE-S100, 타입 A)

- 멸균 헛 (hut) (Ingram & Bell에서 구입된 박막 플로우 헛 (laminar flow hut) NuAire)

- Millipack-60 0.22㎛ 멸균 필터

- 멸균의 투명하거나 호박색 유리병

- 농축기 DC-10 Amicon

- Rotofor Biorad 170-2950

- 각각 10, 30 및 100 kDa의 컷-오프 값을 갖는 Amicon 필터 SIOY10, SIOY30 및 SIOY100

- FPLC Pharmacia 216007 (컴퓨터 Pharmacia 216014)

- Hilstand S-300 26mm/60cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10mm/30cm (Pharmacia)

- 동결건조제 Labconco 10273 A

Claims (29)

1. 전체 상어 연골의 수용액상 균질물을 원심분리시켜 얻은 상층액의 분획인 유효량의 상어 연골 추출물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 상층액은 500 KDa의 명목상 분자량 컷-오프 값을 갖는 막상에서 분획되고, 여기서 상기 추출물은 500 KDa 이하의 분자량을 가지며, 상기 추출물은 항-콜라겐 분해증 및 항-염증 활성을 갖는 인간을 제외한 포유동물에 콜라겐 분해증 및 염증으로부터 선택된 병인학적 성분을 갖는 질병 또는 질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 1 KDa의 명목상 분자량 컷-오프 값을 갖는 막상에서 농축되어 1 내지 500 KDa 분자량의 미분자에서 농축된 농축 추출물로 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 피부 염증인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 피부 염증은 물리적 마찰에 의해 발생된 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 피부 염증은 화학적 자극에 의해 발생된 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 피부 염증은 자외선 방사에 노출에 의해 발생된 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제6항에 있어서, 상기 방법은 국소적으로 적용됨을 특징으로 하는 방법.
8. 제3항에 있어서, 상기 방법은 국소적으로 적용됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 방법은 항산화제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 항산화제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제9항 내지 제10항에 있어서, 상기 항산화제는 토코페롤, 토코페롤 유도체, 아스코빅산, 아스코빅산 유도체 및 BHT로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항에 있어서, 상기 방법은 항-염증제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제3항에 있어서, 상기 방법은 항-염증제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제7항에 있어서, 상기 방법은 항-염증제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 방법은 항-염증제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 항-염증제는 야생종에서 유도된 항-자극제인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제13항 내지 제15항에 있어서, 상기 항-염증제는 야생종에서 유도된 항-자극제인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 항-염증제는 콜라 및 녹차 추출물로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 항-염증제는 콜라 및 녹차 추출물로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
20. 제12항에 있어서, 상기 항-염증제는 포스포리파제 A2 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제13항 내지 제15항에 있어서, 상기 항-염증제는 포스포리파제 A2 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 용액, 현탁액, 로숀, 팅크제, 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼, 접착물 및 연고로부터 선택된 담체에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
23. 제11항에 있어서, 상기 추출물은 용액, 현탁액, 로숀, 팅크제, 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼, 접착물 및 연고로부터 선택된 담체에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
24. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 용액, 현탁액, 로숀, 팅크제, 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼, 접착물 및 연고로부터 선택된 담체에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
25. 제17항에 있어서, 상기 추출물은 용액, 현탁액, 로숀, 팅크제, 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼, 접착물 및 연고로부터 선택된 담체에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
26. 제21항에 있어서, 상기 추출물은 용액, 현탁액, 로숀, 팅크제, 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼, 접착물 및 연고로부터 선택된 담체에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
27. 제8항 내지 제10항, 제13항 내지 제15항, 및 제18항 내지 제20중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 용액, 현탁액, 로숀, 팅크제, 겔, 크림, 스프레이, 에멀젼, 접착물 및 연고로부터 선택된 담체에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
28. 제22항 내지 제26항중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 리포좀에 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제27항에 있어서, 상기 추출물은 리포좀에 포함된 것을 특징으로 하는 방법.