PL187989B1

PL187989B1 - Ekstrakty z chrząstki rekina, sposoby ich otrzymywania, kompozycje zawierające ekstrakty z chrząstki rekina i ich zastosowanie

Info

Publication number: PL187989B1
Application number: PL32688896A
Authority: PL
Inventors: Eric Dupont; Paul Brazeau; Christina Juneau; Daniel H. Maes; Kenneth Marenus
Original assignee: Aeterna Lab Inc
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 2004-11-30
Also published as: ES2190475T3; CZ129398A3; IS4728A; DK0859622T3; RU2181292C2; CA2236021A1; IL119030A; US6025334A; NZ313957A; BG102419A; EP0859622B1; NO981781D0; CO4750839A1; DE69625698T2; KR100296016B1; HK1015683A1; HUP9802604A2; HU225490B1; JP2003246740A; TW503108B

Abstract

1 . Sposób otrzymywania plynnego ekstraktu ¿chrzastki rekina, zawierajacego aktywne biologicznie, rozpuszczalne w wodzie skladniki, wystepujace w chrzastce nie poddanej obróbce, znamienny tym, ze chrzastke rekina najpierw ho- mogenizuje sie w roztworze wodnym o pH w zakresie od 6 do 8, pozwalajacym na zachowanie w stanie nienaruszonym skladników aktywnych biologicznie, do uzyskania homogenatu zawierajacego czasteczki chrzastki o rozmiarze nie prze- kraczajacym 500 µ m, przy czym do homogenizacji wprowadza sie co najmniej 1 litr roztworu wodnego na 1 kg chrzast- ki, nastepnie homogenat poddaje sie wirowaniu i oddziela czasteczki z nie oczyszczonego plynnego ekstraktu; po czym nie oczyszczony plynny ekstrakt poddaje sie dalszemu rozdzielaniu do otrzymania koncowego plynnego ekstraktu zawie- rajacego czasteczki chrzastki o masie czasteczkowej mniejszej lub równej 500 kilodaltonów (kDa) (8,510-1 9 g); i koncowy plynny ekstrakt poddaje sie zatezaniu, za pomoca którego usuwa sie przynajmniej czesc czasteczek o masie czasteczkowej mniejszej od 0,1 kDa (1,7- 10-22g). 9. Sposób otrzymywania plynnego ekstraktu z chrzastki rekina, zawierajacego rozpuszczalne w wodzie skladniki an ty-kolagenolityczne i anty-angiogeniczne, wystepujace w chrzastce nie poddanej obróbce, znamienny tym, ze chrzastke rekina najpierw homogenizuje sie w roztworze wodnym o odczynie zblizonym do obojetnego, w temperaturze od 0 do 20°C do uzyskania homogenatu zawierajacego czasteczki o rozmiarze nie przekraczajacym 500 µ m, przy czym do homo- genizacji wprowadza sie co najmniej 1 litr roztworu wodnego na 1 kg chrzastki, nastepnie homogenat poddaje sie wiro- waniu i oddziela sie osad od nie oczyszczonego plynnego ekstraktu; po czym nie oczyszczony plynny ekstrakt poddaje sie filtracji na kolumnie filtracyjnej do otrzymania plynnego ekstraktu zawierajacego czasteczki chrzastki o masie cza- steczkowej mniejszej lub równej 500 kilodaltonów (kDa), a oczyszczony plynny ekstrakt poddaje sie filtracji na blonie o wartosci odciecia masy czasteczkowej 0,1 kDa ( 1,7-10-2 2 g); i odzyskuje frakcje zawierajaca czasteczki o masie cza- steczkowej od 0 do 0,1 kD a(0 do 1,7-10-22g), .... 10. Sposób otrzymywania plynnego ekstraktu z chrzastki rekina zawierajacego rozpuszczalne w wodzie skladniki an ty-angiogeniczne, wystepujace w chrzastce nie poddanej obróbce, znamienny tym, ze chrzastke rekina najpierw homo- genizuje sie w roztworze wodnym o odczynie zblizonym do obojetnego do uzyskania homogenatu zawierajacego cza- steczki o rozmiarze nie przekraczajacym 500 µ m, przy czym do homogenizacji wprowadza sie co najmniej jeden litr roztworu wodnego na 1 kg chrzastki, nastepnie homogenat poddaje sie wirowaniu i oddziela sie osad od nie oczyszczo- nego plynnego ekstraktu;.... PL 1 8 7 9 8 9 B 1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są płynne ekstrakty z chrząstki rekina zawierające aktywne biologicznie, rozpuszczalne w wodzie składniki występujące w chrząstce nie poddanej obróbce o działaniu przeciwkolagenolitycznym, przeciwzapalnym, przeciwnaczyniowotwórczym i przeciwnowotworowym. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania tych ekstraktów, kompozycji je zawierających i ich zastosowania.

Chrząstka jest tkanką beznaczyniową, którą badano jako potencjalne źródło czynników przeciwnaczyniotwórczych. Dodatkowo tkanka ta jest stosunkowo odporna na rozwój nowotworu. Nowotwór związany z chrząstką, chrzęstniakomięsak (chondrosarcoma), jest najmniej unaczynionym ze wszystkich rodzajów guzów. Rozwój naczyń jest jednym z ważnych czynników w procesie tworzenia nowotworu. Poszczególne guzy pojawiają się, jeśli komórki rakowe są w stanie doprowadzić do powstawania przyległej sieci naczyniowej, dostarczającej składniki pokarmowe i umożliwiającej rozprzestrzenianie się nowotworu. Ze względu na rolę, jaką odgrywają w rozwoju nowotworu, rozpoczęto badanie czynników biorących udział w stymulacji rozwoju naczyń oraz badanie czynników przeciwnaczyniotwórczych, jak i leków powodujących obniżenie aktywności czynników naczyniotwórczych, jako czynników umożliwiających kontrolę wzrostu lub wpływających na cofanie się nowotworów.

Odkryto, iż chrząstki barkowe u cieląt zawierają substancję, która hamuje unaczynienie guzów (Langer i in., 1976). Ponieważ uzyskane wyniki wskazywały na możliwość zastosowania tej substancji jako czynnika przeciwnowotworowego, rozpoczęto poszukiwania wydajniejszego źródła chrząstki.

Ze względu na fakt, iż szkielet wewnętrzny rekina jest złożony całkowicie z chrząstki (6% wagi ciała rekina względem 0,6% wagi ciała cielaka), zwierzęta te, są potencjalnie lepszym źródłem inhibitorów rozwoju naczyń. Ciekawą właściwością rekinów jest również brak

187 989 skłonności do zapadania na nowotwory. W celu wyjaśnienia niskiego prawdopodobieństwa rozwoju nowotworów u rekinów powstało wiele teorii. Marchalonis i in., (1990) wykazali, że przeciwciała IgM są w stanie z łatwością atakować każdy czynnik agresywny. McKinney i in. (1990) odkryli, że makrofagi rekinów są zdolne do odróżniania komórek normalnych od nowotworowych i do niszczenia komórek nowotworowych. Rosen i Woodhead (1980) postulowali, że rzadkość występowania nowotworów u spodoustych (podgromada, do której należą rekiny i płaszczki) może być spowodowana wysoką siłą jonową w ich tkankach, która odpowiada wysokiej temperaturze ich ciała. Autorzy ci uważają, że w tej sytuacji system immunologiczny jest efektywny niemalże w 100%. Moore i in. (1993) odkryli, że rekiny produkują aminosterol posiadający właściwości przeciwbakteryjne i przeciwpierwotniakowe. Ostatecznie, Lee i Langer (1983) oraz Folkman i Klagsbrun (1987) wykazali, że rekiny produkują substancję, która hamuje tworzenie nowych naczyń krwionośnych. Lee i Langer (op. cit) wyizolowali tę substancję z chrząstki rekina stosując ekstrakcję w warunkach denaturujących (ekstrakcja guanidynowa). Zastosowany przez nich proces ekstrakcji jest jednak bardzo długi (41 dni) i może prowadzić do powstania ekstraktów zawierających zdenaturowane czynniki, a ilość otrzymanych w jego wyniku związków aktywnych jest daleka od doskonałej. Podczas gdy wiadomo, że substancja aktywna otrzymana z cieląt ma masę cząsteczkową ok. 16 kDa (2,77-10'^2Og), Lee i Langer (op. cit) nie podali dokładnej masy cząsteczkowej substancji aktywnej wyizolowanej z chrząstki rekina. Substancja ta została określona jedynie jako związek o masie cząsteczkowej wyższej niż 3500 Da (5,6-10'²¹g). Oikawa i in. (1990) zastosowali te same metody ekstrakcji, jak te opisane przez Lee i Langera, lecz znacznie skrócili czas trwania ekstrakcji (2 dni zamiast 41 dni). W wyniku badań przeprowadzonych przez Oikawę i in., stwierdzono, że substancja przeciwnaczyniotwórcza otrzymana z chrząstki rekina ma masę cząsteczkową zawierającą się w przedziale pomiędzy 1000 do 10 000 Da (1,7· 10'2^Jg do 1,7-10'2°g). Schinitsy (USP 4,473,551) opisał wodny ekstrakt otrzymany z grubo sproszkowanej chrząstki, którego frakcja (sama lub w połączeniu z glukozoaminą) o masie cząsteczkowej powyżej 100 000 Da (1,7-10' ⁹g), wykazuje aktywność przeciwzapalną. W patencie tym nie przedstawiono żadnych uwag na temat aktywności przeciwnaczyniotwórczej lub przeciwnowotworowej składnika tego ekstraktu. Kuetner i in., (USP 4,746,729) otrzymali z chrząstki wołowej neutrofil polimorficzny pod względem jądra (PMN), będący inhibitorem elastazy. Inhibitor ten otrzymano z wodnego ekstraktu chrząstki, zawierającego cząsteczki o masie cząsteczkowej niższej niż 50 000 Da (8,5·W^g). W wyniku frakcjonowania na podłożu Sephacryl S-200 otrzymano wiele frakcji i po zbadaniu ich aktywności antyelastazowej, frakcje o masie cząsteczkowej 10-40 kDa (1,7-6,8-10'2°g) połączono. Składnik aktywny ma punkt izoelektryczny 9,5 i może mieć masę cząsteczkową ok. 15 000 Da (2,55·10'2°g). Kuetner i in. (USP 4,042,457) wykazali, że chrząstka rekina zawiera składnik o masie cząsteczkowej mniejszej niż 50 000 Da (8,5-10^), który hamuje proliferację komórek, lecz nie wpływa na wzrost komórek śródbłonka. Balassa i in. (USP 4,822,607) otrzymali wodny ekstrakt z chrząstki, który to ekstrakt wykazywał aktywność przeciwnowotworową. Jednakże uzyskawszy ekstrakt metodą Balassa, nie zaobserwowaliśmy żadnej aktywności przeciwnaczyniotwórczej w tym ekstrakcie. Spilburg i in. (USP 4,243,582) wyodrębnili z chrząstki wołowej (ekstrakcja guanidynowa) dwie glikoproteiny o masie cząsteczkowej 65 kDa (1,105-10'g) oraz punkt izoelektryczny 3,8, które wykazywały aktywność przeciwtrypsynową i hamowały wzrost komórek śródbłonka.

Chrząstka wyizolowana z cielaka i rekina wykazuje wieloraką aktywność biologiczną: pro-zapalną przeciwzapalną, przeciwnaczyniotwórczą lizoz.ymową, stymulującą wzrost komórek, inhibitorową w stosunku do kolagenazy typu I i IV, elastazy i innych proteaz takich jak trypsyna, chymotrypsyna i plazmina. Jednakże, jak dotychczas nikt nie otrzymał ekstraktu z chrząstki, który obejmowałby wszystkie te właściwości, ważne klinicznie.

Składnik (lub składniki) przeciwnaczyniotwórczy z chrząstki rekina został ogólnie przebadany stosując test na kieszonce rogówki królika (rabbit corneal pocket assay) lub test na błonie kosmówki omoczniowej kurczaka (CAM). Do chwili obecnej, ze względu na działanie przeciwnaczyniotwórcze, przebadano sproszkowaną chrząstkę in vivo, bezpośrednio na nowotworach, na ludzkim czerniaku (melanoma xenograft) implantowanym u nagiej myszy (USP

187 989

5,075,112), jak i stosując testy CAM. Mimo, iż działanie przeciwnowotworowe przypisywano ekstraktowi z chrząstki, to najczęściej wiązano je ze składnikiem przeciwnaczyniotwórczym, który pozbawia nowotwór dostaw krwi. Do tej pory, nie ma dowodów, że chrząstka rekina ma bezpośredni wpływ na proliferację komórek nowotworu.

Znanych jest kilka sposobów otrzymywania ekstraktów z chrząstki rekina oraz ich frakcjonowania. Niektóre z nich polegają na otrzymywaniu sproszkowanej surowej chrząstki bez żadnej ekstrakcji (USP 5,075,112). Inne polegają na użyciu czynników denaturujących takich jak guanidyna (USP 4,243,582). W jeszcze innych stosuje się wstępne trawienie enzymatyczne chrząstki, w celu pozbycia się struktur mięśniowych, nerwowych lub naczyniowych otaczających chrząstkę; następnie eliminuje się tłuszcze w rozpuszczalnikach organicznych, po czym związki aktywne są ekstrahowane w fazie wodnej (Balassa i in. USP 3,478,146; 4,350,682; 4,656,137 oraz 4,822,607). Nie jest znany wpływ takiego wstępnego trawienia na zachowanie całej aktywności biologicznej składników chrząstki. Jeśli trawienie trwa zbyt długo, aktywne związki białkowe mogą ulec hydrolizie. Na przykład, stosując sposób Balassa (USP 4,822,607) uzyskuje się ekstrakt płynny pozbawiony aktywności przeciwnaczyniotwórczej; utrata aktywności może być wynikiem degradacji enzymatycznej. Sposób Balassa nie obejmuje etapu frakcjonowania, który w znacznym stopniu mógłby wzbogacić ekstrakt w związki czynne. Stosując inne metody otrzymuje się po prostu ekstrakty wodne (w wodzie (USP 4,473,551) lub roztworach soli (USP 4,746,729)) chrząstki usuwając materiał nierozpuszczalny. Stosując te sposoby otrzymano poszczególne frakcje o odpowiednich masach cząsteczkowych, w celu prowadzenia dalszych badań i dalszego oczyszczenia substancji aktywnej (patrz dyskusja powyżej).

Cytowane powyżej sposoby posiadają kilka niedogodności. Stosując je można spowodować denaturację niektórych ważnych związków. Jeżeli nawet nie stanowi to problemu, to i tak sposoby te są zbyt czasochłonne, aby mogły mieć zastosowanie w praktyce. Ponadto, stosując sposoby wymagające dużo czasu, nie koniecznie otrzymuje się wystarczającą ilość aktywnego składnika, a pomiędzy składnikami, których aktywność biologiczna została zachowana, mogą być takie, które nie odzyskały aktywności w ogóle, lub w niewystarczającym stopniu, aby wykryć ich aktywność; bądź niektóre składniki zostały odrzucone ponieważ nie wykazywały pożądanej aktywności.

Rozwój naczyń jest zaangażowany nie tylko w rozwój nowotworu. Wiele chorób lub stanów chorobowych wpływających na różne układy fizjologiczne (wskazane w nawiasach) zależy od rozwoju naczyń, na przykład: zapalenie stawów i płytki miażdżycowe (kości i wiązadła); retynopatia cukrzycowa, jaskra nowonaczyniowa, zwyrodnienie plamki, opryszczka oczna, jaglica i nowounaczynienie przeszczepu rogówkowego (oko); łuszczyca, twardzina skóry, trądzik różowaty, naczyniak krwionośny i bliznowacenie przerosłe (skóra); zrosty naczyniowe i naczyniaki (system krwionośny). Dlatego, każdy nowy i skuteczny „czynnik” przeciwnaczyniotwórczy może znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób, podobnie jak w terapii nowotworów i innych chorób zależnych od rozwoju naczyń. Ponadto, ponieważ elementem wielu spośród chorób i stanów chorobowych wymienionych powyżej jest także stan zapalny, każdy nowy i skuteczny „czynnik” przeciwzapalny może znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób i stanów, podobnie jak innych chorób lub stanów zapalnych. Co więcej, ponieważ proteazy takie jak kolagenazy, ze względu na ich zdolność degradacji kolagenu, są zaangażowane w rozmaite choroby i stany, takie jak nowotwór oraz przedwczesne starzenie, nowy i skuteczny „czynnik” przeciwkolagenolityczny może znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób i stanów chorobowych związanych z degradacją kolagenu. Ponieważ rozwój naczyń, zapalenie i proteoliza mogą, osobno lub w połączeniu, być przyczyną wielu różnych chorób lub stanów, zatem produkt zdolny do przeciwdziałania wszystkim tym procesom, lecz nie wpływający negatywnie na normalne funkcje organizmu, miałby olbrzymie znaczenie terapeutyczne.

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina, a uzyskany tym sposobem ekstrakt zawiera większość aktywnych biologicznie, rozpuszczalnych w wodzie związków obecnych w chrząstce nie poddanej obróbce.

187 989

Istotą wynalazku jest sposób, w którym najpierw homogenizuje się chrząstkę rekina w roztworze wodnym o pH w zakresie od 6 do 8, pozwalającym na zachowanie w stanie nienaruszonym składników aktywnych biologicznie, do uzyskania homogenatu zawierającego cząsteczki chrząstki o rozmiarze nie przekraczającym 5θ0 pm; przy czym do homogenizacji wprowadza się co najmniej 1 litr roztworu wodnego na 1 kg chrząstki, następnie homogenat poddaje się wirowaniu i oddziela cząsteczki z nie oczyszczonego płynnego ekstraktu; po czym nie oczyszczony płynny ekstrakt poddaje się dalszemu rozdzielaniu do otrzymania końcowego płynnego ekstraktu zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kilodaltonów (kDa) (8,5-10'¹⁹g); i końcowy płynny ekstrakt poddaje się zatężaniu, za pomocą którego usuwa się przynajmniej część cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10’²²g).

Korzystne jest prowadzenie kolejnych etapów sposobu w niskiej temperaturze (od 0 do 20°C), najlepiej w czystej wodzie, przy wartościach pH bliskich obojętnemu. Stosując ten sposób otrzymywania ekstraktu, składniki chrząstki mogą zostać wyekstrahowane po okresie homogenizacji od 15 minut do 24 godzin, korzystnie w czasie od 15 minut do 1 godziny Zatężania dokonuje się przez filtrowanie płynnego ekstraktu na błonie o wartości odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącej 0,1 kDa (1,7-10^-2 g). Zatężania można również dokonać przez liofilizację płynnego ekstraktu. Korzystnie liofilizację prowadzi się w obecności stabilizatora lub czynnika ochronnego dodanego do płynnego ekstraktu w ilości wystarczającej do zwiększenia ochrony całości składników biologicznie aktywnych.

W odmianie wynalazku sposób otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina, zawierającego rozpuszczalne w wodzie składniki anty-kolagenolityczne i anty-angiogeniczne, występujące w chrząstce nie poddanej obróbce obejmuje: homogenizację w roztworze wodnym o odczynie zbliżonym do obojętnego, w temperaturze od 0 do 20°C do uzyskania homogenatu zawierającego cząsteczki o rozmiarze nie przekraczającym 500 pm, przy czym do homogenizacji wprowadza się co najmniej 1 litr roztworu wodnego na 1 kg chrząstki, następnie homogenat poddaje się wirowaniu i oddziela się osad od nie oczyszczonego płynnego ekstraktu, po czym nie oczyszczony płynny ekstrakt poddaje się filtracji na kolumnie filtracyjnej do otrzymania płynnego ekstraktu zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kilodaltonów (kDa) (8,5-1 O^g), a oczyszczony płynny ekstrakt poddaje się filtracji na błonie o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 100 Da (1,7-10’22g) i odzyskuje frakcję zawierającą cząsteczki o masie cząsteczkowej od 0 do 0,1 kDa (0 do 1,7- 10’22g), przy czym homogenizację prowadzi się w temperaturze od 0 do 20°C, a wirowanie i filtrowanie prowadzi się w temperaturze od 0 do 10°C.

W innej odmianie wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego rozpuszczalne w wodzie składniki anty-angiogeniczne, występujące w chrząstce nie poddanej obróbce obejmuje najpierw homogenizację w roztworze wodnym o odczynie zbliżonym do obojętnego do uzyskania homogenatu zawierającego cząsteczki o rozmiarze nie przekraczającym 500 pm, przy czym do homogenizacji wprowadza się co najmniej jeden litr roztworu wodnego na 1 kg chrząstki, następnie homogenat poddaje się wirowaniu i oddziela się osad od nie oczyszczonego płynnego ekstraktu, po czym poddaje się płynny ekstrakt dalszemu rozdziałowi przez filtrację i otrzymuje się płynny ekstrakt zawierający cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej nie przekraczającej 500 kDA (8,5- 1<^)^I9g) i oczyszczony płynny ekstrakt zatęża się przez filtrację na błonie o wartości odcięcia 10 kDa (0 do 1,7-1 (0²°g); i odzyskuje się frakcję zawierającą cząsteczki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa (l,7-10'2°g) i frakcjonuje tą frakcję na jonowymiennej kolumnie chromatograficznej odzyskując frakcję ulegającą wymywaniu z kolumny przy stężeniu NaCl w zakresie od 0,8 do 1,0 M.; przy czym homogenizację prowadzi się w temperaturze od 0 do 20°C, a wirowanie, filtrowanie i zatężanie w temperaturze od 0 do 10°C.

Odmiana wynalazku obejmuje również płynne ekstrakty z chrząstki rekina oraz ekstrakty liofilizowane otrzymywane sposobami według wynalazku.

Kolejna odmiana wynalazku obejmuje kompozycje do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez jeden lub więcej czynników etiologicznych wybranych z grupy obejmującej proliferację nowotworu, angiogenezę, stany zapalne i kolagenolizę, zawierające farmaceu187 989 tycznie akceptowalny nośnik oraz jako aktywny składnik skuteczną ilość otrzymanego sposobem według wynalazku płynnego ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10'9g), z którego przez zatężanie usunięto część cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10'²²g) lub liofilizowanego płynnego ekstraktu lub ekstraktu zawierającego wydzielone przez filtrację cząsteczki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa (1,7-10'2°g) z frakcji wymywanej z jonowymiennej kolumny chromatograficznej 0,8-1,0 M. roztworem NaCl.

Korzystna odmiana wynalazku obejmuje kompozycje do podawania donaczyniowego, podskórnego, doocznego, doustnego, doodbytowego, podjęzykowego, domięśniowego, śródskórnego lub przezskórnego zawierające farmaceutycznie akceptowalny nośnik, oraz jako aktywny składnik skuteczną ilość, otrzymanego sposobem według wynalazku, płynnego ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10’’9g), z którego usunięto część cząsteczek o masie mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10’22g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego.

Przedmiot wynalazku obejmuje następnie kompozycję do stosowania miejscowego zawierającą farmaceutycznie akceptowalny nośnik, oraz jako aktywny składnik płynny ekstrakt z chrząstki rekina otrzymany sposobem według wynalazku, zawierający cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa (1,7-10’'^2<)g) z frakcji wymywanej z jonowymiennej kolumny chromatograficznej 0,8-1,0 M roztworem NaCl, dodany w ilości niezbędnej do uzyskania zawartości stałej masy w kompozycji wynoszącej od 1 do 50 mg/l ml.

Objęta przedmiotem wynalazku kompozycja do stosowania miejscowego wleczeniu trądziku, zawiera farmaceutycznie akceptowalny nośnik, oraz jako aktywny składnik leczniczy 2 mg suchej masy/1 ml, otrzymanego sposobem według wynalazku, ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10'¹⁹g), z którego usunięto część cząsteczek o masie mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10'²²g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego.

Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu łuszczycy, zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, oraz jako aktywny składnik leczniczy 30-50 mg suchej masy/l ml, otrzymanego sposobem według wynalazku, płynnego ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10'’9g), z którego usunięto część cząsteczek o masie mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10'2²g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego.

Dalszym korzystnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja do leczenia nowotworów, zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, oraz jako aktywny składnik leczniczy skuteczną ilość, otrzymanego sposobem według wynalazku, płynnego ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-1019g), z którego usunięto część cząsteczek o masie mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10’22g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego.

Jeszcze inna odmiana wynalazku obejmuje zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10*1 g), z którego usunięto część cząsteczek chrząstki o masie mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10'2²g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego, otrzymanych sposobem według wynalazku, do wytwarzania leków do leczenia stanów zapalnych oraz do hamowania angiogenezy.

Korzystna odmiana wynalazku obejmuje zastosowanie kompozycji do stosowania miejscowego, zawierającej farmaceutycznie akceptowalny nośnik oraz jako aktywny składnik ekstrakt z chrząstki rekina zawierający cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa (1,7-10'2°g) z frakcji wymywanej z kolumny 0,8-1,0 M roztworem NaCl, otrzymany sposobem według wynalazku, dodany w ilości niezbędnej do uzyskania zawartości stałej masy w kompozycji wynoszącej od 1 do 50 mg/l ml do wytwarzania leku do udoskonalenia działania skóry ssaków jako bariery, do udelikatniania skóry ssaków i do ograniczenia stanu zapalnego skóry ssaków, szczególnie wywołanego otarciem i podrażnieniem skóry substancją chemiczną a także do wytwarzania leku zmniejszającego zmarszczki i atrofię skóry oraz ograniczającego przedwczesne starzenie się skóry.

187 989

Dalsza korzystna odmiana wynalazku obejmuje zastosowanie kompozycji do stosowania miejscowego, zawierającej farmaceutycznie akceptowalny nośnik, oraz jako aktywny składnik leczniczy 2 mg suchej masy/l ml ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10’¹⁹g), z którego usunięto część cząsteczek o masie mniejszej od 0,1 kDa (l,7-10'22g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego, otrzymanych sposobem według wynalazku, do wytwarzania leku ograniczającego występowanie trądziku na skórze ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji do stosowania miejscowego, zawierającej farmaceutycznie akceptowalny nośnik, oraz jako aktywny składnik leczniczy 30 - 50 mg suchej masy/l ml ekstraktu chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10‘¹⁹g), z którego usunięto część cząsteczek o masie mniejszej od 0,1 kDa (l,7-10'²²g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego, otrzymanych sposobem według wynalazku, do wytwarzania leku leczącego łuszczycę występującą na skórze ssaków.

Korzystnie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez jeden lub więcej czynników etiologicznych zawierającej jako aktywny składnik skuteczną ilość ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-10’¹⁹g), z którego przez zatężanie usunięto część cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej od 0,1 kDa (1,7-10'²²g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego, otrzymanych sposobem według wynalazku, do wytwarzania leku do leczenia chorób lub stanów obejmujących jeden lub więcej komponentów wybranych z grupy obejmującej proliferację nowotworów, angiogenezę, stany zapalne, kolagenolizę, zwłaszcza chorób łub stanów z grupy obejmującej nowotwory, grudkowo-łuskową chorobę skóry, zapalenie stawów, trądzik, naczyniaki, żylaki, ciemne kręgi wokół oczodołowe, hipertroficzne blizny, łysienie, egzemę, brodawki, stwardnienie rozsiane, zwłóknowacenie, stany zapalne jelita, stwardnienie więzadła, choroby związane ze zwężaniem się naczyń, infekcje rogówki, wtórne unaczynianie rogówki, jaskrę nowonaczyniową, opryszczkowe zapalenie rogówki, retinopatię cukrzycową i odrzucanie przeszczepów.

Korzystnym rozwiązaniem według wynalazku jest także zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kDa (8,5-W¹ g), z którego przez zatężanie usunięto część cząsteczek chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej od 0,1 kDa (l,7-10'22g) lub płynnego ekstraktu liofilizowanego, otrzymanych sposobem według wynalazku, do wytwarzania leku do zahamowania proliferacji komórek śródbłonkowych oraz do hamowania różnicowania uaktywnionych keratynocytów.

Obecny wynalazek stanowi nowy sposób otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina, którego zaletą jest to, że zawiera on aktywne biologicznie, rozpuszczalne w wodzie składniki wartościowe terapeutycznie, występujące w chrząstce nie poddanej obróbce. W płynnym ekstrakcie z chrząstki rekina występują (w zadawalających stężeniach) składniki wykazujące aktywność przeciwnaczyniotwórczą, przeciwzapalną, przeciwkolagenolityczną; hamujące proliferację komórek nowotworowych in vivo i bezpośrednio hamujące proliferację komórek nowotworowych in vitro. Występowanie w tym ekstrakcie innych składników aktywnych biologicznie wymaga jeszcze potwierdzenia bądź wręcz czeka na odkrycie. Wszystkie wymienione wyżej typy składników aktywnych biologicznie uzyskano dla płynnego ekstraktu z chrząstki rekina, a występowanie niektórych z nich zaobserwowano lub potwierdzono również dla ekstraktu stałego z tej chrząstki.

Zaletą nowego sposobu jest łatwość wykonania oraz odpowiednia wydajność. Stosując ten sposób uzyskano wysoką wydajność otrzymywania ekstraktu z chrząstki, a otrzymany ekstrakt (w szczególności ekstrakt z chrząstki rekina), zawierał aktywne biologicznie składniki występujące w chrząstce nie poddanej obróbce.

Największą uwagę skierowano na preparaty stosowane w dermatologii i kosmetologii, co wynika z obserwacji efektów jakie w tych dziedzinach daje stosowanie ekstraktów uzyskiwanych z chrząstki. Obserwowana aktywność biologiczna: przeciwnaczyniotwórczą, przeciwkolagenolityczna i przeciwzapalna, oraz antagonistyczny wpływ na proliferację komórek,

187 989

U przekazywany przez szlaki sygnalizacyjne (takie jak np. szlak kinazy białkowej C w keratynocytach), umożliwia wykorzystywanie ekstraktów z chrząstki rekina do tworzenia kompozycji terapeutycznych i stosowanie ich do leczenia.

Niniejszy wynalazek będzie znacznie bardziej zrozumiały, jeśli zostanie wyjaśniony na podstawie szczegółowych zastosowań przedstawionych na załączonych rysunkach, których celem jest zobrazowanie wynalazku, nie ograniczając jego zakresu:

Figura 1 przedstawia stężenie aminokwasów w płynnym ekstrakcie.

Figura 2 przestawia wykres zależności stopnia hamowania wzrostu komórek linii komórkowych ZR75-1 i MCF-7 od stężenia stałego ekstraktu z chrząstki rekina w próbie.

Figura 3 przedstawia krzywe zależności między ilością komórek linii MCF-7 a stężeniem estradiolu, w obecności lub przy braku stałego ekstraktu z chrząstki rekina (zastosowano dwa różne stężenia ekstraktu).

Figura 4 a) i b) przedstawia porównanie obrazu nowotworu sutka u szczurów, którym podawano przez zagłębnik jedynie wodę (A) lub połączenie stałego i płynnego ekstraktu z chrząstki (B).

Figura 5 przedstawia histogram, obrazujący, iż unaczyniony obszar guza jest o 50% mniejszy u szczurów leczonych preparatem z chrząstki.

Figura 6 pokazuje, iż płynny ekstrakt z chrząstki nie wpływa na proliferację komórek fibroblastu.

Figura 7 przestawia krzywą zależności hamowania proliferacji komórek HUVEC od stężenia płynnego ekstraktu z chrząstki.

Figura 8 przedstawia hamowanie przez płynny ekstrakt z chrząstki, różnicowania keratynocytu indukowanego przez TPA.

Figura 9 przestawia krzywą zależności hamowania aktywności kolagenazy od stężenia płynnego ekstraktu z chrząstki.

Figura 10 przedstawia krzywą zależności hamowania unaczynienia od stężenia płynnego ekstraktu z chrząstki w Teście Unaczynienia Embrionalnego (Embryonic Vascularization Test) ex ovo.

Figura 11 przedstawia wpływ różnych dawek ciekłego ekstraktu z chrząstki na hamowanie rozwoju nowotworu u myszy.

Figura 12 ilustruje, że dootrzewnowe dawkowanie ciekłego ekstraktu z chrząstki może spowodować wzrost wydajności tego ekstraktu w hamowaniu wzrostu nowotworu.

Figura 13 a) i b), przedstawia obraz elektroforezy frakcji ciekłych, rozdzielonych uprzednio na złożu Rotofor; wzorce mas cząsteczkowych znajdują się w ostatniej ścieżce po lewej stronie, do następnej kieszonki nałożono próbkę ekstraktu płynnego dla porównania z wyizolowanymi frakcjami rozdzielanymi w pozostałych ścieżkach; elektroforezę prowadzono w warunkach nie denaturujących.

Figura 14 przedstawia obraz rozdziału podczas HPLC frakcji całkowitego ekstraktu z chrząstki (otrzymanego według opisu tego wynalazku), zawierającego związki o masie cząsteczkowej niższej niż 10 kDa (l ,7-10'^2Og), którą to frakcję zatężono i rozdzielono na pięć podfrakcji.

Figura 15 przestawia wyniki EVT otrzymane dla dwóch frakcji ciekłego ekstraktu z chrząstki rekina jak wyżej (DUP), jedna frakcja o masie cząsteczkowej niższej niż 10 000 Da, druga o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa (l,7TO’²⁰g).

Figura 16 a), b) i c) przedstawia obraz rozdziału podczas FPLC trzech różnych ekstraktów z chrząstki rekina. Na rysunku fig. 16 a), DUP oznacza płynny ekstrakt z chrząstki rekina otrzymany według opisu tego wynalazku. Na rysunku fig. 16 b), BAL i OIK oznaczają ekstrakty otrzymane według sposobów znanych wcześniej, odpowiednio Balassa i in., oraz Oikawa i in.

Figura 17 przestawia obraz rozdziału podczas HPLC ekstraktów opisanych na fig. 16.

Figura 18 przedstawia porównanie CZE ciekłego ekstraktu otrzymanego według opisu tego wynalazku z ekstraktami otrzymanymi według znanych wcześniej sposobów. A = DUP, B = Bal, C = OIK.

187 989

Figura 19 przedstawia porównanie EVT ciekłego ekstraktu otrzymanego według opisu tego wynalazku, z ekstraktami otrzymanymi według sposobów znanych wcześniej.

Figura 20 przedstawia porównanie składu aminokwasów ekstraktu otrzymanego według opisu tego wynalazku, z ekstraktami otrzymanymi według sposobów znanych wcześniej.

Figura 21 ilustruje znaczącą poprawę stanu zdrowia dwóch pacjentów cierpiących na łuszczycę, jeden z nadmiernym rogowaceniem fig. 21 a) i b), drugi bez nadmiernego rogowacenia fig. 21 c) i d), po miejscowym zastosowaniu kompozycji zawierającej skuteczną dawkę stężonego ciekłego ekstraktu z chrząstki rekina (fotografie u dołu); w porównaniu do stanu wcześniejszego, przed leczeniem (fotografie u góry).

Figura 22 przedstawia poprawę w wyglądzie twarzy pacjenta z pękającymi naczyńkami po leczeniu z zastosowaniem ciekłego ekstraktu z chrząstki.

Figura 23 przedstawia poprawę w wyglądzie ludzi z ciemnymi obwódkami wokół oczu, leczonych z zastosowaniem ciekłego ekstraktu z chrząstki.

Figura 24 przedstawia poprawę w wyglądzie nóg pacjentów z żylakami, leczonych z zastosowaniem ciekłego ekstraktu z chrząstki.

Figura 25 przedstawia znaczną poprawę stanu zdrowia pacjenta cierpiącego na trądzik, po zastosowaniu miejscowym kompozycji zawierającej skuteczną ilość ciekłego ekstraktu z chrząstki rekina (fotografia u dołu), w porównaniu do stanu wcześniejszego, przed leczeniem (fotografia u góry).

Figura 26 przedstawia właściwości przeciwzapalne ciekłego ekstraktu z chrząstki stosowanego na skórę ludzką.

Figura 27 przedstawia poprawę w funkcjonowaniu skóry ludzkiej jako bariery biologicznej, po leczeniu z zastosowaniem ciekłego ekstraktu z chrząstki.

Szczegółowy opis wynalazku. Chrząstkę otrzymywano ze zdrowych rekinków Black Spiny i Common Spiny. Całą tkankę mięśniową i łączną usuwano wyskrobując skalpelem oraz nożyczkami wysterylizowanymi etanolem. Następnie chrząstkę zamykano próżniowo w plastykowej torbie i zamrażano w -20°C do dalszego użycia. Do otrzymywania ekstraktów można zastosować chrząstkę pochodzącą z dowolnego źródła. My wybraliśmy chrząstkę rekina z powodów przedstawionych we wstępie opisu. Uważa się, że z chrząstki różnych gatunków spodoustych (które obejmują rekiny i płaszczki, jako gatunki zwierząt należące do tej podgromady), można otrzymać niemalże identyczne produkty. Jeśli jako materiał wyjściowy zostanie użyta chrząstka ssaków, otrzymane ekstrakty będą prawdopodobnie różne zarówno pod względem biologicznym jak i stężenia związków aktywnych obecnych w ekstrakcie.

Dopuszczalne są wszelkie te zmiany przed ekstrakcją chrząstki, które nie wpływają znacząco na aktywność produktu, będącego przedmiotem naszego zainteresowania (np. całkowity płynny ekstrakt lub jego odpowiednia frakcja). Niektóre związki aktywne mogą być odporne na trawienie proteolityczne, które zastosowano w celu pozbycia się tkanek otaczających chrząstkę, (Balassa i in. (USP 4, 822, 607)), podczas kiedy inne składniki aktywne mogą nie przetrwać takiego trawienia. Jednym ze składników, który wydaje się nie być odporny na trawienie jest składnik mający aktywność przeciwnaczyniotwórczą (fig. 19). Zatem, jeśli celem jest otrzymanie płynnego ekstraktu zawierającego największą możliwą ilość składników aktywnych rozpuszczalnych w wodzie, o różnych rodzajach aktywności, to podczas ekstrakcji etap polegający na trawieniu powinien być ominięty lub bardzo starannie kontrolowany, tak aby zapobiec hydrolizie lub proteolizie składników aktywnych.

W preparatyce używano czystą i świeżo wypreparowaną chrząstkę, schłodzoną do temp. 4°C lub chrząstkę mrożoną. Chrząstkę wraz z odpowiednią ilością wody przepuszczano kilka razy (dokładnie 3 razy) przez maszynkę do mięsa wysterylizowaną alkoholem. Minimalna objętość wody jaka może być stosowana jest równa wadze chrząstki, lecz może zostać ona zwiększona bez wpływu na wydajność procesu. Mała objętość wody jest korzystna, z praktycznego punktu widzenia, gdyż trudniej jest operować dużą objętością preparatu. Wodę oczyszczano przez odwrotną osmozę i wielokrotne filtrowanie, aż do zastosowania filtra 0,1 pm. W miejsce wody może zostać użytych wiele roztworów wodnych (zawierających np. sole). Chcąc uzyskać różnorakie rozpuszczalne w wodzie składniki aktywne biologicznie, korzystna jest preparatyka przy pH, o wartości bliskiej pH obojętnieniu (5,0 do 8,0)

187 989 i w warunkach niedenaturujących, w celu uniknięcia lizy lub denaturacji niektórych aktywnych składników chrząstki. Nie można przewidzieć zachowania w roztworach wodnych nieznanych białek; niektóre białka mogą lepiej znosić pH kwaśne, niektóre - pH obojętne. Ponadto, niektóre białka mogą łatwiej ulegać ekstrakcji w warunkach łagodnej denaturacji, jeśli warunki te nie zaburzają procesu renaturacji tych białek w roztworach wodnych. Każde warunki ekstrakcji, które umożliwiają zachowanie aktywności biologicznej rozpuszczalnych w wodzie składników chrząstki są objęte niniejszym wynalazkiem. Dlatego biorąc pod uwagę wszystkie wymienione powyżej czynniki wykazano, iż ekstrakcja aktywnych składników chrząstki w czystej wodzie jest najlepszym wyjściem, umożliwiającym przywrócenie z dużą wydajnością związkom (które jeszcze muszą być dokładnie określone) ich struktury i właściwości.

Następnie mieszaninę chrząstki i wody homogenizowano przez gwałtowne mieszanie przez 20 min w kuchennym mikserze, w temp. ok. 4°C. Podczas homogenizacji temperatura homogenatu wzrosła do ok. 20°C. Oczywistym jest, że szybkość mieszania, tak jak i objętość roztworu wodnego może wpływać zarówno na czas mieszania, jak i wydajność ekstrakcji. Zatem, rozsądny czas homogenizacji (zdefiniowanej jako rozdrobnienie do ziaren o średnicy 500 pm) może wynosić od 10 minut do nawet 24 godzin, najkorzystniej jest gdy wynosi on od 10 do 60 minut. Aby uniknąć degradacji związków aktywnych przez enzymy endogenne (jeśli nie używa się inhibitorów tych enzymów), podczas homogenizacji temperatura preparatu powinna być utrzymywana poniżej 10°C. Najkorzystniej jest, gdy temperatura jest bliska 0°C. Ponieważ zwykle doświadczenia takie prowadzone są w chłodni, gdzie może być utrzymywana temperatura pomiędzy 4 a 10°C, utrzymanie odpowiedniej temperatury nie powinno stanowić problemu. Dla jasności oraz zwięzłości, terminy „około 4°C” są poniżej używane aby określić ten dopuszczalny zakres temperatur.

Jeśli stosując mikser nie otrzymano dostatecznie małych cząstek, dodatkowo uzyskany homogenat może być przeprowadzony w stan ciekły stosując do jego rozdrobnienia dezintegrator Polytron (temp. ok. 4°C, przez 10 min). Alternatywnie, mieszanina może być po prostu homogenizowana w bardziej wydajnym urządzeniu, którego zastosowanie w naszym przypadku, skróciło czas przeprowadzania mieszaniny w stan ciekły o 10 min. Otrzymane, po zakończeniu etapu homogenizacji, cząstki są mniejsze niż 500 [im. Oczywistym jest, że w procesie dodatkowego rozdrobnienia stosuje się te same czasy i wartości temperatury, co w przypadku wstępnej homogenizacji. Ponieważ cząsteczki po homogenizacji nie muszą być bardzo małe, zatem nie jest konieczne proszkowanie chrząstki przed przeprowadzeniem ekstrakcji. Co więcej, sproszkowanie chrząstki przed ekstrakcją wodną może nawet spowodować denarurację aktywnych składników, zwłaszcza, gdy sproszkowanie jest prowadzone po zamrożeniu (w stanie freeze-dry) i/lub po wysuszeniu w wysokiej temperaturze (w stanie heat-dry).

Homogenat wirowano przy 13 600 x g przez 15 min w temp. ok. 4°C. Wirowanie to jest jedynym sposobem na szybkie i wydajne oddzielenie supematantu od osadu. Dopuszczalne są zmiany parametrów wirowania, zgodnie z wiedzą specjalisty i zależą, one jedynie od objętości homogenatu i używanego sprzętu.

Otrzymany osad jest liofilizowany przez 24 do 48 godzin. Pierwsza frakcja będzie poniżej określana jako liofilizat lub ekstrakt stały.

Jeśli jest to konieczne, supematant może być filtrowany przez 24 pm filtr Whatmana, w celu pozbycia się cząstek, które mogą zaburzać działanie kolumny ultrafiltracyjnej. Następnie otrzymany w procesie filtracji materiał ultrafiltrowano w4°C, na kolumnie filtracyjnej 0 przepływie stycznym o porowatości ok. 500 kDa (8,5-10¹⁹), która pozwala otrzymać pierwszy. zgrubny przesącz, zawierający rozpuszczalne w wodzie cząsteczki, o masie cząsteczkowej od 0 do 500 kDa. Ten zgrubny ekstrakt został poddany filtrowaniu na filtrze 0,22 pm, 1 przeniesiony do jałowych butelek. Frakcja ta będzie dalej nazywana zgrubnym przesączem lub ekstraktem płynnym.

W celu otrzymania osadu i supematantu opracowano alternatywną procedurę wirowania o wyższej wydajności. Wirowanie homogenatu przy 13 600 x g przez 15 minut i przeprowadzoną po nim zgrubną filtrację na filtrach Whatmana zastąpiono przez wirowanie w wirówce CEPA wyposażonej w nylonową kieszeń o porowatości 1 pm, przy 3 000-4 000 x g. Preparat

187 989 kg chrząstki/25 litrów wody może być wirowany w ten sposób przez 30 minut i dostarcza około 29 litrów supematantu. Otrzymana objętość frakcji wodnej jest wyższa niż początkowa objętość wody, co sugeruje, iż zebrano część wody znajdującej się w chrząstce. Liofilizat oraz całkowity płynny ekstrakt mogą mieć następujący, przybliżony skład, podany poniżej, który uwzględnia różnice obserwowane pomiędzy poszczególnymi preparatami uzyskanymi z różnego materiału wyjściowego:

EKSTRAKT STAŁY
Lipidy	7,35%¹
Białka	46,2%²
Wilgotność	20,4%
Sód	416 mg/g³
Potas	2,,64 mg/g
Wapń	114 mggg
Magnez	l^mg^
Cynk i żelazo ilości śladowe
EKSTRAKT PŁYNNY
Lipidy	010-0,20%¹
Białka	8-25%²
Sucha masa	!-255%
Wilgotność
Sód	30-220 mg/100 g
Potas	304,0 mg/l 00 g
Wapń	2,0 mg/100 g
Magnez	11 mgHOO g
Cynk i żelazo ilości śladowe

2 , ’ Mierzono zgodnie z wytycznymi opublikowanymi wAOAC Official (1984) części odpowiednio 16.219-220 i 2.055.

³ Mierzono zgodnie z procedurą SAA.

Stężenie białka określano stosując metodę Kjeldahl, która w rzeczywistości mierzy stężenie organicznego azotu (N). Znając poziom organicznego azotu oblicza się stężenie białka, korzystając z następującego wzoru:

Stężenie białka (mg/ml) = (% N x 6,25) dzielone przez 100

W otrzymanych ekstraktach nie wykryto węglowodanów, można przypuszczać jednak, iż znajdują się one w jednym lub drugim ekstrakcie, lecz w postaci proteoglikanów i/lub mukopolisacharydów. Możliwe jest, że zawartość węglowodanów jest oznaczana wraz z pomiarem poziomu wilgotności liofilizatu. Oznaczony poziom wilgotności liofilizatu (mierzony poprzez pomiar grup -OH) jest dość niespodziewany. Ponieważ 20% zawartość wody w ekstrakcie jest bliska ilości węglowodanów (w procentach) zwykle otrzymywanych z chrząstki, a wilgotność liofilizatu powinna być bliska 0%, hipoteza przedstawiona powyżej wydaje się być uzasadniona i pozostaje do zweryfikowania.

Płynny ekstrakt z chrząstki analizowano pod kątem składu aminokwasów. Średnia ilość wszystkich aminokwasów wynosiła 1,1 mg/ml; przy czym wolnych aminokwasów było 0,67 mg (61%), a aminokwasów związanych w białkach 0,44 mg (39%). Rozmieszczenie wszystkich

187 989 aminokwasów, przedstawiono na fig. 1. Stwierdzono także znaczne ilości tauryny (dane nie prezentowane).

Aminokwasy obecne w płynnym ekstrakcie z chrząstki występują głównie pod postacią białek i peptydów charakterystycznych dla chrząstki. Np. lizyna, glicyna, kwas asparaginowy i glutaminowy stanowią znaczną ilość składu aminokwasów płynnego ekstraktu i stanowią główne składniki n-telopeptydu, tworzącego usieciowania międzykomórkowe występujące w strukturze kolagenu (Hanson i in., (1992) J. Bone & Min. Res. 7: 1251-1258).

Czystość mikrobiologiczną płynnego ekstraktu kontrolowano przy użyciu standardów USP XXIII <61>.

ANALIZA AKTYWNOŚCI

EKSTRAKT STAŁY

Testy in vitro:

Testy te prowadzono na, zależnych od hormonów liniach komórkowych, MCF-7 i ZR75-1 (numery ATCC (R) odpowiednio: 22-HTB i 1500-CRL).

Komórki ZR75-1:

a. Podstawowy roztwór RPMI: 52 g RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (Sigma R8755); 17,875 g Hepes (wolny kwas; Sigma H0763); 0,55 g pirogronianu sodu (Sigma P5280) i 10 g NaHCO3 zmieszano w 5 litrach czystej wody, pH roztworu doprowadzono, przy pomocy NaOH, do wartości 7,40.

Jeśli roztworu tego nie używa się natychmiast, należy go zabezpieczyć przed dostępem światła, tak aby ochronić substancje światłoczułe w nim zawarte. Roztwór ten filtrowano, rozlano do sterylnych butelek po 500 ml i przechowywano w 4°C przez czas nie dłuższy niż 3 miesiące.

b. Roztwór stosowany do hodowli komórkowej: Podstawowy roztwór RPMI uzupełniony 10% (v/v) FBS (płodowa surowica wołowa), 100 U penicyliny G/50 pg siarczanu streptomycyny (Sigma P0906)/ml roztworu, 2 mM L-Glutaminą (Sigma G1517) oraz 1 nM E2 (β-estradiol Sigma E8875).

c. Roztwór stosowany do doświadczeń: Podstawowy roztwór RPMI uzupełniony 5% FBSA (płodowa surowica wołowa adsorbowana na dextrano-węglu drzewnym), 2 mM L-Glutaminą, 100 U penicyliny G/50 pg siarczanu streptomycyny/ml roztworu i 50 ng/ml insuliny (Sigma). Do roztworu tego dodawano wzrastające stężenia opisanego powyżej liofilizatu jak i różne stężenia E2 (od 10'*2 do 10’⁵ M).

Komórki McF-7

a. Podstawowy roztwór DME-F12: roztwór DME-F12 (bez dwuwęglanu i bez czerwieni fenolowej; Sigma) wykonano z użyciem czystej wody według zaleceń producenta. Do jednego litra roztworu dodawano, 1,2 g wodorowęglanu sodowego i pH doprowadzono do wartości 7,7 przy pomocy NaOH/HCl. Roztwór ten filtrowano, rozlewano do sterylnych butelek po 500 ml i przechowywano w 4°C przez czas nie dłuższy niż 3 miesiące.

b. Roztwór stosowany w hodowli komórkowej: Podstawowy roztwór DME-F12 uzupełniony 10% (v/v) FBS (płodowa surowica wołowa), 100 U penicyliny G/50 p g siarczanu streptomycyny (Sigma P0906)/ml roztworu, 2 mM L-Glutaminą (Sigma) oraz 1 nM E₂.

c. Roztwór stosowany do doświadczeń: Podstawowy roztwór ÓME-F12 uzupełniony 5% FBSA (płodowa surowica wołowa adsorbowana na dekstranie i węglu drzewnym), 2 mM L-Glutaminą, 100 U penicyliny G/50 pg siarczanu streptomycyny/ml roztworu i 50 ng/ml insuliny (Sigma), liofilizat jak i różne stężenia E2 dodawano w tych samych stężeniach, jak opisano dla komórek ZR75-1.

d. Przygotowanie FBSA: płodową surowicę wołową mieszano z 1% (w/v) węglem drzewnym (węgiel odbarwiający alkalicznie). Roztwór dekstranu T70 dodawano do roztworu węgla drzewnego i surowicy, aż do osiągnięcia stężenia 0,1% (w/v).

Mieszanina była mieszana przez noc w4°C. Po wirowaniu przy 10 000 x g, przez 30 min w 4°C, surowicę zdekantowano, zmieszano ponownie z dekstranem i węglem drzewnym w tych samych proporcjach, mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i ponownie wirowano. Surowicę następnie aktywowano ciepłem w temp. 56°C przez 20 min, filtrowano sterylnie i odmierzono do sterylnych stożkowych probówek Falcon.

187 989

Przeprowadzenie doświadczeń i wyniki:

Hodowlę komórek linii ZR75-1 i MCF-7 prowadzono do uzyskania gęstości 20 000 komórek na studzienkę (dla płytki 24 studzienkowej) lub 150 000 komórek na studzienkę (dla płytki 6 studzienkowej) i traktowano różnymi stężeniami liofilizatu otrzymanego jak przedstawiono powyżej. W tym celu stały ekstrakt z chrząstki zawieszano w pożywce i zawiesinę filtrowano sterylnie, tak aby rozpuszczalne związki z ekstraktu odzyskały aktywność i aby można było poddać je badaniu. Wszystkie doświadczenia prowadzono w trzech powtórzeniach. Co dwa dni roztwór hodowlany był usuwany i zastępowany świeżą porcją. Hodowlę komórkową prowadzono w inkubatorze w warunkach stale nawilżanej atmosfery zawierającej 5% CO2, w temp. 73°C przez 17, 7, 3 lub 3 dni, odpowiednio w pierwszym, drugim, trzecim i czwartym doświadczeniu. Hamowanie wzrostu komórek mierzono bezpośrednio licząc komórki lub mierząc całkowitą zawartości DNA w studzience.

Stężenie liofilizatu	Hamowanie wzrostu komórek (%)
MCF-7	ZR75-1
1. doświadczenie: 17 dni
1 mg/ml	1,5	2,0
5 mg/ml	14,33	33,6
10 mg/ml	62,66	90,8
2. doświadczenie: 7 dni
1 mg/ml	3,73	0,97
5 mg/ml	15,7	29,0
10 mg/ml	68,37	66,0
3. doświadczenie: 3 dni
50 mg/ml	95,8	95,0
100 mg/ml	94,6	98,0
4. doświadczenie: 3 dni
10 mg/ml	34,4	51,5
20 mg/ml	62,2	70,5
50 mg/ml	95,8	95
100 mg/ml	94,6	98

Przedstawione powyżej procenty hamowania wzrostu komórek wykazują, że stały ekstrakt z chrząstki może, w zależności od stężenia, hamować wzrost komórek tych dwóch linii komórkowych.

Figura 2 przedstawia, że dawki 50 i 100 mg/ml stałego ekstraktu z chrząstki ewidentnie powodują niedorozwój (hipoplazję) w tych liniach komórkowych, po trzech dniach stosowania.

Figura 3 przedstawia, że w obecności estradiolu o stężeniu od 10^² do 10^ M, komórki, po podaniu ekstraktu zachowują się tak jak komórki kontrolne, czyli jakby w ogóle nie były stymulowane podaniem hormonu. Jednakże, przy stężeniu estradiolu powyżej 1 nM, obserwuje się znaczną stymulację komórek kontrolnych i stężenie DNA osiąga wartość 3,75 μg w obecności 10-⁷ M estradiolu (względem 0,68 μg w kontroli bez estradiolu). W komórkach traktowanych liofilizatem o stęż. 30 i 50 mg/ml, ilość DNA mierzona przy najwyższej stymulacji wynosiła odpowiednio 1,9 i 1,8 μg. Figura 3 przedstawia, że stała powinowactwa (Km) dla komórek traktowanych estradiolem jest 3 i 16 razy wyższa (31,3 nM i 174,0 mM), niż wartość Km komórek kontrolnych (11,7 nM), przy stężeniu liofilizatu w próbie odpowiednio

187 989 i 50 mg/ml. Oznacza to, iż gdy w medium obecny jest ekstrakt z chrząstki konieczne wyższe jest stężenie estradiolu, aby osiągnąć ten sam stopień wzrostu komórek. Dlatego też, ekstrakt z chrząstki ten zmniejsza maksymalną odpowiedź (90% hamowania) i podnosi stałą powinowactwa badanych komórek dla estradiolu.

Testy in vivo:

Model raka sutka u szczura indukowany przez DMBA

a. Opis systemu testowego: 400, 40-dniowych szczurzych samic Sprague-Dawley (zakupionych w Charles River Co., St-Constant, Quebec) asymilowano do nowego środowiska przez 12 dni. W tym czasie podawano im przez zgłębnik 20 mg DMBA/ml oleju kukurydzianego (9,10-dnnctylo-l,2-benzoantracen, zakupiony w Sigma Chemical Co.) Trzy miesiące po podaniu DMBA, wybrano 240 szczurów, u których rozwinął się rak sutka i podzielono na dwie grupy. Pierwszą grupę szczurów podzielono na pięć podgrup. Szczurom z grupy leczonej codziennie przez 8 tygodni podawano dawkę (o wzrastającym stężeniu) liofilizowanego ekstraktu z chrząstki, zawieszonego w 3 ml wody, zaś grupa kontrolna otrzymywała tę samą objętość wody. Druga grupa szczurów podzielona została na 4 podgrupy. Szczurom leczonym codziennie przez 10 tygodni, podawano dawkę liofilizatu (połączoną lub nie połączoną z płynnym ekstraktem) zawieszoną w 3 ml wody, natomiast grupa kontrolna otrzymywała jedynie taką samą objętość wody. Jedynie szczurom z jednej podgrupy z grupy drugiej, którym podawano liofilizat w stężeniu 3000 mg/Kg/dzień i 3 ml płynnego ekstraktu dodatkowo wstrzykiwano dootrzewnowo (intraperitoneal, i.p.) mniejsze dawki płynnego ekstraktu (ok. 8 mg białka w 1 ml wody).

Na początku doświadczeń szczury ważyły 151-175 g i otrzymywały pożywienie i wodę ad libiium. Pierwsza grupa szczurów miała guzy o średnim przekroju 0,9 cm, podczas gdy druga grupa szczurów miała guzy o średnim przekroju 0,6 cm.

b. aktywność przeciwnowotworowa: Wyniki podsumowano jak następuje:

Dzienne dawki ekstraktu z chrząstki podawane przez zgłębnik	% zahamowania wzrostu nowotworu (zmniejszenie przekroju guza względem kontroli)
Doświadczenie 1: czas trwania 8 tygodni Placebo	0
500 mg/kg/dzień	2
1000 mg/kg/dzień	4
3000 mg/kg/dzień	14
5000 mg/kg/dzień	15
Doświadczenie 2: czas trwania 10 tygodni: Placebo	0
3000 mg/kg/dzień	12
3000 mg/kg/dzień +3 ml płynnego ekstraktu	18
3000 mg/kg/dzień +3 ml płynnego ekstraktu + 1 ml zastrzyk	20

Przedstawione wyniki wskazują, że liofilizat zawiera składnik aktywny, który jest adsorbowany w przewodzie żołądkowo-j elitowym i który spowalnia rozszerzanie się guza. Hamowanie to może być wynikiem bezpośredniego oddziaływania na komórki rakowe lub pośredniego oddziaływania na rozwój naczyń, i przez to na wzrost guza.

Płynny ekstrakt wykazuje także aktywność inhibitorową, gdyż podawanie go powodowało dodatkowe zmniejszenie wielkości guza o ok. 6%.

Wyniki te sugerują także, że liofilizat może zawierać składniki aktywne, które nie są rozpuszczalne w wodzie i/lub śladowe ilości aktywnych składników rozpuszczalnych w wodzie. Dlatego też w celu maksymalnego odzyskania składników rozpuszczalnych w wodzie, można rozważyć ponowną re-ekstrakcję osadu w roztworze wodnym.

187 989

c. Histopatologia: W celu określenia nietoksyczności stałego ekstraktu z chrząstki, zwierzęta, na których prowadzono doświadczenia in vivo, zabito przez ucięcie głowy i pobrano do analizy następujące tkanki: wątrobę, płuca, nerki, serce, mózg, mięśnie i gruczoły sutkowe. Z tkanek tych pobrano tłuszcz, po czym utrwalano je przez dwa dni w płynie Bouina. Po odwodnieniu w etanolu, utrwalone tkanki zanurzono w parafinie. Wykonano skrawki tych tkanek i umieszczono je na szkiełku podstawowym, wybarwiono hematoksyliną i oglądano pod mikroskopem.

Badanie histologiczne wykazało brak widocznych szkodliwych efektów, nawet najwyższych dawek zarówno stałego ekstraktu jak i stosowanego w połączeniu z ekstraktem płynnym (dane nie prezentowane).

Wyniki te sugerują, że zarówno liofilizat, jak i ekstrakt płynny mają podobną aktywność powodującą zmniejszenie się nowotworu.

W przypadku raka sutka (patrz figury 4a i b), zaobserwowano znaczące zmniejszenie się powierzchni naczyń krwionośnych (55%), w grupie szczurów którym podawano stały i płynny ekstrakt z chrząstki (figura 5).

Zmniejszenie się rozmiarów nowotworu mogło nastąpić na skutek znaczącego zmniejszenie jego unaczynienia, bezpośredniego wpływu na komórki nowotworowe, lub połączenia obu tych zjawisk. Przeciwnaczyniotwórczy wpływ tych ekstraktów opisano powyżej. In vitro obserwowano bezpośredni wpływ hipoplazjatyczny na komórki zależne od hormonów, wpływ ten jednak należy potwierdzić in vivo.

Ponieważ, przedstawione powyżej wyniki wykazały, iż płynny ekstrakt ma wzrastający wpływ na komórki ZR75-1, a nawet wyższy niż stały ekstrakt z chrząstki, jego składniki zostały poddane dalszym badaniom.

Ekstrakt płynny, testy in vitro:

Aby sprawdzić, czy podobnie jak w przypadku stałego ekstraktu (część powyżej) obserwuje się aktywność hypoplazjatyczną prowadzono hodowle nowotworowych linii komórkowych w obecności płynnego ekstraktu z chrząstki.

W skrócie, komórki umieszczono w studzienkach na 96 studzienkowej płytce i prowadzono hodowlę na pożywce (odpowiedniej dla każdej linii komórkowej; np. hodowlę komórek MCF-7 prowadzono jak opisano powyżej) w obecności lub przy braku różnych stężeń płynnego ekstraktu. Proliferację komórek zmierzono przy pomocy testu MIT, po 3 do 5 dniach prowadzenia hodowli. Stosowano następujące linie komórkowe:

CHANG nowortwOrowy hepatocyt

Hep-G2 nowoworowy hepatocyt

A2780 komórki gruczolaka jajnika

MCF-7 k^c^m^ć^^kii gniczolaka piersi (zależne od estrogenu)

MCF-7-ADR komórki gruczolaka piersi odporne na adriamycynę.

Płynny ekstrakt z chrząstki powodował hamowanie proliferacji komórek we wszystkich liniach komórkowych. Najsilniejsze hamowanie, 50 i 80%, otrzymano przy stęż. 8,5 mg/ml (suchej masy ekstraktu płynnego/ml pożywki) w komórkach odpowiednio MCF-7 i A2780.

Nie liofilizowany i liofilizowany ekstrakt z chrząstki wykazywał jednakową skuteczność w hamowaniu proliferacji komórek nowotworowych. Wynik ten sugeruje, że czynnik (czynniki) hamujące nie ulegają denaturacji w czasie tej procedury.

Pierwotne linie komórkowe:

a. Fibroblasty z jaskrą nowounaczynioną: Aby określić specyficzność aktywności komórek nowotworowych, przesącz otrzymany po ultrafiltracji testowano na komórkach, ludzkich fibroblastów pochodzących z mezenchymy TENON (HTF), które są normalnymi fibroblastami. Użyto komórki HTF jedynie od dwóch pacjentów (jeden chory na jaskrę nowcunaczynlcną, NVG, drugi chory na jaskrę z pierwotnie otwartym kątem przesączania, POAG).

Prowadzenie hodowli następczej i zachowanie komórek HTF: każdą konfluentną kolonię pasażowano przez przemywanie i oddzielenie stosując 0,5 ml 0,05% trypsyny/0,5 mM eDtA (Gibco 610-5300 AG) przez 5-10 minut, w temp. 37°C. Następnie w celu zneutralizowania trypsyny/EDTA dodawano 1,5 ml roztworu dMe/F-12 zawierającego 15%o płodową surowicę wołową (FBS).

187 989

Łączenie komórek wywoływano przez rozcieranie i przeniesienie do 25 cm2 kolb-T, następnie dodawano 10 % roztwór (FBS). Po osiągnięciu przez komórki stanu konfluencji, HTF były przenoszone do kolb-T o powierzchni 75 cm2 lub ewentualnie 180 cm2. Gdy otrzymano wystarczającą ilość komórek, część wykorzystano w doświadczeniach, jak opisano powyżej, a część zamrożono, aby zapewnić identyczne pasaże do eksperymentów w przyszłości.

Protokoły doświadczeń: Gdy komórki osiągnęły stan konfluentny, komórki pobrane od jednego pacjenta znajdujące się w 2 lub 3 identycznych, kolbach 180 m2 rozdzielono według opisu powyżej. Po krótkim wirowaniu przy małej prędkości, zliczono je przy pomocy licznika ZMI Coulter Counter 216013, wyposażonego w 256-Channelyzer.

We wszystkich następnych doświadczeniach in vitro, około 50 000 komórek w 1 ml roztworu DME/F-12, zawierającym 1% FBS, wysiano na szalki: 16 mm i 12-studzienkową. 17 godzin po posiewie, dodano 1 ml świeżego, identycznego roztworu wzbogaconego 1% FBS („doskonałe” kontrole). W zależności od zaplanowanego doświadczenia (jak w niniejszym opisie), 1% roztwór FBS wzbogacono lub nie GF (Czynniki Wzrostu) lub płynnym ekstraktem, a następnie filtrowano w sterylnych warunkach. Od tego dnia (dzień 0), w celu określenia wydajności posiewu (który powinien być równy lub większy niż 95%), zliczano także, próbki komórek.

godzin po rozpoczęciu doświadczenia, komórki przemywano, rozdzielano i liczono ponownie. Ilość komórek przedstawiono jako procent komórek otrzymanych w kontrolach „doskonałych”.

Każda „doskonała” kontrola, zawierająca odpowiednio 1% lub 5% FBSu, i każda grupa doświadczalna, wzbogacona o 1% FBSu oraz jednostkowy GF lub płynny ekstrakt z chrząstki składała się z trzech próbek

Każde doświadczenie przeprowadzano na komórkach jednego lub dwóch pacjentów równocześnie i było powtarzane przynajmniej dwukrotnie.

W niniejszych doświadczeniach dodawano GFy: świński czynnik wzrostu płytek krwi (pPDGF) i ludzki czynnik wzrostu fibroblastu, będący produktem rekombinacji (hr bFGF) (dar dla Dr P. Brazeau od Farmitalia Carlo Erba, Milan, Włochy) w stężeniach odpowiednio 10 do 100 ng/ml w 1% FBSie. 48 godzin po rozpoczęciu doświadczenia, komórki zawieszano w trypsynie/EDTA i liczono w liczniku Coulter. Wszystkie potrójne wartości (kolumny 1, 2 i 3) przedstawione poniżej są równe 1/20 zliczeń na studzienkę.

Wyniki przedstawiono na figurze 6. Komórki HTF otrzymano z jaskry 53-letniego mężczyzny. Podczas gdy czynniki wzrostu takie jak PDGF i bFGF stymulowały komórki HTF (* P < 0,02, ** P <0,01; wyznaczone na postawie Testu Studenta-Fishera), nie obserwowano żadnego wpływu, ani pozytywnego ani negatywnego, płynnego ekstraktu z chrząstki (1 Kg/2 litry). Wynik ten sugeruje, że wpływ hipoplazjatyczny płynnego ekstraktu z chrząstki na komórki nowotworowe nie jest jednakowy dla wszystkich komórek, oraz, że płynny ekstrakt z chrząstki nie wpływa na wzrost fibroblastów. Nie obserwowano także wpływu tego samego ekstraktu z chrząstki na inny typ komórek fibroblastu, HSF (Ludzki Fibroblast Skóry; dane nie prezentowane). Mimo, iż nie przeprowadzono odpowiednich badań, uważa się że ekstrakt stały również nie wpływa na normalne komórki.

b. Komórki śródbłonka z ludzkiej żyły pępkowej (HUVEC): komórki HUVEC ekstrahowano stosując kontrolowane trawienie kolagenazą, jak opisano w artykule Jaffe i in., (1973). Czyste komórki śródbłonka użyto przed czwartym pasażem (trypsyna-EDTA w każdym pasażu). Jakość komórek analizowano ze względu na ich zdolność do wbudowywania diaceilu LDL i znakowania czynnikiem VIII.

Komórki śródbłonka o gęstości 2 500 komórek/cm2 wysiewano na sterylną szalkę, pokrytą żelatyną. Hodowlę prowadzono przez 24 godziny (aby być pewnym adhezji komórek) na odżywce pełnej (Med199 + heparyna (90 pg/ml) + L-glutamina (2mM) + dwuwęglan + FBS (10%) + ECGS (120 pg/ml)). Następnie komórki przemywano 3 razy PBS i dodawano pożywkę, zgodnie z warunkami doświadczenia. Ostatnie przemycie roztworem PBS, oznaczano jako czas 0.

Każde doświadczenie wykonywano w trzech powtórzeniach oraz w celach porównawczych wykonano analizę statystyczną. Pożywkę zmieniano po 24 godzinach, a następnie co

187 989 dwa dni. Po 168 godzinach prowadzenia hodowli, do każdej pożywki dodano BrdU (końcowe stęż. 10 mM) i inkubowano przez 2 godziny w37°C. Następnie komórki uwolniono przez krótkie trawienie trypsyną/EDTA i przeniesiono na płytkę o 96 studzienkach, aby wykryć BrdU testem ELISA. Test ELISA wykonywano według metody i przy użyciu zestawu Boehringer Mannheim. W celu określenia poziomu tła przeprowadzono kontrolę w nieobecności komórek. Natomiast w celu wyjaśnienia, czy płynny ekstrakt z chrząstki wpływa na adhezję komórek, wykonano inną kontrolę, polegającą na pomiarze zawartości DNA w pożywce po zakończeniu czasu inkubacji.

Określano także stopień proliferacji komórek, mierząc ilość DNA obecnego na szalkach Petriego. Każde doświadczenie wykonywano w trzech powtórzeniach oraz w celach porównawczych przeprowadzano analizę statystyczną. Pożywkę zmieniano codziennie. Po 168 godzinach hodowli, komórki poddano lizie stosując roztwór Nacytrynian-SDS, i inkubowano z Hoescht 33358. Próbki odczytywano spektrofluorometrycznie przy długości fali 365 nm.

Co więcej, mierząc aktywność kwaśnej fosfatazy określono także ilość komórek obecnych na szalkach Petriego. Każde doświadczenie wykonywano w trzech powtórzeniach oraz w celach porównawczych przeprowadzano analizę statystyczną. Aktywność tych enzymów wykazywała znaczną korelację z ilością komórek śródbłonka obecnych na szalkach Petriego (wbudowanie BrdU i znakowanie przez Hoescht; dane nie prezentowane). Aktywność kwaśnej fosfatazy mierzono przy pomocy zestawu z Sigma Chemical Company (zgodnie z procedurą producenta, z modyfikacjami).

Wyniki wykazały hamowanie proliferacji komórek śródbłonka, zależne do stężenia płynnego ekstraktu z chrząstki (figura 7). Otrzymana wartość ED50 wynosi w przybliżeniu 90 (il płynnego ekstraktu (równowartość w przybliżeniu 1,5 mg suchej masy, obecnej w płynnym ekstrakcie).

c. Keratynocyty: Płynny ekstrakt z chrząstki testowano na keratynocytach, których kinazę białkową C (PKC) aktywowano octanem triforbolu (TPA), znanym agonistą tej komórkowej drogi przetwarzania energii. Założono kolonie pierwotne z normalnych, ludzkich naskórkowych keratynocytów (Matsui i in., (1992) J. Invest. Dermat. 99: 565-571). Kultury te prowadzono na określonej pożywce (KGM) (bez surowicy) zawierającej epidermalny czynnik wzrostu (10 ng/ml), insulinę (5 pg/ml), hydrokortyzon (0,5 pg/ml) i ekstrakt z przysadki mózgowej wołu (70 pg/ml) w zmodyfikowanym preparacie MCDB 153.

Hodowlę keratynocytów prowadzono do osiągnięcia 70% konfluencji i 48 godzin po dostarczeniu świeżej pożywki, podano 200 ng/ml lub 2 nl/ml DMSO, bez dodatkowej zmiany pożywki. Różne stężenia płynnego ekstraktu z chrząstki podawano do pożywki, lub nie podawano w ogóle. Wyniki wykazały brak wpływu płynnego ekstraktu na proliferację keratynocytów; nie wpływał on także na hamowanie proliferacji indukowanej przez TPA. Jednakże, płynny ekstrakt był w stanie hamować różnicowanie keratynocytów indukowane przez TPA (figura 8). Poziom różnicowania keratynocytów wzrastał 5-krotnie pod wpływem TPA. Sam płynny ekstrakt nie wpływał na tworzenie się zrogowaciałej koperty. Jednak, jego obecność powodowała zahamowanie o ponad 60%, tworzenia się zrogowaciałej koperty pod wpływem TPA.

W niedawno opublikowanych artykułach wykazano, iż aktywacja PKC w normalnych keratinocytach prowadzi do syntezy coraz większych ilości interleukiny-8 (IL-8), jest to czynnik pośredniczący zapaleń (Chabot-Fletcher i in., (1994) J. Invest. Dermatol. 103; 509-515). Ponadto, keratynocyty łuszczycowe syntetyzują bardzo duże ilości IL-8, które następnie wzmacniają nowounaczynienie w płytkach łuszczycowych (Nickoff i in., (1994) Am. J. Pathol. 144: 509-515). Inne czynniki wzrostu i integryny są także odpowiedzialne za ten proces, i ważne jest rozszerzenie rodziny cząsteczek branych pod uwagę, które mogą być zaangażowane (I1-1, TNF, itp.) w procesy unaczyniania. Nie wiemy, czy indukcja keratynocytów przez TPA naśladuje powstawanie keratynocytów łuszczycowych. Jeśli jednak tak jest, prezentowane powyżej wyniki wskazują, że chrząstka może nie wpływać in vivo na normalne keratynocyty, natomiast może oddziaływać na keratynocyty łuszczycowe (lub aktywowane). Należy sprawdzić czy płynny ekstrakt z chrząstki hamuje syntezę IL-8 w keratynocytach aktywowanych TPA oraz w płytkach łuszczycowych lub keratynocytach. Obniżenie poziomów IL-8

187 989 i/lub innych czynników wzrostu może wyjaśniać właściwości przeciwzapalne i przeciwnaczyniotwórcze tego ekstraktu.

Testy kolagenazy:

a. Test 1. Test ten został opisany w pracy Knight i in., (1992) FEBS let. 296: 263- 266. Sposób ten polega na użyciu fluoryzującego substratu peptydowego (Mca-pro-leu-Dpa-ala-arg-NH? naśladującego miejsce aktywne metaloproteinaz. Substrat ten zawiera grupę fluorescencyjną (Mca) na jednym końcu i grupę maskującą fluorescencję (Dpa) na drugim końcu. W niezmienionym substracie, grupa maskująca skutecznie znosi fluorescencję. Po enzymatycznym cięciu substratu następuje wzrost fluorescencji w badanej próbie.

Aktywację kolagenazy opisują Weingarten i in., (1985) Biochemistry 24, 6730. 1 pg kolagenazy rozpuszczono do objętości końcowej 100 pl w 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCh, pH 7,5; dodawano 1 pl roztworu trypsyny (w 1 mM HC1) o stęż. 10 mg/ml i inkubowano przez 15 min w 20°C. Aktywację przerywano dodając 10 pl inhibitora trypsyny z ziaren soi (SBTI, 5 mg/ml). Do każdej mikrokuwety dodawano:

lub 50 pl inhibitora* (dopełniono wodą do 50 (1);

ul 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCh, pH 7,5;

pl aktywowanej kolagenazy** (67 ng końcowo); i pl substratu (1 mM roztwór wyjściowy w DMSO, 20 pM stęż. końcowe;

Fluorescencję mierzono przy Xex=328 nm, Xem=393 nm.

* inhibitor jest określony jako substancja kontrolna (tj. EDTA, Orto-fenantrolen) lub płynny ekstrakt z chrząstki.

** kolagenaza jest określona jako ludzki typ I, typ IV, i kolagenaza kijanki płaza; używano także żelatynazy.

b. Test 2. Test ten jest opisany przez Welgusa i in., (1979) JBC 256, 9511-9516. Sposób ten polega na użyciu SDS-PAGE w celu sprawdzenia cięcia przez kolagenazę, typ 1 (MMP1). Kolagenaza typ 1, tnie cząsteczkę natywną kolagenu w jednym miejscu, dając dwa fragmenty 75% i 25% wielkości wyjściowego kolagenu. Po zakończeniu cięcia, prowadzonego przez kilka godzin, produkty i substraty reakcji rozdzielano na żelu SDS-PAGE. Stosunek kolagenu przeciętego do całego jest określany optycznie, po wybarwieniu żelu w barwniku Coomassie blue (lub azotanem srebra).

ng zaktywowanej kolagenazy (patrz Test 1) dodano do 5 p g kolagenu ze skóry cielęcej (Worthington) +/- inhibitor, objętość końcowa roztworu wynosiła 20 pl. Reakcje prowadzono w temp. 35°C przez 16 godzin, następnie reakcje przerywano dodając próbki SDS-PAGE i 40 mM EDTA, doprowadzano do wrzenia i wprowadzano na 8% żel akrylamidowy·.

c. hamowanie zależne od stężenia: Wyniki otrzymane stosując płynny ekstrakt z chrząstki, wykazały zależne od jej stężenia hamowanie aktywności kolagenazy z obu testów. Figura 9 przedstawia wyniki otrzymane w przypadku testu 1. Otrzymano wartość ED50 stosując 30 pl płynnego ekstraktu (lub 0,51 suchej masy obecnej w 30 pl płynnego ekstraktu).

Testy in vivo:

Embrionalny Test Naczyniotworzenia (EVT).

a. Określenie systemu testowego: W normalnym rozwoju embrionu kurczaka znaczną rolę odgrywa tworzenie się zewnętrznego systemu naczyniowego, zlokalizowanego w błonie żółtkowej, który przenosi składniki pokarmowe z żółtka jaja do rozwijającego się embrionu. Umieszczone na błonie żółtkowej substancje przeciwnaczyniotwórcze mogą hamować rozwój naczyń krwionośnych, w błonie żółtkowej. Aby ułatwić dostęp do błony żółtkowej, embriony kurczaka przeniesiono do sterylnego pojemnika hodowlanego (szalka Petriego) i umieszczono w inkubatorze o kontrolowanej wilgotności i temperaturze. W tych warunkach ex ovo, embriony mogą rozwijać się przez kilka dni.

Odmierzone ilości płynnego ekstraktu z chrząstki zmieszano z roztworem metylocelulozy i pozostawiono na powietrzu do wyschnięcia, otrzymując cienki dysk. Podczas tej procedury wewnętrzny NaCl, obecny w płynnym ekstrakcie z chrząstki zatęża się i oddziałuje z EVT, jeśli jego masa jest wyższa niż 25 p g na dysk. Dlatego też usunięcie soli z płynnego ekstraktu z chrząstki może być konieczne. Do dopuszczalnych sposobów należy dializa na błonie przepuszczającej cząstki nie większe niż 100 Da lub elektrodializa.

187 989

Metyloceluloza tworzy chemicznie obojętny szkielet, z którego płynny ekstrakt może powoli dyfundować. Dyski z metylocelulozy, zawierające płynny ekstrakt umieszczono na zewnętrznej granicy obwodu naczyniowego błony żółtkowej, gdzie nadal zachodzi rozwój naczyń.

Wpływ dysku, zawierającego płynny ekstrakt z chrząstki na proksymalny rozwój naczyniowy jest zawsze porównywany do wpływu dysku zawierającego jedynie wodę i odpowiednią ilość NaCl. Dyski umieszczono na embrionalnej błonie żółtkowej dnia 0 lub dnia 1 wzrostu ex ovo. W tym momencie jedynie zaczątki głównych naczyń krwionośnych penetrują żółtko. Następnie embriony umieszczano w warunkach hodowlanych, do momentu unaczynienia (w przybliżeniu 24 godz.). Dyski zawierające wodę lub płynny ekstrakt zawsze umieszczano jednocześnie na błonie żółtkowej tego samego embrionu. W celu zmniejszenia wpływu wewnątrzosobniczych zmienności, przy porównywaniu ekstraktu z chrząstki rekina z kontrolą, obydwa dyski układano symetrycznie względem osi głowo-ogonowej embrionu.

b. Aktywność przeciwnaczyniotwórcza: testy EVT wykonywano stosując różne stężenia protaminy (37, 75 i 150 pg) (jako kontrolę pozytywną) lub ekstrakt płynny z chrząstki. Po jednym dniu prowadzenia hodowli, dwóch naukowców porównuje unaczynienie powierzchni przykrytych dyskami, szukając ich na „ślepo”. Aby ułatwić lokalizację dysku na żółtku, po położeniu go na błonie żółtkowej, umieszczane są wokół niego czarne uszczelki typu O-ring. Stosowana do określania unaczynienia skala składa się z 3 stopni: 1, 2 i 3; (stopień 3) - normalne unaczynienie, w porównaniu do przeciwnej poziomej ćwiartki lub odpowiadające ćwiartce kontrolnego embrionu; (stopień 2) naczynia krwionośne przenikają do obszaru przykrytego dyskiem, lecz znikają w połowie. Główne naczynia krwionośne przechodzą przez obszar przykryty dyskiem, lecz ich droga jest wyraźnie zmieniona lub obserwuje się obniżenie gęstości bocznych odgałęzień; (stopień 1) nie obserwuje się naczyń krwionośnych w obszarze przykrytym dyskiem lub ich część gwałtownie zmienia przebieg, tak aby uciec z powierzchni przykrytej dyskiem. Naczynia krwionośne nie rosną dalej niż do granicy dysku, chyba, że przechodzą przez powierzchnię przykrytą dyskiem i dalej.

Stosując protaminę (dane nie prezentowane) oraz płynny ekstrakt z chrząstki (figura 10) otrzymano hamowanie unaczyniania zależne od stężenia podawanych związków (protaminy bądź ekstraktu). Wartość ED50 otrzymano stosując 170 pg części stałej płynnego ekstraktu (ilość suchej masy obecnej w płynnym ekstrakcie). Do porównywania znaczących różnic pomiędzy miejscami na jednym żółtku, przykrytymi przez dwa dyski zastosowano statystyczny test Wilcoxona (Wilcoxon-signed rank statistical test).

Model mysi gruczolaka sutka.

a. Opis układu (systemu) doświadczalnego. Skuteczność przeciwnowotworową płynnego ekstraktu z chrząstki badano posługując się mysim modelem gruczolaka sutka (przeszczep w obrębie tego samego gatunku). Układ doświadczalny składał się z myszy BALB/C, szczepionej podskórnie komórkami 1 x 10⁶ DA3. Komórki te pochodziły z mysiego gruczolaka sutka zaindukowanego przez 7,12 - dimetylobenzantracen (DMBA). Model ten stworzył Daniel Medina (J. Nati. Cancer Inst. (1969) 42: 303-310; ibid. (1976) 57: 1185-1189). Wszczepione myszy komórki in vivo rosły powoli i tworzyły guz o niskim prawdopodobieństwie przerzutów. Komórki DA3 hodowano w pożywce RPMI 1640, wzbogaconym 1 mM merkaptoetanolem, roztworem buforowym 1 M Hepes, 100 mM pirogronianem sodu, 200 mp, L-glutaminą 10 mM dowolnymi aminokwasami, IM witaminami, 10% płodową surowicą wołową, 1% penicylino-streptomycyną w 37°C i 5% stęż. CO2. W celu zaindukowania nowotworu, komórki rosły do osiągnięcia stanu konfluencji w 70% na całkowitej pożywce, a następnie zbierane przy użyciu roztworu EDTA-trypsyna. Następnie komórki wirowano i przemywano trzy razy roztworem buforu fosforowego, i ponownie zawieszano w rozcieńczeniu 1 x 106 komórek/0,1 ml.

Myszy, którym zaszczepiono komórki DA3 (n = 15), codziennie otrzymywały doustnie płynny ekstrakt z chrząstki rekina lub placebo (roztwór wodny soli). Podawanie tych związków rozpoczęto 7 dni po wszczepieniu komórek DA3. Badano różne stężenia płynnego ekstraktu z chrząstki. Ilość podawanego płynnego ekstraktu wyrażano jako ilość suchej masy obecnej w ekstrakcie płynnym. Badany ekstrakt przygotowywano w następujący sposób:

187 989 płynny ekstrakt liofilizowano i zawieszano ponownie w wodzie, tak aby otrzymać różne stężenia (0,2; 1,5; 3, 10 i 20 mg w 200 μί). Stężenie końcowe codziennych dawek było następujące: 10, 75, 150, 500 i 1000 mg/kg wagi ciała zwierzęcia.

b. Aktywność przeciwnowotworowa. Wyniki wykazały, że maksymalne hamowanie rozprzestrzeniania się nowotworu otrzymywano stosując płynny ekstrakt w ilości 75 mg/kg wagi zwierzęcia (figura 11). Co ciekawe, większe dawki wykazywały niniejszą skuteczność. Wynik ten sugeruje, że płynny ekstrakt, zawiera substancje mogące hamować rozprzestrzenianie się nowotworu, i inne substancje mogące hamować działanie inhibitorów nowotworowych. Zjawisko to jest znane w przypadku leków pochodzenia naturalnego.

Ostatecznie, dawkowanie dootrzewnowe płynnego ekstraktu spowodowało gwałtowne obniżenie (75x) dawki o najwyższej skuteczności hamowania wzrostu nowotworu (figura 12).

c. Toksyczność (Szkodliwość). Żadna z podawanych powyżej procedur leczenia nie powodowała spadku wagi lub śmierci związanej z otrzymywaniem płynnego ekstraktu. Nie obserwowano, w czasie codziennej kontroli myszy, żadnych niepokojących objawów lub zmian w zachowaniu zwierząt w czasie podawania ekstraktu. Na koniec leczenia myszy zabito i dyplomowany patolog wykonał ogólną morfologię wszystkich organów. Nie stwierdzono żadnych nieprawidłowości.

d. Histopatologia. Przeprowadzenie histopatologii nowotworu nie wykazało żadnych większych różnic pomiędzy nowotworami u myszy, którym podawano placebo a nowotworami u myszy, którym podawano płynny ekstrakt z chrząstki. Stwierdzono, iż stopień żywotności nowotworu we wszystkich grupach był dość wysoki. Analiza różnych organów myszy (płuc, wątroby, nerek, trzustki, żołądka, jelit, jajników, piersi, mózgu i serca) nie wykazała żadnych specjalnych zmian, które mogą być związane z podawaniem płynnego ekstraktu.

Model nadwrażliwości mysiej (CHS):

a. Opis układu doświadczalnego. Dinitrofluorobenzen (DNFB) jest skutecznym czynnikiem drażniącym skórę, który może wywoływać silną reakcję zapalną u myszy BALB/C. W dniu 0, 10 myszy poddano przez nakładanie na ich brzuch DNFB. 5 dni po uwrażliwianiu myszy prowokowano nakładając na ich prawe ucho 10 μ1 DNFB. Po wystawieniu na działanie DNFB mierzono kilka razy opuchnięcie ucha, jako wskaźnik podrażnienia tkanki.

Sprawdzono czy ekstrakt z chrząstki może obniżyć u myszy odpowiedź zapalną na DNFB. W tym celu podawano myszom doustnie, przez 3 następujące po sobie dni, przed przeprowadzeniem sensytyzacji i 4 dniowej przerwie, sam nośnik (0,2 ml roztworu wodnego soli; 5 myszy) lub płynny ekstrakt (0,2 ml płynnego ekstraktu, zawierającego 20 mg/ml suchej masy; 5 myszy).

b. Aktywność przeciwnadwrażliwościowa. Jeden dzień po prowokowaniu przez nałożenie na ucho DNFB, myszy, którym podawano sam nośnik miały ucho spuchnięte do grubości 8,2 mm. Co ciekawe, myszy, którym podawano płynny ekstrakt z chrząstki rekina miały ucho spuchnięte jedynie do grubości 2,8 mm. Istotność statystyczna tych danych p była niższa niż 0,001. Wyniki te wykazują, iż płynny ekstrakt z chrząstki jest skutecznym inhibitorem zapalenia.

Otrzymywanie płynnych frakcji zawierających cząsteczki aktywne.

Testy in vitro.

Nowotworowe linie komórkowe:

Przygotowanie układu doświadczalnego: chrząstka rekina została zebrana i przygotowana, jak opisano powyżej. Po wirowaniu, osad został usunięty, a supernatant poddano utrafiltracji jak opisano powyżej, ostatnią filtracją była filtracja na filtrze o średnicy porów 22 pm. Tak otrzymany płynny ekstrakt poddano dalszemu frakcjonowaniu różnymi metodami. Hodowle nowotworowych linii komórkowych prowadzono, jak opisano w poprzedniej części.

b. Warunki FPLC. Kolumna: Hiload 26 mm x 60 cm złoże Sephacryl S-300. Układ FPLC zakupiony w firmie Pharmacia. Przed nałożeniem na kolumnę wszystkie próbki filtrowano przez filtr o porowatości 22 pm. Eluent, którym był bufor fosforanowy, wodny roztwór soli (PBS) przefiltrowano i usuwano rozpuszczone w nim gazy przez 15 minut. Objętość nakładanej próbki zwykle wynosiła 3,2 ml (możliwe jest nałożenie próbki do objętości 13 ml). Prędkość przepływu wynosiła 1 ml/minutę. Zbierano frakcje po 10 ml. Wymyte związki sprawdzano przez pomiar ich absorbancji w świetle U.V. (280 nm). Wykres kalibracyjny otrzymano stosując zestaw kalibracyjny MW-GF-1000 produkowany przez firmę Sigma, sto24

187 989 sowano tę samą objętość wzorca, co badanej próbki (3,2 ml). Objętość elucyjną badanej próbki wyznaczono na podstawie wykresu masy cząsteczkowej związków w zestawie kalibracyjnym, względem ich objętości elucyjnej, od której odjęto objętość międzyziamową kolumny. Objętość międzyziamową otrzymano stosując błękit dekstranu (Mcz = 2 000 000).

Aktywność biologiczną otrzymanych frakcji badano na komórkach ZR75-1. Zidentyfikowano pożądane frakcje i potwierdzono ich charakterystykę w dalszych testach (poniżej).

Przeprowadzono dodatkową charakteryzację składników aktywnych przesączu na złożu Rotofor (Biorad 170-2950; patrz opis izoelektrofokalizacji poniżej) oraz na fitrach Amicon o różnych przekrojach porów, w celu otrzymania frakcji o masach cząsteczkowych pomiędzy 10-30 kDa, 30-100 kDa i ponad 100 kDa.

c. Warunki izoelektrofokalizacji. Preparat płynnego ekstraktu z chrząstki rekina (46 ml przesączu o gęstości 1 Kg/litr) dializowano w 4°C, przez noc w 4 litrach czystej wody, zawierającej 5% roztwór gliceryny stosując błony Spectra o porach #7 MWCO 3500 kDa (Spectrum 132110). Dializowany roztwór zmieszano z 2,75 ml amfolitu* (Pharmacia #80-1125-87), pH 3,5 - 10,0 oraz 0,5 g CHAPS (Sigma C3023; siarczan 3-[(3-cholamidopropylo)-dimetyloamonio]-1-propanu). Objętość uzupełniono czystą wodą do wartości 55 ml. Roztwór nałożono na złoże Rotofor. Izoelektrofokalizację przeprowadzano w4°C, przy stałej mocy 12 watów (zasilacz 3000 xi Biorad 165-0554), w naczyniu termostatowanym przepływem wody. Na początku rozdzielania, ustawiono napięcie 380 V i natężenie 31 mA. Gdy natężenie ustabilizowało się (przy 14 mA), potencjał wynosił 870 V. Izoelektrofokalizację zakończono i zebrano 20 frakcji.

Frakcja	Objętość (ml)	PH
1	3,7	3,56
2	2,1	4,01
3	2,2	4,18
4	2,3	4,31
5	2,2	4,63
6	2,1	5,03
7	2,5	5,30
8	2,1	5,50
9	2,4	5,81
10	2,5	6,26
11	2,3	7,00
12	2,4	7,29
13	2,4	7,64
14	2,5	7,94
15	2,3	8,32
16	2,5	8,62
17	2,4	8,94
18	2,9	9,30
19	3,1	9,88
20	3,6	10,71

Identyfikację tych białek przeprowadzono na podstawie ich masy cząsteczkowej wyznaczonej przy pomocy elektroforezy (Laemmli, U.K. (1970) Naturę (Lond.) 227: 680).

187 989

Frakcje te przemywano czterokrotnie buforem (patrz Laemmli) i porcje po 8 pl nakładano na żel w warunkach niedenaturujących. Figura 13 przedstawia obraz elektroforezy każdej frakcji i materiału przed izoelektrofokalizacją.

Wszystkie frakcje zostały umieszczone w sterylnych butelkach, w komorze o przepływie laminamym, przez przepuszczanie ich przez sterylny filtr Millipack-60 o porowatości 0,22 pm.

d. Hamowanie wzro stu komórek nowo twOrowyeh.Skład białkowa' irw^cji azacowano stosując metodę Lowriego (Lowry dosage method). Różne stężenia w pożywce roztworów 1 kg/2 litry (co oznacza zgrubna waga chrząstki na litr przesączu) badano na komórkach ZR75-1. Wyniki zebrano w następujących tabelach:

Pierwszy test. Test wykonano na frakcjach, scharakteryzowanych przy użyciu Rotoforu (przesącz zatężano przez odparowanie). Zidentyfikowano białka:

Określona frakcja	Punkt incoloktrhanzh	Wartość średnia	Masa cząsteczkowa
7-8-9-10	5,30 do 6,26	5,78	29 +/- 1 kDa
7-8-9	5,30 do 6,26	5,68	60 +/-1 kDa
12-13-14	7,29 do 7,94	7,62	48 +/- 1 kDa
13-14	7,64 do 7,94	7,62	35 +/- 1 kDa

Drugi test przeprowadzono na frakcjach otrzymanych w FPLC (przesącz zatężono przez odparowanie)·.

Frakcje	Masa cząsteczkowa
6 i 7	0,1 -2,5 kDa

Trzeci test wykonywano na 100 jal frakcjach otrzymanych na filtrze cząsteczkowym Amicon:

Badane stężenie	Masa cząsteczkowa	Hamowanie wzrostu kultury komórkowej ZR75-1
100 pl/ml	Mcz >100 kDa	64%
100 ul/ml	30kDa < Mcz < 100 kDa	114%
100 ul/ml	10 kDa < Mcz < 30 kDa	127%
400 ul/ml	Mcz < 10 kDa	149%

Frakcje 6 i 7, otrzymane w procesie FPLC, zawierały składniki aktywne o bardzo małych masach cząsteczkowych: 0,1 do 2,5 kDa.

Efekt hypolazjatccznc frakcji może być wyższy aż do 33 000 krotności, niż efekt ten obserwowany dla liofilizatu.

e. Dalsza identyfieacjf zkłcdników aktywuke-h ductu. Liatyskany krancje aktjjeyne yten stowane na komórkach ZR75-1) w następujących zakresach mas cząsteczkowych, określonych przy pomocy innych sposobów oczyszczania, rozpoczynając od zaniosiezia samego przesączu (1 kg/litr) na kolumnę o wymiarach 10 mm śrokzich i 30 cm długości, wypełnioną złożem Superose-12, stosując procedurę jak opisano powyżej w przypadku FPLC i rotoforu. Szybkość przepływu ustalono na 1 ml/minutę. Zebrano 45 frakcji po 1 ml każda.

187 989

Frakcje 20-21	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 70 do 120 kDa
Frakcja 22	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 60 do 70 kDa
Frakcje 29-32	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 35 do 46kDa
Frakcje 34-35	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 29 kDa
Frakcje 38-39	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 0 do 2,5 kDa

Test kolagenazy:

a. Chromatografia HPLC. Próbkę płynnego ekstraktu (DUP), o objętości 980 ml, ultrafiltrcwanc w aparaturze o przepływie stycznym (tangential) (PELLICON, Millipore) przez błonę usuwając związki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa. Aparaturę przemywano po raz pierwszy 1 litrem wody. Na końcu zebrano 480 ml frakcji o masie cząsteczkowej > 10 kDa i 1,8 litra frakcji o masie cząsteczkowej <10 kDa. Frakcję <10 kDa zatężono przez odparowanie na zimno (cold-finger evaporatton) do objętości 180 ml (<10 - 10 x). Osiem razy próbki po 100 pl frakcji <10-10x nanoszono na złoże CDC-S Hexyl, 5 pm kolumna HPLC (25 x 0,94 cm) i wymywane po raz pierwszy 100% H₂O przy prędkości 4 ml/minutę następnie 100% metanolem przy prędkości 8,5 ml/minutę. Frakcje zbierano zgodnie z pikami OD₂i4.

Zebrano pięć frakcji (figura 14): Frl, Fr2, Fr3, Fr4 i Fr5. Pierwsze trzy frakcje zawierały przynajmniej główny pik.

b. Aktywność przeciwkolagenolityczna. Wyniki wykazują, że Frl jest najbardziej aktywną frakcją, w sensie hamowania aktywności kolagenazy; niższy poziom aktywności przeciwkclanrnolitycznej obserwowano we wszystkich pozostałych frakcjach: test 1, zobacz figura 14, test 2 poniższa tabela:

Próbka	znakowanie kolagenu	znakowanie fragmentu kolagenu
sam kolagen (C)	++++	-
C + Enz	+	+++
C + Enz + EDTA	++++	-
C + Enz + DUP	+	++
C + Enz + Frl	++++	-
C + Enz + Fr2	+++	+
C + Enz + Fr3	+++	+
C + Enz + Fr4	+++	+
C + Enz + Fr5	+++	+
C + Enz + > 10 kDa	+	+++

Aktywność kolagenazy hamował 40 mM roztwór EDTA. Całkowity ekstrakt płynny DUP wykazywał niską aktywność przeciwkolagenolityczną. Frakcje od 1 do 5 były aktywne, przy czym najwyższą aktywność obserwowano w przypadku frakcji 1. Frakcje zawierające związki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa nie wykazywały znaczącej aktywności.

c. Dalsze czynników antykolagcnolnu)cnych. yiynny ennlraet tr ckrząstki frakcjonowano przy użyciu aparatu do chromatografii o przepływie stycznym (tangrnsowóτπ) i filtru 10 kDa (Pellicon, Millipore). Stwierdzono, iż przesącz wykazuje całkowitą aktywność przeciwkclagenclityczną i został dokładniej scharakteryzowany w sposób następujący. Frakcję < 10 kDa poddano dializie na błonie o nominalnej wartości usuwania cząsteczek mniejszych niż 100 Da (Spectra/Por- CE (ester celulozy) MWCO: 100 Da, Nr katalogowy 131015). Aktywność antykclagrnolityczną uzyskano w przesączu (frakcja < 100 Da). Frakcję tę naniesiono na kolumnę C8 o odwróconej fazie (EM Science Lichroprep_ RP-8, Nr katalogowy 9242) i wymywano wodą, następnie 60% metanolem i na koniec 100% metanolem. Więk187 989 szość aktywności kołagenolitycznej (98%) odzyskano w eluacie wodnym, a 2% aktywności wymyto 60% metanolem.

Podsumowaując, za aktywność kolagenolityczną w ekstrakcie odpowiada związek (lub związki) o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą ulegać dializie, lub przechodzić przez błonę Spectra/Por_ CE (ester celulozy) MWCO: 100, i nie ulegają adsorbcji na podłożu kolumny C8, o odwróconej fazie (Lichroprep) jeśli są nanoszone jako roztwór wodny.

Testy in vivo:

Embrionalny Test Unaczynienia (EVT). Płynny ekstrakt z chrząstki frakcjonowano przy użyciu aparatury do filtracji o przepływie stycznym (tangensowym) oraz filtru 10 kDa (Pellicon, Millipore). Frakcje zawierające związki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa i niższej niż 10 kDa badano w identycznych warunkach. Skuteczność związków z obydwu tych frakcji w przypadku nowounaczynienia, okazała się taka sama. Wynik ten jest przeciwny do wyniku otrzymanego dla aktywności przeciwkolagenolitycznych, która nie jest obecna we frakcji zawierającej związki o masie cząst. wyższej niż 10 kDa.

a. Frakcja zawierająca związki o masie cząst. niższej niż 10 kDa (frakcja < kDa). Czynnik przeciwnaczyniotwórczy w tej frakcji zachowuje się podobnie jak czynnik antykolagenolityczny, podczas kolejnych etapów oczyszczania, jak opisano powyżej.

b. Frakcja zawierająca związki o masie cząst. wyższej niż 10 kDa (frakcja > kDa). Frakcję tę poddano chromatografii na żelowo-permeacyjnej kolumnie chromatograficznej (Sephacryl S-300, Pharmacia). Frakcję (S300-4) wykazującą aktywność przeciwnaczyniotwórczą scharakteryzowano na SDS-PAGE. Frakcja ta zawiera kilka prążków białkowych o masach cząsteczkowych ok. 8 i 18 kDa (wyznaczonych na podstawie standardów białkowych Biorad, SDS-PAGE). Następnie frakcję tę poddano dalszemu frakcjonowaniu przy zastosowaniu chromatografii anionowymicnnej (Mono-Q, Pharmacia), używając 25 mm Tris-HCl, pH 8,0 oraz gradient NaCl od 0 do 1,0 M. Frakcja wymyta pomiędzy 0,8 i 1,0 M NaCl wykazywała wysoką aktywność przeciwnaczyniotwórczą. Frakcje wymyte pomiędzy 0,3 a 0,6 M NaCl i 0,08 a 0,2 M NaCl miały niższą aktywność przeciwnaczyniotwórczą.

Porównanie z produktami ze stanu techniki.

Określenie stanu techniki.

Nie my pierwsi zainteresowaliśmy się głębiej ekstraktami z chrząstki, dlatego sprawdzamy wyjątkowy charakter ekstraktów otrzymywanych z chrząstki rekina sposobem przedstawionym w wynalazku przez bezpośrednie testy porównujące z dwoma produktami które wcześniej opisano lub wydedukowano w oparciu o wcześniej istniejącą wiedzę, konkretnie z produktami uzyskiwanymi zgodnie z procedurą opisaną przez Balassa (USP 4,822,607) i Oikawę i wsp. (cyt. powyżej).

Oikawa i wsp. opisali procedurę prowadzącą do wydzielenia dwóch głównych frakcji z których pierwsza zawierała cząsteczki o masie cząsteczkowej od 1 do 10 kDa, a druga składniki o masie większej niż 10 kDa. Właściwości anty angiogeniczne przypisywali jedynie frakcji pierwszej podczas gdy pozostałe określano jako nie wykazujące właściwości anty angiogenicznych w teście CAM. Aby przeprowadzić odpowiednie porównanie z produktami Oikawy rozfrakcjonowaliśmy całkowity ekstrakt na dwie odpowiednie frakcje i zachowaliśmy tą, która zawiera cząsteczki o masie od 0 do 10 kDa.

Ponieważ Balassa opisał proces ekstrakcji prowadzący do uzyskania całkowitego, płynnego, ekstraktu, porównywaliśmy nasz całkowity, płynny, ekstrakt z chrząstki (zawierający cząsteczki o masie od 0 do 500 kDa) z produktem sporządzonym zgodnie z metodą Balassa z tą różnicą, że chrząstkę cielęcą zastąpiono chrząstką rekina. Założyliśmy, że jeśli Balassa i Oikawa opisali procesy odpowiadające naszemu to wzory' cząsteczek uzyskiwanych przez FPLC, HPLC i VZE powinny zasadniczo pokrywać się oraz podobne aktywności anty angiogeniczne powinny być wykrywane w EVT. Wszystkie próby były przygotowane tak, że ich końcowe stężenie przed chromatografią FPLC i HPLC wynosiło 12 pg/pL (suchej masy/objętość roztworu). Produkt otrzymywany według Oikawy zawierał nierozpuszczalny materiał dlatego przed chromatografią był wirowany i filtrowany.

187 989

Przygotowywanie próbek.

Próbki ekstraktów z chrząstki rekina uzyskane zgodnie z trzema metodami oznaczono (podając oszacowaną ilość suchej masy w objętość roztworu) w następujący sposób:

1) DUP jest preparatem otrzymanym zgodnie z metodą przedstawioną w prezentowanym wynalazku zawierającym cząsteczki o masie od 0 do 500 kDa (12 (ig/jaL);

2) BAL jest preparatem uzyskanym zgodnie z procedurą Balassa i wsp. (12 pg/pL);

3) OIK jest preparatem frakcji 3 uzyskanym zgodnie z metodą Oikawa i wsp.. Wszystkie próbki zostały przygotowane tak, że ich końcowe stężenie, przed każdą analizą, wynosiło 12 pg/pL (suchej masy/objętość). Próbka OIK zawierała znaczną ilość nierozpuszczalnego materiału, który łatwo mógł być osadzony przez wirowanie przy 13,200 obr. na min lub filtrowanie przez błony o porach o średnicy 0,2 pm. Usunięcie nierozpuszczalnego materiału przez filtrowanie miało zasadnicze znaczenie w przypadku FPLC, HPLC i CZE (rys. 16, 17 i 19).

Porównanie FPLC.

Warunki:

Sączenie na kolumnach z Superose 12 (Pharmacia). Próbki sączono na kolumnach (10/30) z Superose 12 stosując jako eluent bufor fosforanowo solankowy przy przepływie 0,5 ml/min, (szybkość przesuwu papieru w drukarce = 0,25 cm/min). Przed wstrzyknięciem próbkę o objętości 100 pl, o ustalonym stężeniu, filtrowano przez błony o średnicy porów wynoszącej 0,2 pm. Śledzono adsorbancję dla OD28°.

Kolumnę kalibrowano przy pomocy następujących standartów (masa cząsteczkowa wyrażona w Daltonach): katalaza (232,000), aldolaza (158,000), albumina (56,000), owalbumina (44,000), chymotrypsyna (25,700), rybonukleaza (13,700), insulina (5,700) łańcuch B insuliny (3500), łańcuch A insuliny (2500), bacytracyna (1450) i witamina B-12 (1355). Masę cząsteczek stanowiących frakcję zasadniczego maksimum absorbancji obliczono korzystając z następującego wzoru: LogioMW= 7,52 - 0,212 x RT gdzie RT = objętość eluatu wyrażona w ml. R2 = 0,976. Całkowitą objętość kolumny (Vt) oznaczono przy pomocy cytydyny (246 Da) na 21,93 ml. Objętość pustą kolumny określono przy pomocy blue dextranu (2x10⁶ Da) na 8,38 ml.

Podsumowanie wyników:

Na rys. 16a) nasza próbka oznaczona jako DUP ma pierwsze maksimum absorbapcji (1) dla objętości eluentu wynoszącej 18,76 ml co odpowiada cząsteczkom o masie około 3500 Da. Kolejne maksima absorbapcji obserwowano dla frakcji eluowanych przy objętościach odpowiednio 22,7 (2) i 27,3 ml (3) co mieści się w objętości całkowitej kolumny (którą przy pomocy cytydyny określono na 21,93 ml). Substancje zawarte w omawianych frakcjach wydają się wykazywać powinowactwo do złoża.

Na rys. 16b) przedstawiono rozdział próbki BAL otrzymanej metodą Balassa na którym widoczny jest mały szczyt absorbancji (1) dla Vo, szczyt (2) dla 18,9 ml (3300 Da), szczyt (3) dla 18,5 ml (4000 Da) i dwa szczyty adsorbancji dla objętości przekraczających Vt (3) - dla 22,6 min i (4) 28,2 ml.

Na rys. 16c), próbka OIK otrzymana metodą Oikawa daje również niewielkie maksimum absorbapcji (1) dla V0, szczyt (2) dla objętości 18,9 ml (3300 Da), szczyt (3) dla 21,5 ml (1000 Da) i mały szczyt (4) dla 27,3 ml.

Porównując próbki zauważyć można, że poza szczytem absorbcji odpowiadającym związkom o masie 3500 Da pozostałe główne frakcje, charakterystyczne dla próbki DUP, nie były obserwowane w zbliżonej ilości w innych próbkach. Próbka OIK wydaje się zawierać niewielką ilość materiału wypłukiwanego we frakcji 27,3 ml. Próbka BAL zawiera frakcję wypłukiwaną w objętości 28,2 ml która mogłaby odpowiadać jednej z pobocznych frakcji wydzielanych z próbki DUP.

Porównanie HPLC.

Warunki:

Kolumna z CS-S-heksylu 5 pm o wymiarach 25 x 0,94 cm, CSC #059-085; kolumna do sączenia w odwróconej fazie.

187 989

Podsumowanie wyników:

W trakcie HPLC na kolumnie odwrotnej fazy z heksylu śledzono w sposób ciągły OD210 i OD₂₈0. Odwirowane próbki o objętości 50 μl (wszystkie o stężeniu 12 jigĄiL) nanoszono i wypłukiwano w 100% H2O. Wykreślano maksima absorbancji w przypadku każdego chromatogramu oznaczone odpowiednio dla OD210 (przykł. 1) i OD280 (przykł. 1). Objętość Vo kolumny wynosiła 5,5 ml (1,4 min).

Na rys 17a) widoczne są 3 główne (1, 2 i 3) szczyty adsorbancji oraz dwa poboczne (4 i 5) obserwowane dla OD210. Dwa poboczne maksima absorbancji towarzyszące szczytowi 1 oznaczono jako 1a i 1b. Znaczącą absorbancję przy OD280 obserwowano dla szczytów absorbancji 1, la, 1b i 3. Porównując, absorbancja przy OD280 oznaczona dla szczytu 2 jest względnie znacznie niższa przy OD210.

Na rys. 17b) próbka BAL wykazuje więcej szczytów absorbancji przy OD210 względem szczytów absorbancji charakterystycznych dla DUP lecz są one mniej intensywne. Ponieważ o identyczności cząsteczek świadczy nakładanie się szczytów absorbancji to jedynie szczyty absorbancji oznaczone dla preparatu Balassa jako 3 i 7 wydają się odpowiadać z uwagi na czas wypłukiwania szczytom absorbancji obserwowanym dla próbki DUP i oznaczonym odpowiednio jako 1a lub 1b i 4.

Na rys. 17c) widać, że w przypadku preparatu OIK obserwowano jedynie trzy główne szczyty absorbancji (1, 2 i 3). Szczyty 1 i 3 odpowiadają szczytom 1 i 3 obserwowanym dla próbki DUP lecz w przypadku chromatogramu OIK nie obserwowano szczytów z serii 1. Wysokość szczytów absorbancji w przypadku próbki OIK była niższa niż dla próbki DUP. Tak więc wzory uzyskiwane w FPLC i HPLC były charakterystyczne dla poszczególnych produktów.

Porównanie CZE.

Warunki:

Aparat: system Beckman (p/ace system 2050) z oprogramowaniem (wersja 7.11 U); Kapilary: Silice (TSPO 50375), 50 μm x 97 cm; bufor: 2 M kwas mrówkowy; roztwór opłaszczający, 5% wag./obj. Bromek heksadimetrenu i 2% obj./obj. Roztwór glikolu etylenowego w wodzie; układ wykrywający: UV (200 nm); natężenie: -30 kV; wstrzyknięcie: 0,5 psi, 20 sekund; temp.: 22°C.

Kapilary równoważono 1 M NaOH (20 psi, 20 min), wodą (20 psi, 10 min), roztworem opłaszczającym (20 psi, 20 min) i buforem (20 psi, 10 min). Następnie ustalono warunki rozdziału: bufor (20 psi, 2 min), wstrzyknięcie próbki (0,5 psi, 20 sek.), rozwijanie (-30 kV, 45 min), 1 M NaOH (20 psi, 4 min) i bufor (20 psi, 4 min).

Każdą próbkę (BAL, DUP i OKI frakcja 3) zawieszano tak aby jej stężenie wynosiło 16,5 mg/ml, a pH roztworów wynosiło odpowiednio 7,1, 6,8 i 8,2 dla próbek bAl, DUP i OIK. Stężenie NaCl w próbkach BAL, DUP i OIK wynosiło odpowiednio 2,08,4,37 i 0,71 mg/ml.

Podsumowanie wyników:

Na rys. 18 przedstawiono profil składu cząsteczkowego każdej z próbek (BAL, DUP i OIK-3). Porównanie próbek DUP i BAL pokazało, że próbka BAL zawiera znaczną ilość szczytów absorbancji 0% powierzchni <1. Obie próbki, BAL i DUP, zawierają materiał dający maksima absorbcji dla MT/EOF = 1,06, 1,54, 1,59, 1,66 i 3,22. Maksima dla wartości 1,06, 1,54 i 3,22 posiadały, dla próbek BAL i DUP, podobne % powierzchnie podczas gdy szczyt dla wartości 1,59 jest 8 razy większy niż dla BAL, a przeciwną właściwość wykazano dla szczytu 1,66.

Dla próbek DUP i OKI uzyskano bardzo odmienne elektrochromatogramy. Dla OKI stwierdzono obecność jednego głównego oraz szeregu pobocznych szczytów. Żaden z powyższych szczytów nie był obserwowany w przypadku próbki DUP.

Porównanie EVT.

Analizowano anty angiogeniczne właściwości próbek DUP, BAL i OIK (rys. 19). Dla ekstraktu uzyskanego metodą Balassa nie stwierdzono żadnych właściwości anty angiogenicznych. Nieoczyszczony ekstrakt DUP porównano z frakcją 3 ekstraktu Oikawa OIK. Oba ekstrakty DUP i OIK były prawie równocenne. Jednakże Oikawa i wsp. nie konkurują z przedstawianym wynalazkiem, bowiem sugerowali iż nie wykrywa się aktywności związa30

187 989 nej z frakcjami o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa co jest w sprzeczności z wynikami przedstawionymi na rys. 15.

Pomimo podobieństw pomiędzy procedurami Balassa i naszą, jednoznacznie widać, że produkty otrzymywane w wyniku ich zastosowania nie są tym samym.

Porównanie składu aminokwasowego.

Metodą Lowry'ego oznaczono zawartość białek w próbkach BAL, DUP i OIK (każda 0 stężeniu 16,5 mg/ml) otrzymując odpowiednio dla próbek BAL, DUP i OIK wartości 3,31, 0,27 i 4,15 mg/ml. Gdy porównać próbkę DUP z BAL i OIK okaże się, że charakteryzują się one bardzo odmienną proporcją białka/sucha masa.

Analizę prowadzono dla dalszej analizy składu aminokwasowego płynnych preparatów uzyskiwanych z chrząstki. Rys. 20 przedstawia proporcje każdego z aminokwasów w próbkach BAL, DUP i OIK. Proporcje wolnych aminokwasów różnią się znacznie pomiędzy poszczególnymi preparatami i wynoszą odpowiednio dla próbek BAL, DUP i OIK 23%, 73% i 4%. Oczywiście pomiędzy preparatami z chrząstek obserwuje się znaczne różnice w zawartości aminokwasów pochodzących z białek, wynosi ona odpowiednio dla preparatów BAL, DUP i OIK 77%, 27% i 86%. Poniższa tabela zbiera nieopracowane dane:

Preparat chrząstki	Zawartość wolnych a.a. (ng/ml)	a.a pochodzące z białek (ng/ml)
BAL	675	2314
DUP	604	223
OIK	181	3910

Wnioski

Dwa wcześniej opisane produkty (BAL i OIK) które porównywaliśmy z naszym (DUP) są traktowane jako klasyczne procedury otrzymywania ekstraktów z chrząstek. Przedstawione powyżej wyniki pokazują, że obecnie przedstawiana procedura (DUP) pozwala otrzymać produkt o zaskakująco dobrych właściwościach, zarówno anty angiogenicznych, anty nowotworowych, anty zapalnych jak i anty kolagenolitycznych. Podsumowując stwierdzamy, że wprowadzana procedura rzeczywiście pozwala odzyskiwać w postaci pojedynczego ekstraktu liczne rozpuszczalne w wodzie inhibitory.

Bezpośrednie porównanie profili cząsteczkowych BAL, DUP i OIK oraz zawartości białek wykazało, że każdy z preparatów uzyskanych z chrząstki charakteryzował się szczególnymi właściwościami. Pomimo, że posiadały one pewne elementy wspólne to jednoznacznie pokazano, że występowały one w odmiennych proporcjach. Jest to szczególnie istotne z uwagi na fakt, że DUP wykazuje właściwości anty nowotworowe gdy podawany jest doustnie w dawce wynoszącej około 75 mg/kg, a traci stopniowo tę właściwość gdy podawany jest w wyższych dawkach. Co więcej, różne preparaty uzyskiwane z chrząstki, takie jak BAL, DUP i OIK, mogą wykazywać bardzo różne właściwości biologiczne spowodowane różnymi proporcjami poszczególnych składników w nich zawartych.

Postępowanie kliniczne.

Przygotowanie płynnych ekstraktów dla celów klinicznych.

Płynne ekstrakty z tkanki rekina, otrzymane metodą opisaną w przedstawianym wynalazku, zastosowano we wstępnych postępowaniach klinicznych. Płynne ekstrakty otrzymane po ultrafiltracji sączono przez filtry o średnicy porów wynoszącej 0,22 pm. Spełnianie wymagań mikrobiologicznych przez płynny ekstrakt sprawdzano zgodnie ze standardem USP XXIII <61>, Płynny ekstrakt dzielono na 7 ml dawki (około 85 mg białka), które umieszczano w jałowych fiolkach i zamrażano przez noc w -60°C, a następnie przechowywano do momentu użycia w -20°C.

Efekt anty angiogeniczny.

Płynny ekstrakt z chrząstki stosowano w leczeniu chorób zależnych od angiogenezy. W praktyce u człowieka sprawdzano możliwość leczenie w trzech różnych rodzajach chorób zależnych od angiogenezy: łagodnych nowotworach (nowotwór stercza), chorobach dermatologicznych (psoriasis) i łagodnych reumatyzmach (gościec przewlekły i zapalenie kości

187 989 i stawów). Poniższe przykłady obrazują i równocześnie dowodzą anty angiogeniczzych właściwości płynnego ekstraktu.

Przedstawione poniżej wyniki dodają otuchy i pozwalają przypuszczać, że przesącz, a w konsekwencji jego frakcje będą użyteczne w leczeniu wszystkich chorób zależnych od ang^e^zy nie tylko tych odnośnie których prowadzono badania. Przypuszcza się, że ekstrakt z chrząstki przedstawiany w wynalazku będzie skuteczny gdy choroba posiada składnik zależny od angiogezozy i gdy podawany jest w odpowiedni sposób wprowadzając kompozycję zawierającą odpowiednią ilość aktywnych składników, a co za tym idzie kompozycja ta ma postać umożliwiającą jej odpowiednie pokazie. W konsekwencji pożądanym będzie aby wynalazek nie ograniczał się do wyszczególnionych specyficznych kompozycji dla użycia w leczeniu chorób związanych z ang^e^zą, bowiem biegli w sztuce będą w stanie, w zależności od sposobu podawania, a tym samym adresowania do chorej tkanki, wyprowadzić szereg pochodnych kompozycji. Kompozycje mogą być podawane różnymi drogami np. domiejscowo, doustnie, podjęzykowo, doodbytniczo, kcnaazyzIcwo, domięśniowo, śródcazzie, śrókotrnewzcwc, dyfuzyjnie itd..

Z uwagi na rybi smak i zapach ekstraktu z chrząstki dodane mogą być składniki smakowe i zapachowe lub też inne składniki farmaceutyczne (lipcecmy, składniki opuszczające, plastry itd.) mogące zapobiegać występowaniu u pacjenta efektów ubocznych. Określenie „pacjent określa zarówno człowieka jak i zwierzęcia.

Nowotwór:

Nasi pacjenci obarczeni nowotworem stercza mieli dodawany do kioty płynny ekstrakt z chrząstki co powodowało u nich znaczący powrót do zdrowia. Gróczolorak został zkiagzczowazy w 1986 roku. W tym czasie stosowana była radioterapia. W 1991 roku pczicm PSA (występujący w surowicy antygen dla nowotworu stercza) wynosił 138 pg/L, gdy najwyższy poziom uznawany za normalny wynosi 4 pg/L. Następnie pacjent przechodził całkowicie odmienne leczenie obejmujące kastrację połączoną z leczeniem anty ankrogezowhm (EUFLEX). Leczenie to było wystarczającym przez trzy lata po czym ponownie podniósł się poziom PSA. Od czerwca 1994 roku pacjent uzupełniał swoją dietę płynnym wyciągiem z chrząstki rekina (dzienna dawka wynosiła około 75 mg suchej masy/7 ml ekstraktu co odpowiada 1-1,5 mg/kg masy ciała dzień). Poziom PSA spadał stopniowo z 12 do poniżej 4 pg/ml (górna granica wartości normalnej), przy czym poziom ten osiągnięto w kwietniu 1996 roku. Dawka może być modyfikowana w zależności od sposobu podawania, dostępności biolcgiazzoj aktywnych składników i pożądanej aktywności koztrclyjąaoj stan chorobowy. W powyższym przypadku, ekstrakt płynny był prawdopodobnie wchłaniany ze znaczącą wydajnością w przewodzie pokarmowym. Można polegać na wynikach otrzcmanhah dla traktowanych DMBA szczurów i nastrzhkzIęthah myszy (patrz powyżej). W doświadczeniach tych na szczurach, myszach (patrz powyższe przykłady) i małpach (dane nie przedstawiane) wykazano brak toksycznych właściwości preparatu.

Doustne podawanie płynnego ekstraktu szczurom poddanym działaniu DMBA i myszom z przeszczepem DA3 sugeruje stosowanie dawek w zakresie od 1 do 300 mg/kg wagi ciała co ma przypuszczalnie, w przypadku modelu zwierzęcego, ma ogromny wpływ na zahamowanie rozwoju nowotworu i jego yzaanhnziezIo. W przypadku myszy (model DA3) konaazyzicwo podawanie płynnego ekstraktu wykazało, że dla uzyskania dawki wydajnie hamującej rozwój nowotwory ważny jest sposób podawania. Sugeruje on, że efektywna dla nowotworu stercza dawka wynosząca 1 mb/kg może być zmniejszona do prawie 0,01 mg/kg jeśli wybierze się pozajelitowy sposób jej podania. Podsumowując należy przyjąć, że dla zredukowania lub całkowitego zahamowania azgicgezenh w leczeniu nowotworów zastosowana może być dawka w zakresie od 0,01 do 200 mg/kg wagi ciała na dzień co wyznacza rozsądny zakres dawki średniej (ED50).

Kilku innych pacjentów uzupełniało swoją dietę płynnym ekstraktem z chrząstki (dzienna dawka doustna wynosiła około 75 mg suchej masy/7 ml ekstraktu co odpowiada około 1-1,5 mg/kg wagi ciała/dzień) stosując równocześnie bardziej tradycyjne sposoby leczenia (chirurgiczne, chemioterapię, leczenie przocIwhcrmonalne itd.). Podsumowując, szereg przypadków zebrano w formie poniższej tabeli. Wyniki wskazują iż połączenie leczenia

187 989 z podawaniem płynnego ekstraktu może zwiększyć przeżywalność i jakość życia pacjentów obarczonych zwartymi guzami.

Rodzaj nowotworu	Historia choroby
Nowotwór pęcherza	Pęcherz moczowy u 70 letniego mężczyzny; zastosowano chirurgiczne usunięciu fragmentów tkanki (2 cm i 15 cm) i uzupełnianie diety płynnym wyciągiem z chrząstki; brak śladów nowotworu do 09/94.
Gruczolorak jajników	47 letnia kobieta; usunięcie - 15 cm (prawego), 11 cm (lewego) oraz kilka 2 cm; przebyła leczenie chirurgiczne i chemoterapię w 1991 roku; nawrót choroby leczony przez chemoterapię w 1992 roku; ponowny nawrót choroby leczony przez chemoterapię w 1993 roku, uzupełnianie diety płynnym ekstraktem z chrząstki od 1994 roku; w tym czasie ograniczenie masy złośliwego nowotworu.
Mięśniakomięsak prążkowany	63 letni mężczyzna; guz naciekowy o średnicy 11 cm (450 g); przebył leczenie chirurgiczne i chemioterapię, nawrót leczony radioterapią i przez uzupełnienie diety płynnym ekstraktem z chrząstki; w tym czasie w obrębie nowotworu zaobserwowano zmiany nekrotyczne tkanki i jego stabilizację.
Nowotwór trzustki z przerzutami na wątrobę	45 letnia kobieta; usunięcie fragmentu trzustki (9 cm) oraz przerzutów na wątrobę; chemoterapia oraz uzupełnianie diety płynnym ekstraktem z chrząstki w tym czasie, w 1994 roku, 80% zanik nowotworu, w 1995 roku nowotwór zanikł całkowicie.
Gruczolorak piersi	67 letnia kobieta; zabieg chirurgiczny w 1978 roku, nawrót i przerzuty na płuca (1994); Megace oraz uzupełnienie diety płynnym ekstraktem z chrząstki; w tym czasie częściowe cofnięcie się nowotworów pod względem wielkości (z 1,5 cm do 1 cm) i liczby (z 12 do 6).

Łuszczyca:

Przygotowano następującą kompozycję dermatologiczną, a następnie sprawdzono ją celem określenia jej użyteczności u pacjentów obarczonych łuszczycą:

- emulgator eMuLGADE CLB 29% (wagowo/wagowych)

- 20 x nierozfrakcjonowany przesącz 69,5% (wagowo/wagowy)

- GERMABEN 111% (wagowo/wagowy) i

- Lawenda (Lavandula angustifolia) 0,5% (wagowo/wagowa)

EMULGADe CLB, mieszaninę estrów kwasu stearynowego, alkoholo tłuszczy i niejonowych emulgatorów (dostarczone przez Henkel Canada Ltd.) podgrzewano do 65-70°C przy wytrząsaniu. Po zakończeniu ogrzewania mieszaninę nadal wytrząsano. Gdy temperatura mieszaniny osiągnęła 45°C dodawano stężony olejek z lawendy (Lavandula augustifolia) iprezerwant - GeRMABEN (diazonidvl urea 30%, methylparaben 11%, propylparaben 3% i glikol propylenowy 56%; otrzymane z Sutton Laboratories, NJ, U.S.A.). Gdy temperatura mieszaniny spadła do 30°C dodano płynny ekstrakt z chrząstki. Otrzymana w ten sposób kompozycja była jednorodnym nie tłustym kremem; zmieniając zawartość procentową EMULGADE można otrzymać, zależnie od zaleceń producenta (mleczko, płyn, maść) inne kompozycje dermatologiczne różniące się lepkością. Dla otrzymania past, żeli lub innych form zdolnych do przenikania przez skórę użyte mogą być inne nośniki lub dodatki.

187 989

Mieszanka o powyższym składzie podawana była grupie 9 pacjentów, obarczonych łuszczycą, którzy poddani byli konwencjonalnemu leczeniu lecz po pewnym czasie przestali na nie reagować, dwukrotnie w ciągu dnia przez okres dwunastu tygodni (podawanie miejscowe). Dla badań wybrani zostali pacjenci wykazujący podobny i symetryczny rozwój łuszczycy. Postępowanie prowadzone było tak, że ani pacjent, ani lekarz nie wiedzieli, która strona ciała porażona łuszczycą była traktowana kompozycją zawierającą ekstrakt z chrząstki, a która traktowana była kompozycją kontrolną Znaczącą poprawę zaobserwowano w przypadku pięciu pacjentów u których nie obserwowano komplikacji związanych z nadmiernym rogowaceniem, u pacjentów z nadmiernym rogowaceniem efekt leczenia był umiarkowanie pozytywny. Zdjęcia części ciała dwóch pacjentów pokazano na fig. 21. Na fig. 21a i b pokazano, że pacjenci dotknięci łuszczycą z nadmiernym rogowaceniem zaledwie po miesiącu leczenia również ujawniają bardzo znaczne ograniczenie rumieni połączonej ze swędzeniem. Jednakże nadmierne rogowacenie nie ustępuje. Zdjęcie drugiego pacjenta przedstawia przypadek łuszczycy bez komplikacji spowodowanych nadmiernym rogowaceniem (fig. 21 c i d) u którego postęp w leczeniu trwającym trzy miesiące był znacznie większy. Ponieważ łuszczyca wydaje się być chorobą złożoną należy założyć, że reakcja pacjenta będzie zależała od znaczenia jakie dla stanu i rozwoju jego choroby mają takie elementy jak angiogeneza i stan zapalny. Jak wykazano w przypadku szczurów traktowanych DMBA (fig. 5), proliferacji komórek nabłonkowych (fig. 7) i EVT (fig. 10) nasz ekstrakt rzeczywiście wykazuje aktywność anty-angiogeniczną. Potwierdzono również występowanie aktywności antyzapalnej (model mysi CHS). Jest prawdopodobnym, że lepsze wyniki mogłyby być uzyskane gdyby skład mieszanki byłby uzupełniony o czynniki terapeutyczne skierowane przeciw innym elementom choroby (czynniki keratolityczne, dodatkowe czynniki antyzapalne, aptyhistamipowe, immunosupresory itd.).

Uzupełnianie może przyjąć postać dostosowania składu tak aby przykładowo uwzględniona była efektywna ilość czynnika keratolitycznego, dającego produkt konkurencyjny lub alternatywny względem przedstawionej mieszaniny przeznaczonej do stosowania miejscowego. Co więcej nie istnieje potrzeba aby dopełniające medykamenty podawane były tą samą drogą. Preparat o wyżej opisanym składzie nie wykazuje działania systemicznego (efekt jego aktywności jest ograniczony do miejsca nałożenia) i efektów ubocznych związanych z dużą zawartością płynnego ekstraktu z chrząstki.

Zapalenie stawów:

Ochotnicy obarczeni zapaleniem stawów wypróbowywali działanie pobierania codziennie przez kilka miesięcy jednej lub dwóch 7 ml jednostek płynnego ekstraktu. Stan pacjentów stopniowo poprawiał się czego obrazem było przywracania działania ścięgien, zmniejszenie bólu i stanów zapalnych (do 60%). Ponieważ składnikami zapalenia stawów są angiogeneza i stan zapalny to mogą być one obiektem działania aktywności aptyapgiogenicznej i antyzapalnej które wykazuje ekstrakt z chrząstki.

Następnie zespół specjalistów z zakresu reumatologii przeprowadził pilotowe badania kliniczne. Brało w nich udział siedmiu ochotników w wieku od 39 do 60 lat którzy dotknięci byli zapaleniem stawów. Diagnozy określające ich choroby były oparte na kryteria chopisanych w poprawionym wydaniu American Rheumatism Association's (Arnett, F.C. i wsp., 1988, Artgritis & Rheumatism, vol. 31, 315-325).

Leczenie trwało 30 dni i polegało na przyjmowaniu przez pacjentów dziennej dawki 21 ml płynnego ekstraktu z chrząstki rekina (12 mg suchej masy/ml). Efektywność leczenia określano przy pomocy współczynnika stawowego wyznaczanego na podstawie tkliwości uciskowej ścięgien (Ritchie, D.M. i wsp., 1968, Quaterly J. Med., New Series XXXVII, vol. 147, 393-406). Współczynnik wynika z sumowania liczby ilościowych oznaczeń bólu doznawanego przez pacjenta gdy jego ścięgna poddane są ciągłemu naciskowi wywieranemu na skraj stawu lub w pewnej odległości od wykonującego ruch ścięgna. Wyniki pokazują, że u 4 z 7 pacjentów leczonych płynnym ekstraktem z chrząstki uzyskano poprawę (tabela poniżej), co sugeruje, że produkt może być użytecznym w leczeniu zapalenia stawów lub w innych przypadłościach w których występuje przewlekły stan zapalny.

187 989

Pacjent (zr)	Wiek (lata)	Współczynnik RUchie^o	Poprawa
Dzień 0	Dzień 30
1	60	30	22	Tak
2	43	8	8	Nie
3	52	12	12	Nie
4	41	15	19	Nie
5	46	5	3	Tak
6	39	6	2	Tak
7 '	55	14	7	Tak

Naczyniaki:

Do badań wybrano grupą obejmującą 16 osób. Mieli oni na twarzy widoczne lecz nie rozległe rozszerzenia naczyń krwionośnych. Zespól pokzIelcnc na dwie ośmioosobowe grupy. Grupie A podawano liposomy zbudowane z cholesterolu zawierające 5% płynny ekstrakt z chrząstki (B) podawano wyłącznie zbudowane z cholesterolu Upos^c. Produkty te nanoszono przez 3 miesiące dwukrotnie w ciągu dnia na całą powierzchnię twarzy. Przy pomocy mikroskopu światłowodowego uzyskano obraz czterech miejsc twarzy na których występowały zaczyzIakI. Otrzymany obraz analizowano przy pomocy Zeiss Ibas Image Analyzer pod względem poziomu szarości. Łączną gęstość optyczną (IOD) obliczono dla każdego badanego obszaru u poszczególnych pacjentów. Dla każdego z czterech punktów czasowych wyznaczano średnią wartość z wartości dla każdego pacjenta przez uśrednienie wartości uzyskanych dla wszystkich czterech badanych obszarów.

Przedstawione wyniki pokazują 35% zmniejszenie IOD po 4 tygodniach, a efekt ten utrzymywał się w trakcie prowadzonych badań (fig. 22). Puste cholesterolowe liposomy ujawniały tło, którego wyrazem była 5 i 8% poprawa odpcwiedzic po 8 i 12 tygodniach ich stosowania.

Ciemne kręgi okółoczodołowe (peri-orbital dark circles):

Przebarwienia skury niekoniecznie wywołane są obecnością lub brakiem melanizy, lecz również zaopatrzeniem w krew i zawartością plazmy. Gdy przepływ krwi jest ospały, a większość tlenu zostaje z niej odebrana dla zaspokojenia potrzeb metabolizmu, skóra przebarwia się na niebieskawo. Z uwagi na ciezkość skóry różnice w barwie szczególnie ujawniają się w ckcliac oczu (Oresajo i wsp. 1987, Cosmetics & Toiletries 102: 29-34). Powstanie ciemnych kręgów może być również spowodowane zmianami w budowie ścian naczyń krwionośnych występujących w sąsiedztwie oczu. Ciemne kręgi wokół oczu występują również przy odkładaniu tłuszczu, obrzęku powiek i wysięku krwi z naczyń występujących wokół oczu. Zaprojektowano badania kliniczne dla oceny płynnego ekstraktu z chrząstki rekina na kontrolowanie azgiogozezy na obszarze wokół oczu, a w konsekwencji ograniczenie występowania ciemnych kręgów okółoczodołowhah.

W badaniach brało udział łącznie 18 ochotniczek w wieku od 18 do 65 lat. Wszystkie one były normalne i zdrowe bez objawów ostrych lub chronicznych stanów chorobowych w tym również z uwagi na problemy dermatologiczne i oftalmolcgIczze.

Z testu wykluczono osoby mające oparzenia słoneczne, wysypkę, skaleczenia, ślady po cparnoniaah itp., bowiem mogły oze wpływać na ocenę wyników testów. Wykluczono również kobiety ciężarne i karmiące. Testowane miejsca były pozbawione dostrzegalnych brodawek, znamion, oparzeń słonecznych, przebarwień, ranek i aktywnych ubytków skórnych.

Zespół podzielono za dwie grupy gdzie grupę A stanowiło 10 kobiet, a grupę B 8 z których każda otrzymywała odpowiednio nośnik zawierający 5% płynnego ekstraktu z chrząstki lub sam nośnik. Członkinie zespołu zaopatrzono w wystarczającą ilość produktu aby mogły one zakładać go za skórę wokół oczu przez 12 tygodni dwukrotnie w ciągu dnia. Pomiary wykonywano bezpośrednio przed przystąpieniem do doświadczenia oraz po 4, 8 i 12

187 989 tygodniach jego trwania. Przy każdej wizycie robiono fotografie, które analizowano przy pomocy Image Analysis.

Fotografie analizowano z uwagi na wartości szarości opisujące zaciemnienia i przejaśnienia skóry. Jest oczywistym, że w grupie poddanej działaniu płynnego roztworu z chrząstki obserwOwano dobry przyrost wartości szarości (co oddaje przejaśnienie ciemnych przebarwień). W grupie poddanej działaniu płynnego ekstraktu z chrząstki obserwowano 11%, 21% i 14% rozjaśnienie skóry wokół oczu odpowiednio po upływie 4, 8 i 12 tygodni. W grupie poddanej działaniu wyłącznie nośnika nie obserwowano zmian (fig. 23).

Żylakowate naczynia:

W badaniach brało udział 20 uczestników. Uczestnicy posiadali na nogach widoczne, ale nie rozległe obszary z rozszerzonymi naczyniami krwionośnymi. Zespół podzielono na dwie grupy. Osoby z grupy A (n=9) zaopatrzono w krem zawierający płynny ekstrakt z chrząstki gdy grupa B (n=l 1) była zaopatrzona w krem zawierający jedynie nośnik w ilości wystarczającej na codzienne dwukrotne pokrycie nóg przez okres 3 miesięcy. Dla uzyskania obrazów żylakowatych naczyń otrzymywano przy pomocy mikroskopu światłowodowego obrazy z 2-4 miejsc na nodze każdej osoby. Obrazy analizowano z uwagi na wartość szarości przy pomocy urządzenia analizującego Zeiss Ibas. W przypadku każdej osoby średnia gęstość optyczna (IOD) była wyliczana dla wszystkich badanych miejsc. Dla każdego pacjenta oraz punktu czasowego uzyskane dla różnych miejsc wartości uśredniano.

Wyniki przedstawiono na fig. 24. Obserwowano 21%, 17% i 26% spadek IOD odpowiednio po 4, 8 i 12 tygodniach używania specyfiku. W przypadku kontrolnego nośnika obserwowano tło wynoszące 5%, 0% i 0% odpowiednio po 4, 8 i 12 tygodniach jego używania.

Inne możliwe zastosowania dla leczenia klinicznego i weterynaryjnego:

Oftalmologia: Ograniczenie widzenia lub ślepota może być spowodowana przez szereg czynników charakteryzowanych przez nienormalny wzrost naczyń krwionośnych lub powstawanie nowych naczyń krwionośnych. Obejmuje to tworzenie nowych naczyń rogówki (wywołane podrażnieniem fizycznym lub chemicznym), infekcję rogówki, odrzut przeszczepu rogówki, jaskry, degenerację plamki, opryszczkowe zapalenie rogówki i cukrzycowa retóncpatia. Płynny ekstrakt z chrząstki powinien działać w warunkach klinicznych przez hamowanie tworzenia naczyń krwionośnych i przez ograniczenie rozrostu naczyń krwionośnych i stanów zapalnych.

Gojenie ran:

Gojenie ran wymaga złożonych oddziaływań pomiędzy komórkami, mediatorów biochemicznych, cząsteczek zewnątrzkcmórkowego matrix i mikrośrodowiska komórki. Po osiągnięciu przez ranę pełnej grubości, tkanka zlamincwa (fibroblasty, naczynia włosowate i komórki biorące udział w powstawaniu stanu zapalnego) przyrasta w określonej sekwencji począwszy od brzegów rany. W ciągu 24 godzin do przestrzeni rany zaczynają migrować fibroblasty wchodzące w skład tkanki łącznej znajdującej się na brzegach rany. W miarę przemieszczania fibroblasty wytwarzają cząsteczki matrix (kolagen i glikoscminoglikany), tworzące zewnątrzkomórkowe matrix. Pierwsze pączki naczyń włosowatych mogą być zaobserwowane, w 18 godzin po zranieniu, na obszarze brzegów rany gdzie zachodzi mikrokrążenie przez przesączanie. Pączki te wrastają w przestrzeń rany i tworzą nową sieć naczyń włosowatych dla tkanki łącznej rany. Proliferacja, migracja fibroblastów i wzrost naczyń włosowatych trwa aż do momentu gdy przestrzeń rany zostanie całkowicie wypełniona nową tkanką. Pewne warunki gojenia które są zaburzane przez nadmierną ekspresję czynników ziarnino wania takich jak hipertroficzne bliznowacenie i leczenie skóry głęboko poparzonych osób mogą być korzystnie zmienione przez podawanie płynnego ekstraktu z chrząstki (doustnie lub miejscowo) prowadząc do spowolnienia procesu annionenezó, a w efekcie spowolnienia procesu gojenia się rany.

Grudkowo-łuskowa skóra:

Korzystny efekt jaki wywołuje płynny ekstrakt z chrząstki na zmiany łuszczycowe sugeruje, że może mieć on korzystny efekt gdy się ją stosuje miejscowo lub systemicznie w przypadku chorób o charakterystyce podobnej do łuszczycy. Choroby z grudkowo-łuskowata. skórą charakteryzują się występowaniem na skórze gruzełek o barwie od czerwonej do fioletowej

187 989 do fioletowej oraz płytek będących wynikiem wycienienia naskórka i/lub powodującym stan zapalny skóry i obejmującej łuszczycę, zespół Reitera, łupież różowy, liszaj płaski, łupież czerwony mieszkowy, wtórny syfilis, ziarniak grzybiasty i ichthyosiform eruptions.

Łysienie:

Podwiązanie małego bocznego naczynia prowadzącego krew do owłosionej głowy z powodzeniem chroni przed utratą włosów spowodowaną nadmiernym wystawieniem na działanie androgenu. Miejscowe podanie płynnego ekstraktu z chrząstki na pewne obszary owłosionej głowy powinno zapobiegać utracie włosów poprzez ograniczenie siatki naczyń włosowatych, a w konsekwencji wystawienie na działanie hormonów.

Zastosowania w weterynarii:

Ekstrakt z chrząstki w postaci stałej lub płynnej może być podawany zwierzętom w celach terapeutycznych i kosmetycznych, które opisano dla człowieka.

Działanie nie antyangiogeniczne

Trądzik:

Nawet jeśli trądzik nie jest zgodnie z wiedzą wynalazców klasyfikowany jako choroba posiadająca składnik angiogeniczny jednak kuszącym było sprawdzenie działania płynnego ekstraktu z chrząstki u pacjentów nim dotkniętych z uwagi na to, że posiada on również właściwości anty-zapalne. Dla eksperymentalnego sprawdzenia ekstraktów z chrząstki u pacjentów dotkniętych trądzikiem przygotowano żel o następującym składzie:

CARBOPOL	^/o
Oczyszczona woda	77,2%
NaOH	0,3%
PHENOXETOL	0,3%
TWEEN 80	0,3%
Płynny ekstrakt z chrząstki	20,0%
40 x ekstrakt z Aloesu	0,5%
Płynny ekstrakt z chrząstki zawiera 9-12 mg/ml suchej masy. Zastosowana mieszanka

wywoływała znaczącą poprawę stanu skóry pacjentów dotkniętych mniej lub bardziej ostrą postacią łupieżu (łupież zapalny i kystic acne). Na fig. 25 pokazano znaczącą poprawę stanu pacjentów z łupieżem jeśli stosowali oni miejscowo przez 12 tygodni nośnik z płynnym ekstraktem.

Wynik ten może być związany z efektem antyangiogenicznym (co ujawniało by w łupieżu składnik angiogeniczny), lub mogą być zależne od aktywnych składników innych niż antangiogeniczne (przypadkowo działanie antyzapalne). Wszystkie wyniki uzyskane w postępowaniach klinicznych wykazały ogromne możliwości płynnego ekstraktu z chrząstki w leczeniu chorób związanych z angiogenezą i/lub stanami zapalnymi. Ilość ekstraktu z chrząstki jak również formuła mogą być zmieniane dla zaspokojenia specyficznych potrzeb.

Można spostrzec, w oparciu o zawartość białka, że zarówno stosowane miejscowo jak i inne kompozycje mogą zawierać różne ilości ekstraktu z chrząstki. W przypadku trzech badanych kategorii stosowano bardzo różne dawki i/lub składy mieszanek.

Podrażnienie skóry:

Ponieważ angiogeneza jest w przypadku wielu chorób związana z występowaniem stanów zapalnych, pożądanym by było oznaczyć w ekstrakcie z chrząstki każdą z tych aktywności niezależnie. W tym celu określenia antyzapalnych i łagodzących właściwości ekstraktów dla testów wybrano model podrażnienia skóry w przypadku którego nie oczekuje się występowania angiogenezy. Do badań wybrano dziewięciu ochotników w przypadku których udokumentowano wrażliwość na Balsam of Peru. Testowano następujące składniki:

1. 1 x 50% chrząstka rekina w pożywce D-MEM

2. 1 x 20% chrząstka rekina w pożywce D-MEM

3. 1 x 10% chrząstka rekina w pożywce D-MEM

4. 10% Cola nitida (Indena), hydro-alkohol 1:1.

Ochotnikom nanoszono cztery badane składniki na wewnętrzną stronę przedramienia. Pozwalano, aby nastąpiło wchłonięcie naniesionego materiału, co trwało dwadzieścia minut, po czym na badane miejsca nanoszono czynnik drażniący którym był Balsam of Peru. Podraż187 989 nienie skóry mierzono obserwując wzrost zaczerwienienia skóry. Stopień zaczerwienienia mierzono przy pomocy urządzenia Minolta Chromameter, po czym porównywano z wynikami uzyskanymi dla pozytywnych i negatywnych prób kontrolnych. Pozytywną kontrolą była barwa skóry poddanej wyłącznie działaniu Balsam of Peru, a kontrolą negatywną skóra poddana miejscowemu działaniu roztworu cola i traktowanemu jak badany produkt. Statystyczną istotność uzyskanych wyników badano stosując test T. Figura 26 pokazuje, że 10% cola była aktywna w 70%. Chrząstka rekina była aktywna w 58% i 60% jako czynnik przeciwdrażniący w stężeniach odpowiednio 20% i 10%. Nie obserwowano zależności efektu od dawki. Wynik ten sugeruje, że ekstrakt z chrząstki posiada aktywności antyzapalną i łagodzącą, które można oddzielić od aktywności antyaugiogenicznej.

Nowotwory:

U 53 letniej pacjentki wykryto wielkokomórkową postać nieziamiczego chłoniaka typu B. Prześwietlenie CAT ujawniło adenopatię wokół tętnicy i żyły szyjnej (2,5 cm średnicy) oraz znacznej objętości adenopatię ponad prawą wnęką nerki. Pacjentka odrzuciła chemoterapię i uzupełniała swoją dietę płynnym ekstraktem z chrząstki (październik 1993) (dzienna dawka doustna około 75 mg suchej masy/7 ml ekstraktu co odpowiada około 1-1,5 mg/kilogram wagi ciała/dzień). W trzy miesiące później (styczeń 1994) prześwietlenie CAT pełną resorbcję adenopati w szyi. Do listopada 1994 roku w 75% zmniejszyła się objętość adenopati występującej w brzuchu. W tym czasie nastąpiła stabilizacja choroby, a pacjentka czuła, że jej stan zdrowia jest dobry.

Wynik wskazuje, że anty nowotworowa aktywność płynnego ekstraktu z chrząstki może być skierowana nie tylko przeciw guzom zwartym.

Warstwa ochronna dla skóry:

W badaniach brał udział zespół złożony z sześciu zdrowych ochotników. Członkowie zespołu otrzymali krem zawierający płynny ekstrakt z chrząstki, który mieli nanosić dwa razy dziennie przez okres czterech miesięcy na prawe przedramię oraz jedynie nośnik kremu z którym mieli postępować analogicznie nanosząc go na lewe przedramię.

Członkiniami zespołu były kobiety w wieku od 21 do 45 lat u których nie wykryto objawów ostrych lub chronicznych chorób w tym przypadłości dermatologicznych lub oftalmologicznych. Z testu wykluczono osoby mające oparzenia słoneczne, wysypkę, skaleczenia, ślady po oparzeniach itp.. Testowane miejsca były pozbawione dostrzegalnych brodawek, znamion, oparzeń słonecznych, przebarwień, ranek i aktywnych ubytków skórnych. W dniu rozpoczęcia testu poinformowano ochotniczki, aby unikały w trakcie prowadzonego doświadczenia nakładania na twarz płynów, kremów lub innych produktów. Przed rozpoczęciem pomiarów ochotniczki przebywały przez 30 min w kontrolowanych warunkach, gdzie temperatura wynosiła 20-22°C, a wilgotność 40%.

Miejscami na których przeprowadzano test były lewe i prawe przedramię. Na każdym z przedramion zaznaczono małą powierzchnię (3,5 cm x 7 cm), prowadząc oznaczenie w trzech miejscach wyznaczonego obszaru, mierzono podstawowy poziom utraty wody przez skórę (TEWL) (Pinnagoda i wsp., 1990) Contact Dermatitis 22: 164-178; Grove (1994) w The effects of aging in oral mucosa and skin, Ed. Squier & Hill, CRC Press, str 124-125).

Do przykrycia badanego obszaru użyto taśmy klejącej (Tuck), po mocnych uderzeniach w obu kierunkach taśmę zrywano (Elias (1993) J. Invest. Dermatol. 80:; 044s-049s). Łącznie otrzymano 5 pasków. Ponownie mierzono TEWL. Uzyskiwanie pasków po którym prowadzone były pomiary TEWL kontynuowano w grupach po 5 pasków. Zdejmowanie pasków przerywano gdy wartość TEWL osiągnęła 18 G/Mzgodz. TEWL mierzono ponownie po zakończeniu ostatniej sekwencji zdejmowania pasków. Liczba zdejmować pasków wymagana dla zniszczenia bariery jaką stanowi skóra była obliczana przez określenie maksymalnej liczby zdjętych, z każdego z przedramion, pasków do momentu gdy wartość TEWL osiągnęła 18 G/Mbgodz. lub więcej. Wynik analizowano przy pomocy testu koincydencji Z na istotność statystyczną różnic pomiędzy wynikami uzyskanymi w różnym czasie dla badanego obszaru i wartości wzorcowej.

Nanoszenie nośnika nie wydaje się mieć pozytywnego znaczenia bowiem jedynie 26% i 21% więcej pasków potrzebnych jest do zniszczenia skóry którą traktowano nośnikiem od38

187 989 powiednio przez 2 i 4 tygodnie. Zaobserwowano istotną poprawę (p<0,05) w stanie skóry jako bariery u ochotniczek które poddano przez 2 i 4 tygodnie działaniu płynnego ekstraktu z chrząstki, bowiem do zniszczenia bariery wymagane było zdjęcie o 60 i 55% więcej pasków (fig. 27).

Tym samym płynny ekstrakt z chrząstki potwierdził, że jest użytecznym dla wzmacniania bariery przeciw uszkodzeniom fizycznym jaką jest skóra.

Egzema:

Płynny ekstrakt z chrząstki badano w salonie piękności pod względem zdolności do zmniejszania wywołanych przez egzemę chorobowych zmian zapalnych. Kosmetyczka która nanosiła krem zawierający płynny ekstrakt od wielu lat miała na dłoniach objawy przewlekłej egzemy. Co interesujące, użycie kremu zawierającego płynny ekstrakt z chrząstki znacząco zmniejszyło na jej dłoniach objawy egzemy. Obecnie z powodzeniem stosuje ona krem zawierający płynny ekstrakt z chrząstki celem ochrony przed pojawieniem się egzemy.

Brodawki:

letnia kobieta obarczona brodawkami podeszwowatymi leczona była przez trzy lata dermatologicznie celem kontrolowania rozwoju brodawek, a co za tym idzie również bólu. W leczeniu stosowano ciekły azot, kwas salicylowy (40%), warunki beztlenowe, kwas azotowy, kwas siarkowy. Wyniki leczenia trwającego prawie trzy miesiące były prawie żadne. W marcu 1996 roku rozpoczęła nakładać na brodawki płynny ekstrakt z chrząstki (na 5 min) nanosząc go bezpośrednio na brodawki, w dwa tygodnie później zaobserwowano różową strefę tworzącej się wokół brodawek nowej epidermy; w kolejnym tygodniu brodawki odpadły. Tym samym uzyskany wynik sugeruje, że płynny ekstrakt z chrząstki może być pomocnym w leczeniu brodawek.

Odrzucanie przeszczepów: Stan zapalny jest jedną z głównych przyczyn obumierania przeszczepionych komórek. Co za tym idzie korzystnym dla przeszczepów tkanek, z uwagi na antyzapalne działanie jego składników, byłoby stosowanie płynnego ekstraktu z chrząstki rekina.

Stwardnienie rozsiane: Nieznana jest przyczyna stwardnienia rozsianego. Tkanka zachowuje się tak jakby podlegała procesowi immunopatologicznemu z pozanaczyniowym przesiąkaniem monocytów i brakiem jakichkolwiek histopatologicznych danych, które mogłyby świadczyć o wystąpieniu infekcji. Metaloproteiny wchodzące w skład matrix są istotnym czynnikiem zaangażowanym w odpowiedź w postaci stanu zapalnego. Ponieważ płynny ekstrakt z chrząstki jest efektywnym inhibitorem metaloprotein matrix może być użytecznym w leczeniu stwardnienia rozsianego.

Zwłóknienie: Współczesne poglądy głoszą, że zwłóknienie jest efektem normalnego procesu gojenia się ran który zostaje nieprawidłowo zakończony czego efektem jest zastąpienie normalnej tkanki blizną. Większość zwłóknowaceń będąca wtórną względem urazu, infekcji, stanu zapalnego lub innej nieznanej przyczyny, ma składnik genetyczny. Zazwyczaj nadprodukcji ulega TGF-β, który pobudza proliferację komórek fibroblastu, a w efekcie nadmierną produkcję kolagenu. Ponieważ odkładanie się kolagenu jest znakiem firmowym zwłóknienia przypuszczamy, że płynny ekstrakt z chrząstki, który opóźnia ziaminowanie tkanki może w dłuższym czasie być korzystnym dla hamowania reakcji zwłóknowacenia.

Zapalenia jelita: Etiologia zapaleń jelita jest nieznana, lecz w patogenezę choroby Crohn'a i owrzodzenia okrężnicy zaangażowane są nienormalne, jelitowe reakcje immunologiczne. Jednojądrowe komórki śluzowe wytwarzają inne niż normalnie przeciwciała, prolferują, ujawniają działanie cytotoksyczne oraz wytwarzają cytokiny (FGF, PDGF, EGF, TNF). Płynny ekstrakt z chrząstki ujawnia aktywność antyzapalną. a tym samym jego podawanie doustne może okazać się pomocnym w leczeniu stanów zapalnych jelita.

Choroby serca: Nieprawidłowe funkcjonowanie śródbłonka naczyń wieńcowego układu odpornościowego może powodować nienormalności włosowatych naczyń wieńcowych a w efekcie prawdopodobnie niedokrwienie mięśnia sercowego i bóle zamostkowe. Na poziomie komórkowym, nieprawidłowe funkcjonowanie śródbłonka jest stowarzyszone z ograniczoną produkcją tlenku azotu (NO), wytwarzanego przez śródbłonek czynnika rozluźniającego. Synteza NO pozwala układowi naczyniowemu utrzymać rozszerzone naczynia, a co za

187 989 tym idzie regulować ciśnienie naczyniowe. Braki w endogennej syntezie NO są powodem powstania nadciśnienia tętniczego, nadciśnienia płucnego i chorób serca. Z hodowli komórek śródbłonka uzyskaliśmy wstępne wyniki pokazujące, że płynny ekstrakt z chrząstki zwiększa wytwarzanie NO. Tym samym płynny ekstrakt poprzez NO mógłby wpływać korzystnie na stan zdrowia w przypadku niektórych chorób serca z powikłaniami wynikającymi z nadciśnienia w tętnicy płucnej.

Co więcej, płynny ekstrakt z chrząstki mógłby zmniejszać komplikacje wynikające z występujących w arteriosklerozie stanów zapalnych.

Twardzina skóry: Twardzina skóry (twarda skóra) jest niepospolitą chorobą znamienną zwiększoną ilością w skórze i innych organach trzewnych włóknistej tkanki łącznej. Zazwyczaj objawia się występowaniem w skórze nadmiernie skeranityzowanych obszarów. Nadmierna keratynizacja jest procesem komórkowym w trakcie którego keratocyty skóry w pełni różnicują się i gromadzą sztywne włókna keratyny. Taki stan skóry może prowadzić do ograniczenia ruchliwości jeśli dotknięte nim są jej szczególne obszary. Gdy do układu doświadczalnego, w którym pobudzono keratocyty do różnicowania doda się płynny ekstrakt z chrząstki nastąpi zahamowanie procesu różnicowania lub keratynizacji. Tak więc, płynny ekstrakt może być korzystnym dla stworzenia skórze warunków w których ograniczone będzie nadmierne gromadzenie w pełni zróżnicowanych keratocytów.

Zastosowania weterynaryjne: Stały i/lub płynny ekstrakt z chrząstki może być podawany zwierzętom w tych samych celach terapeutycznych lub kosmetycznych jak ma to miejsce w przypadku ludzi.

Zastosowania kosmetyczne i kompozycje:

Przedstawione powyżej testy i badania pokazały, że przedstawiany w wynalazku ekstrakt może znaleźć liczne zastosowania w medycynie. Pomiędzy rozmaitymi aktywnościami, które odzyskuje się w postaci ekstraktu, anty-angiogeniczna, anty-kolagenolityczna, anty-zapalna i efekt hamowania różnicowania zależnego od PKC są szczególnie pożądanymi w zastosowaniach kosmetycznych. Ponieważ przedstawiany w wynalazku ekstrakt z chrząstki wykazuje aktywność antagonistyczną względem zjawisk komórkowych zależnych od PKC i ponieważ w sztuce sugeruje się, że takie działanie wspomaga skórę w pełnionej przez nią funkcji bariery ochronnej, to zakres wynalazku obejmować będzie sposób udoskonalenia u ssaków barierowej aktywności skóry obejmujący etap nakładania na skórę kompozycji zawierającej ekstrakt z chrząstki. Inne lub podobne kompozycje mogą również być użyte dla skóry ssaków celem łagodzenia lub dla ograniczenia występujących stanów zapalnych. Stany zapalne mogą być wywołane przez liczne czynniki takie jak chemiczne substancje drażniące, otarcie i wystawienie skóry na promieniowanie ultrafioletowe. Rozważana jest również kompozycja i sposób postępowania dla zahamowania w skórze kolagenazy. Kolagenaza i stany zapalne skóry towarzyszą przedwczesnemu starzeniu (degradacja kolagenu) a co za tym idzie aktywności antagonistyczne odzyskiwane w ekstrakcie z chrząstki powinny również korzystne dla kompozycji oraz sposobu jej zastosowania dla ograniczenia, poprzez regulowanie ilości zmarszczek i atrofi skóry, przedwczesnego starzenia. Poza wiekiem, który przykładowo podano jako przyczynę zmarszczek i atrofi są nimi również wystawienie na działanie promieniowania ultrafioletowego i zanieczyszczeń środowiska. Stosowana miejscowo kompozycja może zawierać efektywną ilość tkanki z rekina, która to określana jest dla każdego specyficznego zastosowania. Ogólnie kompozycja może zawierać od około 0,1 do około 75% wagowych płynnego ekstraktu z chrząstki i od 25 do 99,9% wagowych nośnika. Kompozycja taka może zawierać anty-utleniacz taki jak czynnik zapobiegający powstawaniu w skórze nadtlenków tłuszczów. Przykładami takich anty-utleniaczy są tokoferol, pochodne tokoferolu, kwas askorbinowy, pochodne kwasu askorbinowego i BHT. Kompozycje mogą być uzupełnione przez czynniki anty-zapalne takie jak inhibitor fosfolipazy A2 lub zapobiegające podrażnieniom substancje pochodzenia roślinnego jak cola i wyciąg z zielonej herbaty. Stosowane miejscowo kompozycje mogą przybierać różne postaci takie jak roztwory, zawiesiny, płyny, nalewki, żele, kremy, spraye, emulsje, sztyfty, maści lub liposomów (co najmniej część liposomów zawiera płynny ekstrakt z chrząstki). Inne zastosowania kosmetyczne dotyczą ciemnych kręgów wokół oczu i pełnionej przez skórę funkcji bariery.

187 989

Pokazano, że sposób przedstawiony w wynalazku pozwala za wytworzenie ekstraktu o wielkiej wartości klinicznej z chrząstki. Wytwarzany tym nowym sposobem ekstrakt z chrząstki rekina zawiera liczne aktywności, które odzyskiwane są z chrząstki z dobrą wydajnością. Ekstrakt z chrząstki, w szczególności ekstrakt płynny i jego frakcje posiadają ogromne możliwości, bowiem są dla normalnych komórek nietoksyczne, a równocześnie są skuteczne w różnych typach chorób lub zaburzeń.

Dla wszystkich przewidywanych zastosowań (od kropli do oczu do leków dermatologicznych i przeciwncwctworcwych) przypuszcza się, że minimalne końcowe stężenie białka w całkowitym ekstrakcie będzie bardzo niskie (od około 0,01 mg/ml). Dolny zakres dawki zależy od przyswajania i możliwości penetracji aktywnych składzików do miejsca działania jak również od wydajności przyswajania tych składzików i wrażliwości lub odpowiedzi tkanki na inhibitory a^^ge^zy. Górzy zakres ostatecznego stężenia białek zawartych w mieszankach przeznaczonych dla pewnych zastosowań nie jest zzazy. Największe końcowe stężenia stosowane były przy podawaniu dcmIojsaowym i wynosiły około 9 mg/ml białka w mieszaninie i były stosowane w przypadku łuszczycy, a w przypadku podawania doustnego około 12 mg/ml w dawkach dziennych wynoszących dla przypadków leczenia nowotworów 7 ml dziezzie, a dla zapalenia stawów 21 ml.

W wyniku lifilizacji ekstrakt z chrząstki może utracić pewze swoje właściwości. Jakkolwiek dodanie, przed liofilizacją, znanych biegłym w sztuce, stabilizatorów lub czynników chroniących może spowodować zachowanie niestabilnych aktywności i umożliwić podawanie w postaci suchej wyższych dawek ekstraktu z chrząstki.

WYMAGANY MATERIAŁ:

- czynniki chłodzące

- narzędzia chirurgiczne

- topór rzeźniczy ' - torby plastikowe

- przemysłowy homogenizator (hcmogenizator o trzech prędkościach homogenizacji typ

Warizg kupiony w Fisher Saientific) _a

- system oczyszczania wody (odwrotna osmoza i filtracja przy 0,1 Em; Continental Water system, model PRE 2202, numer serii 91089, Modulab Bioscienae RQ/Pclishizg System kupiony z Fisher SaIentifia, Montreal, puebec). System tez dostarczał apyrogenną wodę 0 wysokiej jakości

- precyzyjna waga - Mettler, seria AE kupiona od Fisher Scientific

- wirówka Sorvall RC-285 kupiona z DuPozt, Kanada

- wirówka CEPA

- woreczek o wielości porów 1 pM

- autoklaw (automatyczny sterylizator parowy Sazyo, model MAC 350P)

- pojemniki Nalgeze o pojemności 500 ml, które sterylizowano przez 10 miz w temp 132°C i suszono przez 35 minut

- filtry stożkowe Whatmaz Reeve Azgel o porowatości 24 pm

- kolumna do yltrafiltraaji (o punkcie odcięcia: w zależności od zastosowania 500 kDa i 1 kDa; powierzchnia 25 stóp kwadratowych; przepływ 130 L/min; ciśnienie na wejściu: 30 psi; ciśnienie za wyjściu 5 psi; kupiony w Koch Membraze Systems Izc., Wilmingtoz, Ma, USA)

- sanitarna pompa perystalthazza (Monarch model ACE-S100, typA) zapewniająca przepływ z szybkością 130 L/miz

- lamizar dla sterylnej pracy (lamizar NuAire kupiony z Ingram & Bell)

- jałowe filtry Millipaak-60 o średnicy porów 0,22 pm

- jałowe przezroczyste lub bursztynowe butelki szklane

- koncentrator DC- 10 Amicon

- Rctofcr Biorad 170-2950

- filtry Amicoz SIOYIO SIOY30 i SIOY1OO o wartości odcięcia odpowiednio 10, 30 i 100 kDa

- FPLC Pharmacia 216007 (komputer Pharmacia 216014)

187 989

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Liofilizator Labconco 10273 A

Wynalazek został przedstawiony powyżej, jest zrozumiałym że osoba biegła w stanie techniki nie odchodząc od rozwiązań według wynalazku może wprowadzić pewne modyfikacje wymieniając niektóre elementy przez ich równoważniki, co doprowadzi do takich samych efektów. Te oczywiste odmiany są objęte niniejszym zgłoszeniem patentowym.

187 989

Fig.2

187 989

Fig. 4B

187 989

2000

Psi

Ε

X3

Q c?

§ 1000 'C u

e «υ kontrola traktowane chrząstką

Fig. 5

187 989

Fig. 7 zrogowaciałe otoczki/100 komórek

Fig. 8

187 989

Fig. 9

Ilość płynnego ekstraktu (pg) Fig. 10

187 989

2.50 π

Τ—'—r

uo	o
CM	o
CM	CM

tn	o	io	Q	tn	o	to	o
r-*	io	CM	O	r**	uO	CM	CJ
-—	•—		U	rS	O	d	o

(_£UJO) tUOMJOMOU oso}3fqo zaszczepienie komórek

187 989

2.50 η ¹—I—’—Γ

LO	o	lO
CM	o	θ'.
Osi	CM

1—,—,—ι—|—.—|—i—,—.—,—ι—Ε ο

O	LO	O	LO	o	LO	o
un	CM	o	o-	lO	CM	o
F			o	o	o	o

(_£uia) njOMjOMOU osofolcjo zaszczepienie komórek

187 989

Fig. 13Β

187 989

Fig. 15 (η=8) (η=8)

187 989

Fig 18A

187 989

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 45.00

187 989

Absorbancja (0.0. 280 nm) Absorbancja (q p 280 nm) Absorbancja (0.0. 280 nm)

187 989

Fig. 17A

Objętość przesączu (ml)

Fig. 17B

Fig. 17C

187 989

Fig.. 18C

187 989

Badane próbki

Fig. 19

Fig. 20A

187 989

Stężenie aminokwasów Stężenie aminokwasów

Fig. 20C

187 989

Fig. 21 A

Fig. 21B

187 989

Fig. 21C

Fig. 21D

187 989

Fig. 22 poziom podstawowy

Fig. 23

187 989

(% redukcji)

Fig. 24

187 989

Fig. 25B

187 989

z chrząstki z chrząstki z chrząstki

Fig. 26

Fig. 27

187 989

(|Ul/6rf)

MęSBMąOUIlUB 31U3?S)S

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina, zawierającego aktywne biologicznie, rozpuszczalne w wodzie składniki, występujące w chrząstce nie poddanej obróbce, znamienny tym, że chrząstkę rekina najpierw homogenizuje się w roztworze wodnym 0 pH w zakresie od 6 do 8, pozwalającym na zachowanie w stanie nienaruszonym składników aktywnych biologicznie, do uzyskania homogenatu zawierającego cząsteczki chrząstki o rozmiarze nie przekraczającym 500 pm, przy czym do homogenizacji wprowadza się co najmniej 1 litr roztworu wodnego na 1 kg chrząstki, następnie homogenat poddaje się wirowaniu i oddziela cząsteczki z nie oczyszczonego płynnego ekstraktu; po czym nie oczyszczony płynny ekstrakt poddaje się dalszemu rozdzielaniu do otrzymania końcowego płynnego ekstraktu zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kilodaltonów (kDa) (8,5-10'¹⁹g); i końcowy płynny ekstrakt poddaje się zatężaniu, za pomocą którego usuwa się przynajmniej część cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej od 0,1 kDa (l,7-10'²²g).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kolejne etapy sposobu prowadzi się w temperaturze od 0 do 20°C.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że utrzymuje się pH roztworu wodnego zbliżone do obojętnego.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że homogenizację prowadzi się w czasie od 15 minut do 24 godzin.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że homogenizację prowadzi się w czasie od 15 minut do 1 godziny.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zatężania dokonuje się przez filtrowanie płynnego ekstraktu, które prowadzi się na błonie o wartości odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącej 0,1 kDa (l,7-10'2²g).
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zatężania dokonuje się przez liofilizację płynnego ekstraktu.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że liofilizację prowadzi się w obecności stabilizatora lub czynnika ochronnego dodanego do płynnego ekstraktu w ilości wystarczającej do zwiększenia ochrony całości składników biologicznie aktywnych.
9. Sposób otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina, zawierającego rozpuszczalne w wodzie składniki anty-kolagenolityczne i anty-angiogeniczne, występujące w chrząstce nie poddanej obróbce, znamienny tym, że chrząstkę rekina najpierw homogenizuje się w roztworze wodnym o odczynie zbliżonym do obojętnego, w temperaturze od 0 do 20°C do uzyskania homogenatu zawierającego cząsteczki o rozmiarze nie przekraczającym 500 pm, przy czym do homogenizacji wprowadza się co najmniej 1 litr roztworu wodnego na 1 kg chrząstki, następnie homogenat poddaje się wirowaniu i oddziela się osad od nie oczyszczonego płynnego ekstraktu; po czym nie oczyszczony płynny ekstrakt poddaje się filtracji na kolumnie filtracyjnej do otrzymania płynnego ekstraktu zawierającego cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej mniejszej lub równej 500 kilodaltonów (kDa), a oczyszczony płynny ekstrakt poddaje się filtracji na błonie o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 0,1 kDa (1,7-10'²²g); i odzyskuje frakcję zawierającą cząsteczki o masie cząsteczkowej od 0 do 0,1 kDa (0 do 1,7-10' g), przy czym homogenizację prowadzi się w temperaturze od 0 do 20°C, a wirowanie i filtrowanie prowadzi się w temperaturze od 0 do 10°C.
10. Sposób otrzymywania płynnego ekstraktu z chrząstki rekina zawierającego rozpuszczalne w wodzie składniki anty-angiogeniczne, występujące w chrząstce nie poddanej obróbce, znamienny tym, że chrząstkę rekina najpierw homogenizuje się w roztworze wodnym o odczynie zbliżonym do obojętnego do uzyskania homogenatu zawierającego cząsteczki

187 989 o rozmiarze nie przekraczającym 500 pm, przy czym do homogenizacji wprowadza się co najmniej jeden litr roztworu wodnego na 1 kg chrząstki, następnie homogenat poddaje się wirowaniu i oddziela się osad od nie oczyszczonego płynnego ekstraktu; po czym poddaje się płynny ekstrakt dalszemu rozdziałowi przez filtrację i otrzymuje się płynny ekstrakt zawierający cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej nie przekraczającej 500 kilodaltonów (kDa) (8,5-10' ^r9g) i oczyszczony płynny ekstrakt zatęża się przez filtrację na błonie o wartości odcięcia 10 kDa (1,7-10'^2Og); następnie odzyskuje się frakcję zawierającą cząsteczki o masie cząsteczkowej wyższej niż 10 kDa (l,7-10'²0g) i frakcjonuje tą frakcję na jonowymiennej kolumnie chromatograficznej odzyskując frakcję ulegającą wymywaniu z kolumny przy stężeniu NaCl w zakresie od 0,8 do 1,0 M.; przy czym homogenizację prowadzi się w temperaturze od 0 do 20°C, a wirowanie, filtrowanie i zatężanie w temperaturze od 0 do 10°C.
11. Płynny ekstrakt z chrząstki rekina wytworzony sposobem określonym w zastrz. 1.
12. Liofilizowany ekstrakt z chrząstki rekina wytworzony sposobem określonym w zastrz. 7.
13. Liofilizowany ekstrakt z chrząstki rekina wytworzony sposobem określonym w zastrz. 8.
14. Płynny ekstrakt z chrząstki rekina wytworzony sposobem określonym w zastrz. 9.
15. Płynny ekstrakt z chrząstki rekina wytworzony sposobem określonym w zastrz. 10.
16. Kompozycja do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez jeden lub więcej czynników etiologicznych wybranych z grupy obejmującej proliferację nowotworu, angiogenezę, stany zapalne i kolagenolizę zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 1.
17. Kompozycja do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez jeden lub więcej czynników etiologicznych wybranych z grupy obejmującej proliferację nowotworu, angiogenezę, stany zapalne i kolagenolizę zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 7.
18. Kompozycja do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez jeden lub więcej czynników etiologicznych wybranych z grupy obejmującej proliferację nowotworu, angiogenezę, stany zapalne i kolagenolizę zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 8.
19. Kompozycja do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez etiologiczny czynnik kolagenolityczny, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 9.
20. Kompozycja do leczenia chorób lub stanów powodowanych przez etiologiczny czynnik angiogeniczny zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 10.
21. Kompozycja do podawania donaczyniowego, podskórnego, doocznego, doustnego, doodbytowego, podjęzykowego, domięśniowego, śródskómego lub przezskórnego zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 1.
22. Kompozycja do podawania donaczyniowego, podskórnego, doocznego, doustnego, doodbytowego, podjęzykowego, domięśniowego, śródskómego lub przezskórnego zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 7.
23. Kompozycja do podawania donaczyniowego, podskórnego, doocznego, doustnego, doodbytowego, podjęzykowego, domięśniowego, śródskómego lub przezskórnego zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera skuteczną ilość liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 8.

187 989
24. Kompozycja do stosowania miejscowego zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik zawiera ekstrakt z chrząstki rekina wytworzony sposobem określonym w zastrz. 10 dodany w ilości niezbędnej do uzyskania zawartości stałej masy w kompozycji wynoszącej od 1 do 50 mg/ml.
25. Kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu trądziku zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik leczniczy zawiera 2 mg suchej masy ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 1 w 1 ml kompozycji.
26. Kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu trądziku zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik leczniczy zawiera 2 mg suchej masy liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 7 w 1 ml kompozycji.
27. Kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu trądziku zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik leczniczy zawiera 2 mg suchej masy liofilizowanego ekstraktu chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 8 w 1 ml kompozycji.
28. Kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu łuszczycy zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik leczniczy zawiera 30-50 mg suchej masy ekstraktu chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 1 w 1 ml kompozycji.
29. Kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu łuszczycy zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik leczniczy zawiera 30-50 mg suchej masy liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 7 w 1 ml kompozycji.
30. Kompozycja do stosowania miejscowego w leczeniu łuszczycy zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako aktywny składnik leczniczy zawiera 30-50 mg liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 8 w 1 ml kompozycji.
31. Kompozycja do leczenia nowotworów zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, do podawania doustnego lub podjęzykowego, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera skuteczną ilość ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 1.
32. Kompozycja do leczenia nowotworów zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, do podawania doustnego lub podjęzykowego, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera skuteczna ilość liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 7.
33. Kompozycja do leczenia nowotworów zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik, do podawania doustnego lub podjęzykowego, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera skuteczną ilość liofilizowanego ekstraktu z chrząstki rekina wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 8.
34. Zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina otrzymanego sposobem określonym w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia stanów zapalnych.
35. Zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina otrzymanego sposobem określonym w zastrz. 7 do wytwarzania leku do leczenia stanów zapalnych.
36. Zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina otrzymanego sposobem określonym w zastrz. 1 do wytwarzania leku do hamowania angiogenezy.
37. Zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina otrzymanego sposobem określonym w zastrz. 7 do wytwarzania leku do hamowania angiogenezy.
38. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do udoskonalenia funkcjonowania skóry ssaków jako bariery.
39. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do udelikatnienia skóry ssaków.
40. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do ograniczenia stanu zapalnego skóry ssaków.

187 989
41. Zastosowanie leku określonego w zastrz. 38 do ograniczenia stanu zapalnego skóry ssaków, zwłaszcza wywołanego otarciem.
42. Zastosowanie leku określonego w zastrz. 38 do ograniczenia stanu zapalnego skóry ssaków, zwłaszcza wywołanego podrażnieniem skóry substancją chemiczną.
43. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do powstrzymywania aktywności kolagenowej skóry ssaków.
44. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do zmniejszania zmarszczek i atrofii skóry ssaków.
45. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 25 albo zastrz. 26, albo zastrz. 27 do wytwarzania leku do ograniczenia występowania trądziku na skórze ssaków.
46. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 28 albo zastrz. 29, albo zastrz. 30 do wytwarzania leku do leczenia łuszczycy występującej na skórze ssaków.
47. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do ograniczenia przedwczesnego starzenia się skóry ssaków.
48. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 16 albo zastrz. 17, albo zastrz. 18 do wytwarzania leku do leczenia chorób lub stanów obejmujących jeden lub więcej komponentów wybranych z grupy obejmującej proliferację nowotworów, angiogenezę, stany zapalne, kolagenolizę, zwłaszcza chorób lub stanów z grupy obejmującej nowotwory, grudkowo-łuskową chorobę skóry, zapalenie stawów, trądzik, naczyniaki, żylaki, ciemne kręgi wokół oczodołowe, hipertroficzne blizny, łysienie, egzemę, brodawki, stwardnienie rozsiane, zwłóknowacenie, stany zapalne jelita, stwardnienie więzadła, choroby związane ze zwężaniem się naczyń, infekcje rogówki, wtórne unaczynianie rogówki, jaskrę nowonaczyniową, opryszczkowe zapalenie rogówki, retinopatię cukrzycową i odrzucanie przeszczepów.
49. Zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina określonego w którymkolwiek z zastrz. 11 albo 12, albo 13 do wytwarzania leku do zahamowania proliferacji komórek śródbłonkowych.
50. Zastosowanie ekstraktu z chrząstki rekina określonego w którymkolwiek z zastrz. 11 albo 12, albo 13 do wytwarzania leku do hamowania różnicowania uaktywnionych keratocytów.