HU225490B1

HU225490B1 - Extracts of shark cartilage and process for producing them

Info

Publication number: HU225490B1
Application number: HU9802604A
Authority: HU
Inventors: Paul Brazeau; Christina Juneau; Daniel H Maes; Kenneth Marenus; Eric Dupont
Original assignee: Aeterna Zentaris Inc
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 2006-12-28
Also published as: ES2190475T3; CZ129398A3; IS4728A; DK0859622T3; RU2181292C2; PL187989B1; CA2236021A1; IL119030A; US6025334A; NZ313957A; BG102419A; EP0859622B1; NO981781D0; CO4750839A1; DE69625698T2; KR100296016B1; HK1015683A1; HUP9802604A2; JP2003246740A; TW503108B

Description

A leírás terjedelme 52 oldal (ezen belül 26 lap ábra)

HU 225 490 Β1

A találmány antikollagenolitikus, gyulladásgátló, antiangiogén és tumorellenes hatású cápaporcextraktumokra, előállítási eljárásukra és alkalmazásukra vonatkozik.

A porcok nem erezett szövetek, ezért felmerült a kérdés, hogy tartalmaznak-e érképződést gátló faktorokat. A porcszövetek a tumornövekedéssel szemben is viszonylag ellenállóak. A porcokban jelentkező tumor, a porcszarkóma a legkevésbé erezett szilárd tumor. Az érképződés a tumorfejlődés egyik fontos tényezője. Elhatárolt szilárd tumoros csomók ott fejlődnek ki, ahol a tumorsejtek hatására a közeli érhálózat kiterjed, és ellátja táplálkozási igényeiket. Megvizsgálták az érképződést serkentő tényezők tumorfejlődésre gyakorolt hatását és az érképződést gátló hatású tényezőket és anyagokat, amelyekkel szabályozható a tumornövekedés, illetve melyek tumorcsökkentő hatásúak.

Langer és munkatársai 1976-ban felfedezték, hogy a borjúlapockaporc olyan anyagot tartalmaz, amely a szilárd tumorokban gátolja az érképződést. Mivel vizsgálataik sikeresnek bizonyultak, nagyobb mennyiségű porcforrást kerestek.

Az eresedést gátló anyagok potenciális forrásai lehetnek a cápák, mivel teljes csontvázuk porcból épül fel (testtömegük 6%-a porc, ezzel szemben a borjaké 0,6%). A cápák figyelemre méltó tulajdonsága, hogy kevéssé hajlamosak tumorképzésre. Számos elméletet dolgoztak ki annak magyarázatára, hogy miért ilyen kicsi a cápáknál a tumorfejlődés valószínűsége. Marchalonis és munkatársai (1990) kimutatták, hogy az IgM-antitestek azonnal megtámadnak bármilyen ellenséges anyagot. McKinney és munkatársai (1990) kimutatták, hogy a cápák makrofágjai képesek megkülönböztetni a normális sejteket a daganatos sejtektől, és az utóbbiakat megsemmisítik. Rosen és Woodhead (1980) feltételezték, hogy a cápákhoz és a rájákhoz hasonló állatoknál azért fordul elő ritkán tumoros megbetegedés, mert szöveteik ionerőssége olyan nagy, mintha magas testhőmérsékletűek lennének. A szerzők szerint ilyen feltételek között az immunrendszer immunológiai hatása közel 100%-os. Moore és munkatársai (1993) felfedezték, hogy a cápák antibakteriális és protozoaellenes tulajdonságú aminoszterolt termelnek. Végül Lee és Langer (1983), valamint Folkman és Klagsbrun (1987) kimutatták, hogy a cápák újraereződést gátló anyagot termelnek. Lee és Langer (lásd fent) ezt az anyagot denaturáló körülmények között extrakcióval izolálták cápaporcból (guanidinextrakció), azonban ez az eljárás nagyon hosszú (41 nap) és denaturált elemeket tartalmazó extraktumokat eredményezhet, melyek hatóanyag-tartalma alacsony. A borjakból izolált hatóanyagot körülbelül 16 kilodalton (kDa) molekulatömegűnek találták, de a cápákból kinyert anyagokra nem adtak meg pontos molekulatömeg-értéket. Erről az anyagról csak azt írták le, hogy molekulatömege több, mint 3,5 kDa. Oikawa és munkatársai (1990) a Lee és Langeréhez hasonló extrakciós eljárást alkalmaztak, de sokkal rövidebb időtartammal (2 nap 41 nap helyett). Az Oikawa és munkatársai által cápaporcból izolált antiangiogén hatású anyag molekulatömege 10 kDa tartományra korlátozódik. Schinitsky (4 473 551 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) durva porítású cápaporc vizes kivonatát vizsgálta, és a 100 kDa-nál magasabb molekulatömegű frakciót önmagában vagy glukózaminnal kombinálva gyulladásgátló hatásúnak találta. A szabadalmi leírásban az extraktum egyik komponensével kapcsolatban sem írtak le érképződést gátló vagy tumorellenes hatást. Kuetner és munkatársai (4 746 729 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) polimorfonukleáris neutrofil (PMN) elasztáz inhibitort izoláltak szarvasmarhaporcból. Ezt az inhibitort a porcextraktum 50 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakciójából nyerték ki. A frakcionálást Sephacryl S-200-οη végezték, a kapott számos frakció közül az antielasztáz hatású 10-40 kDa közötti frakciókat összegyűjtötték. A hatásos komponens izoelektromos pontja 9,5, molekulatömege körülbelül 15 kDa. Kuetner és munkatársai (4 042 457 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) kimutatták, hogy a szarvasmarhaporc 50 kDa-nál kisebb molekulatömegű komponense sejtburjánzást gátló hatású, de nem gyakorol hatást belhámsejtek növekedésére. Balassa és munkatársai (4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) tumorellenes hatású porcextraktumot állítottak elő vizes oldatban. A Balassa-féle eljárással nyert extraktum nem mutat antiangiogén hatást. Spilburg és munkatársai (4 243 582 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) kétféle 65 kDa molekulatömegű (pl 3,8) glikoproteint izoláltak szarvasmarhaporcból (guanidinextrakcióval), melyeket antitripszinhatásúnak és belhámsejt-növekedést gátló hatásúnak találtak.

A borjúporc és a cápaporc sokféle biológiai hatása ismert, például gyulladást okozó hatás, gyulladásellenes hatás, antiangiogén hatás, lizozimre gyakorolt hatás, sejtnövekedést serkentő hatás, I és IV típusú kollagenáz, elasztáz és proteáz - mint például tripszin, kimotripszin és plazmin - gátló hatás.

A cápaporc antiangiogén komponenseit általában nyúl szaruhártya tasak vizsgálattal vagy csirke korioallantois membrán (CAM) vizsgálattal vizsgálták. Meztelen egerekbe közvetlenül beültetett humán melanoma xenografton vizsgálták a teljes porított porcok tumorra gyakorolt in vivő hatását (5 075 112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint CAM teszttel antiangiogén hatását. Habár a porcextraktumnak tulajdonítottak tumorellenes hatást, ezt a hatást leggyakrabban az antioangiogén komponensnek tudták be, amely a tumort megfosztja a vérellátástól. Mostanáig nem bizonyították, hogy a cápaporc közvetlenül hat a tumoros sejtburjánzásra.

A cápaporcextraktumok és frakciók előállítására vonatkozó eljárások ismertek. Ezek egy részénél extrakció nélkül durvára porított porcot állítottak elő (5 075 112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Más esetben denaturálóanyagot alkalmaztak, mint például guanidint (4 243 582 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Mások a

HU 225 490 Β1 porc előkezelését úgy végezték el, hogy enzimatius kezeléssel távolították el a porcot körülvevő izom-, idegvagy érszerkezeteket, az előkezelési lépést a zsír szerves oldószerben való eltávolítása követte, majd a hatóanyagot vizes fázisban extrahálták [Balassa és munkatársai 3 478 146, 4 350 682, 4 656 137 és 4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások). A fenti előkezelés hatása a biológiailag aktív porckomponensek épségének megőrzésére nem ismert. Ha az enzimes kezelés nagyon kimerítő, az aktív fehérjekomponensek hidrolizálhatnak. Például a Balassa-féle módszerrel (4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) antiangiogén hatást nem mutató folyékony extraktumok állíthatók elő; a veszteséget feltehetőleg ilyen enzimatikus degradálódás okozza. A Balassa-féle eljárás nem foglalja magában az aktív komponens dúsítását elősegítő frakcionálási lépést, amely továbbá hatóanyagokban gazdagítaná az extraktumot. Mások egyszerűen vizes extraktumot állítottak elő a porcból a nem oldható anyag eltávolításával (vizes oldatban a 4 473 551 számú, vagy sóoldatban a 4 746 729 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban). Molekulatömeg-specifikus frakciókat állítottak elő, tisztították és további vizsgálatokat végeztek ereken (lásd a fenti ismertetést).

A fent idézett eljárásoknak számos hátrányuk van. Bizonyos értékes komponensek denaturálódhatnak. Ha ez nem is következik be, közös hátrányuk, hogy gyakorlati szempontból túl hosszadalmasak. Ezen túlmenően a hosszadalmas eljárások nem szükségképpen vezetnek megfelelő mennyiségű hatóanyag előállításához, és a kinyert komponensek egy része egyáltalán nem, vagy nem elegendő detektálható aktivitást mutat, más komponensek figyelmen kívül hagyhatók a specifikus hatás elérése szempontjából.

Érképződés nem csak rákos növekedésnél fordul elő. Számos fiziológiai rendszerre ható betegség vagy állapot áll kapcsolatban az érképződéssel (az érintett fiziológiai rendszert a betegség után zárójelben adjuk meg), például ízületi gyulladás és ateroszklerózisos folt (csont és ínszalagok), retinopathia diabetica, neovaszkuláris glaukóma, pigmentdegeneráció, szemherpesz, trachoma és szaruhártya-átültetéssel kapcsolatos újraereződés (szem), pszoriázis, szkleroderma, rosacea, hemangióma és hipertrófiás hegesedés (bőr), vaszkuláris adhézió és angiofibróma (vérrendszer). A betegségek kezelésére a rákterápiához hasonlóan bármilyen új, érképződést gátló „faktor” alkalmazható. Ezen betegségek kezelésében, akárcsak a rákterápiában és más, angiogénfüggő betegségek kezelésében. Ezen túlmenően, mivel a fent említett betegségek nagy része gyulladásos tünetekkel jár, ezért ezek a betegségek és tünetek bármilyen új és hatásos gyulladásgátló „faktor” segítségével kezelhetők, akárcsak egyéb gyulladásos betegségek vagy tünetek. Mivel a proteázok, mint a kollagenázok, kollagéndegradáló hatásúak, ezért a rák és az idő előtti öregedés és hasonló betegségek és tünetek kialakulásában részt vesznek. Egy új és hatásos antikollagenolitikus „faktor” jól alkalmazható kollagenolitikus komponenssel járó betegségek és tünetek kezelésére. Mivel az angiogenezis, gyulladás és a proteolízis önmagukban is és számos más betegséggel vagy tünettel együtt is előfordulhatnak, nagy terápiás értéke van annak a terméknek, amely ezeket a hatásokat legalább antagonizálni képes a normális testfunkciók zavarása nélkül.

Találmányunk új eljárást biztosít a sokoldalú terápiás hatású porcextraktumok előállítására. A cápaporcextraktumban kielégítő koncentrációban vannak jelen többek között antiangiogén, gyulladásgátló, antikollagenolitikus, in vivő tumoros sejtburjánzás-ellenes és közvetlenül in vitro tumoros sejtbuijánzás-ellenes hatású anyagok. Más hatások még nem azonosítottak vagy nem bizonyítottak. A fenti hatások mindegyikét megfigyeltük cápaporc-folyadékextraktumban, és ezek egy részét megfigyeltük vagy igazoltuk a szilárd extraktumban is.

Találmányunk tárgya új eljárás az ép porcban jelen lévő, biológiailag aktív vízoldható komponensek jelentős részét tartalmazó porc-folyadékextraktum előállítására, mely a következő lépésekből áll:

a) a cápaporcot vizes oldatban homogenizáljuk a fent megadott hatású komponensek épségének megőrzéséhez megfelelő körülmények között, körülbelül 500 pm vagy ennél kisebb részecskeméret eléréséig, a fent megadott hatású részecskék nyers folyadékextraktum és keverékének előállítására;

b) a homogenátum centrifugálásával elválasztjuk a részecskéket a nyers folyadékextraktumtól; és

c) tovább folytatjuk a nyers folyadékextraktum elválasztását körülbelül 500 kDa-nál kisebb vagy azzal egyenlő molekulatömegű porcmolekulákat tartalmazó végső folyadékextraktum előállítására.

Új eljárásunk nagy előnye, hogy könnyen és hatásosan elvégezhető. Segítségével nagy kitermeléssel állítható elő legalább a fent említett biológiai hatásokat mutató, különösen cápaporcot tartalmazó extraktum. A porcextraktumot előnyösen hidegben állítjuk elő (kb. 0 °C és 20 °C közötti hőmérséklet-tartományban), nem denaturáló körülmények között (előnyösen tiszta vízben közel semleges pH-π, körülbelül pH 5-8), ezzel növelve az ismeretlen fizikai-kémiai tulajdonságú anyag kinyerésének valószínűségét. Az eljárás szerint a porckomponens rövid ideig tartó homogenizálással (mindössze 10 perc és 20 perc közötti időtartam) kis térfogatú oldat formájában extrahálható (1 kg porcból csupán 1 liter). A szilárd extraktum kinyerésére hasonló módon járunk el, kivéve, hogy a kinyert szemcsés anyagot elválasztjuk, és a felülúszóra tekintet nélkül liofilizáljuk.

Találmányunk porcextraktumokra, különösen porcos halakból készült extraktumokra, még előnyösebben cápaporcextraktumokra vonatkozik. A szilárd extraktum aktivitást mutat. Feltehetőleg kollagén és nem vízoldható komponenseket tartalmaz. Tartalmazhat továbbá a teljes folyadékextraktumból extrahálásakor visszamaradó hatóanyagot. A teljes folyadékextraktum hatóanyagban nagyon gazdag. Felhasználható közvetlenül vagy koncentrálás után. A koncentrálási lépés végrehajtása után a biológiai aktivitás előnyösen meg3

HU 225 490 Β1 marad. A hatóanyagokat károsító eljárások, mint a hővel történő bepárlás, óvatosságból kerülendő. A találmányunk szerinti folyadékextraktum koncentrálását ultraszűréssel végezzük, körülbelül 1 kDa résméretnél elválasztó membránon. Körülbelül 0,1 kDa molekulatömeg-értéknél vágómembránon végzett nanoszűréssel még jobban koncentrálhatok a folyadékextraktum biológiai (antiangiogén, antikollegenolitikus) hatóanyagai. Ennek eredményeképpen kapott koncentrált extraktum, vizsgálataink szerint, körülbelül 0,1 kDa és körülbelül 500 kDa közötti molekulákat tartalmaz.

A folyadékextraktumot (0 és 500 kDa közötti molekulatömeg) továbbfrakcionáljuk a hatóanyag jellemzésére. Különböző eljárásokkal számos hatóanyag-frakciót nyerünk. Ezek egy részét tumorellenes hatásuk szempontjából tumoros sejtvonalakon vizsgáljuk, és nagy vonalakban molekulatömeg- és izoelektromos pont meghatározással jellemezzük. Más frakciókat hatásukkal, különösen antikollagenolitikus vagy antiangiogén hatásukkal jellemzőnk. A frakciók teljes jellemzését és azonosítását még nem végeztük el. A teljes folyadékextraktum és a frakciók - előnyösen az utóbbiakat használjuk - jelentős aktivitást mutatnak. A nagy mennyiségű porított porc beadása helyett sokkal elfogadhatóbb a dúsított extraktum beadása.

Találmányunk kiterjed hatóanyagként a fenti porcextraktumok egyikének hatásos mennyiségét tartalmazó gyógyászati vagy kozmetikai készítményekre is. Legnagyobb jelentőségűek a bőrgyógyászati és kozmetológiai készítmények. Ezek jelentősége a porcextraktumok megfigyelt hatásában rejlik. Ebben a vonatkozásban megfigyelt antiangiogén, antikollagenolitikus és gyulladásgátló hatás és a jelzési utakon, például a keratinocitákban a protein-kináz C által közvetített sejtdifferenciálódás antagonista hatása lehetővé teszi a cápaporcextraktumok alkalmazását gyulladást és irritációt csökkentő, bőrráncosodást és sorvadást rendbe hozó, korai öregedést megállító, aknecsökkentő, a bőr védőszerepét javító, a szem körüli sötét karikákat csökkentő, a pókszerű vénákat és a visszértágulatot csökkentő, a szemölcsöket csökkentő és bőrnyugtató hatású készítményekben és eljárásokban. Ezek az eljárások is a találmány tárgyát képezik.

Ezen túlmenően, mivel a cápaporc-folyadékextraktumot sikeresen alkalmazzuk rák, ízületi gyulladás, pszoriázis és akne esetén, találmányunk kiterjed a tumoros sejtburjánzás, angiogenezis, gyulladás és kollagenolízis közül egy vagy több tünettel járó betegség vagy állapot kezelésére alkalmas készítményekre és eljárásokra is.

Találmányunk jellemző megvalósítási módjait az alábbiakban ismertetjük közelebbről, és az alábbi ábrákkal illusztráljuk, melyeknek célja a találmány szemléltetése, azonban az oltalmi kör nem korlátozódik ezekre.

Az ábrákon:

az 1. ábrán a folyadékextraktum speciális aminosav-összetétele látható;

a 2. ábrán a cápaporc (szilárd extraktum) ZR75-1 és MCF-7 sejtvonalakra gyakorolt dózis-válasz gátló hatása látható;

a 3. ábrán MCF-7 sejtek mennyiségének dózis-válasz görbéje látható növekedő esztradiolkoncentráció jelenlétében szilárd porcliofilizátum két különböző koncentrációnál és anélkül;

a 4A. és 4B. ábrán patkányok rákos emlőmirigymetszetének összehasonlítása látható, melyeket vízzel (A) vagy szilárd és folyékony porcextraktum (B) kombinációjával mesterségesen tápláltunk;

az 5. ábrán látható, hogy a porccal kezelt patkányok tumorában az eresedés területe 50%-kal csökken;

a 6. ábrán látható, hogy a folyékony porcextraktum nem gyakorol hatást a fibroblasztsejt-szaporodásra;

a 7. ábrán a folyékony porcextraktumnak a HUVEC szaporodására gyakorolt gátlásának dózis-válasz görbéje látható;

a 8. ábrán a folyékony porcextraktumnak a keratinociták TPA által indukált differenciálódására gyakorolt gátlóhatása látható;

a 9. ábrán a folyékony porcextraktum kollagenázaktivitásra gyakorolt gátlásának dózis-válasz görbéje látható;

a 10. ábrán a folyékony porcextraktumnak az embrionális eresedési vizsgálatban (ex ovo) mutatott gátlásának dózis-válasz görbéje látható;

a 11. ábrán különböző folyékony porcextraktumdózisok tumornövekedésre gyakorolt gátlóhatása látható egereken;

a 12. ábrán bemutatjuk, hogy folyékony porcextraktum intraperitoneális beadásával jelentősen növelhető a termék tumornövekedést gátló hatása;

a 13. ábrán nem denaturáló körülmények között rotoforral elválasztott folyadékfrakciók elektroforézisprofilja látható; a bal oldalon a marker-molekulatömegek láthatók, ezt követi a folyadékextraktumminta frakcionálás előtt, összehasonlítva az izolált frakciókkal;

a 14. ábrán a találmányunk szerinti teljes folyadékextraktum 10 kDa-nál alacsonyabb molekulatömegű frakciójának HPLC migrációs felvétele látható, amely frakciót koncentráltuk, és 5 alfrakcióra választottuk szét;

a 15. ábrán a találmányunk szerinti folyékony cápaporcextraktum két frakciójával (DUP) meghatározott EVT eredményeket mutatjuk be, egyik molekulatömege kisebb, mint 10 kDa, a másik molekulatömege nagyobb, mint 10 kDa;

a 16. ábrán három különböző cápaporcextraktum

FPLC migrációs felvétele látható. Az

A felvételen DUP jelentése a találmányunk szerinti folyékony porcextraktum.

A B és C felvételeken BAL, illetve ÓIK

HU 225 490 Β1 jelentése rendre Balassa és munkatársai, illetve Oikawa és munkatársai által a szakirodalomban ismertetett extraktumok;

a 17. ábrán a 16. ábránál meghatározott extraktumok HPLC migrációs felvételei láthatók;

a 18. ábrán a találmányunk szerinti és a szakirodalomban ismertetett folyadékextraktumok CZE vizsgálattal történő összehasonlítása látható, A=DUP; B=BAL; C=OIK;

a 19. ábrán a találmányunk szerinti és a szakirodalomban ismertetett folyadékextraktumok EVT vizsgálattal történő összehasonlítása látható;

a 20. ábrán a találmányunk szerinti és a szakirodalomban ismertetett extraktumok aminosavtartalmának összehasonlítása látható;

a 21. ábrán két pszoriázisban szenvedő páciens állapotának (egyik esetben, a 22A. és 22B. ábrán hiperkeratózissal, másik esetben, a 22C. és 22D. ábrán hiperkeratózis nélkül) koncentrált folyékony porcextraktum hatásos mennyiségét tartalmazó helyi készítménnyel való kezelés hatására bekövetkező jelentős javulása látható (alsó fénykép) összehasonlítva kezdeti állapotukkal (felső fénykép);

a 22. ábrán emberi arcon megjelenő pókhálószerű vénák folyékony porcextraktummal történő kezelés hatására bekövetkező javulása látható;

a 23. ábrán emberek szeme körül megjelenő sötét karikák folyékony porcextraktummal történő kezelés hatására bekövetkező javulása látható;

a 24. ábrán emberek lábán megjelenő visszértágulatok folyékony porcextraktummal történő kezelés hatására bekövetkező javulása látható;

a 25. ábrán aknéban szenvedő páciens állapotának kifejezett javulása látható folyékony porcextraktum hatásos mennyiségét tartalmazó helyi készítménnyel való kezelés hatására (alsó fénykép) összehasonlítva kezdeti állapotukkal (felső fénykép);

a 26. ábrán a folyékony porcextraktum emberi bőrre kifejtett gyulladásgátló hatása látható;

a 27. ábrán folyékony porcextraktummal kezelt ember bőre védőfunkciójának javulása látható.

A találmány egy speciális megvalósítási módja szerint a porcot egészséges fekete tüskés cápákból és közönséges tüskés cápákból nyerjük ki. Izom- és kötőszöveteiket etanollal megtisztított szikével és ollóval távolítjuk el. Ezután a porcot későbbi felhasználás céljából műanyag zsákokban, vákuumcsomagolásban -20 °C-ra fagyasztjuk. A találmány szerinti eljárásban bármilyen forrásból származó porc alkalmazható. Választásunk a bevezetőrészben ismertetett okokból esett a cápaporcra. Azt találtuk, hogy más porcos halak családjába tartozó egyedekből kiindulva is közel egyenértékű termék nyerhető. Emlősök porcából származó termékek valószínűleg ettől eltérnek mind a hatóanyag természetét, mind koncentrációját illetően.

Az extrakciót megelőzően a porcok bármilyen módon preparálhatok, ha ez nem befolyásolja lényegesen a kívánt termék aktivitását (például a teljes folyadékextraktum vagy egy bizonyos frakciója). Balassa és munkatársai (4 822 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) megállapítása szerint bizonyos hatóanyag-komponensek képesek ellenállni a porcot körülvevő szövetek eltávolítására szolgáló proteolitikus kezelésnek, más anyagok ilyen kezeléssel szemben nem ellenállók. Az antiangiogén hatás azon hatások közé tartozik, amelyek ilyen kezelésnek nem képesek ellenállni (19. ábra). Ezért amennyiben olyan folyadékextraktumot kívánunk előállítani, amely a lehető legtöbb különböző hatású vízoldható hatóanyagot tartalmaz, akkor az extrakciós eljárás során ezt a kezelési lépést el kell kerülni, vagy gondosan kell végezni a nagymértékű hidrolízis vagy proteolízis elkerülésére.

Porcextraktumok előállítása

A tiszta porcot frissen 4 °C-ra felolvasztva vagy fagyasztva használjuk fel. Ezután a porcot egy etanollal sterilizált húsdaráló pórusain többször (leggyakrabban háromszor) ledaráljuk megfelelő mennyiségű víz hozzáadása mellett [a minimális térfogatmennyiség az egyenlő mennyiség (tömeg/térfogat)], de ez a térfogat növelhető anélkül, hogy az értékes komponensek kinyerésének hatékonyságára hatást gyakorolna. A kis térfogat előnyös, mivel gyakorlati szempontból kényelmesebb ezzel dolgozni, mint szükségtelenül nagy térfogatokkal. A gyakorlatban a vizet inverz ozmózissal és 0,1 pm-es szűrőn való szűréssel tisztítjuk. Víz helyett sokféle vizes oldat alkalmazható (például sóoldatok). Ha sokféle vízoldható hatóanyagot kívánunk kinyerni, akkor közel semleges pH-η (pH 5,0 és pH 8,0 között) és nem denaturáló körülmények között előnyös dolgozni, a víz és bizonyos porckomponensek denaturálódásának elkerülésére. A nem ismert fehérjék viselkedése vizes oldatban nem számítható ki. Egyeseknek kedvezőbb a savas pH, másoknak a bázisos pH. Ezen túlmenően bizonyos fehérjék kíméletes denaturáló körülmények között extrahálhatók, ha a denaturálódás nem teszi megfordíthatatlanná ezeknek a fehérjéknek vizes oldatban való renaturálódását. Le kívánjuk szögezni, hogy találmányunk oltalmi köréhez tartozik az extrakcióval kapcsolatos minden körülmény, amely a biológiailag hatásos vízoldható porckomponens tartósításával összefér. Ezeket a tényezőket figyelembe véve megfontolt választásnak látszik egy, a későbbiekben meghatározandó szerkezetű és tulajdonságú komponensek jó kitermeléssel való előállítására olyan eljárást

HU 225 490 Β1 alkalmazni, ahol a porc hatóanyagainak extrakcióját tiszta vízben végezzük.

A porc/víz keveréket ezután egy konyhai keverőgépben maximális sebességgel homogenizáljuk körülbelül 4 °C-on 20 percig. A homogenizálás folyamán a homogenátum hőmérséklete közel 20 °C-ra emelkedik. Természetesen mind az extrakció idejét, mind a kitermelést befolyásolhatja a kevertetés sebessége és a vizes oldat térfogata. Ezért az (500 pm méretűnél kisebb részecskékké történő) homogenizálás ideje 10 perc és 24 óra között, előnyösen 10 perc és 60 perc között változhat. A hőmérsékletet 10 °C alatt tartjuk, a hatóanyag endogén enzimek hatására történő degradációjának elkerülésére, ha nem használunk enziminhibitort. Ideális esetben a hőmérséklet közel 0 °C. Mivel a kísérletet általában hideg szobában végezzük, ahol a hőmérséklet 4 °C és 10 °C között tartható, ezt a hőmérséklet-tartományt elfogadhatónak tartjuk az eljárásban. A továbbiakban a fent megadott elfogadható hőmérséklet-tartomány helyett a tömörség kedvéért a „körülbelül 4 °C” kifejezést használjuk.

A homogenátum folyadékfrakciója Polytron diszintegrátorral is előállítható 10 perc alatt 4 °C-on, ha a keverőben nem csökken megfelelően a részecskék mérete. Más módon, a keverék egyszerűen homogenizálható egy megfelelően kialakított dezintegrátorban, amellyel megtakarítható a 10 perces folyadékfrakcionálási lépés. A teljes homogenizációs lépés végén a végső részecskeméret kisebb, mint 500 pm. Természetesen az első darált por kinyerésénél megadott időés hőmérséklet-tartományok is alkalmazhatók. A homogenizálás utáni részecskeméret nem szükséges, hogy nagyon kicsi legyen. Ezért az extrakció előtt a porc porítására nincs szükség. Ezzel szemben, ha a porcot porítjuk a vizes extrakció előtt, akkor a porc értékes hatóanyagai denaturálódhatnak, különösen ha ezt fagyasztással vagy hővel történő szárítással végezzük.

A homogenátumot 4 °C-on 13 600 g-vel 15 percig centrifugáljuk, ezzel az egyetlen lépéssel gyorsan és hatékonyan elválasztjuk a felülúszót a szemcsés anyagtól. A szakember számára ismertek ennek az eljárásnak a körülményei és változatai, melyek az adott készülékben a homogenátum térfogatától is függenek.

A kapott szemcsés anyagot 24 óra és 48 óra közötti időtartamig liofilizáljuk. Ezt az első frakciót a továbbiakban liofilizátumnak vagy szilárd extraktumnak nevezzük.

A felülúszót, amennyiben szükséges, egy 24 pm-es Whatman szűrőn szűrjük, az ultraszűrő oszlopon való szűrést zavaró részecskék eltávolítására. A szűrt anyagot ezután körülbelül 4 °C-on egy tangenciális áramlású szűrőoszlopon ultraszűrjük, melynek porozitása körülbelül 500 kDa, így kapjuk a 0 és körülbelül 500 kDa közötti molekulatömegű vízoldható molekulákat tartalmazó első nyers permeátumot. Ezt a szűrt nyers extraktumot 0,22 pm-es szűrőn szűrjük, és aszeptikus üvegekbe töltjük felhasználásig. Ezt a frakciót a továbbiakban nyers permeátumnak vagy folyadékextraktumnak nevezzük.

Alternatív módon, a szemcsés anyag és a felülúszó elválasztására nagyobb teljesítményű centrifugálási eljárást is kifejlesztettünk. Eszerint a 13 600 g-vel 15 percig végzett centrifugálás és ezt követő Whatman szűrőn végzett előszűrés egy 1 pm porozitású nejlontasakkal felszerelt CEPA centrifugálóberendezéssel 3000-4000 g-n végzett centrifugálással helyettesítjük. A 25 kg/25 liter készítményt ezzel az eljárással 30 perc alatt centrifugáljuk, és 29 liter felülúszót kapunk. A kapott vizes oldat térfogata nagyobb, mint a kiindulási víztérfogat, ez arra utal, hogy a porc saját víztartalma növeli a térfogatot. A liofilizátum és a teljes folyadékextraktum összetételének meghatározásakor nagy vonalakban figyelembe vettük a különböző sarzsokra és különböző kiindulási anyagokra kapott eredményeket.

Szilárd extraktum:

Zsírok 7,35%¹

Fehérjék 46,2%²

Nedvességtartalom 20,4%

Nátrium 4,16 mg/g³

Kálium 2,64 mg/g

Kalcium 114 mg/g

Magnézium 1,49 mg/g

Cink és vas nyomokban

Folyadékextraktum:

Zsírok 0,10-0,20%¹

Fehérjék 8-25 mg/ml²

Száraz tömeg 8-25 mg/ml

Nedvességtartalom 97-99%

Nátrium 30-220 mg/100 g³

Kálium 30-40 mg/100 g

Kalcium 2,0 mg/100 g

Magnézium 1,1mg/100g

Cink és vas nyomokban

T ² A méréseket az AOAC Official (1984) publikált utasításai 16,219-220 és a 2,055 szakasza szerint végezzük.

³ A méréseket az SAA eljárás szerint végezzük.

A fehérjetartalmat Kjeldahl-módszerrel határozzuk meg, amely valójában a szerves nitrogéntartalom (N) mérésén alapul. A szerves nitrogéntartalomból az ekvivalens fehérjetartalom a következő egyenlet alapján határozható meg:

Fehérjetartalom (mg/ml)=%N 6,25/100

A szénhidrátok nem detektálhatok, de feltételezhető, hogy egyik-másik extraktumban előfordulnak proteoglikánok és/vagy mukopoliszacharidok formájában. Lehetséges, hogy ezeket a vegyületeket a mért nedvességtartalom foglalja magában, ugyanis a liofilizátumnak a hidroxicsoportok alapján meghatározott nedvességtartalma váratlanul magas. A mért 20%-os nedvességtartalom közel azonos a porcból kinyerhető százalékos szénhidráttartalommal, míg a liofilizátum nedvességtartalmának a 0%-hoz kellene közel állnia, azonban ez a feltételezés még nem bizonyított. Meghatározzuk a folyékony porcextraktum aminosavtartalmát. A teljes aminosavmennyiség átlaga körülbelül 1,1 mg/ml, ebből a szabad aminosav mennyisége 0,67 mg (61%), és a fehérjeeredetű aminosav mennyisége 0,44 mg (39%). Az egyes aminosavak eloszlása

HU 225 490 Β1 az 1. ábrán látható. Jelentős mennyiségű taurint is detektálunk (nem látható).

A folyadékextraktumban jelen lévő fő aminosavak a porcból származó fehérjék és peptidek képviselői. Például lizin, glicin, aszparaginsav és glutaminsav teszi ki a folyadékextraktum aminosavtartalmának nagy részét, és ezek képezik a kollagénben a N-telopeptid intermolekuláris térháló főkomponenseit [Hanson és munkatársai: J. Boné & Min. Rés. 7, 1251-1258 (1992)].

A folyadékextraktum mikrobás határát USP XXIII <61 > standard alkalmazásával szabályozzuk.

Hatástani vizsgálatok

Szilárd extraktum

In vitro vizsgálat

A vizsgálatokat hormonfüggő MCF-7 és ZR75-1 rákos sejtvonalakon végezzük [az ATCC (R) számok rendre 22-HTB és 1500-CRLj.

ZR75-1 sejtek

a) BASAL RPMI táptalaj: 52 g fenolvöröst nem tartalmazó RPMI 1640-et (Sigma R8755), 17,875 g Hepest (szabad sav; Sigma HO763), 0,55 g nátrium-piruvátot (Sigma P5280) és 10 g NaHCO₃-ot 5 I tiszta vízben oldunk, és az oldat pH-ját 7,40-ra állítjuk be NaOH-dal.

A fel nem használt oldatot fénytől védve tároljuk, mert fényérzékeny anyagokat tartalmaz.

Az oldatot szűrjük, 500 ml-es steril üvegekbe töltjük, és 4 °C-on maximum három hónapig tároljuk.

b) Sejttenyészet fenntartására szolgáló táptalaj: A Basal RPMI táptalajt a következő anyagokkal egészítjük ki: 10 térfogat% FBS (szarvasmarha magzati szérum), 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát (Sigma P0906)/ml táptalaj, 2 mmol/liter L-glutamin (Sigma G1517) és 1 nmol E₂ (β-esztradiol Sigma E8875).

c) Kísérleti táptalaj: A Basal RPMI táptalajt a következő anyagokkal egészítjük ki: 5% FBSA (faszénen adszorbeált szarvasmarha magzati szérum), 2 mmol/l L-glutamin, 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát/ml táptalaj és 50 ng/ml inzulin (Sigma). Ehhez a táptalajhoz növekvő koncentrációban adjuk a fent ismertetett liofilizátumot és E₂-t (10^-12-5 mol/l).

MCF-7 sejtek

a) BASAL DME-F12 táptalaj: DME-12 táptalajt (bikarbonátot és fenolvöröst nem tartalmaz; Sigma) a gyártó utasításai szerint állítunk elő tiszta vízben. Egy literhez 1,2 g nátrium-bikarbonátot adunk, és kémhatását pH 7,40-ra állítjuk be NaOH/HCI-dal. Az oldatot szűrjük, 500 ml-es steril üvegekbe töltjük, és 4 °C-on tároljuk maximum három hónapig.

b) Sejttenyészet-táptalaj: A Basal DME-F12 táptalajt a következőkkel egészítjük ki: 10% (térfogat/térfogat) FBS (szarvasmarha magzati szérum), 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát/ml táptalaj, 2 mmol/liter L-glutamin (Sigma) és 1 nmol E₂.

c) Kísérleti táptalaj: A Basal DME-F12 táptalajt a következőkkel egészítjük ki: 5% FBSA (dextrán-faszénen abszorbeált szarvasmarha magzati szérum), mmol/liter L-glutamin, 100 U penicillin G/50 pg sztreptomicin-szulfát/ml táptalaj és 50 ng/ml inzulin (Sigma). A liofilizátumot és az E₂-t a ZR75-1 sejteknél megadott koncentrációban alkalmazzuk.

d) Az FBSA előállítása: Szarvasmarha magzati szérumot 1 % (tömeg/térfogat) faszénnel (szénnel színtelenített lúg) keverünk. A faszénszérum oldatához T70 dextránoldatot adunk 0,1% koncentráció (tömeg/térfogat) eléréséig. Az elegyet egy éjszakán át keverjük 4 °C-on. Ezután 4 °C-on 30 percig 10 000 g-n centrifugáljuk, majd a szérumot dekantáljuk, és ismételten azonos arányú faszénnel és dextránnal keverjük össze. Ezután szobahőmérsékleten három órán át kevertettük, és újra centrifugáljuk. A szérumot 56 °C-on hőkezeléssel 20 percig inaktiváltuk, majd sterilen szűrjük, és steril kónuszos Falkon-csőbe adagoljuk.

Kísérleti tenyészeten végzett vizsgálatok és eredmények

ZR75-1 és MCF-7 sejteket a 24 mérőhelyes tálcákon 20 000 sejt/mérőhely sűrűségig vagy a 6 mérőhelyes tálcákon 150 000 sejt/mérőhely sűrűségig szaporítunk, és a fent ismertetett eljárással előállított liofilizátum különböző mennyiségével vagy anélkül kezeljük. Ehhez a hatáshoz a szilárd porcextraktumot sejtkultúraközegben reszuszpendáljuk, és sterilen szűrjük a vízoldható komponensek kinyerésére és vizsgálatára. Minden kísérletet háromszor ismételünk meg. A sejttenyészet-táptalajt minden második nap friss táptalajjal helyettesítjük. A sejteket állandó nedvességtartalmú, 5% CO₂-ot tartalmazó atmoszférában, 37 °C-os inkubátorban tenyésztjük az első, második, harmadik vagy negyedik kísérletnek megfelelően, rendre 17, 7, 3 vagy napig. A sejtszaporodás gátlását a sejtek direkt megszámolásával vagy a mérőhely teljes DNS-tartalmának mérésével határozzuk meg.

Liofilizátumkoncentráció	Sejtgátlás (%)
MCF-7	ZR75-1
1. kísérlet: 17 nap
1 mg/ml	1,5	2,00
5 mg/ml	14,33	33,6
10 mg/ml	62,66	90,8
2. kísérlet: 1 nap
1 mg/ml	3,73	0,97
5 mg/ml	15,7	29,00
10 mg/ml	68,37	66,00
3. kísérlet: 3 nap
50 mg/ml	95,8	95,00
100 mg/ml	94,6	98,00
4. kísérlet: 3 nap
10 mg/ml	34,4	51,5
20 mg/ml	62,5	70,5
50 mg/ml	95,8	95
100 mg/ml	94,6	98

A sejtszaporodás gátlásának fentiekben bemutatott százalékos értékeiből látható, hogy a szilárd porcextraktum a dózistól függő mértékben gátolja a mindkét sejtvonal sejtjeinek szaporodását.

A 2. ábrán jól látható, hogy a szilárd extraktum 50 és 100 mg/ml dózisnál három nap kezelés után egyértelműen gátolja ezen sejtvonalon a hipopláziát.

HU 225 490 Β1

3000 mg/kg/nap 14

5000 mg/kg/nap 15

2. kísérlet: 10 hét időtartam

Placebo 0

3000 mg/kg/nap 12

3000 mg/kg/nap+3 ml felülúszó 18

3000 mg/kg/nap+3 ml felülúszó 20 +1 ml inj. ip. felülúszó

A 3. ábrán látható, hogy 10^_12-10^-9 mól/liter esztradiol jelenlétében a kezelt sejtek a kontrollsejtekhez hasonlóan viselkednek, azaz nem hatnak rájuk ezek a hormondózisarányok. Ezzel szemben 1 nmol/l érték felett a kontrollsejtek erősen reagálnak, és a DNS-koncentráció 10^-7 mól/liter esztradiol jelenlétében eléri a 3,75 pg értéket (szemben az esztradiol nélküli 0,69 pg kontrollértékkel). A 30 és 50 mg/ml liofilizátummal kezelt sejtekben mért DNS-érték maximuma sorrendben 1,9 és 1,8 pg. A 3. ábrán látható, hogy a kezelt sejtek affinitási konstansa (Km) esztradiolra 3-16-szor nagyobb (31,3 nmol/l és 174,0 nmol/l), mint a kontrollsejtek Km-értéke 30 mg/ml és 50 mg/ml koncentrációnál. Ez azt jelenti, hogy szilárd porcextraktum jelenlétében azonos sejtszaporulat eléréséhez nagyobb esztradiolkoncentráció szükséges. Következésképpen az extraktum csökkenti a kezelt sejtek esztradiolra adott maximális válaszát (90%-os gátlás), és növeli ezek affinitási konstans értékét.

In vivő vizsgálatok

DMBA-val kiváltott emlőrákos patkánymodell

a) A vizsgálati rendszer ismertetése

Négyszáz darab 40 napos nőstény Sprague-Dawley-patkányt (Charles River Co. St-Constant, Québec) 12 napig szoktattunk környezetükhöz. Ezután 20 mg DMBA-t (9,10-dimetil-1,2-benzantracén, Sigma Chemical Co.) kapnak 1 ml gabonaolajban mesterséges táplálással. Három hónap múlva kiválasztunk 240 patkányt, melyeknél emlőrák fejlődött ki, és ezeket két csoportra osztjuk. Az első csoportot öt alcsoportra osztjuk. A kezelt csoportokban lévő patkányoknak nyolc héten át napi dózisban növekvő mennyiségű liofilizátumextraktumot adunk 3 ml vízben, míg a kontrollcsoport azonos mennyiségű vizet kap. A második csoportot négy alcsoportra osztjuk. A kezelt csoportokba tartozó patkányoknak tíz héten át szintén napi dózisban 3 ml vízben adunk liofilizátumot folyadékextraktummal kombinálva vagy anélkül, és a kontrollcsoport ugyanennyi vizet kap. A második csoportba tartozó patkányok közül egy alcsoportot 3000 mg/kg/nap koncentrációban kezelünk a liofilizátummal, és emellett intraperitoneális (ip.) injekcióban 3 ml folyadékextraktumot adagolunk, amely a folyadékextraktum kisebb dózisát tartalmazta (körülbelül 8 mg fehérjetartalom 1 ml vízben).

A patkányok testtömege a kéthetes kísérlet kezdetén 151-175 g, ad libitum táplálkoznak és vizet isznak. Az első csoportba tartozó patkányok átlagos tumormérete 0,9 cm átmérőjű volt, a második csoportba tartozó patkányoké 0,6 cm.

b) Tumorellenes hatás

Az eredmények összefoglalása:

Porcextraktum napi Tumornövekedés gátlása dózisa mesterséges %-ban (tumorátmérő táplálással csökkenése a kontrolihoz képest) (%)

1. kísérlet: 8 hét időtartam

Placebo 0

500 mg/kg/nap 2

1000 mg/kg/nap 4

Az eredmények azt mutatják, hogy a liofilizátum olyan hatóanyagot tartalmaz, mely a gyomor-bél traktusban abszorbeálódik, és lelassítja a tumor fejlődését. Ez a gátlás lehet közvetlenül a tumoros sejtekre gyakorolt hatás vagy a tumornövekedést zavaró, érképződést gátló hatás.

A folyadékextraktum inhibitor hatást is mutat, mivel beadása következtében a tumor mérete további körülbelül 6%-kal csökken.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a liofilizátum nem vízoldható hatóanyagot és/vagy maradék vízoldható hatóanyagot is tartalmaz. Ezért megfontolandó lehet a szemcsés anyag újraextrahálása vizes oldatban, amellyel a vízoldható komponensek tökéletesebben kinyerhetők, amennyiben a kitermelés még növelhető.

c) Kórszövettani vizsgálatok

Annak bizonyítására, hogy a porcextraktum hatásos molekulái nem toxikusak, a fenti in vivő kísérletben használt állatokat dekapitálással leöljük, és a következő szöveteiken végzünk analízist: máj, tüdő, vese, szív, agy, izom és emlőmirigy. A felsorolt szöveteket két napig Bouin-folyadékban fixáltuk, majd zsírtartalmukat eltávolítjuk. Az etanolos víztelenítés után a fixált szöveteket paraffinba ágyazzuk. Az így készült metszeteket üveglemezekre helyezzük, haematoxilinnal megfestjük és mikroszkóp alatt vizsgáljuk.

A szövettani vizsgálattal a szilárd extraktum legnagyobb dózisának önmagában való alkalmazása esetén (nincs bemutatva adat) sem mutatható ki észlelhető káros hatás, sem a szilárd extraktum és folyadékextraktum kombinált alkalmazása esetén (adat nincs bemutatva).

A vizsgálatok azt mutatják, hogy a liofilizátum és a folyadékextraktum egymástól függetlenül tumorméretcsökkentő hatású.

A rákos emlőmirigyekben (4A. és 4B. ábra) a véredények területének jelentős csökkenése figyelhető meg (55%) szilárd és folyékony porcextraktummal kezelt patkányok csoportjában (5. ábra).

A tumorméret csökkenése az erezettség jelentős csökkenésére, a tumoros sejtekre gyakorolt közvetlen hatásra vagy a két jelenség kombinációjára vezethető vissza. Az extraktumok érképződést gátló hatását a fentiekben részletesen bemutattuk. A közvetlen hipopláziás hatást hormonfüggő sejteken in vitro tanulmányozzuk, melynek in vivő megerősítése még hátravan.

Mivel a fent ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a folyadékextraktum megnöveli a szilárd porcextraktumnak a ZR75-1 sejtekre gyakorolt hatását, ezért ennek komponenseit további vizsgálatoknak vetjük alá.

HU 225 490 Β1

Folyadékextraktum

In vitro vizsgálat

Tumoros sejtvonalak

Számos tumoros sejtvonalat növesztünk folyékony porcextraktum jelenlétében, annak megállapítására, hogy a szilárd extraktumnál megfigyelt hipopláziás hatás (előző fejezet) jelentkezik-e.

Röviden, a sejteket egy 96 mérőhelyes tálcára helyezzük, és tenyésztő táptalajon növesztjük (minden sejttípusra specifikusan; például az MCF-7 sejtek az előző fejezetben leírt módon voltak növesztve) a folyadékextraktum különböző koncentrációjának jelenlétében vagy anélkül. A sejtszaporodást MTT vizsgálattal mérjük a tenyésztés 3. és 5. napja között. A tumoros sejtvonalak a következők;

CHANG: tumoros hepatociták

Hep-G2: tumoros hepatociták

A2780: petefészekadenokarcinóma-sejtek

MCF-7: melladenokarcinóma-sejtek (ösztrogénfüggő)

MCF-7-ADR: melladenokarcinóma-sejtek adriamicinrezisztens

A folyékony porcextraktum mindegyik tumoros sejtvonalra antiproliferatív hatást mutat. A legerősebb gátlást, 50%-ot és 80%-ot, 8,5 mg/ml (a folyadékextraktum száraz tömege/ml tenyésztő táptalaj) koncentrációban határozzuk meg rendre MCF-7 és A2780 sejtekre.

A nem liofilizált és liofilizált folyékony porcextraktum egyformán hatásos a tumoros sejtek szaporodására vonatkozó hatásuk szempontjából. Ez arra utal, hogy a gátlófaktor(ok) nem denaturálódnak ebben a koncentrálási eljárásban.

Primer tenyésztett sejtek

a) Neovaszkuláris glaukómából származó fibroblasztok: A tumoros sejtekre gyakorolt specifikus hatás vizsgálata céljából a szűrletet ultraszűrtük, majd más alapsejt-eredetű sejteken, nevezetesen emberi TENON kötőszöveti sejteken (HTF-ek) teszteljük, melyek szabályos kötőszöveti sejtek. Csupán két betegből származó (egyik neovaszkuláris glaukómás, NVG, és egy elsődleges nyitott szemzug glaukómás POAG) HTF-et alkalmazunk.

A HTF-ek másodlagos tenyésztése és fenntartása: Mindkét konfluenstenyészetet mossuk és elválasztjuk 0,5 ml 0,05% tripszin/0,5 mmol/liter EDTA (Gibco 610-5300 AG) oldattal 5-10 percig 37 °C-on. A tripszin/EDTA semlegesítésére 1,5 ml DME/F-12 táptalajt adunk, amely 15% FBS-t tartalmaz.

A sejtek asszociációját úgy végezzük, hogy szétmorzsoljuk és 25 cm²-es T-lombikba tesszük át, melyhez 10% FBS-t tartalmazó kiegészítő táptalajt adunk. Miután a tenyészet a konfluenciát elérte, a HTF-et 75 cm²-es és végül 180 cm²-es T-lombikba helyezzük. Mikor elegendő sejt keletkezik, ezek egy részét felhasználjuk a fent leírt kísérletekben, a többit lefagyasztjuk, hogy azonos sejteket őrizzünk meg további kísérletekhez.

Kísérleti előírások: Az egyik beteg sejtjeit a konfluencia elérése után két vagy három azonos 180 cm²-es

T-lombikban tenyésztjük, majd a fent leírt eljárással osztjuk szét. Rövid ideig, kis sebességen végzett centrifugálás után a sejteket 256-Channelyzerrel ellátott ZMI Coulter 216013 számolóval megszámoljuk.

Az alábbi in vivő kísérleteknél mindegyik 16 mm-es tálon és a 12 mérőhelyes tálcán körülbelül ötvenezer sejtet oltunk be az 1% FBS-t tartalmazó 1 ml DME/F-12 táptalajba. A beoltás után tizenhét órával azonosan 1 ml 1 % FBS-t tartalmazó („abszolút” kontroll) friss táptalajt adunk hozzá. A kísérlet megtervezésétől függően (lásd fent és alább) az 1%-os FBS táptalajhoz GF-et (szaporodási faktort) vagy folyékony porcextraktumot adunk vagy nem adunk, és steril körülmények között szűrjük. Ezen a napon (0. nap) megszámolunk néhány sejtmintát, a lemezre helyezés hatékonyságának meghatározására (mely egyenlő vagy nagyobb, mint 95%).

A kísérlet kezdetétől számított negyvennyolc óra után a sejteket leöblítjük, szétosztjuk, majd ismét megszámoljuk. A sejtek számát az „abszolút kontrolinál meghatározott értékek százalékában fejezzük ki.

Az 1 % vagy 5% FBS-t tartalmazó „abszolút” kontrollcsoportok és az 1% FBS-t, és adott mennyiségű GF-et vagy folyékony porcextraktumot tartalmazó kísérleti csoportok három-három mintából állnak.

Mindegyik kísérletet az egyik vagy egyidejűleg mindkét beteg sejtjein elvégezzük, és legalább kétszer megismételjük.

A kísérletek során 10-100 ng/ml koncentrációban rendre GF-et, disznóvérlemezke-eredetű növekedési faktort (pPDGF) és emberi rekombináns bázis fibroblaszt növekedési faktort (hr bFGF) [Farmitalia Carlo Erba (Milánó, Olaszország) ajándéka dr. P. Brazeau-nak] adunk 1 % FBS-hez. A kísérlet megkezdése után negyvennyolc órával a sejteket Trypsin-EDTA-val szétoszlatjuk, és Coulter számlálón megszámoljuk. Az alábbi táblázatban látható értékhármasok (1, 2 és 3 oszlop) az egyes mérőhelyeken meghatározott értékek huszadrészével egyenlőek.

Eredmények: Az eredményeket a 6. ábrán foglaljuk össze. A HTF-eket egy 53 éves férfi glaukómájából nyerjük. Bár a PDGF és bFGF-szerű növekedési faktorok a HTF-ekre stimulálóhatást fejtenek ki (* P<0,02, ** P<0,01; Student-Fisher teszttel meghatározva), sem pozitív, sem negatív hatás nem észlelhető, ha ezeket a sejteket folyékony porcextraktum (1 kg/2 liter) jelenlétében növesztjük. Ez arra utal, hogy a folyékony porcextraktum tumoros sejtre gyakorolt hipopláziás hatása nem univerzális, és nem befolyásolja a fibroblasztok növekedését. Ugyanez a porcextraktum nem gyakorolt hatást más típusú fibroblasztsejtekre, HSF-re (humán bőrfibroblasztok; adat nincs bemutatva). Habár erre nem terjedt ki a vizsgálat, feltételezhető, hogy a szilárd extraktum sem gyakorol hatást a normális sejtekre.

b) Emberi köldökvénából származó endoteliális sejtek (HUVEC-ek): A HUVEC-eket kollagenázzal szabályozott emésztéssel extraháljuk, ahogy ezt Jaffe és munkatársai ismertették (1973). A negyedik passage előtt (tripszin-EDTA minden passage) tiszta endoteliális sejteket alkalmazunk. A sejtek minőségét diacetil

HU 225 490 Β1

LDL befogadó kapacitásuk szempontjából analizáljuk, és Vili faktorként jelöljük.

Az endoteliális sejteket 2500 sejt/cm sűrűségben lemezre helyezzük egy zselatinnal bevont steril tálcára. A sejteket teljes táptalajon [Med199+heparin (90 pg/ml)+L-glutamin (2 mmol/liter)+bikarbonát+FBS (10%)+ECGS (120 pg/ml)] tenyésztjük 24 órán át a sejtadhézió biztosítására. Ezután a sejteket PBS-sel háromszor mossuk, és a kísérleti körülményeknek megfelelő tenyésztő táptalajt adunk hozzá. Az utolsó PBS-mosás időpontját tekintjük 0 időpontnak.

Minden vizsgálatot háromszor végzünk el, és az összehasonlítás céljából statisztikai analízist végzünk. A tenyésztő táptalajt mindennap, 24 óra elteltével cseréljük. 168 óra tenyésztés után BrdU-t (10 mmol/liter végső) adunk mindegyik tenyésztő táptalajhoz, és 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a sejteket rövid tripszin-EDTA-emésztéssel felszabadítjuk, és egy 96 mérőhelyes tálcára visszük át a BrdU ELISA-meghatározására. Az ELISA-meghatározást Boehringer Mannheim készlettel és eljárással végezzük. A kontrollvizsgálatot sejtek nélkül végezzük a háttér basal szintjének meghatározására. Egy másik kontrollvizsgálatot végzünk a tenyésztő táptalaj DNS-tartalmának meghatározására, az inkubációs periódus végén, annak kiderítésére, hogy a folyékony porcextraktum befolyásolja-e a sejtadhéziót.

A sejtszaporodást a Petri-csészéken jelen levő DNS-mennyiség alapján is meghatározzuk. Mindegyik kísérletet háromszor végezzük el, és az összehasonlítás céljából statisztikai analízist végzünk. A tenyésztő táptalajt naponta cseréljük. 168 óra tenyésztés után a sejteket nátrium-citrát-SDS-oldattal lizáljuk, és Hoechst 33358-cal inkubáljuk. A mintákat 365 nm-nél olvassuk le spektrofluorométerben.

Végül a Petri-csészében jelen levő sejtek mennyiségét a sav foszfatázaktivitása alapján határozzuk meg. Minden kísérletet háromszor végzünk el, és összahasonlítás céljából statisztikai analízist végzünk. Ezen enzim hatása erős összefüggést mutat a Petri-csészékben jelen lévő endoteliális sejtek számával (BrdU befogadása és Hoechst jelölés; adat nincs bemutatva). A sav foszfatázaktivitását egy Sigma Chemical Company készlettel határozzuk meg (a gyártó szerinti eljárással, melyen bizonyos módosításokat alkalmazunk).

Az eredmények azt mutatják, hogy a folyékony porcextraktumok az endoteliális sejtek szaporodására dózis-válasz gátlást fejtenek ki (7. ábra). A meghatározott ED₅₀-érték körülbelül 90 μΙ folyadékextraktum (ez körülbelül a folyadékextraktumban jelen lévő 1,5 mg száraz tömegnek felel meg).

c) Keratinociták: A folyékony porcextraktumot keratinocitákban vizsgáljuk, ahol a protein-kináz C-t (PKC) triforbol-acetáttal (TPA) aktiváljuk, ami ezen sejttranszdukciós út ismert agonistája. Primer tenyészetként normális humán epidermális keratinocitákat használunk [Matsui és munkatársai: J. Invest, Dermatol. 99, 565-571 (1992)]. A tenyészeteket szérummentes táptalajon (KGM) növesztjük, amely 10 ng/ml epidermális növekedési faktort, 5 pg/ml inzulint, 0,5 pg/ml hidrokortizont és 70 pg/ml marhahipofízis-extraktumot tartalmaz módosított MCDB 153 készítményben.

A keratinocitákat 70%-os összefolyásig növesztjük, és 48 óra múlva 200 ng/ml TPA-val vagy 2 pl/ml DMSO-val kezelt friss táptalajt adunk vagy nem adunk hozzá. A folyékony porcextraktumot különböző koncentrációban adjuk vagy nem adjuk a tenyésztő táptalajhoz. Az eredmények azt mutatják, hogy a folyadékextraktum nem gyakorol hatást a keratinocitaszaporodásra; szintén nem gyakorol hatást a proliferáció TPA-val indukált gátlására, azonban a folyékony porcextraktum képes gátolni a keratinocita TPA-val indukált differenciálódását (8. ábra). A keratinociták differenciálódásának szintje TPA hatására ötszörösére nő. A folyékony porcextraktum önmagában nem gyakorol hatást az elszarusodott tasak képződésére. Azonban ennek jelenlétében az elszarusodott tasak TPA indukálta képződésének gátlása több, mint 60%.

Az utóbbi időkben megjelent publikációkból látható, hogy a PKC-aktiválás hatására a normális keratinociták megnövekedett mennyiségű interleukin-8-at termelnek (IL—8), ami a gyulladást közvetíti [Chabot-Fletcher és munkatársai: J. Invest. Dermatol. 103, 509-515 (1994)]. Ezen túlmenően a pszoriázisos keratinociták nagyon nagy mennyiségű IL-8-at termelnek, amely még jobban elősegíti a pszoriázisos lemezkék újraeresedését [Nickoloff és munkatársai: Am. J. Pathol. 144, 820-828 (1994)]. Egyéb növekedési faktorok és integrinek is számításba jönnek, és fontosak lehetnek a számításba jövő célmolekula-családok számának bővítésében (például 11-1 vagy TNF). Nem vagyunk tisztában azzal, hogy TPA-indukció utánozza-e a pszoriázisos keratinocitákat. Amennyiben ez a helyzet, akkor az eredmények azt mutatják, hogy a porc esetleg nem gyakorol in vivő hatást a normális keratinocitákra, azonban hatást gyakorol a pszoriázisos (vagy akvitált) keratinocitákra. Még nem bizonyított a TPA-aktivált keratinocitákban az IL—8 képződése, továbbá a pszoriázisos lemezkék vagy keratinociták képződésének a folyékony porcextraktummal történő gátlása. Az IL-8-szintek és/vagy más növekedési faktorok koncentrációjának csökkenése magyarázható lehet az extraktumok gyulladásellenes és antiangiogén hatásával is.

Kollagenázvizsgálatok

a) 1. vizsgálat: A vizsgálatot Knight és munkatársai ismertették [FEBS Let. 296, 263-266 (1992)]. Az eljárásban fluorogén peptidszubsztrátumot (Mca-pro-leuglu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂) alkalmazunk a fémproteinázok aktív helyének utánzására. A szubsztrátum egyik végén fluoreszcens csoport (Mca) van, és a másik végén egy fluoreszcenciakioltó csoport van (Dpa). Az ép szubsztrátumban a kioltócsoport lefedi a fluoreszcenciát. A szubsztrátum enzimes hatásának következtében a kémcsőben növekszik a fluoreszcencia.

A kollagenáz aktivitásának meghatározását a Weingarten és munkatársai által ismertetett módon végezzük [Biochemistry 24, 6730 (1985)]. 1 pg-ot 100 μΙ-re hígítunk 50 mmol-os trisz-HCI-dal és 10 mmol

7,5 pH-jú kalcium-kloriddal, 1 pl 10 mg/ml-es tripszinol10

HU 225 490 Β1 datot (1 mmol-os sósavban) adunk hozzá, és 15 percig 20 °C-on inkubáljuk. Az aktiválást 10 μΙ szójabab-tripszin-inhibitorral indítjuk be (SBTI, 5 mg/ml). Mindegyik mikroküvettába a következőket mérjük be:

vagy 50 μΙ inhibitor * (50 μΙ-re feltöltve vízzel);

μΙ 50 mmol-os trisz-HCI, 200 mmol nátrium-klorid, 10 mmol kalcium-klorid, pH 7,5;

μΙ aktivált kollagenáz ** (67 ng végső); és pl szubsztrátum (20 pmol teljes térfogatú 1 mmol-os dimetil-szulfoxidos törzsoldat).

A fluoreszcenciát λθ_χ=328 nm, λ_ΘΓη=393 nm-en mérjük.

*: Az inhibitor kontrollanyagként (például EDTA, orto-fenantrolén) vagy folyékony porcextraktumként van definiálva **: A kollagenáz I típusú, IV típusú humán, valamint amphibian tadpole kollagenázként van meghatározva; zselatináz is használatos

b) 2. vizsgálat: A vizsgálatot Welgus és munkatársai által ismertetett módon végezzük [JBC 256, 9511-9516 (1979)]. Az eljárásban SDS-PAGE-t használunk az 1 típusú (MMP1) kollagenázzal történő hasítás vizsgálatára. Az 1 típusú kollagenáz a természetes kollagénmolekulát egyszer hasítja az eredeti kollagén méretére nézve egy 75%-os és egy 25%-os fragmensre bontva. Többórás hasítás után a reakció befejeződését úgy ellenőrizzük, hogy a terméket SDS-PAGE-vel választjuk el. A hasított és nem hasított kollagén aránya vizuálisan ellenőrizhető a gél Comassie kékkel (ezüstfesték) történő megfestésével.

ng aktivált kollagenázt (lásd 1. vizsgálat) adunk 5 pg borjúbőrkollagén (Worthington)±inhibitorhoz, és 20 μΙ teljes térfogatra töltjük fel. 16 órán át 35 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót SDS-PAGE minta és 40 mmol EDTA hozzáadásával állítjuk le, felforraljuk, majd 8%-os gélre visszük.

c) Dózis-válasz gátlás: Az eredményeket olyan folyadék-porcextraktummal nyerjük, amelyek mindkét vizsgálatban gátolják a kollagenázhatás dózis-válaszát. A 9. ábrán az 1. vizsgálat eredményei láthatók. Az ED₅₀-értékeket 30 μΙ folyadékextraktummal kapjuk (vagy a 30 μΙ folyadékextraktumban 0,51 mg száraz tömeg van jelen).

In vivő vizsgálatok

Embrionális eresedési vizsgálat (EVT)

a) A vizsgálati rendszer definiálása: A csirkeembrió normális fejlődése során a petemembránban elhelyezkedő külső érrendszer képződése játszódik le, amely a tápanyagot a peteszikből (tojássárgája) a fejlődő embrióhoz juttatja. A petemembránra helyezett antiangiogén anyagok a petemembránban lejátszódó véredényfejlődést gátolni képesek. A petemembrán hozzáférhetőségének biztosítására a csirkeembriót egy steril tenyésztődobozba (Petri-csésze) visszük át, és egy szabályozható hőmérsékletű és nedvességtartalmú inkubátorba helyezzük. Ebben hagyjuk az embriót fejlődni ex ovo körülmények között néhány napig.

Metil-cellulóz-oldattal összekevert folyékony porcextraktum aliqot mennyiségét levegőn vékony lemezzé szárítjuk. Ezen eljárás közben a folyékony porcextraktumban jelen lévő belső nátrium-klorid-tartalom koncentrálódik, és az EVT-vel kölcsönhatásba lép, ha mennyisége a tálcán 25 pg-nál nagyobb. Ezért szükség lehet a folyadékextraktum sómentesítésére; megfelelő eljárásnak bizonyult a 0,1 kDa-nál kisebb vágási értékű membránon történő dialízis vagy elektrodialízis.

A metil-cellulóz inért mátrixot képez, melyből a folyadékextraktum lassan kidiffundálhat. A folyadékextraktumot tartalmazó metil-cellulóz-lemezt a petemembrán vaszkuláris periméterének külső határára helyezzük, ahol az angiogén folyamat még aktív.

A lemezt tartalmazó folyadék-porcextraktumnak a középső részhez közelebb eső vaszkuláris fejlődésre gyakorolt hatását mindig összehasonlítjuk a vizet+ekvimoláris mennyiségű nátrium-kloridot tartalmazó lemezeknél kifejtett hatással. A lemezeket az embrió petemembránjára helyezzük az ex ovo növekedési eljárás 0. vagy 1. napján; ekkor a fővéredényeknek csak a kezdete terjed a petében. Ekkor az embriókat tenyésztési körülmények közé helyezzük az eresedés meghatározására (körülbelül 24 óra). A vizet és folyadékextraktumot tartalmazó lemezeket mindig egymással párhuzamosan helyezzük az azonos embrió petemembránjára. Mindkét lemezt szimmetrikus módon helyezzük el az embrió cefalocaudális vonalán az egyedek közötti eltérések minimalizálására, a cápaporcextraktumoknak a kontrollal való összehasonlítása céljából.

b) Antiangiogén hatás: Az EVT-t különböző protaminkoncentrációk (37, 75 és 15 pg), mint pozitív kontroll vagy folyékony porcextraktum alkalmazásával végezzük. Egynapi tenyésztés után a lemezzel borított terület eresedési szintjét két szakember határozza meg a szokásos vakeljárással. A lemezek rögzítésére egy fekete O gyűrűt helyezünk rájuk közvetlenül azután, hogy a petemembránra helyeztük. Az EVT vizsgálat fejlődési skálája az 1-2-3 jelölésen alapul: (3. jelölés) normális az eresedés, ha a kontroliembrió ellentétes horizontális kvadránsához hasonlóan megy végbe, vagy illeszkedő kvadránsához; (2. jelölés) a véredények belépnek a lemezzel borított területre, de középtájon eltűnnek, a fővéredények keresztezik a lemezzel borított területet, de útjuk határozottan befolyásolt, és az oldalsó elágazások sűrűségének csökkenése figyelhető meg; (1. jelölés) a lemezzel borított területen nem látható véredény, vagy terjedése gyorsan megváltozik oly módon, hogy a lemezzel borított területet elkerüli. A lemezzel borított területen nem fejlődnek véredények, kivéve, ha kikerülik és túlnőnek rajta.

A dózis-válasz gátlást protaminnal (adat nincs bemutatva) és folyékony porcextraktummal határozzuk meg (10. ábra). Az ED₅₀-értékeket körülbelül 170 pg száraz folyadékextraktumnál kapjuk (a folyadékextraktumban jelen levő száraz tömeg). Wilcoxon jelölésű stasztikai tesztet használunk az azonos tojásra helyezett két lemez (víz és porcextraktum) közötti különbség mértékének meghatározására.

Egéremlőadenokarcinóma-modell

a) A vizsgálati rendszer leírása: A folyékony porcextraktum tumorellenes hatását egéremlőadenokarcinóma-modellen (allograft) vizsgáljuk. A vizsgálati rend11

HU 225 490 Β1 szer szubkután beadott BALB/C egér és 1*10⁶DA3 sejtekből áll. Ezek a sejtek 7,12-dimetilbenzantracén (DMBA) által kiváltott patkány-egér eredetű emlőadenokarcinómából származnak. A modellt Dániel Medina fejlesztette ki [J. Natl. Cancer Inst. 42, 303-310 (1969); ibid. 57, 1185-1189 (1976)]. A beinjektált sejtek in vivő lassan fejlődnek és alacsony metasztatikus prognózissal szilárd tumort képeznek.

DA3 sejteket 1 mmol/liter merkapto-etanollal, 1 mól/liter Hepes-puffer-oldattal, 100 mmol/liter nátrium-piruváttal, 200 mmol/liter L-glutaminnal, 10 mmol/liter nem esszenciális aminosavakkal, 1 mól/liter vitaminokkal, 10% szarvasmarhaembrió-szérummal, 1% penicillin-sztreptomicinnel ellátott RPMI 1640 táptalajon tartjuk 37 °C-on 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett. A tumor indukálására a sejteket 70%-os összefolyásig növesztjük teljes táptalajon, ezután tripszin-EDTA-oldattal összegyűjtjük. A sejteket ezután centrifugáljuk és foszfátpufferoldattal háromszor mossuk, és 1 ^x10⁶ sejt/0,1 ml hígításnál újraszuszpendáljuk.

A DA3 sejtekkel beoltott egereknek (n=15) orálisan naponta folyékony cápaporcextraktumot vagy placebót (sóoldat) adunk be. A kezelést a DA3 sejtek beinjektálását követő 7. napon kezdjük. Különböző koncentrációjú folyadékextraktumokat vizsgálunk. A beadott folyadékextraktum mennyiségét a folyadékextraktumban jelen levő száraz tömeg mennyiségében fejezzük ki. A vizsgált anyagokat az alábbiak szerint állítjuk elő: a folyadékextraktumot liofilizáljuk és vízzel újraszuszpendáljuk különböző koncentrációértékekre (0,2 mg,

1,5 mg, 3 mg, 10 mg és 20 mg/200 μΙ). A napi beadott végső dózis testtömeg-kg-ra számítva 10 mg, 75 mg, 150 mg, 500 mg és 1000 mg.

b) Tumorellenes hatás: Az eredmények azt mutatják, hogy a tumorfejlődés maximális gátlása körülbelül 75 mg/kg folyadékextraktum beadásánál érhető el (11. ábra). Érdekes módon a nagyobb dózis kevésbé hatásos. Ez arra utal, hogy a folyadékextraktum olyan anyagokat tartalmaz, amelyek gátolják a tumor fejlődését, továbbá olyan anyagokat is, amelyek gátolják a tumorgátló hatást. Ez a jelenség más biológiai hatóanyagokra már ismert.

Végül a folyékony extraktum intraperitoneális beadásával a tumornövekedés gátlásának maximális hatásos dózisa drasztikusan csökken (75-ször), ahogy ez a 12. ábrán látható.

c) Toxicitás: A kezelések során testtömegcsökkenés vagy a folyadékextraktum beadásával kapcsolatosan elhullás nem következett be. A kezelési periódus folyamán az egerek napi vizsgálatánál semmilyen tünet vagy viselkedésbeli változás nem észlelhető. A kezelés végén az egereket leöljük, és minden szerv tömegének morfológiáját hivatásos patológus analizálja; rendellenesség nem észlelhető. A vérminták analízise sem mutatja abnormalitás jelét.

d) Hísztopatológia: A tumor hisztopatológiai vizsgálata nem mutat lényeges különbséget a placebóval vagy folyadékextraktummal kezelt tumorok között. A tumor életképességének mértéke minden csoportban igen magas. A különböző szervek (tüdő, máj, vese, hasnyálmirigy, gyomor, belek, méh, mell, agy és szív) analízise nem mutat ki a folyadékextraktummal kapcsolatba hozható speciális elváltozást.

Hiperérzékeny egérmodell (CHS)

a) A vizsgálati rendszer ismertetése: A dinitro-fluorbenzol (DNFB) egy erős bőrirritációs hatású anyag, amely BALB/C egereknél erős gyulladási reakciót válthat ki. A 0. napon 10 egeret érzékenyítünk oly módon, hogy hasukat DNFB-vel befestjük. Az egerek jobb fülét az érzékenyítés 5. napja után 10 μΙ DNFB-vel befestjük. A fül duzzadását a kezelés után néhány alkalommal megmérjük a szövetirritációs index meghatározására.

A folyékony porcextraktumot megvizsgáljuk olyan szempontból, hogy képes-e csökkenti a DNSB által kiváltott gyulladási választ az egereknél. Az érzékenyítés előtt 3 egymást követő napon és az ezt követő 4 napon át csak hordozót (0,2 ml sóoldatot 5 egérnek) vagy folyadékextraktumot (0,2 ml 20 mg/ml száraztömeg-tartalmú folyadékextraktumot; 5 egérnek) adunk be orálisan.

b) Antihiperérzékenységi hatás: A fülek bekenése után 1 nappal a csak hordozóval kezelt egerek füle 8,2 ml vastagra duzzad. Érdekes módon a folyékony porcextraktummal kezelt egerek fülének duzzadása csupán 2,8 mm. Ezen adatok statisztikai eltérése kisebb, mint 0,01. Az eredmények azt mutatják, hogy a folyékony porcextraktum hatásos gyulladásgátló.

Az aktív molekulákat tartalmazó folyadékfrakciók előállítása

In vitro vizsgálatok

Tumoros sejtvonalak

a) A vizsgálati rendszer előállítása: A cápaporcot a fentiekben leírtak szerint gyűjtjük be és kezeljük. Centrifugálás után az üledéket félretesszük, és a felülúszót a fent leírtakkal azonos módon kezeljük, a 0,22 pm-es szűrőn történő steril szűrésig bezárólag. Az így előállított folyadékextraktumot továbbfrakcionáljuk különböző eljárásokkal. A tumoros sejtvonalakat a fenti fejezetben ismertetett módon növesztjük.

b) FPLC körülmények: Oszlop: Hiload 26 mmx60 cm Sephacryl S-300, Pharmacia FPLC rendszer. Minden mintát 0,22 μιτι-es szűrőn szűrünk, mielőtt az oszlopra visszük. Eluálópufferként foszfátsópuffert (PBS) alkalmazunk, melyet szűrünk és 15 percig gáztalanítunk. Az oszlopra vitt minta térfogata általában 3,2 ml (legfeljebb 13 ml lehet), és az áramlási sebesség 1 ml/perc. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. Az eluált vegyületeket UV-abszorbancia alapján detektáljuk (280 nm). A kalibrációs diagram elkészítéséhez Sigma MW-GF-1000 kalibrációs készletet alkalmazunk, a kalibrálóminta térfogata azonos az analizált minták térfogatával (3,2 ml). A minta elúciós térfogatát úgy határozzuk meg, hogy a kalibrációs készlet vegyületeinek molekulatömegét ábrázoljuk az elúciós térfogat függvényében, melyből levonjuk az üres oszloptérfogatot. Az üres térfogatot dextránkék injektálásával határozzuk meg (MT=2 000 000).

A frakciók hatását ZR75-1 sejteken vizsgáljuk. A hasznos frakciókat azonosítjuk, tulajdonságaikat további vizsgálatokkal igazoljuk (lásd az alábbiakat).

HU 225 490 Β1 porctömeg per liter szűrlet hányadosban kifejezve)

ZR75-1 sejtekre gyakorolt hatását különböző koncentrációjú sejttenyészet-táptalajban vizsgáljuk. Az eredmények összefoglalása:

1. teszt: A rotofor frakciók vizsgálata (a szűrletet

A szűrlet hatásos komponenseinek kiegészítő jellemzését rotoforon (Biorad 170-2950; lásd alább az izoelektrofokuszálásnál) és különböző mérethatárú Amicon szűrőkön végezzük, melyekkel a 10-30 kDa közötti, 30-100 kDa közötti és 100 kDa fölötti molekulatömegű frakciókat választjuk el.

c) Izoelektrofokuszálás körülményei: A cápaporc-folyadékextraktumot (1 kg/l-es szűrletből 46 ml) egy éjszakán át 4 °C-on 4 liter 5% glicerintartalmú tiszta vízzel dializáljuk, melyhez #7 MWCO 3500 kDa pórusú Spectra membránt alkalmazunk (Spectrum 132110). A dializált oldatot 2,75 ml pH 3,5-10,0 amfolitoldattal (Pharmacia #80-1125-87) és 0,5 g 3-[(kolamido-propil)-dimetil-ammónio]-1-propánszulfonáttal (Sigma C3023) keverjük. A térfogatot tiszta vízzel 55 ml-re egészítjük ki. Az oldatot rotoforba helyezzük. Az izoelektrofokuszálást 4 °C-on, 12 watt állandó teljesítményen végezzük (3000*i Biorad 165-0554 áramforrás), az állandó hőmérsékletet folyamatos víz cirkuláltatásával biztosítjuk. Az elválasztás kezdetén a feszültség 380 V, az áramerősség 31 mA volt. Az áramerősség stabilizálódása után (14 mA-en) a feszültség 870 voltra emelkedik. Ekkor az izoelektrofokuszálást megállítjuk,

és 20 frakciót gyűjtünk össze.
Frakció	Térfogat (ml)	pH
1	3,7	3,56
2	2,1	4,01
3	2,2	4,18
4	2,3	4,31
5	2,2	4,63
6	2,1	5,03
7	2,5	5,30
8	2,1	5,50
9	2,4	5,81
10	2,5	6,26
11	2,3	7,00
12	2,4	7,29
13	2,4	7,64
14	2,5	7,94
15	2,3	8,32
16	2,5	8,62
17	2,4	8,94
18	2,9	9,30
19	3,1	9,88
20	3,6	10,71

A fehérjék azonosítása elektroforézisgélen meghatározott molekulatömegük alapján történik [Laemmli, U. K. (1970) Natúré (Lond.) 227/680].

A frakciókat pufferrel négyszeresére hígítjuk (lásd Laemmli), és ebből 8 μΙ aliquot mennyiségeket veszünk ki, és nem redukáló körülmények között elektroforézissel vizsgáljuk. Az izoelektrofokuszálás előtti anyag és a frakciók elektroforézisprofilja a 13. ábrán látható.

A frakciókat lamináris áramlású fülkében, 0,22 μπη porozitású Millipack-60 steril szűrőn szűrjük, és steril körülmények között palackoztuk.

d) A tumoros sejtekre gyakorolt gátlóhatás: A frakciók fehérjetartalmát Lowry-féle dóziseljárással határozzuk meg. Az 1 kg/2 I koncentrációjú oldatok (nyers bepárlással koncentráljuk): Fehérjemeghatározás

Azonosított	Izoelektromos 1	Közép-	Molekula-
frakciók	pont	érték	tömeg
7-8-9-10	5,30-6,26	5,78	29±1 kDa
7-8-9	5,30-6,26	5,68	60±1 kDa
12-13-14	7,29-7,94	7,62	48±1 kDa
13-14	7,64-7,94	7,79	35±1 kDa
2. teszt:
FPLC frakciók vizsgálata (a	szűrletet	bepárlással

koncentráljuk):

Frakciók Molekulatömeg és 7 1-2,5 kDa

3. teszt:

Amicon molekulaszűrőn elválasztott 100 μΙ-es frakciók vizsgálata:

Mért Molekulatömeg Gátlás koncentráció ZR75-1 sejtkultúrákon

100 pg/ml MT>100 kDa 64%

100 pg/ml 30 kDa<MT<100 kDa 114%

100 pg/ml 10 kDa<MT<30 kDa 127%

400 pg/ml MT<10kDa 149%

A 6. és 7. FPLC frakciók nagyon kicsi molekulatömegű hatásos komponenseket tartalmaznak: 1-2,5 kDa.

A frakciók hipopláziás hatása akár 33 000-szerese lehet a liofilizátum esetében meghatározottnak.

e) Az eluátum hatásos komponenseinek további azonosítása: Ugyanebből a szűrletből (1 kg/l), más típusú tisztítási eljárással egy 10 mm átmérőjű és 30 cm hosszú Superose-12 oszlopon, a fent leírt FPLC és rotofor eljárást alkalmazva, 1 ml/perc áramlási sebességgel az alábbi molekulatömegű hatásos frakciókat szedjük (ZR75-1 sejteken tesztelve) (45 darab 1 ml-es frakció): 20-21 frakciók a frakciók aktivitása 70-120 kDa molekulatömegnek felel meg frakció a frakciók aktivitása 60-70 kDa molekulatömegnek felel meg

29-32 frakciók az egymással átlapolt frakciók aktivitása 35-46 kDa molekulatömegnek felel meg

34-35 frakciók a frakciók aktivitása 29 kDa molekulatömegnek felel meg

38-39 frakciók a frakciók aktivitása 1-2,5 kDa molekulatömegnek felel meg

Kollagenázvizsgálat

a) HPLC kromatográfia: 980 ml DUP folyadékextraktum-mintát átszűrünk egy tangenciális áramlású ultraszűrő egységen (PELLICON, Millipore), 10 kDa vágási értékű membránon. Az egységet először 1 liter vízzel öblítjük. Végül 480 ml 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakciót és 1,8 110 kDa-nál kisebb molekulatömegű frakciót nyerünk ki. A 10 kDa-nál kisebb frakciót „cold-finger” bepárlással 180 ml-re koncentráljuk

HU 225 490 Β1 (<10-1 Οχ). A <10-1 Οχ oldatból 100 μΙ aliquot mennyiségeket 8-szor felvisszük CDC-S Hexyl, 5 pm HPLC oszlopra (25*0,94 cm), és először 100%-os vízzel eluáljuk, 4 ml/perc áramlási sebességgel, majd 100%-os metanollal eluáljuk 8,5 ml/perc áramlási sebességgel. A frakciókat az OD₂₁₄-nél mért csúcsok alapján gyűjtjük össze.

öt frakciót nyerünk (14. ábra): Fr1, Fr2, Fr3, Fr4 és Fr5. Az első három frakció legalább egy főcsúcsot tartalmaz.

b) Antikollagenolitikus hatás: Az eredmények azt mutatják, hogy az Fr1 a leghatásosabb frakció a kollagenáz gátlására; alacsony szintű hatás észlelhető minden más frakcióban: az 1. vizsgálat eredményeit a 14. ábrán; a 2. vizsgálat eredményeit a következő táblázatban mutatjuk be.

Minta	Kollagénfestés	Kollagénfrag- mens-festés
Csak kollagén (C)	++++	-
C+Enz	+	+++
C+Enz+EDTA	++++	-
C+Enz+DUP	+	++
C+Enz+Fr1	++++	-
C+Enz+Fr2	+++	+
C+Enz+Fr3	+++	+
C+Enz+Fr4	+++	+
C+Enz+Fr5	+++	+
C+Enz+>10 kDa	+	+++

A 40 mmol EDTA gátolja a kollagenázt. A DUP teljes folyadékextraktum kis antikollagenolitikus hatást mutat. Az 1-5. frakciók aktivitást mutatnak; az 1. frakció aktivitása a legnagyobb. A 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakció nem mutat jelentős inhibitor aktivitást.

c) Az antikollagenolitikus faktor további meghatározása: A folyékony porcextraktumot tangenciális áramlásban működő szűrőberendezés és egy 10 kDa szűrő (Pellicon, Millipore) alkalmazásával frakcionáljuk. Megállapítjuk, hogy mindegyik szűrlet (<10 kDa-os frakció) antikollagenázhatású anyagot tartalmaz, és a továbbiakkal jellemezhető: a <10 kDa-os frakciót dializáljuk egy 0,1 kDa névleges molekulatömeg vágási értékű membránon [Spectra/Por_ CE (cellulóz-észter) MWCO: 0,1 kDa, Cat# 131015]. Az antikollagenolitikus hatást a szűrletben határozzuk meg {<0,1 kDa-os frakció). A <0,1 kDa-os frakciót egy C8 reverz fázisú oszlopra visszük fel (EM Science Lichroprep_ RP-8, Cat# 9242), és vízzel, majd 60%-os metanollal, végül 100%-os metanollal eluáljuk. Az antikollagenolitikus anyagok többsége (98%) a vizes eluátumban jelenik meg, a hatóanyag 2%-a a 60%-os metanollal eluálódik.

Összefoglalva, az extraktumban az antikollagenolitíkus hatású anyag a kis molekulatömegű vegyületnek (vagy vegyületeknek) tulajdonítható, amelyek egy Spectra/Por_ CE (cellulóz-észter) MWCO: 100 membránon átjutnak, és nem adszorbeálódnak C8 reverz fázisú oszlop anyagán (Lichroprep_) víz alkalmazásával.

In vivő vizsgálat

Embrionális eresedési vizsgálat (EVT)

A folyékony porcextraktumot egy tangenciális áramlású szűrőberendezés és egy 10 kDa-os szűrő (Pellicon, Millipore) alkalmazásával frakcionáljuk. A 10 kDa-nál alacsonyabb és magasabb folyékony porcextraktum-frakciókat hasonló körülmények között vizsgáljuk. A 15. ábrán látható, hogy ezek egyformán hatásosak az újraeresedés gátlásában. Ez ellentmondásban van azzal, hogy a 10 kDa fölötti frakcióban nincsenekjelen antikollagenolitikus hatású anyagok.

a) 10 kDa-nál kisebb frakció: Ebben a frakcióban az antikollagén faktor hasonló tulajdonságokat mutat, mint a fent ismertetett tisztítási lépésben az antikollagenolitikus faktor.

b) 10 kDa-nál nagyobb frakció: Ezt a frakciót gélpermeációs kromatográfiás oszlopon kromatografáljuk (Sephacyl S-300, Pharmacia). A frakció (S300-4) antiangiogén hatását SDS-PAGE-n jellemezzük. A hatásos frakció (S300-4) számos fehérjesávot mutat, amelynek molekulatömege körülbelül 8 kDa és 18 kDa között van (összehasonlítva a BioRad SDS-PAGE jelzésű fehérjékkel). Ezt a frakciót anioncserélő kromatográfiával (Mono-Q, Pharmacia) továbbfrakcionáljuk egy 25 ml-es oszlopon, Tris-HCL jelenlétében, pH 8,0 értéken, 0 és 1,0 mól nátrium-klorid-gradienssel. A 0,8 mól/liter és 1,0 mól/liter nátrium-klorid-koncentráció között eluálódó frakció erősen antiangiogén hatású. A 0,3 mól/liter és 0,6 mól/liter nátrium-klorid-koncentráció között eluálódó frakció és a 0,8 mól/liter és 0,2 mól/liter nátrium-klorid-koncentráció között eluálódó frakció antiangiogén hatása kisebb.

Összehasonlítás a technika állásából ismert termékekkel

A technika állásának ismertetése

Mivel előttünk már mások is nagy érdeklődést mutattak a porcextraktumok iránt, a találmány szerinti eljárással előállított cápaporc-folyadékextraktumok egyedülálló tulajdonságainak bizonyítására összehasonlító vizsgálatokat végeztünk a szakirodalomból ismert vagy a következő termékekkel, nevezetesen Balassa (4 822 607 számú amerikai szabadalmi leírás) és Oikawa és munkatársai (lásd fent) eljárása szerint előállított termékekkel.

Az Oikawa és munkatársai szerinti eljárás két főfrakciót eredményez, az egyik 1 kDa és 10 kDa közötti molekulatömegű molekulákat tartalmaz, a másik 10 kDa-nál nagyobb komponenseket tartalmaz. Ezek a kutatók csak az első frakciónak tulajdonítottak antiangiogén tulajdonságokat, a másik, véleményük szerint, CAM tesztben nem mutat antiangiogén hatást. Az Oikawa-féle termékkel való összehasonlítás céljából a találmány szerinti teljes folyadékextraktumot két frakcióra bontjuk, és az 0 és 10 kDa közötti molekulatömegűt tartjuk meg.

Mivel a Balassa-féle eljárás a teljes folyadékextraktumra vonatkozik, ezért a találmány szerinti teljes porc14

HU 225 490 Β1 extraktumot (0 és 500 kDa közötti molekulatömeg) hasonlítjuk össze a Balassa-féle eljárás reproduklásával kapott termékkel. Kiindulási anyagként borjúporc helyett cápaporcot használunk.

Feltételezzük, hogy ha Balassa és Oikawa ekvivalens eljárásokat írtak le, akkor a kapott FPLC, HPLC és CZE görbék egymással lényegében átfednek, és a találmány szerintihez hasonló antiangiogén hatást kellene mutatniuk EVT-re. Az FPLC és HPLC kromatográfiás vizsgálat előtt minden mintát 12 pg/μΙ (száraz tömeg/térfogat oldat) végső koncentrációra hozunk. Az Oikawa-féle terméket a kromatográfiát megelőzően centrifugáljuk és szűrjük, mivel oldhatatlan anyagot tartalmaz.

Mintakészítés

A három különböző módszerrel extrahált cápaporcmintát a következőképpen jelöljük (száraz tömeg/oldat térfogat);

1. DUP a találmány szerinti eljárással előállított 0 és 500 kDa közötti méretű molekulákat tartalmazó frakció (12 pg/μΙ);

2. BAL a Balassa és munkatársai szerinti eljárással előállított minta (12pg/pl);

3. ÓIK az Oikawa és munkatársai szerint előállított 3. frakció. Mindegyik mintát a 12 pg/μΙ (száraz tömeg/térfogat) végső koncentrációra hozzuk az analízis előtt. Az ÓIK minta nagy mennyiségű oldhatatlan anyagot tartalmaz, amelyet 13 200 RPM-en centrifugálva vagy 0,2 pm-es membránon szűrve gyorsan eltávolítunk. Az oldhatatlan anyag szűrését vagy koncentrálását lényegében az FPLC, HPLC vagy CZE eljárás előtt végezzük (16., 17., 18. ábra).

FPLC eredmények összefoglalása

Körülmények

Superose 12 (Pharmacia): gélpermeációs oszlop. A mintákat Superose 12 (10/30) gélpermeációs oszlopra visszük fel foszfátpufferoldat eluenssel (PBS) 0,5 ml/perc áramlási sebességnél (diagrampapír sebessége 0,25 cm/perc). Az injektálás előtt a megfelelő koncentrációjú minták 100 pl aliquot mennyiségét egy 0,2 pm-es membránon szűrjük. OD₂₈₀ értéken mérünk.

Az oszlopot a következő standardokkal kalibráljuk (molekulatömeg daltonban megadva): kataláz (232 000), aldoláz (158 000), albumin (56 000), ovalbumin (44 000), kimotripszin (25 700), ribonukleáz (13 700), inzulin (5 700), inzulin B lánc (3500), inzulin A lánc (2500), bacitracin (1450), B-12 vitamin (1355). A főcsúcs molekulatömegét a következő egyenlettel számítjuk ki: Log₁₀ móltömeg=7,52-0,212xRT, ahol RT=elúciós térfogat (ml). R²=0,976. A teljes oszloptérfogat (V_T) 21,93 ml citidinnel meghatározva (0,246 kDa). Az üres térfogat (V_o) 8,38 ml kék dextránnal meghatározva (2χ10³ kDa).

Az eredmények összefoglalása

A 16A. ábrán látható, hogy a találmányunk szerinti DUP minta első főcsúcsa (1) 18,76 ml-nél eluálódik, molekulatömege 3,5 kDa. További csúcsok jelennek meg 22,7 ml-nél (2) és 27,3 ml-nél (3), a teljes oszloptérfogaton túl (21,93 ml, citidinnel meghatározva). Ezek a csúcsok valószínűleg az oszlop anyagához kötődő anyagoktól származnak.

A 16B. ábrán látható, hogy a Balassa-féle BAL mintának az oszlop V_o értékéhez közel eiuálódó kis csúcsa van (1) (8,4 ml), és 18,5 ml-nél jelenik meg a második csúcs (2) (4 kDa), a két csúcs a V_t után 22,6 percnél (3) és 28,2 ml-nél (4) eluálódik.

A 16C. ábrán látható, hogy az Oikawa-féle ÓIK mintának V_o értékén kis csúcsa van (1), és 18,9 ml-nél jelenik meg egy csúcs (2) (3,3 kDa), továbbá

21,5 ml-nél (3) (1 kDa) és egy kisebb csúcs 27,3 ml-nél (4) jelenik meg.

A minták összehasonlításánál megfigyelhető, hogy a 3300 daltonos csúcstól eltekintve a DUP minta legfontosabb sávjai a másik két mintához képest nem azonos intenzitással jelentkeznek. Az ÓIK minta kisméretű csúcsa 27,3 ml-nél, a BAL minta csúcsa 28,2 ml-nél jelenik meg, és ezek a DUP minták kisebb csúcsaival korrelálnak.

HPLC-vel végzett összehasonlítás

Körülmények

CS-S-hexil oszlop 5 pm, 25*0,94 cm, CSC #059-085; reverz fázisú oszlop.

Az eredmények összefoglalása

A HPLC vizsgálatokat hexil reverz fázisú oszlopon OD₂iq és OD₂₈o értéknél szimultán végezzük. 50 pl aliquot mennyiségű centrifugált mintákat (mindegyik 12 pg/pl-es) viszünk fel és 100%-os vízzel eluálunk. A csúcsokat mindegyik kromatogramon az OD₂₁₀ értéknek (eg. 1), illetve az OD₂₈₀ értékeknek (eg. 1) megfelelően jelöljük. Az oszlop V_o térfogata 5,5 ml (1,4 perc).

A 17A. ábrán a DUP 3 főcsúcsot (1,2,3) és 2 kis csúcsot (4,5) mutat, amelyeket OD₂₁₀-nél határozunk meg. Az 1. számú csúcsnál megfigyelhető két oldalcsúcsot 1a-val és 1b-vel jelöljük. Az 1., 1a., 1b. és 3. csúcsokhoz jelentős OD₂₈₀ abszorbancia tartozik. Összehasonlítva a megfelelő OD₂₈₀ abszorpcióval a 2. számú csúcs sokkal kisebb az OD₂₁₀-hez képest.

A 17B. ábrán a BAL több OD₂₁₀ csúcsot mutat, de ezek intenzitása kisebb a DUP csúcsokhoz képest. A csúcsok átlapolása jelzi a molekula azonosságát. A Balassa-féle mintában csak a 3. és 7. számú csúcsok korrelálnak a DUP minták csúcsainak retenciós idejével (rendre az 1a. vagy 1b. és 4. számú csúcsokkal).

A 17C. ábrán az ÓIK extraktumban csak három főcsúcs látható (1,2,3). Az 1. és 3. számú csúcsok a DUP minta 1. és 3. csúcsaival korrelálnak, de az ÓIK kromatogramon az 1. számú csúcs oldalcsúcsai nem jelennek meg. Az ÓIK mintában a csúcsok magassága kisebb, mint az DUP mintában. Tehát az FPLC és HPLC görbék alapján a különböző termékek tulajdonságai jól megkülönböztethetők.

CZE összehasonlítás

Körülmények

Berendezés; Beckman rendszer (p/ace system 2050) célszoftverrel ellátva (7,11 U verzió); kapilláris: Silice (TSPO 50375), 50 pm*97 cm; puffer: 2 mól/liter

HU 225 490 Β1 hangyasav; bevont oldat, 5% p/v hexadimetrin-bromid és 2 térfogat%-os etilénglikol-oldat; detektor: UV (200 nm); áram: -30 kV; injektálás: 0,5 psi, 20 másodperc; hőmérséklet: 22 °C.

A kapillárist 1 mól/liter nátrium-hidroxid-oldattal (20 psi, 20 perc), vízzel (20 psi, 10 perc), bevont oldattal (20 psi, 20 perc) és pufferrel (20 psi, 10 perc) kondicionáljuk. A futtatáshoz a következő körülményeket alkalmazzuk: puffer (20 psi, 20 perc), minta injektálása (0,5 psi, 20 másodperc), futtatás (-30 kV, 45 perc), 1 mól/liter nátrium-hidroxid-oldat (20 psi, 3,5 perc), víz (20 psi, 3,5 perc), bevont oldat (20 psi, 4 perc) és puffer (20 psi, 4 perc).

A mintákat, a BAL, DUP, ÓIK 3 frakció, 16,5 mg/ml koncentrációban újraszuszpendáljuk. Az oldatok pH-ja rendre 7,1, 6,8 és 8,2 a BAL, DUP és ÓIK minta esetén. Mindegyik oldat nátrium-klorid-koncentrációja rendre 2,08 mg/ml, 4,37 mg/ml és 0,71 mg/ml a BAL, DUP, illetve ÓIK minták esetében.

Eredmények összehasonlítása

A 18. ábrán mindegyik minta (BAL, DUP és OIK-3) molekuláris profilja látható. A DUP és BAL minták összehasonlításából látható, hogy a BAL minta az 1 -nél kisebb terület%-ú csúcsokban nagyobb arányban részesedik. A BAL és a DUP következő csúcsokon osztozik: MT/EOF=1,06, 1,54, 1,59, 1,66 és 3,22. Az 1,06, 0,54 és 3,22 arányú csúcsok hasonló %-os területinek a BAL és DUP mintáknál, míg az 1,59 arányú csúcsok 8-szor intenzívebbek, mint a bal mintában, és ennek ellenkezője látható 1,66 aránynál.

A DUP és ÓIK minták nagyon különböző elektrokromatogramot mutatnak. Az ÓIK mintának egy főcsúcsa és számos kisebb csúcsa van. Ezen csúcsok egyike sem hozható összefüggésbe egyetlen DUP mintáéval sem.

EVT összehasonlítás

A DUP, BAL és ÓIK minták antiangiogén hatását EVT-vel analizáljuk, az eredményeket a 19. ábrán mutatjuk be. A Balassa-féle extraktum nem mutat jelentős antiangiogén hatást. A DUP nyers extraktumot összehasonlítjuk az Oikawa-féle minta 3. frakciójával. A DUP és ÓIK minták majdnem ekvivalensek. Oikawa és munkatársai munkája azonban eltér a találmányunk szerintitől, mivel említik, hogy a 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű frakcióknál nem detektálható hatás, amely ellentmondásban van a 15. ábrán bemutatott eredményeinkkel.

Ezért a Balassa és az általunk kidolgozott eljárás közötti hasonlóságok ellenére a kétféle eljárással előállított termék világosan eltér egymástól.

Aminosavtartalom összehasonlítása

A BAL, DUP és ÓIK minták (16,5 mg/ml száraz tömeg mindegyik esetben) fehérjetartalmát Lowry eljárásával határozzuk meg: az eredmények a BAL, DUP és ÓIK mintákra rendre 3,31 mg/ml, 0,27 mg/ml és 4,15 mg/ml. A fehérje/száraz tömeg arány igen eltérő a DUP minták és a BAL és ÓIK minták összehasonlításánál.

Vizsgálatokat végzünk mindegyik folyékony porckészítmény aminosavtartalmának további analizálására.

A 20. ábrán látható a BAL, DUP és ÓIK mintákban az egyes aminosavak aránya. A szabad aminosavak aránya mindegyik porckészítményben változik: a BAL, DUP és ÓIK mintákban rendre 23%, 73%, illetve 4%. A fehérjeeredetű aminosavak aránya nyilvánvalóan változik a porckészítményekben, a BAL, DUP és ÓIK mintákban rendre 77%, 27%, illetve 86%. A nyers adatokat a következő táblázatban mutatjuk be.

Porkészítmény	Szabad aminosavtartalom (pg/ml)	Fehérjeeredetű aminosav (pg/ml)
BAL	675	2314
DUP	604	223
ÓIK	181	3910

Értékelés

A szakirodalomból ismert BAL és ÓIK termékeket, amelyeket saját termékeinkkel (DUP) összehasonlítunk, a porcextraktumok előállítására alkalmas klasszikus eljárásokkal előállítottnak tekintjük. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a találmányunk szerinti eljárással (DUP) váratlanul nagy aktivitású termékek állíthatók elő, antiangiogén, tumorellenes, gyulladásgátló és antikollagenolitikus hatás szempontjából. Összefoglalhatjuk, hogy a találmányunk szerinti eljárással egyetlen extraktumban vízoldható gátlófaktorok sorozatát sikerült visszanyerni.

A BAL, DUP és ÓIK minták molekulaprofiljának és fehérjetartalmának közvetlen összehasonlításából látható, hogy mindegyik porcpreparátum jellegzetes tulajdonságú. Habár úgy tűnik, hogy bizonyos tulajdonságaik egyeznek, nyilvánvaló, hogy ezek aránya különböző. Különösen nagy jelentőségű, hogy a DUP minta körülbelül 75 mg/kg alatti dózisban tumorellenes hatású, és ezt a hatását nagyobb dózisoknál fokozatosan elveszíti. Ez az eredmény arra utal, hogy a DUP folyékony porcextraktumban 1-nél több faktor mennyisége kritikus. Ezért a BAL-, DUP- és OIK-féle különböző porckészítmények nagyon különböző biológiai tulajdonságokat mutathatnak, mivel ezekben az egyes komponensek aránya változik.

Klinikai vizsgálatok

Folyadékextraktumok előállítása klinikai vizsgálatok céljára

A találmányunk szerinti folyékony cápaporcextraktumokkal előzetes klinikai vizsgálatokat végzünk. Az ultraszűréssel nyert folyadékextraktumot egy 0,22 pm porozitású Millipore szűrőn szűrjük. A folyadékextraktum mikrobás határa USP XXIII <61 > standard szerint szabályozott. A folyadékextraktumot aszeptikus lombikokba 7 ml-es aliqot mennyiségekre osztjuk szét (körülbelül 85 mg fehérje), 1 éjszakán át -60 °C-ra fagyasztjuk és felhasználásig -20 °C-on tároljuk.

Antiangiogén hatás

A folyékony porcextraktumot érképződéssel kapcsolatos betegségek kezelésére alkalmazzuk. Az érképződéssel kapcsolatos betegségek két különböző tí16

HU 225 490 Β1 pusát vizsgáljuk a humán pácienseken; az első típus a rák (prosztatarák), a második típus a dermatológiai rendellenességek (pszoriázis) és a harmadik típus az ízületi gyulladás (reumatoid arthritis és osteoarthritis). Az alábbi példában legalább a folyadékextraktum antiangiogén hatását Illusztráljuk és mutatjuk be.

Az alább bemutatott eredmények nagyon bátorítóak, a nyers szűrlet és frakciói alkalmazhatósága nemcsak a vizsgált speciális betegségek, hanem minden érképződéssel kapcsolatos betegség kezelésére ígéretesnek látszik. Az érképződéssel járó betegségekkel szemben a találmányunk szerinti porcextraktum hatásosnak bizonyult, ha a beadott készítmény hatásos mennyiséget a beadáshoz megfelelő formában tartalmaz. Találmányunk érthető módon nem korlátozódik a következő, angiogén betegségek kezelésére alkalmas egyedi készítményekre, mivel a szakterületen járatos személy a fentiek alapján sokféle készítményt állíthat össze a beadás módjától függően, és a beteg szövetre célzottan. A készítmények különféle úton adagolhatok be, például helyileg, szájon át, nyelv alatt, rektálisan, intravénásán, intramuszkulárisan, szembe, intraperitoneálisan diffúzióval.

Mivel a porcextraktum halízű és -illatú, a készítményekhez ízesítő- és illatosítóanyagok adhatók vagy más galenikus készítmények írhatók elő, hogy könnyebben bevehetők legyenek a páciens számára. „Páciens” kifejezésen embert vagy állatot értünk.

Rák

Prosztatarákban szenvedő páciensnek folyékony porcextraktumot adunk, és egészségi állapotában jelentős javulás mutatkozik. A betegnél 1986-ban adenokarcinómát diagnosztizáltak. Ebben az időben radioterápiát alkalmaztak nála. 1991-ben a beteg PSA(prosztata szérum antigén) szintje 138 pg/l volt, ezzel szemben a legmagasabb elfogadható normális határ 4 pg/l. Ezután a páciens teljesen eltérő terápián, nevezetesen antiandrogén terápiával kombinált kasztráción esett át (Euflex). Ez a kezelés 3 évig volt hatásos, ezután a PSA-szint ismét emelkedni kezdett. 1994 júniusa óta a páciens folyékony porcextraktumot fogyaszt (orálisan, körülbelül 75 mg fehérje/7 ml extraktum napi mennyiségben, ez testtömegre vonatkoztatva körülbelül napi 1-1,5 mg/kg mennyiségnek felel meg). A PSA-szint 12-ről fokozatosan 0,4 pg/ml-re csökken (normális szint), az utolsó eredményeket 1996 áprilisában határoztuk meg. A beadott dózis módosítható a beadás útjának megfelelően, a hatóanyag biológiai hozzáférhetőségével összhangban és a terápiához szükséges erélyesség miatt. Egyidejűleg patkányokon, egereken (lásd a fenti mintát) és majmokon (adat nincs megadva) igazoljuk, hogy az anyag nem toxikus.

DMBA-val kezelt patkányoknak és DA3-mal kezelt egereknek orálisan folyadékextraktumot adunk be, 1 mg és 300 mg közötti dózisarányban testtömeg-kg-ra számítva, ami várhatóan nagymértékben gátolja a tumorfejlődést és a tumoros eresedést az állatmodellekben. A DA3 modell egereknek intraperitoneálisan beadott folyadékextraktumra kapott eredmények azt mutatják, hogy a beadási útnak nagy jelentősége van a tumorfejlődés gátlásában hatásos dózis meghatározásában. Ez azt mutatja, hogy prosztatarák esetén 1 mg/kg hatásos dózisarány majdnem 0,1 mg/kg-ra csökkenthető, ha parentrális beadási utat választunk. Ezért feltételezhető, hogy napi testtömeg-kg-ra számított körülbelül 0,1 mg és 200 mg közötti dózis körülbelül megfelelő közepes dózistartomány (ED₅₀) rák kezelésében, az angiogenezis legalább részleges csökkentésével vagy megszüntetésével.

Számos más betegnek is adunk folyékony porcextraktumot (napi orális dózis körülbelül 75 mg száraz tömeg/7 ml extraktum, amely körülbelül 1 mg és 1,5 mg közötti mennyiséggel ekvivalens testtömeg-kg-okra számítva naponta) más hagyományos terápiákkal kombinálva (például sebészet, kemoterápia, antihormon terápia), az orvosi esetek összefoglalása az alábbi táblázatban látható. Az eredmények azt mutatják, hogy a folyékony porcextraktummal kombinált terápia javíthatja a szilárd tumorban szenvedő páciensek túlélési arányát és életminőségét.

Rák típusa	Kortörténet
Húgyhólyag	húgyhólyag, 70 éves férfi; sebészeti eltávolításából eredő hegek (2 cm és 1,5 cm) és folyékony porcextraktum adagolása a diétához; visszamaradó karcinóma nem jelentkezik 1994. 09. hó óta
Petefészek- adenokar- cinóma	47 éves nő; 15 cm-es jobb oldali és 11 cm-es bal oldali heg és több 2 cm-es heg; 1991-ben sebészeti beavatkozáson és kemoterápián esett át, 1992-ben visszaesés, kemoterápiával kezelve; 1993-ban második visszaesés, kemoterápiával kezelve; 1994ben folyékony porcextraktum adagolása a diétához; azóta csökkent tömegű rosszindulatú neoplazma
Rhabdomyo- sarcoma	63 éves férfi; 11 cm átmérőjű beszűrődő tumor (450 g); sebészeti beavatkozáson és kemoterápián esett át; visszaesés kezelése sugárterápiával és folyékony porcextraktum adagolása a diétához; azóta a tumor elhalt szöveteket tartalmaz, és az állapot stabilizálódott
Hasnyálmirigy-karcinóma májmetasztázissal	45 éves nő; 9 cm-es hasnyálmirigyheg+májmetasztázis, kemoterápia és folyékony porcextraktum adagolása a diétához azóta; 1994-ben a tumor 80%-a visszafejlődött; 1995-ben a tumor eltűnt
Emlőadeno- karcinóma	67 éves nő; sebészeti beavatkozás 1978-ban; visszaesés, tüdőmetasztázis 1994-ben; Megace és folyékony porcextraktum adagolása a diétához azóta; a tumorok mérete 1,5 cm-ről 1 cm-re és száma 12-ről 6-ra visszafejlődött

HU 225 490 Β1

Pszoriázis

Pszoriázisban szenvedő betegnek a következő összetételű dermatológiai készítményt adjuk be, és bemutatjuk hatásosságát:

Emulgade CLB 29 tömeg%

20X nyers szűrlet 69,5 tömeg%

Germabenll 1 tömeg% és

Lavandula Augustofolia 0,5 tömeg%

Emulgade CLB-t, sztearát-észterek keverékét, zsíralkoholokat és nemionos emulgeátorokat (forgalmazza a Henkel Canada Ltd.) keverés közben 65-70 °C-ra melegítünk. A melegítés leállítása után a keverést tovább folytatjuk. Amikor a keverék 45 °C-ra hűl, Lavandula Augustifolia esszencia olajat és Germabenll tartósítóanyagot (diazonidil-karbamid 30%, metil-paraben 11%, propil-paraben 3% és propilénglikol 56%; Sution Laboratories, NJ, USA) adunk hozzá. Amikor a keverék hőmérséklete 30 °C-ra csökken, hozzáadjuk a folyékony porcextraktumot. A kapott készítmény egyenletes, nem zsíros krém. Az Emulgade™-tartalom változtatásával más formájú, különböző viszkozitású dermatológiai készítmények is előállíthatók, a gyártó utasításainak megfelelően (tej, lotion, kenőcs). Más hordozóval vagy kötőanyaggal előállítható paszta, gél vagy más formájú transzdermális készítmény is.

A fenti készítményt 12 héten át naponta kétszer adjuk be egy 9 páciensből álló csoportnak (helyi alkalmazás), akik pszoriázisban szenvednek, és bár a korábban próbált szokásos terápiákra reagáltak, de egy idő után nehezen gyógyíthatóvá váltak. A vizsgálathoz olyan betegeket választunk ki, akiknek szimmetrikusan mindkét oldalra kiterjedt pszoriázisuk van. Dupla vak típusú kísérleteket végzünk oly módon, hogy sem a bőrgyógyász, sem a beteg nem tudja, hogy melyik oldalát kezeljük a porcextraktumot tartalmazó készítménnyel, és melyiket a kontrollkészítménnyel. Figyelemre méltó javulást figyelhetünk meg 5 betegnél, akiknél a pszoriázist nem komplikálja hiperkeratózis; a hiperkeratózisos betegeknél az eredmények mérsékelten jók voltak. Két páciens testrészéről készült fényképek láthatók a 21 A. és 21B. ábrán. A 21 A. és 21B. ábrán hiperkeratózisos pszoriázisban szenvedő beteget mutatunk, akinek viszketéssel nem társuló eritémája egy hónap kezelés után jelentős mértékű csökkenést mutatott, azonban a hiperkeratózis jelentős maradt. A második beteg, akinek pszoriázisát hiperkeratózis nem komplikálta (21C. és 21D. ábra), 3 hónapi kezelés után sokkal jelentősebb javulást mutatott. A pszoriázis sokfaktorú betegség, azonban feltételezhető, hogy a páciens reagálása attól is függ, hogy állapotának alakulásában és fenntartásában mekkora jelentősége van az eresedési és gyulladási faktornak. Extraktumunkban valóban jelen van antiangiogén hatású anyag, ahogy ez a DMBA-val kezelt patkányokon végzett vizsgálatokból (5. ábra) endoteliális sejtszaporodásból (7. ábra) és az EVT eredményekből (10. ábra) látható. A gyulladásgátló hatást is igazoljuk (CHS egérmodell). Valószínűleg jobb eredményeket kapnánk, ha a készítményt olyan terápiás anyagokkal egészítenénk ki, amelyek a betegséget befolyásoló más faktorokat céloznának meg (keratolitikus anyagok, gyulladásgátló anyagok, antihisztaminok, immunszuppresszorok stb.).

A készítményhez adható például keratolitikus anyag hatásos mennyisége is. A kiegésztő terápiás anyag beadható külön vagy a helyileg alkalmazott készítménnyel egyidejűleg, továbbá váltakozva. A kiegészítő kezelés nem feltétlenül történik hasonló terápiás úton.

A fenti készítmény semmilyen szisztémás hatást nem mutat (a hatás a kezelt részre korlátozódik), és a folyékony porcextraktum magas aránya ellenére semmilyen másodlagos hatást nem észlelünk.

izületi gyulladás ízületi gyulladásban szenvedő önkéntes páciensek hónapokon át napi 7 ml teljes folyadékextraktumot vesznek be két egységre bontva. A páciensek állapota fokozatosan javul, az ízületi funkció helyreáll, a fájdalom és a gyulladás csökken (körülbelül 60%-ig). Mivel az ízületi gyulladásnak angiogén és gyulladásos komponensei vannak, a fenti hatás a porcextraktum antiangiogén és gyulladásgátló hatásával hozható kapcsolatba.

Kísérleti klinikai vizsgálatot végzünk egy reumatológiai szakembercsoporttal. 7 reumatoid arthritisben szenvedő 39 és 60 év közötti önkéntes felvilágosított személy vesz részt a vizsgálatban. A diagnózist az American Rheumatism Association’s átdolgozott kiadásában meghatározott klasszifikációs kritériumok alapján állítjuk fel [Arnett F. C. és munkatársai: Arthritis & Rheumatism, 31, 315-325 (1988)].

A kezelés 30 napig tart, és 21 ml folyékony cápaporcextraktum (12 mg/ml száraz tömeg) napi dózis bevételéből áll. A kezelés hatásosságát a csukló érzékenységének becslésére vonatkozó ízületi indexszel határozzuk meg [Ritchie D. M. és munkatársai: Quaterly J. Med. New Series XXXVII, 147, 393-416 (1968)]. Az index a páciens által érzett fájdalom egy sor mennyiségi meghatározásának összegzésén alapul, ha a csuklót az ízületi vonal fölött vagy bizonyos esetekben a csukló mozgatása során finom nyomásnak tesszük ki. Az eredmények azt mutatják, hogy 7 páciensből 4 állapota javult, a folyékony porcextraktum kezelés során (ahogy ez az alábbi táblázatban látható), ami azt mutatja, hogy a termék jól alkalmazható reumatoid arthritis vagy más krónikus gyulladással kapcsolódó tünet kezelésére.

Beteg száma	Kora (év)	Ritchie-index	Javulás
0. nap	30. nap
1	60	30	22	igen
2	43	8	8	nem
3	52	12	12	nem
4	41	15	19	nem
5	46	5	3	igen
6	39	6	2	igen
7	55	14	7	igen

Pókhálószerű erek

Összesen 16 személy vesz részt a vizsgálatokban. A személyek arcán jól látható, de nem kiterjedt telan18

HU 225 490 Β1 giectasia mutatkozik. A csoportot két 8 fős csoportra osztjuk. Az A csoportnak 5%-os folyékony porcextraktumot tartalmazó koleszterinliposzóma-bázist adunk, míg a 2. csoportnak (B. csoport) kizálólag koleszterinliposzóma-bázist adunk. A terméket a teljes arcon alkalmazzuk 3 hónapon át naponta kétszer. Az arcon mutatkozó pókhálószerű erekből legalább 4 helyen felvételt készítünk egy száloptikás felületi mikroszkóp alkalmazásával. A felvételek szürke értékeit analizáljuk Zeiss Ibas Image Analyzerrel. Minden személy esetében minden vizsgálati helyén meghatározzuk az integrált optikai sűrűséget (IOD). A 4-4 helyen kapott értéket minden alkalommal minden személy esetében átlagoljuk.

Az eredmények azt mutatják, hogy 4 hét után az lOD-érték 35%-kal csökken, és a hatás a vizsgálat időtartama alatt fennmarad, ahogy ez a 22. ábrán látható. Az üres koleszterinliposzóma-bázis esetében 8 és 12 hét használat után rendre 5%, illetve 8% háttérjavulás mutatkozik.

Szemüreg körüli sötét karikák

A bőr elszíneződése nem vezethető vissza teljes egészében a melanin jelenlétére vagy hiányára, hanem összefüggésben lehet a vérellátással és a vérsavótartalommal is. Ha a véráramlás renyhe, akkor a metabolizmus nagyobb mennyiségű oxigént von el, és a bőr kékes színűvé válik. Ez a színeltérés kifejezettebben jelentkezik a szem körüli területen a bőr vékonysága miatt [Oresajo és munkatársai: Cosmetics & Toiletries 102, 29-34 (1987)]. A szem alatt jelen lévő szeptumok eresedésbeli változása szintén sötét karikák megjelenéséhez vezethet. A szem körüli sötét karikák megjelenése visszavezethető a zsírlerakódásra, a szem alatti ödémára és a szem körüli véredények szivárgására is. Klinikai vizsgálatot végzünk, melyben megvizsgáljuk a folyékony cápaporcextraktum hatását a szem körüli terület angiogenezisének szabályozására, ezáltal a szemüreg körüli sötét karikák megjelenésének csökkentésére.

összesen 18 önkéntes 18 és 65 év közötti életkorú nő vesz részt a vizsgálatban. A személyek szeme körül sötét karikák mutatkoznak. Mindegyik személy egészsége rendben van, nem mutatják jelét akut vagy krónikus betegségnek, beleértve a dermatológiai vagy szemészeti problémákat is.

A kísérletből kizárjuk azokat a személyeket, akiken napbarnaság, kiütések, horzsolások, égési foltok és egyebek befolyásolhatják a vizsgálati eredmények értékelését. Szintén kizárjuk a terhes vagy szoptató nőket. A vizsgálati hely nem tartalmaz szemölcsöket, anyajegyeket, lesült bőrfelületet, horzsolásokat és aktív bőrsérüléseket.

A csoportot két csoportra osztjuk, a 10 fős A csoportra és a 8 fős B csoportra, ezek rendre 5% folyékony porcextraktumot tartalmazó hordozót vagy önmagában hordozót kapnak. A személyeket 12 hétre napi legalább kétszeri, a szem körüli terület kezelésére elegendő termékkel látjuk el. A méréseket az alapvonalon végezzük a 4., 8. és 12. hét elteltével. Mindegyik vizit alkalmával fényképeket készítünk, amelyeket Image Analysisszel analizálunk.

A felvételeken meghatározzuk az úgynevezett szürke értékeket, amelyek a bőr sötétségét/világosságát mutatják. Nyilvánvaló, hogy a folyékony porcextraktummal kezelt csoportban a szürke értékek jelentős növekedést mutatnak (ami a bőrszíneződés világosodását jelenti). 4, 8 és 12 hét után a folyékony porcextraktummal kezelt csoportban a szem körüli bőrfelület 11%-kal, 21%-kal és 14%-kal világosodik. A kizárólag hordozóval kezelt csoportban semmilyen változás nem észlelhető, ahogy az a 23. ábrán látható.

Visszértágulatok

A vizsgálatban összesen 20 személy vesz részt. A személyek lábán jól látható, de nem kiterjedt telangiectasia van. A csoportot két csoportra osztjuk, az A csoportba tartozók (n=9) folyékony porcextraktumot tartalmazó krémet kapnak, míg a B csoport tagjai (n=11) hordozókrémet kapnak önmagában, amelyet a teljes lábon kell alkalmazni naponta kétszer 3 hónapon át. Egy száloptikás mikroszkóppal 2-4 helyen felvételt készítünk a visszértágulatos lábakról. A felvételeken meghatározunk a szürke értékeket egy Zeiss Ibas analizátorral. Minden helyen meghatározzuk az integrált optikai sűrűséget (IOD). A kapott értékeket mindegyik személy esetében mindegyik helyre minden időpontban átlagoljuk.

Az eredményeket a 24. ábrán mutatjuk be. 4, 8 és 12 heti használat után az lOD-értékek rendre 21%, 17% és 26% csökkenést mutatnak. A kontrollhordozó 4, 8 és 12 heti alkalmazás során rendre 5%, 0% és 0% háttérjavulást eredményez.

Egyéb klinikai és állatorvosi alkalmazási lehetőségek

Szemészet: A véredények rendellenes növekedésével vagy újraeresedésével jellemezhető tünetek látás csökkenéséhez vagy akár vaksághoz is vezethetnek. Ezek közé tartozik a szaruhártyaszerű neovaszkularizáció (kémiai vagy fizikai irritáció következtében), szaruhártya-fertőzés, átültetett szaruhártya kilökődés, neovaszkuláris glaukóma, pigmentdegeneráció, herpeszvírus-keratitisz és diabetikus retinopátia. A folyékony porcextraktum úgy hat ezekre a klinikai tünetekre, hogy gátolja az új véredények képződését, és csökkenti a telangiectasist és a gyulladást.

Sebgyógyulás: A seb gyógyulása a sejtek, a biokémiai közvetítők, a sejtek közötti mátrixmolekulák és a sejtek és mikrokörnyezetük közötti komplex kölcsönhatást foglalja magában. Teljes vastagságban történő sérülés után a sarjadzó szövetek (fibroblasztok, kapillárisok és gyulladássejtek) először a seb szélén kezdenek növekedni jellemző sorrendben. A fibroblasztok 24 órán belül el kezdenek migrálni a seb szélén lévő kötőszövetekből a seb üregébe. A fibroblasztok mozgás közben mátrixmolekulákat termelnek (kollagén és glikózaminoglikánok), amelyek sejten kívüli mátrixot képeznek. Az első kapillárissarjak a sérülés után már 18 órával láthatóvá válnak a seb szélén az elárasztott mikrocirkulációban. Ezek a sarjak a seb üregébe nőnek, és a seb kötőszövete számára új kapillárishálózatot biztosítanak. A fibroblasztok szaporodása és migrációja, és a kapillárisnövekedés egységesen folytatódik,

HU 225 490 Β1 amíg a sebüreget teljesen kitöltik az új szövetek. Bizonyos sebgyógyulási tünetek, amelyek a sarjadzási faktorok túlképződésével társulnak (például a hipertrófiás hegesedés és az erősen leégett személyek bőrének hegesedése), számára hasznos lehet folyékony porcextraktum (orális vagy topikális) adagolása, mivel az angiogén folyamat csökkentésével lelassul a sebhegedési folyamat.

Papulás-pikkelyes bőrbetegség: A folyékony porcextraktum pszoriázisos sebekre gyakorolt előnyös hatásából arra következtetünk, hogy más, hasonló tulajdonságokat mutató betegségek és betegségekre is jól hat a folyadékextraktum helyi vagy szisztémás beadása. A papulosquamous bőrbetegségekre jellemzőek a vörös és ibolyaszínű hólyagok és lemezkék, amelyek az epiderma és/vagy alapjául szolgáló bőrgyulladásból eredő megvastagodás következménye, és pszoriázis, Reiter-szindróma, pityriasis rosea, planus sömör, pityriasis rubra pilaris, szekunder szifilisz, gombás fertőzések és pikkelyes bőrkiütések esetében jelentkeznek.

Hajhullás: Kisebb oldalsó artériák lekötésével a véráramnak a hajas fejbőrhöz való vezetésével sikeresen meggátolható az androgén túltermelés által okozott hajhullás. A hajas fejbőr bizonyos területein helyileg alkalmazott folyékony porcextraktummal megelőzhető az érhálózat csökkenése, és ennek következtében a hormonok hatására bekövetkező hajhullás.

Állatorvosi alkalmazások: Szilárd és/vagy folyékony porcextraktumok beadhatók állatoknak is a fentiekben humángyógyászatban ismertetett gyógyászati és kozmetikai alkalmazások céljából.

Nem antiangiogén hatás

Akne

A szerzők ismeretei szerint az aknét nem sorolják az eresedéssel kapcsolatban álló betegségek vagy rendellenességek közé, ennek ellenére ilyen betegségben szenvedő betegek kezelését is megkíséreljük a folyékony porcextraktummal a folyadékextraktum gyulladásgátló hatására alapozva. Az aknéban szenvedő betegeket az alábbi összetételű gél formájú porcextraktummal kezeljük:

Carbopol™	1,2%
Tisztított víz	77,2%
NaOH	0,3%
Phenoxetol™	0,3%
Tween 80™	0,3%
2*folyékony porcextraktum	20,0%
40*aloeextraktum	0,5%
A folyékony porcextraktum száraztömeg-tartalma

9-12 mg/ml. Ez a készítmény figyelemre méltó javulást eredményez többé-kevésbé súlyos aknéban szenvedő páciensek állapotában (gyulladásos akne és kystikus akne). A 25. ábrán látható, hogy aknéban szenvedő páciensek állapotában jelentős javulás mutatkozik folyékony extraktumot tartalmazó hordozóval történő 12 hetes helyi kezelés hatására.

A kapott kiváló eredmények vagy az eresedést gátló hatásnak tudhatok be (amely az akne esetében az eresedési komponens szerepére utal), vagy nem az eresedést gátló, hanem ettől eltérő hatású hatású hatóanyagra utal (például gyulladásellenes hatás). Az eredmények azt mutatják, hogy a folyékony porcextraktum nagy lehetőségeket rejt az érképződéssel és/vagy gyulladással kapcsolatos megbetegedések kezelésében. A porcextraktum mennyisége és beadási útja a speciális szükségleteknek megfelelően változtatható.

Meg kell jegyeznünk, hogy a porcextraktum a bőrön, helyileg alkalmazott készítményben széles dózistartományban alkalmazható a fehérjetartalom alapján. Például a vizsgált esetek három speciális csoportjában ugyan különböző dózisok és/vagy készítmények alkalmazhatók.

Bőrirritáció

Számos betegségnél a gyulladás következtében lép fel az angiogenezis, ezért a porcextraktumban a két hatást elkülönítve célszerű vizsgálni. Az extraktum gyulladásgátló és nyugtatóhatását bőrirritációs modellen vizsgáljuk, ahol feltehetőleg nem lép fel angiogenezis. A vizsgálathoz 9 önkéntest választunk ki, akik bőre korábban Peru balzsamra érzékenynek bizonyult. A következő tesztanyagokat alkalmazzuk:

1.1- szeres cápaporc 50% D-MEM közegben

2. 1-szeres cápaporc 20% D-MEM közegben

3.1- szeres cápaporc 10% D-MEM közegben

4. Cola nitida (Indena) 10% 1:1 vizes alkohololdatban

A 4 tesztvegyületet a csoporttagok ventrális alkarján alkalmazzuk. Az anyagokat 20 percig hagyjuk abszorbeálod™, majd a vizsgálati helyen irritánsként Peru balzsamot alkalmazunk. A bőrirritációt a bőr vörösödésének növekedésével határozzuk meg. A vörösödés mértékét Minolta kromaméterrel mérjük, és összehasonlítjuk a pozitív és negatív kontrollal. Pozitív kontrollnak a kizárólag Peru balzsammal kezelt bőr színét és negatív kontrollnak a Cola oldattal kezelt bőr színét tekintjük, melyet tesztanyaggal hasonló módon alkalmazunk. A statisztikai szignifikanciát kétvégű valószínűségi T-teszttel számítjuk ki. A 26. ábrán látható, hogy a 10%-os Cola-oldat 70%-os aktivitást mutat. A cápaporc 20%, illetve 10% koncentrációban alkalmazása 58%-os és 60%-os antiirritáns hatást mutat. Dózis-válasz hatást nem észlelünk. Az eredmények azt mutatják, hogy a porcextraktum gyulladásgátló és gyulladáscsillapító hatású, és ezek a hatások az antiangiogén hatástól elkülönülve jelentkeznek.

Rák éves női páciensnél B típusú nagysejtes nonHodgkin-limfómát diagnosztizáltak. A CAT scan analízis eredménye adenopátiára mutat a nyaki ütőér és a torkolati véna körül (2,5 cm átmérő), továbbá nagyméretű adenopátiára a jobb vese hilus fölött. A páciens 1993 októberében visszautasította a kemoterápiát, és diétája mellett folyékony porcextraktumot fogyasztott (körülbelül 75 mg száraz tömeg/7 ml extraktum napi orális dózisban, ami naponta és testtömeg-kg-ra számítva körülbelül 1 mg és 1,5 mg körüli mennyiséggel ekvivalens). Három hónappal később, azaz 1994 januárjában elvégzett CAT scan analízis adatok szerint a nyaki adenopátia teljesen felszívódott. 1994 novemberére a hasüregi adenopátia térfogata 75%-kal csökken.

HU 225 490 Β1

Azóta a beteg állapota stabil, és egészségi állapota kielégítő.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a folyékony porcextraktum bizonyos, nem szilárd rákok esetében is kifejthet tumorellenes hatást.

A bőr védőszerepe

A vizsgálatot 6 egészséges önkéntesből álló csoporttal végezzük. A csoport tagjai folyékony porcextraktumot tartalmazó krémet kapnak, amelyet a jobb alkaron kell alkalmazniuk, és hordozót kell alkalmazniuk a bal alkaron, naponta kétszer 4 héten át.

A csoporttagok 21 és 45 év közötti nők, akik nem szenvednek akut vagy krónikus betegségben, sem dermatológiai vagy szemészeti problémában. A vizsgálatból kizárjuk az olyan személyeket, akiken napbarnaság, kiütések, égési foltok stb. befolyásolhatják a vizsgálati eredmények értékelését. A vizsgálat során a vizsgált bőrfelület kiválasztásánál elkerüljük a szemölcsöket, anyajegyeket, májfoltokat, napbarnított részeket, leégett részeket, hegeket és aktív bőrsérüléseket. A vizsgálat napján a csoporttagokat utasítjuk, hogy ne használjanak lotiont, krémet vagy más terméket az arcon. A vizsgálatot megelőzően és a mérések folyamán a csoporttagokat legalább 30 percig 20 °C és 22 °C közötti hőmérsékletű és 40% relatív páratartalmú szabályozott környezetben tartjuk.

A vizsgálati hely a jobb és bal alkar tenyér felőli része. 3,5 cmx7 cm-es kis területet jelölünk be mindegyik karon, és ezen a területen belül három helyen megvizsgáljuk a bázis transzepidermális vízveszteséget (TEWL) [Pinnagoda és munkatársai: Contact Dermatitis 22, 164-178 (1990); Grove: The effects of aging inoral mucosa and skin, kiadó: Squiler & Hill, CRC Press, 124-125(1994)].

Ragasztószalagot (Tuck) használunk a vizsgált terület lefedésére, és mindkét irányban végzett erős simítás után a tapaszt feltépjük [Éliás J. Invest. Dermatol. 80, 44—49 (1993)]. összesen 5 tapaszt húzunk le. Ismét rögzítjük a TEWL-értékeket. A lehúzást, majd TEWL-méréseket ötös csoportokban folytatjuk. A lehúzást akkor fejezzük be, mikor a TEWL eléri a 18 G/M²/óra értéket. A TEWL-értéket ismét megmérjük az utolsó lehúzás végén. Minden karon a tapaszok maximális számának feljegyzésével kiszámítjuk a bőr védelmének lerombolásához szükséges lehúzások számát, ez minden esetben 18 g/n²/óra vagy ennél nagyobb TEWL-értéket jelent. A különböző időpontokban végzett kezelés és az alapvonal közötti statisztikus eltérést analizáljuk „tailed rang” koefficiens Z teszt alkalmazásával.

A hordozóval kezelt karon nem mutatkozik javulás, mivel csupán 26%-kal és 21%-kal több lehúzás szükséges rendre 2 hetes, illetve 4 hetes kezelés után a bőr lerombolásához. Ezzel szemben 2 hetes, illetve 4 hetes folyékony porcextraktumtermékkel való kezelés után a csoporttagok mindegyikének védőfunkciójában jelentős javulás (p<0,05) tapasztalható, amikor is 60%-kal és 55%-kal több lehúzásra van szükség a bőr védőszerepének lerombolásához 2, illetve 4 hetes folyékony porcextraktummal való kezelés után, ahogy az a 27. ábrán látható.

Ebből következik, hogy a folyékony porcextraktum alkalmasnak bizonyult a bőr védőfunkciójának erősítésére fizikai behatással szemben.

Ekcéma

Kozmetikai szalonban megvizsgáljuk, hogy folyékony porcextraktum képes-e csökkenteni az ekcéma által okozott gyulladásos sebeket. A kozmetikus a folyadékextraktumot tartalmazó krémet sok éve krónikus ekcémában szenvedő személy kezén alkalmazza. Érdekes módon a porcot tartalmazó krém alkalmazásával jelentősen csökken a kézen az ekcéma fejlődése. A kezelt személy jelenleg sikerrel alkalmazza a porcot tartalmazó krémet az ekcéma kifejlődésének megelőzésére.

Kenőcs

Egy 36 éves nőt, akinek kortörténete szerint talpán szemölcsök jelentkeztek, és majdnem 3 évig bőrgyógyász kezelte a szemölcsök képződésének és az ezzel kapcsolatos fájdalom megszüntetésére. A kezelés folyékony nitrogénnel, 40%-os szalicilsavval, anaerobiával, salétromsavval és kénsavval végezték. A kezelést 3 hónapon át általában minden héten végezték, majdnem eredménytelenül. 1996 márciusában a szemölcsökön közvetlenül folyékony cápaporcextraktumot alkalmaztunk naponta 5 percig; két héttel később a szemölcsök körül az új epidermiszképződés következtében rózsaszínű terület alakult ki; a következő héten a szemölcsök eltűntek. Ezekből az eredményekből arra következtetünk, hogy a folyékony porcextraktum szemölcsök kezelésére is alkalmazható.

Más klinikai és állatorvosi alkalmazási lehetőségek

Átültetett szövet kilökődése: Az átültetett sejtek elhalásának egyik fő faktora a gyulladás. Ezért hasznos lehet a találmányunk szerinti folyékony cápaporcextraktumban jelen lévő gyulladásgátló komponensek hasznosítása átültetett szöveteknél.

Sclerosis multiplex: A sclerosis multiplex kiváltó okai ismeretlenek. A szövetválasz immunopatológiai folyamatokkal jellemezhető, perivenuláris, mononukleáris sejtbeszűrődéssel, fertőzés nyilvánvaló hisztopatológiai bizonyítéka nélkül. A mátrix-fémproteinázok a gyulladásválasz jelentős faktorai. Mivel a folyékony porcextraktum a fémproteináz-mátrixok erélyes inhibitorai, hasznosak lehetnek sclerosis multiplex kezelésében.

Fibrózis: Mai ismereteink szerint a fibrózis a normális sebgyógyulásra emlékeztet, de nem ér véget, ennek következtében a normális szövet helyett heg képződik. Úgy tűnik, hogy a fibrotikus reakciók másodlagos traumára, fertőzésre, gyulladásra vagy genetikai komponenst is magában foglaló ismeretlen okokra vezethetők vissza. Jellemző ezekre a TGF-p-túltermelés, ami a fibroblasztsejtek szaporodását és kollagéntúltermelést vált ki. Mivel a fibrózis legjellemzőbb jele a nagy mennyiségű kollagénlerakódás, ezért úgy gondoljuk, hogy a folyékony porcextraktum, amely a sarjadzó szövetképződést visszaszorítja, hosszan tartóan képes visszaszorítani a fibrotikus reakciókat.

Gyulladásos bélbetegségek: A gyulladásos bélbetegségek etiológiája nem ismert, de abnormális bélimmunitás, Crohn-betegség és fekélyes kolitisz patoge21

HU 225 490 Β1 nezisében fordul elő. A mukozális mononukleáris sejtek hatására megváltozik az antitestképződés, szaporodás, citotoxicitás és citokinszintézis (FGF, PDGF, EGF, TNF). A folyékony porcextraktum gyulladásgátló hatást mutat, ezért orálisan adagolva alkalmas lehet gyulladásos bélbetegség gyógyászati kezelésére.

Szívbetegségek: A koronáriás rezisztencia erek endoteliális diszfunkciója számlájára írható a koronáriás mikroerezet és a lehetséges miokardiális ischaemia rendellenessége, valamint a mellkasi fájdalom. Sejtszinten az endoteliális diszfunkció a nitrogén-monoxid (NO) - egy endotéliumeredetű relaxálófaktor - csökkent termelésével kapcsolatos. A nitrogén-monoxid szintézise lehetővé teszi az érrendszer dilatációs állapotának fenntartását, ezáltal az artériás nyomás szabályozását. A nitrogén-monoxid endogén szintézisének hiánya artériás hipertenziót, pulmonáris hipertenziót és szívbetegséget válthat ki. A tenyésztett endoteliális sejtekkel kapott előzetes eredmények szerint a folyékony porcextraktum növeli a nitrogén-monoxid-képződést. Ezért a folyékony extraktum a nitrogén-monoxidon keresztül bizonyos szívbetegségtünetek esetén, akárcsak pulmonáris artériás hipertenzióval társuló veleszületett szívbetegségben szenvedő gyermekgyógyászati pácienseknél igen hasznosnak bizonyul. Ezen túlmenően a folyékony porcextraktum segítséget nyújthat ateroszklerózis esetén gyulladással kapcsolatos tünetek csökkentésére is.

Szkleroderma: A szkleroderma (bőrkérgesedés) egy szokatlan betegség, amelyet a bőr fibrotikus kötőszövetének növekedése és gyakran a belső szervek növekedése jellemez. Gyakran jelenik meg lokalizált bőrfoltok hiperkeratinizációja formájában. A hiperkeratinizáció egy sejtes folyamat, amelyben a bőr keratinocitái teljes mértékben differenciálják és akkumulálják a feszes keratinszálakat. Ez a bőrtünet korlátozhatja az ízületek mobilitását, ha az érintett bőrfelület az ízületek körül helyezkedik el. Ha olyan kísérleti rendszerben alkalmazzuk, amelyben a keratinocitadifferenciálódást segítjük elő, a folyékony porcextraktummal részben megelőzhető a differenciálódási vagy keratinizációs folyamat. Ezért a folyadékextraktum alkalmas lehet ezen bőrtünetek kezelésére, a teljesen differenciált keratinociták túlzott felszaporodásának megelőzésére.

Állatgyógyászati alkalmazások: Szilárd és/vagy folyékony porcextraktum beadható állatoknak is a fentiekben humángyógyászat esetén bemutatott gyógyászati és kozmetikai alkalmazásokhoz hasonló célokra.

Kozmetikai alkalmazás és ilyen célokra alkalmas készítmények

A fenti vizsgálatokból látható, hogy a találmány szerinti porcextraktum széleskörűen alkalmazható gyógyászati célokra. Az extraktum számos ismert hatása közül az antiangiogén, antikollagenolitikus, a gyulladásellenes és a PKC indukálta differenciálódást gátló hatások különösen alkalmassá teszik kozmetikai célokra. Mivel a találmány szerinti porcextraktum a PKC közvetítette sejtfolyamatokra nézve antagonista hatást mutat, és a szakirodalomból ismert, hogy a fenti antagonista hatások javítják a bőr védőfunkcióját, ezért találmányunk tárgyát képezik az emlősök bőrvédő funkcióját javító eljárások, melyekben a bőrön porcextraktumot és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó készítményeket alkalmazunk, a találmány tárgyát képezik továbbá ezek a készítmények is. Összeállíthatók az emlősök bőrének nyugtatására és gyulladásának csökkentésére alkalmas egyéb hasonló készítmények is. A gyulladást számos tényező okozhatja, például irritálóhatású vegyületek, fizikai behatás vagy ultraibolya sugárzás. A bőrben a kollagenáz gátlására szolgáló készítmények és eljárások is megfontolandóak. A kollagenáz és a gyulladások korai öregedést (kollagéndegradációt) okoznak. A porcextraktumból kinyert antagonista hatású anyagok jól alkalmazhatók korai öregedést gátló és az emberi bőr ráncosodását és sorvadását gátló készítményekben és eljárásokban. A bőr ráncosodása és sorvadása egyrészt életkori jelenség, de okozhatja az ultraibolya sugárzás vagy bizonyos környezeti ártalmak. A helyileg alkalmazott készítmények az adott alkalmazáshoz szükséges mennyiségű cápaporcot tartalmazhatnak. Ezek a készítmények általában körülbelül 0,1 tömeg% és körülbelül 75 tömeg% közötti mennyiségű folyékony porcextraktumot és körülbelül 25 tömeg% és 99,9 tömeg% közötti mennyiségű gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazhatnak. A készítmények tartalmazhatnak ezenkívül antioxidánst, amely megelőzi a bőrön lipidperoxidok képződését. Az antioxidáns lehet például tokoferol, tokoferolszármazék, aszkorbinsav, aszkorbinsavszármazék vagy BHT. A készítmények kiegészíthetők gyulladásgátló hatású anyagokkal, például foszfolipáz A2 inhibitorral vagy növényi eredetű antiirritáns hatású Cola- vagy zöldtea-extraktummal. A helyileg alkalmazható készítmények különböző formájúak lehetnek, mint például oldat, szuszpenzió, lotion, tinktúra, gél, krém, spray, emulzió, szonda, kenőcs vagy liposzóma (a folyadék-porcextraktum legalább egy része liposzómában van). További kozmetikai alkalmazások a szem körüli sötét karikák és a bőr védőfunkciójának kezelése.

Értékelés

A találmány szerinti eljárással nagy gyógyászati értékű porcextraktumok állíthatók elő. A találmány szerinti új eljárással előállított cápaporcextraktumok többféle hatást mutatnak, és jó kitermeléssel nyerhetők ki. A porcextraktumok, különösen a folyadékextraktum és ennek frakciói igen nagy jelentőségűek, mivel a normális sejtekre nézve nem toxikusak, és igen hatásosnak bizonyultak egy sor betegség és tünet kezelésében.

Az összes fent megadott alkalmazás esetén (a szemészeti cseppektől a dermatológiai és rákellenes készítményekig) megállapítható, hogy a teljes folyadékextraktum minimális végső fehérjekoncentrációja nagyon kicsi lehet (körülbelül 0,01 mg/ml értéktől). Ez a kicsi dózistartomány függ a hatás helyének hozzáférhetőségétől és a hatóanyagok permeációjától, továbbá a hatóanyagok megkötődnek hatásosságától, valamint a szövetek angiogén inhibitorral szemben mutatott érzékenységétől vagy válaszától. A készítményekben a végső fehérjekoncentráció felső határa bizonyos alkal22

HU 225 490 Β1 mazásoknál még nem ismert. A vizsgált legmagasabb koncentrációértékek topikális beadásnál körülbelül 9 mg/ml fehérjetartalmú készítmény, pszoriázisos esetekben és orális beadásnál körülbelül 12 mg/ml, amelyet rákos esetekben napi 7 ml-es dózisegységben és arthritises vizsgálatoknál 21 ml-es dózisegységben adunk be.

A folyékony cápaporcextraktum liofilizáláskor hatásosságának egy részét elveszítheti. Azonban a liofilizálás előtt a szakirodalomból ismert stabilizátorok vagy védőanyagok hozzáadásával érzékeny aktivitásuk megőrizhető, és száraz állapotban a porcextraktum nagyobb dózisa is beadható.

Szükséges anyagok:

- hűtők

- sebészeti berendezések

- húsdaráló

- műanyag zacskók

- ipari keverő (Fischer Scientifictől vásárolt, Waring 3 fokozatú keverő)

- víztisztító rendszer (inverz ozmózis és 0,1 pm-es szűrés; 91089 szériaszámú Continental Water System, PRE 2202 model, Modulab Bioscience RQ/ Polishing System, Fischer scientific, Montreal Quebec). Ez a rendszer magas minőségű apirogén vizet biztosít

- Mettler precíziós mérleg, AE sorozat, Fischer Scientific

- RC-285 Sorvall centrifuga, DuPont (Kanada)

- CEPA centrifuga

- 30 pmol porozitású nejlonzsák

- autokláv (Sanyo automatikus párasterilizáló, MAC 350P modell)

- 500 ml-es Nalgene tartály 132 °C-on 10 percig sterilizálva és 35 percig szárítva

- 24 pm porizitású Whatman Reeve Angel kónikus szűrő

- ultraszűró oszlop [molekulatömeg-határ 500 kDa (és 1 kDa, ha alkalmazható); felület 25 négyzetláb; áramlás 130 l/perc; bemeneti nyomás 30 psi; kimeneti nyomás 5 psi; Koch Membráné System, Wilmington, MA, USA]

- egészségügyi centrifugaszivattyú (Monarch Industries ACE-S100 model, A típus) 130 l/perc áramlás biztosítására

- steril fülke (NuAire lamináris áramlású fülke, Ingram & Bell)

- Millipack-60 0,22 pm steril szűrő

- steril, átlátszó vagy borostyánüveg palackok

- DC-10 Amicon koncentrátor

- Rotofor Biorad 170-2950

- Amicon szűrők SIOY10, SIOY30 és SIOY100 10, 30 és 100 kDa határértékkel

-FPLC Pharmacia 216007 (Pharmacia 216014 számítógép)

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Labconco 10273 A liofilizátor Találmányunkat a fentiekben ismertettük, és le kívánjuk szögezni, hogy a találmány célján nem változtatnak a szakember számára nyilvánvaló módosítások vagy a találmány egyes elemeinek olyan módon való helyettesítése, ami a szakember ismereteihez és tudásához tartozik, továbbá az ekvivalensek alkalmazása. Ezek a nyilvánvaló változatok szintén az oltalmi körhöz tartoznak.

Claims

1. Eljárás ép porcban jelen lévő biológiailag aktív vízoldható komponensek jelentős részét tartalmazó folyékony porcextraktum előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) porcot vizes oldatban 500 pm vagy ennél kisebb részecskeméret eléréséig homogenizálunk az említett biológiailag aktív komponensek épségének megőrzéséhez megfelelő körülmények között, ezzel a részecskék és az említett biológiailag aktív komponenseket tartalmazó nyers folyadékextraktum keverékét kapjuk;

b) a homogenizátum centrifugálásával a részecskéket és a nyers folyadékextraktumot elválasztjuk;

c) a nyers folyadékextraktum további elválasztásával 500 kilodalton (kDa) vagy ennél kisebb molekulatömegű porcmolekulákat tartalmazó végső folyékony porcextraktumot állítunk elő; és

d) a végső folyadékextraktum koncentrálásával a 0,1 kDa-nál kisebb molekulatömegű molekulákat eltávolítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett körülmények közötti homogenizálást 0 °C és 20 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett körülmények közötti homogenizálást pH 6 és pH 8 közötti kémhatású vizes oldatban hajtjuk végre.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépést 15 perc és 24 óra közötti időtartam alatt hajtjuk végre.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépést 15 perc és 1 óra közötti időtartam alatt hajtjuk végre.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a porc és a vizes oldat arányát 1 kg-ra számítva legalább 1 literre állítjuk be.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) koncentrálási lépésben a végső folyadékextraktumot körülbelül 0,1 kDa molekulatömeg vágási értékű membránon történő szűréssel koncentráljuk.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) koncentrálási lépésben a végső folyadékextraktumot liofilizáljuk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a liofilizálást a biológiailag aktív komponensek épségének megőrzéséhez szükséges mennyiségben a folyadékextraktumhoz adott stabilizátor vagy védőanyag jelenlétében végezzük.

10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a porcot cápából nyerjük ki.

11. Eljárás az ép porcban jelen levő antikollagenolitikus és antiangiogén hatású vízoldható komponense23

HU 225 490 Β1 két tartalmazó folyékony cápaporcextraktum előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) porcot vizes oldatban körülbelül 500 pm vagy ennél kisebb részecskeméret eléréséig homogenizálunk az említett biológiailag aktív komponensek épségének megőrzéséhez megfelelő körülmények között, ezzel a részecskék és az említett biológiailag aktív komponenseket tartalmazó nyers folyadékextraktum keverékét kapjuk;

c) a nyers folyadékextraktum további elválasztásával 500 kDa vagy ennél kisebb molekulatömegű porcmolekulákat tartalmazó végső folyadékextraktumot állítunk elő; és

d) a végső folyadékextraktumot egy 0,1 kDa molekulatömeg vágási értékű membránon szűrjük; és

e) a legfeljebb 0,1 kDa molekulatömegű molekulákat tartalmazó frakciót visszanyerjük.

12. Eljárás ép porcban jelen levő antiangiogén hatású vízoldható komponenseket tartalmazó folyékony cápaporcextraktum előállítására, azzal jellemezve, hogy

c) a nyers folyadékextraktum további elválasztásával 500 kDa vagy ennél kisebb molekulatömegű porcmolekulákat tartalmazó végső folyadékextraktumot állítunk elő;

d) a végső folyadékextraktumot egy 10 kDa molekulatömeg vágási értékű membránon szűrjük;

e) a 10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű molekulákat tartalmazó frakciót visszanyerjük;

f) ezt a frakciót egy anioncserélő kromatográfiás oszlopon frakcionáljuk; és

g) a 0,8 mól/liter és 1,0 mól/liter közötti nátrium-klorid-koncentrációnál eluált frakciót visszanyerjük.

13. Cápából kinyert és az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállítható porcextraktum.

14. Cápából kinyert és a 7. igénypont szerinti eljárással előállítható porcextraktum.

15. A 10. igénypont szerinti eljárással előállítható porcextraktum.

16. A 11. igénypont szerinti eljárással előállítható, antikollagenolitikus és antiangiogén hatású porcextraktum.

17. A 12. igénypont szerinti eljárással előállítható antiangiogén hatású porcextraktum.

18. Készítmény tumoros sejtburjánzás, angiogenezis, gyulladás és/vagy kollagenolízis közül választott egy vagy több etiológiai komponenst magukban foglaló betegségek vagy állapotok kezelésére, amely egy, a 13-15. igénypontok bármelyike szerinti porcextraktum hatásos mennyiségét tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt.

19. Készítmény kollagenolitikus etiológiai komponenst magukban foglaló betegségek vagy állapotok kezelésére, amely egy, a 16. igénypont szerinti porcextraktum hatásos mennyiségét tartalmazza.

20. Készítmény angiogén etiológiai komponenst magukban foglaló betegségek vagy állapotok kezelésére, amely egy, a 16. vagy 17. igénypont szerinti porcextraktum vagy a 16. és 17. igénypont szerinti porcextraktumok kombinációjának hatásos mennyiségét tartalmazza.

21. A 18. igénypont szerinti készítmény intraperitoneális, szubkután, okuláris, nazális, orális, rektális, szublingvális, intramuszkuláris, intradermális vagy transzdermális alkalmazásra.

22. A 18. igénypont szerinti készítmény, amely egy topikális készítmény.

23. A 22. igénypont szerinti készítmény, amely 1 mg/ml és 50 mg/ml közötti végső szilárdanyag-tartalom eléréséhez szükséges mennyiségű porcextraktumot tartalmaz.

24. Topikális készítmény akne kezelésére, amely gyógyászatilag hatásos alkotórészként a készítmény 1 ml-ére számítva egy, a 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktum 2 mg szilárd tömegnek megfelelő mennyiségét tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt.

25. Topikális készítmény pszoriázis kezelésére, amely gyógyászatilag hatásos alkotórészként a készítmény 1 ml-ére számítva egy, a 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktum 30-50 mg szilárd tömegnek megfelelő mennyiségét tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt.

26. Készítmény rák kezelésére, amely egy, a 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktum gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt.

27. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely a páciens testtömeg-kg-jaira számítva az említett porcextraktum 0,01 mg és 200 mg közötti teljes száraz tömegnek megfelelő mennyiségét tartalmazza.

28. A 27. igénypont szerinti készítmény, amely ilyen kezelésre szoruló betegnek orálisan vagy szublingválisan adható be.

29. A 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktum alkalmazása gyulladás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

30. A 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktum alkalmazása angiogenezis gátlására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

31. A 22. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben a bőr védőfunkciójának javítására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

32. A 22. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőr nyugtatására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

33. A 22. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben gyulladás csökkentésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

34. A 33. igénypont szerinti készítmény alkalmazása, ahol a gyulladást fizikai horzsolás okozta.

HU 225 490 Β1

35. A 33. igénypont szerinti készítmény alkalmazása, ahol a gyulladást kémiai irritáns okozta.

36. A 22. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben kollagenázaktivitás gátlására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

37. A 22. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben ráncok vagy sorvadás rendbe hozására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

38. A 24. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben akne csökkentésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

39. A 25. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben pszoriázis kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

40. A 22. igénypont szerinti készítmény alkalmazása emlősbőrben korai öregedés megállítására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

41. A 18. igénypont szerinti készítmény alkalmazása a tumoros sejtburjánzást, angiogenezist, gyulladást és kollagenolízist tartalmazó csoportból választott egy vagy több komponenst magában foglaló betegségek vagy állapotok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

42. A 41. igénypont szerinti készítmény alkalmazása, ahol a betegségek vagy állapotok a rákot, papulás-pikkelyes bőrbetegséget, ízületi gyulladást, aknét, pókhálószerű vénákat, visszértágulatokat, szemgödör körüli sötét karikákat, hipertrófiás hegeket, hajhullást, ekcémát, szemölcsöket, sclerosis multiplexet, fibrózist, gyulladásos bélbetegséget, szklerodermát, érszűkülettel kapcsolatos betegségeket, szaruhártya-neovaszkularizációt, szaruhártya-fertőzést, neovaszkuláris glaukómát, herpeszvírus-keratitiszt, diabetikus retinopátiát és beültetett szerv kilökődést tartalmazó csoportból vannak kiválasztva.

43. A 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktumot tartalmazó készítmény alkalmazása endotéliumsejt szaporodását gátló gyógyszerkészítmény előállítására.

44. A 13., 14. vagy 15. igénypont bármelyike szerinti porcextraktumot tartalmazó készítmény alkalmazása TPA aktiválta keratinocitadifferenciálódás gátlására.