TW503108B - Extracts of shark cartilage having anti-collagenolytic, anti-inflammatory, anti-angiogenic and anti-tumoral activities; process of making, methods of using and compositions thereof - Google Patents

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503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - k A7 _ B7_五、發明説明（1 ) ?彥明夕背署 軟骨像一種非血管化的組織，且已被當作一含有抗血 管形成因子之有潛力的候選物來研究。其亦為一對腫瘤發 展有相當之抗性的組織。與軟骨有關的腫瘤一軟骨肉瘤一 是血管化最低的固態腫瘤。血管形成是一腫瘤的發展中最 重要要的因素之一。若腫瘤細胞能夠激發鄰近的血管網路 擴張以供應其營養需求，分立的固態腫瘤質塊即會出現。 因此，血管形成中所涉及之因子在腫瘤發展中之角色已被 研究，而作為控制腫瘤生長或産生腫廇退化作用的工具之 抗血管形成因子以及具有一血管形成抑制活性之藥物以亦 已被研發之。 _有人發現，小牛肩胛軟骨含有一種能夠抑制固蓋腫 瘤之血管化的物質（Langer , et al . , 1976)。由於其作為 一抗腫瘤劑之潛力，能供應較多軟骨之來源即被亟求之。 鯊魚是此種血管形成抑制劑之一有潛力的來源，因為 其内骨架偽完全由軟骨所構成（占鯊魚體重之Μ，而在小 牛則只有0.6¾)。鯊魚亦有一令人感興趣的特徵是，其發 展腫瘤之傾向很低。曾有人提出許多假說來解釋這傕[在鯊 魚體内發展腫瘤之低可能性。M a r c h a 1 ο n i s等人（19 9 0) _ 顯示能夠容易地攻撃任何攻撃性試劑之IgM抗體。McKinney 等人（1990)»顯示鯊魚具有能夠從贅生細胞分化出正常細 胞且能催毀贅生細胞的巨噬細胞。Rosen與WoodheaV( 1990) 會假設，軟骨魚類（鯊魚與魟魚所屬之一族）體内之少有腫 瘤可能是因為其組織之高離子強度（此相當於一高體溫）之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） 83. 3. !〇,〇〇〇 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 訂

503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7_五、發明説明（2 ) 故。在此等情況中，這些作者相信免疫条統發揮一接近百 分之百的免疫監視之作用。Moore等人（1993)曾發現鯊魚 會生成一種具有抗細菌與抗原生動物性質的胺基固醇。最 後，Lee 與 Langer (1993)以及 Folkman 與 Klagsbrun (1987) 曽顯示鯊魚會生成一種能抑制新血管化的物質。Lee與Langer (在引述之文獻中）已藉由在變性條件（胍萃取）下，從鯊魚 軟骨中萃取此物質而將之分離出。但是，此萃取之過程非 常長（41天），而可能生成含有已變性的因子之抽出物，且 活性組份之産率亦並不理想。雖然由小牛分離出之活性物 質具有一約為16 kDa的分子量，同組之研究者沒有對由鯊 魚所得之物質提供一準確之分子量。此物質僅被界定成具 有一高於3500 Da的分子量。Oikawa等人（1990)已應用相 同於如Lee與Unger所述之萃取方法，但是所用之時間較 短（2天而非41天）。Oikawa等人由鯊魚軟骨所分離出之抗 血管形成物質被限制為一具有一在1000至10,000 Da之範 圍内的分子量之分子。$(^4^81^(03? 4,473,551)曽描 述一種由粗製的粉末狀鯊魚軟骨所搆成之水抽出物，該抽 出物之高於100,000 Da的分離部分本身或合併以菊糖胺會 具有一抗發炎活性。此專利中沒有暗示此抽出物之一組份 會具有抗血管形成活性或抗腫瘤活性。Kuetner等人（USP 4,746,729)曽從牛軟骨中分離出多形核喃中性白血球（PMN) 彈性蛋白酶抑制子。此抑制子己從軟骨之一水性抽出物中 獲得，並由此獲得一具低於50,000 Da的分子量之分子。 在Sephacryl S-200上之分部分離提供了多個分離部分， (請先閎讀背®·之注意事填寫本頁) ~•裝·IL— 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（3) 其中那些具10-40 kDa者在被證實具有抗彈性蛋白酶活性 之後被匯合之。此活性組份具有一為9,5之等電點，且可 能具有一約為15,000 Da之分子量。Kuetner等人（USP 4, 042,457)亦顯示牛軟骨具有一具一低於50,000 Da的分子 量之組份，該組份具有一細胞增殖抑制活性而對内皮細胞 生長上無任何活性。Balsssa等人OJSP 4,822,607)曾獲得 一種位於一水性溶液内之軟骨抽出物，該抽出物具有一抗 腫瘤活性。但是本案發明人觀察到，一藉由重複Balsssa 之方法所獲得之油出物沒有抗血管形成活性。SPilburg等 人（USP 4,243,582)曽從牛軟骨中分離（胍萃取）出兩種具 有分子量為65 kDa以及Pi 3.8的糖蛋白，該等糖蛋白顯示 出抗胰蛋白酶活性以及一内皮細胞生長抑制活性。 小牛與鯊魚軟骨含有許多生物活性，例如前-發炎活 性，抗發炎活性，抗血管形成活性，溶菌酶活性，細胞生 長促進活性，對抗第I與IV型膠原酶、彈性蛋白酵素以及 其他蛋白酶（諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶與血纖維蛋白 溶酶）之抑制活性。但是，尚無人獲得一包含有多種有臨 床價值的活性之軟骨抽出物。 一般而言，鯊魚軟骨的抗血管形成組份係以兔子角膜 袋分析法或雞尿囊絨膜（CAM)分析法來作測試。迄今，整 値粉末軟骨直接於活體内，在腫瘤上、在被植入至裸鼠體 内之人類黑素瘤異種移檀物上（USP 5,075, 1 12)以及用CAM 試驗來測試其抗血管形成活性。即令軟骨抽出物已被認定 有一抗腫瘤活性，此作用通常被歸因於會剝奪腫瘤之血液 (請先閱讀背面之注意事#填寫本頁) 丨11

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 503108 A7 _B7_ 五、發明説明（4 ) 供應的該抗血管形成組份。至今，沒有證據顯示一鯊魚軟 骨對腫瘤細胞增殖具有一直接的作用。 已知有一些用以獲得鯊魚軟骨油出物與分離部分的方 法。若干個該等方法會生成一未經任何萃取之粉末粗製的 軟骨OJSP 5,075,112)。有其他方法使用諸如胍之變性劑 (USP 4,243,582)。有其他方法進行一藉由一酵素消化之 預處理，俾以去除任何圍繞著軟骨之肌肉結構、神經結搆 或血管結構，在該預處理步驟之後接而於有機溶劑内進行 脂肪之去除，並接而於一水相内萃取活性組份。（Balassa 等人，USP 3,478,146、USP 4,350,682、USP 4,656,136 與USP 4,822,607)。尚不清楚該預處理對有生物活性的軟 骨組·份之完整性的維持有何影響。若太過，一酵素消化可 能會將有活性的蛋白質組份水解之。例如，Balassa的方 法（USP 4,822,607)生成一種不具抗血管形成活性的液體 抽出物；此損失可能是該酵素降解作用之結果；Balassa 的方法不包含一種會進一步增濃一抽出物之活性組份的分 部分離步驟。其他的方法僅藉由消除不溶性物質而生成軟 骨之水性抽出物[位於水内（USP 4,473,551)或位於鹽溶液 内（USP 4,746,729)]。在後者之中，具特定的分子量之特 定分離部分被特別地保留以供進一步之研究及純化（參照 前述之討論）。 以上引述之方法有幾個缺點。他們可能會使某些有價 值的組份産生變性即便不是此情況，他們具有過於冗長 而不符實用之缺點。更甚者，該等冗長的方法不會有必要 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事 寫本頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.1〇,〇〇〇 503108 A7 B7 五、發明説明（5 ) 地生成足量之活性組份，而在所回收之組份中，有些根本 未被回收，或是回收量不足而不能顯示出可偵測的活性， 或者因為專注在特定的活性之獲得而使有些被棄之不顧。 血管形成不僅是在癌症的發展中有所涉及。許多會影 響（於括弧内顯示的）生理条統疾病或病狀係為血管形成_ 依賴性的，而以下即為實例：關節炎與粥樣硬化病斑（骨 與韌帶）、糖尿性視網糢病、新血管化青光眼、黃斑性退 化、眼疱疹、沙眼與角膜移植新血管化（眼）、牛皮癖、硬 皮病、红斑痤瘡、血管瘤與肥大性瘢痕形成（皮膚）、血管 黏著以及血管纖維瘤（血液条統）。因此，任何新且有效力 之抗血管形成、'因子〃，可在此等疾病以及癌症和其他血 管形成-依賴性疾病之治療上找到一個用途。更甚者，由 於許多上述之疾病與病狀亦具有一發炎組份，任何新且有 效力之抗發炎*因子"，可在此等疾病與病狀以及任何其 他發炎性疾病或病狀之治療上找到一個用途。再者，由於 諸如膠原酶之蛋白酶，因其膠原降解活性之故，在許多不 同的疾病與病狀（例如癌症與過早老化）中有所涉及，一新 且有效力之抗溶膠原、'因子"，可在具有一膠原溶解組份 的疾病與病狀狀之治療上找到一値用途。由於可能在各種 不同的疾病或病狀中遭遇到單獨的血管形成、發炎與蛋白 溶解或此等之組合，一種能夠拮抗至少所有的此等活性且 不會影響到正常身體功能之産物，將會具有一極大的治療 價值ϋ 發明夕説明 一 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先聞讀背面之注意事 丨-- 寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（6 ) 本發明提供一種用以生成軟骨抽出物之新方法，該軟 骨抽出物具有含有多樣性之治療上有價值的活性之優點。 在這些活性當中，抗血管形成活性、抗發炎活性、抗溶膠 原活性·、活體内的抗腫瘤增殖活性以及直接的活體外抗腫 瘤增殖活性已被確認存在於一鯊魚軟骨抽出物之令人滿意 '的濃度中。其他的活性有待特徵鑑定或確認。所有的活性 於鯊魚軟骨之一液體抽出物中獲得*而若干該等活性則於 該鯊魚軟骨之一固體抽出物中獲得且確證之。 本發明係有關一種用以獲得軟骨之一液體抽出物之新 方法，該軟骨之液體抽出物具有一實質部分的存在於完整 的軟骨中之具生物活性之可水解的組份，該方法包括下列 步驟： a) 在能與該等具生物活性的組份之完整性的保存相容 之狀況下*於一水性溶液内將軟骨均質化，直至該軟骨被 減縮成具低於或等於約500 μ之尺寸的穎粒體，形成一由 穎粒體與一含該等具生物活性的組份之粗製的液體抽出物 所構成之混合物； b) 將該均質物予以離心以將該等穎粒體與該粗製的液 體抽出物分開；以及 c) 進一步分離該粗製的液體抽出物，俾以獲得一含有 具低於或等於大約500 kDa之分子量的軟骨分子之 最終液體抽出物。 此新方法具有容易進行以及有效率之優點。本發明獲 得高産率之軟骨油出物，特別是得自於鯊魚軟骨之油出物 -10 - (請先閲讀背面之注意事 寫本頁 ir

本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503408 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 含有至少所有上述之生物活性。較佳地，其偽在低溫（大 約零至20°C )下，於非變性條件下（尤以在純水内為佳）， 在一近乎中性（大約5至8)之pH值下予以進行的，俥使具未 知的物理化學待徵之化合物的回收可能性增至最高。依據 本案方法，軟骨組份可於一低容積之溶液（低至ΙΙ/lkg軟 骨）内，以及於一短時間（短至10至20分鐘）的均質化之後 被萃取而出。為了回收一固體抽出物，使用相同的方法， 但丢棄上澄液而回收沉澱九並將之冷凍乾燥之。 本發明像有關軟骨抽出物，特別是源自於軟骨魚類物 種之抽出物，更特別是鯊魚軟骨之抽出物。該固體抽出物 已顯示出有活性。其可能含有膠原以及非水可溶的組份。 其亦可能含有一從總液體抽出物中所萃取出之殘餘活性。 該總液體油出物係為富含活性的。其可如此被使用之或被 濃縮之。一有利於生物活性之維持的濃縮步驟傺較為偏好 的。謹慎避免採用會破壤該等活性組份之方法（例如熱蒸 發）。使用於一具一為大約1 kDa的分子量截留值之膜上進 行的超過濾來濃縮本發明之液體抽出物。更佳是使用於一 具一為大約100 Da的分子量截留值之膜上進行的毫微過濾 來濃縮該液體抽出物之生物活性（抗血管形成活性、抗溶 謬原活性）。於是，一含有分子量在大約0.1至500 kDa之 間的分子之濃縮油出物被測試之。 本案液體抽出物（0至500 kDa)已被進一步地分部分離 之，俾以特歡鑑定其活性組份。已藉由不同的方法獲得多 種活性組份。其等當中有些被拿來在腫瘤細胞株上測試其 -11 - (請先閲讀背面之注意事mir填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 £7_ 五、發明説明（8 ) 抗腫瘤活性的分離部分已就其分子量與等電點被大犟地特 徵鑑定之。其他的分離部分已被指定以一活性，特別是抗 溶顧原活性或抗血管形成活性。此等分離部分尚待進行完 全的特徽鑑定。因此，於一總液體抽出物及其分離部分中 回收得有價值之活性，該液體抽出物及其分離部分可被有 利地使用之。一更易接受且增濃的抽出物現可被投藥，以 替代高量的粉末軟骨之投藥。 本發明亦偽有關任一種包含有作為一活性組份之一有 效量的上述油出物之治療或化粧品組成物。更多的興趣被 投注在用於皮慮學與化妝品學之配方上。此興趣傣源自於 該軟骨抽出物被觀察到的活性。在此方面，於角質細胞内 所觀察到的抗血管形成活性、溶膠原活性與抗發炎活性以 及由信號作用途徑（例如蛋白質激酶C)所調節的細胞分化 之拮抗作用，被認為是打開鯊魚軟骨在用於下列之組成物 與方法中之通路：發炎或剌激之減少、雛紋或皮膚萎縮之 調節、過早老化之延遲、痤瘡之減少、皮虜障壁功能之改 善、眼睛周圍黑眼圏之減輕、蛛網靜脈與腫脹之減少、疣 之退化以及皮慮緩解作用。該等方法落在本發明之範醻内 。次又，由於鯊魚軟骨液體油出物已成功地在癌症、鼸節 炎、牛皮癬與痤瘡之病例中被測試之，本發明之範圍亦包 括用於治療具有一或多値擇自於下列群中的搆成要素之疾 病或病狀：腫瘤增殖、血管形成、發炎以及膠原溶解。 發明：> _細說明 本發明將可由於隨文所附圖式中所示之持定實施例而 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4現格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 丨— 本頁

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 503108 A7 B7 五、發明説明（9 ) 被容易地暸解之，該等圖式偽要例示說明本發明而非用以 限制本發明之範圍： 圖式夕槪要説昍 第1圖顯示本案液體抽出物之特定的胺基酸組成。 第2圖顯示鯊魚軟骨（固體抽出物）在ZR75-1與MCF-7細 胞上之劑量-反應抑制活性。 第3圔例示在加有或位加兩種濃度的固體軟骨抽出物 之增高濃度的雌二醇之存在下，MCF-7細胞的數量之劑量-反應曲線。 第4a與b圖顯示大白鼠的乳腺腫瘤切片之一比較，該 等大白鼠被投藥以管飼水（A)或固體與液體軟骨抽出物之 一組合（B) ° 第5圖傺為一柱狀圖，該圔例示經軟骨治療的大白鼠 於其腫瘤内的血管化區域有50¾之降低。 第6圔顯示液體軟骨抽出物對於成纖維細胞之增殖沒 有作用。 第7圖顯示液體軟骨抽出物抑制HUVECs增殖之一劑量-反應曲線。 第8圖顯示液體軟骨抽出物抑制TPA-誘發的角質細胞 分化作用。 第9圔顯示液體軟骨抽出物抑制膠原酶活性之一劑量_ 反應曲線。 第10圔顯示液體軟骨油出物對於（離生體的）胚性血管 化試驗的抑制作用之一劑量-反應曲線。 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83· 3· 10,000 (請先閱讀背面之注意事_ —裝丨 寫本頁 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7 五、發明説明（10) 第11圖顯示不同劑量的液髏軟骨抽出物對於小白鼠體 内的腫瘤生長之抑制作用。 第12圖顯示液體軟骨抽出物對於之腹膜腔内投藥可顯 著地增進該産物抑制腫瘤生長之有效性。 第13圖顯示在非變性條件下，於Rotofor上被分開的 液體分離部分之電泳圖形，分子量標記顯示在左側，接而 為一値液體抽出物在分部分離之前的樣品，俥供與經分離 的分離部分作比較。 第14圖顯示本發明之總液體抽出物之一具有低於10, 000 Da的分子量之分離部分的一個HPLC移動圖形，該分離 部分已被濃縮並分成5個次-分離部分。 第15圔顯示以本發明之鯊魚軟骨液體抽出物的兩値分 離部分（DUP)(—値具有低於10,000 Da之分子量，另一個 具有高於10,000 Da之分子量）所獲得之EVT結果。 第16圖顯示3個不同的鯊魚軟骨抽出物之FPLC移動圔 形。於圖A中，DUP表示一依據本發明之軟骨液體抽出物。 於圖B與C中，BAL與0ΙΚ分別表示習知技藝（Balassa等人以 及〇ilava等人）之抽出物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第17圖顯示相同於第16圖中所界定的抽出物之一 HPLC 移動圔形。 第18圖顯示本發明之液體抽出物與習知技藝之一 CZE 比較。A = DUP ; B = BAL ; OOIK。 第19圖顯示本發明之液體抽出物與習知技藝之一 EVT 比較。 -14 - 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（η) 第20圔顯示本發明的胺基酸含量與習知技藝之一比較 Ο 第21圖為兩個罹患牛皮癬的病人，其中一値病人帶有 角化過度症（第21a與b圔），而另一個病人未帶有角化過度 症（第21c與d圔），當以一含有一有效量之濃縮液體軟骨抽 出物的局部組成物予以治療時（下圖），與其在未治療前之 初始病狀（上圖）相比較之下，顯示出顯著的病狀改善。 第22圖顯示以液體軟骨抽出物予以治療的人之面貌上 蛛網靜脈外觀之改善。 第23圖顯示以液體軟骨抽出物予以治療的人之眼睛周 遭的黑眼圏外觀之改善。 第24圖顯示以液體軟骨抽出物予以治療的人之腿上腫 脹的靜脈外觀之改善。 第25圖例示一患有痤瘡的病人，當以一含有一有效量 之液體軟骨抽出物的局部組成物予以治療時（下圖），相較 於其在未治療前之初始病狀（上圖），顯示出一顯著的病狀 改善。 第26圖顯示本案液體軟骨抽出物在人類皮膚上之抗發 炎潛力。 第27圔顯示以液體軟骨抽出物予以治療的人之皮膚的 障壁功能之改善。 在一待殊的實施例中，從健康的鯊魚黑剌角鯊（b 1 ack spiny dog fish)與普通剌角鯊（c〇M〇n spiny dog fish) 獲得軟骨。利用以乙醇處理的手術小刀與剪刀刮除掉肌肉 -15 一 (請先閲讀背面之注意事 丨丨- 寫本頁

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（1弓 與結締組織。接而將軟骨真空瑱充至塑膠袋内並於進一步 使用之前將之冷凍在-20°C下。在本案方法之實施例中’ 可使用任何來源之軟骨。本案發明人選擇鯊魚軟骨之原因 傺如發明背景乙節中所宣布的。據信從軟骨魚類（此類中 包含有如鯊魚與魟魚之動物物種）軟骨開始，可獲得幾近 相等的産物。若使用哺乳動物來源的軟骨，産物可能在性 質與濃度上會有不同。 在其萃取之前，在軟骨的製備上之任何變化可被使用 之，只要實質上不會影響到感興趣的産物（例如，一總液 體抽出物或其一特定的分離部分）之活性。某些活性組份 可能如&313333等人(1^? 4,822,607)所教示的，對蛋白水 解消化具有抗性*而將軟骨周遭的組織清除掉，而其他的 組份可能對該處理不具抗性。該等活性中對該預處理似乎 不具抗性之一者是抗血管形成活性（第19圔）。因此，若想 要生成一含有儘可能多的所有水可溶的且被指定各別的活 性之活性組份時，在萃取過程中之該一消化步驟應予以避 免或予以小心地監控，俥以防止過度的水解或蛋白水解。 敕骨油m物夕製備 使用新鮮乾淨的軟骨，將之解凍至4°C或冷凍。接而 令軟骨加上一適量之水[一相等數量（重量/容積）是一最小 容積，但將之提高至任何不會對有價值的組份的回收産率 帶來任何影響之數量]通經一經乙醇消毒過之碎肉機之孔 達數次（更待別的是3次）。從一實用的觀點來看，一低容 積是較為適宜的，因為其較不必要之高容積在操作上要方 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2H)X297公嫠） 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事$填寫本頁) 裝· 震填寫太 訂

503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（1弓 便得多。在實施上，已藉由逆向滲透以及多重過濾至0 · 1 um過濾器而將水純化。許多水性溶液（例如，含有鹽類者） 可被使用以代替水。當意料到數個水可溶的活性之回收時 ，在一近乎中性（5.0至8.0)之pH值以及非變性條件下操作 是較為適宜的，俾以避免某些軟骨活性組份之溶解或變性 。位於水性溶劑内之未知的蛋白質之行為是不可預知的； 有些可能在一酸性pH值下是較為適合的，而有些可能在一 鹼性pH值下是較為適合的。再者，有些蛋白質可能於溫和 的變性條件下是可萃取的，如果該變性不會不利地影響此 等蛋白質於水性溶液内之再-自然化。為澄清之故，任何 與有生物活性之水可溶的組份之維持傺為可相容的萃取條 件即落在本發明之範疇内。因此，將所有此等因素納入考 量，於純水中進行一用以萃取軟骨活性組份之方法已被顯 示是一明智的選擇，可以回收得具一極佳産率而其結構與 行為尚待界定之組份。 該軟骨/水攙合物接而藉由在大約4Ό下，於一廚房攪 拌機内以一最大速度之攪拌，在20分鐘内將之均質化；在 均質化期間中，該均質物之溫度上升至20 °C。當然地，« 拌之速度與水性溶液之容積可能會影響萃取之時間與産率 。因此，一合理範圍之均質化時間（被界定成低於500 μm 顆粒體）可為低至10分鐘以至高至24小時，較佳為介於10 至60分鐘。當未使用任何酵素抑制劑時，溫度.可予以維持 在大約10 °C以下，俾以避免任何由内生性酵素所致之活性 組份的降解。理想地，一近於〇 °C之溫度是為所求的◊由 一 17 - (請先閲讀背面之注意事

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本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐〉 83. 3.10,000 503108 A7 B7 五、發明説明（1今 於通常實驗是在一溫度被維持在介於4-10°C之冷房内進行 ，此溫度範圍在本案方法中被視為是可接受的。為澄清及 簡化之故，以下使用a大約4°C 〃此名詞來意指這値可接 受的溫度範圍。 若該攪拌器沒有充分地減小該等顆粒體之尺寸，可進 一步藉由將此均質物引至4°C下，於Polytron粉碎機内處 理10分鐘，而獲得此均質物之液化。任擇地，該攙合物可 僅在一更具功能的攪拌器-粉碎機内被均質化，這樣可簡 省該液化步驟所用之10分鐘。在完全的均質化步驟之末尾 ，殘餘的顆粒體之尺寸偽小於500 Mm。當然地，為得到第 一經研磨的軟骨而討論之相同可接受的時間與溫度亦同樣 適用。因此，可以避免在萃取之前要粉碎軟骨之需求。確 實地，在水性萃取之前，呈一粉末形式之軟骨的粉碎可能 相對地會使有價值之活性産生變性，待別是當該粉碎是於 一冷凍乾燥狀態或一熱乾燥狀態内予以進行時。 該均質物在大約4°C以及13,600xg下予以離心15分鐘 ，該步驟是將一上澄液與沉澱九快速且有效地分開之一方 式。此等參數之變化與調整傺屬熟於此項技藝人士所知之 範晴，這僅是依均質物之容積以及所用的儀器而定。 所形成之沉澱九予以冷凍乾燥歷時24至48小時。以下 將此第一分離部分界定為冷凍乾燥物或固體抽出物。 若有需要，上澄液可於一個24 Mm Whatman過濾器上 予以過濾之，俾以去除會影響一超過濾管柱之性能的顆粒 體。經過濾之物質接而在大約4Ό下，於一具有一約為500 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事 1M%-- 寫本頁) 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 503108 A7 B7 _ 五、發明説明（Η kDa的孔隙度之正切流動過濾管柱上予以超過濾，這容許 一包含有具一介於零至500 kDa的分子量之水可溶的分子 之第一粗製的滲透液可被獲得之。於0 · 22 Am過濾器上過 濾此粗製的滲透抽出物，並將之分裝至無菌瓶内以供進一 步之使用。此分離部分之後被稱之為粗製的滲透液或液體 抽出物。 已發展出一任擇的較高性能之離心程序，俾以獲得該 沉澱九與上澄液。在13, OOOxg下離心15分鐘接而在Whatman 過濾器上進行總體過濾之步驟，已被代之以在3000-4000xg 下，一種於一配備有一具一孔隙度為1 Mm的尼龍袋之CEPA 離心機内進行離心。一為25kg/25i之製品可以此方式於30 分鐘内予以離心，並獲得大約29公升的上澄液。所得水性 容積要比起始的水容積為高，這暗示軟骨本身之一部分的 水含量被收獲之。該冷凍乾燥物與該總液體抽出物可能具 有下列大約之組成，這大略地考慮了不同枇料之間所觀察 到之變化以及當使用不同的材料時所觀察到之變化： (請先閲讀背面之注意事'

-訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 固體油出物： 脂質 7.35¾1 蛋白質 46.2¾2 濕度 20.4% 鈉 4. 16 ing/g 鉀 2.64 mg/g 鈣 114 mg/g m 鋅及鐵微量 1.49 mg/g -19 - 83. 3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503108 A7 B7 五、發明説明（3 液體抽出物： 脂質 0.10-0 .20¾1 蛋白質 8-25 mg/nil2 乾重 8-25 a g/m 12 濕度 97199¾ 鈉 30-220 mg/100g 鉀 30-40 mg/lOOg 鈣 2.0 mg/lOOg 鎂 鋅及鐵微量 1.1 mg/lOOg (請先閱讀背面之注意事 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1與2:分別參照於A0AC公告（1984)第16.219-220以及2.005 中所發布之指引而予以測定的； 3:參照SAA程序而予以測定的。 蛋白質含量像藉由Kjedahl法予以測定的，該法實際 是測定有機氮（N)。有機氮藉由下列工式被轉換成等量之 蛋白質： 蛋白質含量（nig/ml) = UN X 6.25)/100 磺水化物無法被測得，可假設其存在於一或另一値抽 出物内但偽呈蛋白聚酶和/或黏多糖之形式。有可能這些 化合物被包含在所測得的濕度位準内。該冷凍乾燥物含有 一藉由0H-基團予以測定之不可預知的濕度位準。由於20¾ 的水含量接近於通常由軟骨中所得之磺水化物的百分比， 而一冷凍乾燥物之濕度應接近於0¾，此假說留待證實。 分析該液體軟骨抽出物之胺基酸含量。總胺基酸之平 均數量約為1.1 mg/inl，其中自由胺基酸為0.67 mg (61%) ，而蛋白質來源之胺基酸為0.44 mg (391)。各値胺基酸 之分佈示於第1圖中。亦測得顯著量之牛磺酸（未示出）。 -20 - 1¾^-- 寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（17) 該液體抽出物中所存在之主要胺基酸係為衍生自軟骨 的蛋白質與胜呔之代表。例如，離胺酸、甘胺酸、天門冬 胺酸與榖胺酸代表該液體抽出物之一大部分的胺基酸含量 ，且為膠原之N-末端胜肽的分子間交聯之主要組份（Hanson e t a 1 . , J. Bone & Min. Rn. 7_: 1251-1258, 1992) ° 應用USP XXI<61>標準，該液體油出物之微生物限制 已被控制之。 活袢分析： 固體抽出物： 活體外分析： 此等分析已於激素-依賴型癌細胞株MCF-7以及ZR75-1 (分別為ATCC 22-HTB以及1500-CRL)上進行之。 ZR75-1細朐： a. 基本RPMI培養基：未加酚紅之52g的RPMI 1640 (Sigma R8755)、17.875g 的 Hepes (自由酸；Sigma H0763)、 0.55g的丙酮酸銷（Sigma P5280)以及10g的nhc3，將之 混合在5公升的純水内，並以NaOH將pH值調至7.40。 若不馬上使用，此溶液必須防光俥以保存光敏性物質 。將此溶液過濾，分裝於50 0ml的無鋪瓶内，並儲存在4°C 下達一最長為3個月之時間。 b. 細胞培養維持培養基：添加有10¾ (v/v)FBS (胎牛血清） 、100 ϋ青黴素G/50 Mg鏈黴素硫酸鹽（Sigma P0906)/mi 培養基、2mM L-縠胺醯胺（Sigma G1517)和 InM E2 (/?-雌二醇，Sigma E8875)之基本RPMI培養基。 (請先閲讀背面之注意事 裝— 寫本頁 訂 .¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） 83. 3. 10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1弓 C·實驗培養基：添加有5% FBSA (被吸附在葡聚糖-活性磺 上的胎牛血清）、2mM L-榖胺醯胺、100 ϋ青黴素G/50 Mg 鏈黴素硫酸鹽（Sigma P0906)/ml培養基和50ng/ml胰島 素（Sigma)之基本RPMI培養基。對此培養基加入以增高 濃度之前述的冷凍乾燥物以及不同濃度的Ε2 (1(Γ 12至 10-SM)。 HCF-7細朐： a. 基本DME-F12培養基：依製造者之指引，於純水中重建 DME-F12培養基（未加有磺酸氫鹽及酚紅，Sigma)。對於 1公升而言，加入以1.2g的磺酸氫鈉，並以NaOH/HCl將 pH值調至7.40。將此溶液過濾，分裝於500ml的無菌瓶 内，並儲存在4°C下達一最長為3値月之時間。 b. 細胞培養維持培養基：添加有10% U/v)FBS(胎牛血清） 、100 U青黴素G/50 ug鐽黴素硫酸鹽（Sigma P0906)/ml 培養基、2mM L-榖胺醯胺（Sigma G1517)和InM E2之基 本RPMI培養基。 c. 實驗培養基··添加有5¾ FBSA(被吸附在《聚糖-活性磺 上的胎牛血清）、2mM L-穀胺_胺、100 II青黴素G/50 Mg 鏈黴素硫酸鹽（Sigma P0906)/m丨培養基和50ng/ial胰島 素（Sigma)之基本DME-F12培養基。如先前對ZR75-1高所 述的，對此培養基加入相同濃度之冷凍乾燥物以及E2。 d . FBSA之製備：胎牛血清被混合以1% (w/v)的活性碳（碳 脱色驗）°對該活性磺-血清溶液加入以一由®聚糖T 7 〇 所構成之溶液至達致一為〇 · 1¾ U/v)之濃度。在4°C下 -22 - (請先閲讀背面之注意事

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^格（210x297公* ) 83. 3. !〇,〇〇〇 503108 A7 ______B7_ 五、發明説明（工今 攪拌該混合物過夜。在4°C下以10,000xg離心30分鐘之 後，倒掉血清，再次與相同比例之活性與葡聚糖混合， 在室溫下攪拌3小時並再離心之。接而在56 °C下加熱20 分鐘而將血清熱-去活化，進行無菌過濾並將之分裝至 無菌的錐形Falcon試管内。 奮驗·朐惊蕃分析以及結罢： 令ZR75-1與MCF-7細胞在24-井或6-井之培養盤上生長 至趨近一為20,000細胞/并或150,000細胞/井之族群密;g ，並在有或無如上所製備的各種不同濃度之冷凍乾燥物的 存在下予以處理之。為逹此，將固體軟骨抽出物再散浮於 細胞培養基内並予以無鐘過濾之，藉此其水可溶的組份被 回收並測試之。所有實驗均予以進行3次重複。每隔兩天 抽出細胞培養基並置換以新鮮培養基。在37°C下於一含有 5%C02之恒定的濕度氣氛下，在一培育箱内培養細胞，相 對於第1値實驗、第2個實驗、第3個實驗與第4値實驗，分 別培育17天、7天、3天以及3天。細胞生長抑制之測定傺 藉由直接計數一井内之細胞或總DNA含量。 (請先閲讀背面之注意事'

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -23 - 83. 3.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） 503108 A7 B7 五、發明説明（ MCF-7 冷凍乾燥物之濃度 細胞抑制百分比 ZR75-1 玉 7 1 驗 窨 -50 lx li IX mmm /// g g g 0 0 0 3 6 5 3 6 14 2 1 6 2 3 0 3 9 0 6 8 窨， •個 2 第 15 0 -I- Tx IX 7 ffl ffl ffl :/// $ 0 0 0 ^ ffl ffl ffl 3.73 15.7 68.37 7 9 0 0 0 9 6 2 6 (請先閲讀背面之注意事_ 第

s S fflm loo iw 1510a. 4J 驗 一11天 mm3 o o o o 12 5 0 mg/rn 1 mg/m 1 mg/in 1 mg/m 1 8 6 4 5 8 6 5 4 4 2 5 4 9 9 3 6 9 9 ο o 5 5 5 8 10 5 8 9 9 5 7 9 9 — 寫本頁) 上述細胞生長之抑制百分比證實了本案固體軟骨抽出 物可以以一劑量-依賴的方式來抑制這兩種細胞株之細胞 生長。 第2圖顯示在3天的處理之後，50與100 mg/ml的本案 固體油出物明顯地於此等細胞株上激發出發育不全。 第3圖例示在10_12至1(Γ3Μ的雌二醇之存在下，經處 理的細胞反應有如接受此等激素速率而未被剌激的對照組 細胞。但是高於InM時，對照組被強烈地剌激，而在 的雌二醇之存在下，DNA之濃度趨近3.75 iig (相對於未加 有雌二醇之對照組内的0.69 ug)。第3圖顯示，在30與50 mg/m 1之存在下，經處理的細胞相關於雌二醇的親和力常 數（Km) (31 · 3nM與 174. OnM)，要比對照組之 Km值（11 · 7nM) ，分別高出3及16倍。這意諝當有固體軟骨抽出物存在時 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（2i〇X297公釐) 83. 3. !〇,〇〇〇 訂

經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明pi ) ，霈要有較高濃度的雌二醇，俾以達成此等細胞之相同的 生長。因此，此油出物消除最高的反應（其的90%抑制作用) 並提高經處理的細胞對於雌二醇之親和力常數。 活體肉分析： DMBA誘發的大白鼠乳瞧乳瘓塩酒 a·試驗条統之說明：令440天大的雌性Sprague-Dawley大 白鼠（購自於 Charles River Co*, St-Constant, Quebec) 適應於其環境歷時12天。於該時間，藉由管飼法投藥以20 1^0仙六/11〇1玉米油（〇}^力即9,1〇-二甲基-1,2-苯並蒽，購 自於Sigia Chemica丨Co.)。在此處理之後3個月，已發展 出一乳腺乳癌之240隻大白鼠被選出並分成兩組。第1組傺 由5個次組所構成。處理組之大白鼠於8週之期間内被給予 一配於3 ml的水内之具增高濃度的冷凍乾燥抽出物之日劑 量，而對照組之大白鼠則接受同容積之水。第2組傺由4個 次組所搆成。處理組之大白鼠於10週之期間内每天亦接受 一配於3 m 1的水内之冷凍乾燥抽出物的日劑量，並加有或 未加液釀抽出物，而對照組之大白鼠則接受同容積之水。 以3000 mg/kg/天之劑量的冷凍乾燥物以及3ml的液體抽出 物予以處理的第2組之大白鼠中，僅有1値次組亦接受該液 體抽出物之一較小劑量（約的蛋白質/] m 1的水）的腹膜 腔内注射。 在兩個實驗開始之時，大白鼠之體重為15卜1_75g，並 隨意地接受食物與水。第1M之大白鼠具有平均直徑為〇 . 9 cm的腫瘤，而第2組之大白鼠具有一倆平均直徑為〇.6cm的 -25 - (請先閲讀背面之注意事_

:寫本頁) U訂 本紙張又度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 83. 3.10,000 503108 A7 B7 五、發明説明（22 ) 腾瘤。 藉由管飼法投藥之軟 腫瘤生長抑制W分比（腫瘤 骨抽出物的每曰劑暈 首徑相對於對照Μ之減小） 筮ite奮驗：8裯：> 期間 安慰劑 0 500 mg/kg/天 2 1000 mg/kg/天 4 3000 mg/kg/天 14 5000 mg/kg/天 15 筮2値審驗：10碉：> 期間 安慰劑 0 3000 mg/kg/天 12 3000 mg/kg/天 18 + 3 m 1液體抽出物 3000 mg/kg/天 20 + 3m 1液體抽出物 + 1ml注射 (請先閲讀背面之注意事' 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此等結果證實本案冷凍乾燥物含有一為腸胃道所吸收 並降低腫瘤進展之活性組份。此抑制作用可能是對腫瘤細 胞之一種直接的作用或一種干擾腫瘤生長的抗血管形成調 節的作用。 本案液髏抽出物亦含有抑制活性，因為其投藥造成腫 瘤尺寸有一約為6%之頷外的減小。 此等結果亦暗示，本案冷凍乾燥物可能含有水不溶的 活性組份和/或其可能含有殘餘之水可溶的活性組份。因 此，在最後之可能性中，若仍能再改善産率的話，可考慮 該沉澱九可於一水性溶液内被再萃取之，俾以最高量地回 - 26 _ .適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 _B7__ 五、發明説明（23 ) 收水可溶的組份。 c.組織病理學··為評估本案固體軟骨抽出物之無毒性，藉 由杻斷頸部而殺死上述活體内實驗中所使用之動物，並取 出下列組織：肝、肺、腎、心臓、腦、肌肉以及乳腺。在 該等組織已於Bou in流體内固定了兩天之後，將脂肪去除 掉。於乙醇中脱水之後，將經固定的組織包ίί在石鱲内。 獲得切片並將之置放在玻片上，以蘇木精予以染色並在顯 徽鏡下觀察之。 組織病理撿查顯示，當僅使用最高量之固體油出物時 ，或當使用該固體抽出物並加上該液體抽出物時，看不出 存在有不利的作用（數據未示出）。 這暗示本案冷凍乾燥物與液體抽出物具有一選擇性腫 瘤尺寸抑制活性。 在乳腺乳癌中（參照第4a與b圔）*於接受固體與液體 軟骨抽出物的大白鼠之組中（第5圖）觀察到血管的區域之 一重要的減少（55!S)。 該腫瘤尺寸之減小可能是導因於其血管化之一重要的 降低，.一針對腫瘤細胞之直接的作用，或此二現象之一組 合。此等抽出物之抗血管形成活性己於上面詳述之。其直 接的發育不良作用亦於活體外在激素-依賴性細胞上觀察 到，其在活體内之作用留待確證。 因為上述之結果顯示本案液體抽出物在ZR75-1細胞上 具有一超過或高於固體軟骨抽出物之作用的增加作用*其 所含組份被進一步研究之。 -27 - (請先聞讀背面之注意寄 裝^— 寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. !〇,〇〇〇 州108 A7 B7 五、 發明説明（24 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 活體外分析： 膪瘤細朐抶： 數種腫瘤細胞株被培養在有液體油出物的存在之下， 俥以撿查是否存在有於固體抽出物（上一節）所觀察到之發 育不良活性。 概要地，將細胞盤種於96井之培養盤内，並於有或無 各種濃度的液體抽出物之存在下，令細胞各細胞類型所專 屬之培養基内生長（例如，MCF-7細胞要生長在上述之培養 基内）。在培養3至5天之後使用一 MTT分析法來測定細胞增 殖。該等腫瘤細胞為： CHANG: 腫瘤肝細胞 Hep-G2 ： 腫瘤肝細胞 A2780 ： 卵巢腺癌細胞 MCF-7 : (雌激素依賴性）乳腺癌細胞 MCF-7-ADR : 具亞德里亞黴素抗性之乳腺癌細胞 本案液體軟骨抽出物在所有的腫瘤細胞株上顯示出抗 增殖活性。最強的抑制作用，50¾與80¾，傺分別在MCF-7 與A2780細胞上，於一為8.5mg/ml(乾重的液體抽出物/ml 的培養基）之濃度下所獲得的。 非-冷凍乾燥以及冷凍乾燥的液體抽出物，在抑制腫 瘤細胞增殖之能力上偽相等有效的。這暗示該抑制因子不 為此濃縮程序所變性。 初級镔養的細朐： -28 - (請先閱讀背面之注意事β填寫本頁) •裝· 訂 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 83. 3. 10,000 503108 A7 B7 五、發明説明（25 ) a .源自於新血管青光眼之成纖維細胞：為評估對腫瘤細胞 的活性之專一性，在間充質起源的細胞，亦即人類TENON 成纖維細胞（HTFs，其為正常的成纖雒細胞）上測試於超過 濾後所獲得之滲透液。僅使用源自於兩個病人（一値患有 新血管青光眼，而另一痼患有原發性開放眼角青光眼）之 HTFs 〇 HTFs^次铉蕃斑維持： 各痼匯合的細胞培養物之繼代培養傺藉由清洗以及在 37°C 下以 0.5ml 的 0.05¾ 胰蛋白酶/0.5mM EDTA(Gibco 610-5300 AG)予以處理5-10分鐘以使細胞脱離而為之者。， 細胞的締合之進行係藉由將之研磨並轉移至25cm2的 T-培養瓶（其内加有額外的含有10%FBS之培養基）内。在趨 於匯合之後，將HTFs轉移至75cm2的，以及最後為180cm2 的T-培養瓶内。當獲得足夠之細胞時，一些細胞被應用於 下述之實驗，而其他的細胞則在同時間被冷凍起來以維持 供曰後實驗之用的相同繼代。 實驗程序··當趨於匯合之時，源自於一値病人而在兩個或 三値180cm2的T-培養瓶内生長之細胞藉由前述之方式被解 離之。在一短且低速的離心之後，以一値配備有一値256-Channelyzer 之 ZMI Coulter Counter 216013 予以計數之。 關於隨後所有的活體外實驗，大約5xl〇M固細胞被接 種至位在16min培養皿以及一個12-并培養盤内之1 ml的含 有1% FBS之DME/卩-12培養基内。在接種17小時之後，予以 加入lm 1的添加有1¾ FBS之新鮮同樣的培養基（絶對對照組） _ 29 - (請先聞讀背面之注意事 uf 裝 — · ▼漏填寫本頁 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (210X297公釐） 83. 3. 10,000 503108 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 _ _^_ B7_五、發明説明（26 ) 。視實驗設計（參照上述及下述）而定，該1¾ FBS培養基被 添加或未添加以GFs (生長因子）或本案液體軟骨抽出物， 且被無菌過濾之。在此日（g卩零日）某些細胞樣品亦被計數 ，侔以決定盤種之有效性（此應等於或大於95¾)。 在實驗開始之後48個小時，該等細胞被浸潤、解離並 再次計數之。細胞之數目偽以於該絶對對照組中所獲得的 細胞之百分比來表示之。 分別含有1¾或5% FBS之1絶對〃對照組，以及添加有 1% FBS和一各別的GF或液體軟骨抽出物之各個實驗組，係 由三値樣品所構成。 在這些實驗中，GFs、豬血小板-衍生的生長因子（pPDGF) 以及人類重組型鹼性成纖雒細胞生長因子（hr bFGF，由 Farmitalia Carlo Erba, Milan, Italy 送給 Ρ· Brazeau 博士之禮物）被添加至濃度分別為l〇-l〇〇ng/ml的1¾ PBS。 在實驗開始之後48小時，該等細胞被藉由胰蛋白酶-EDTA 予以分散，並於Coii Iter計數器上予以計數之。以下所示 之所有三次重複值等於每并計數的二十分之一。 結果：結果總結於第6圖中，HTFs傺得自於一為53歲的男 性之青光眼。雖然諸如PDGF與bFGF之生長因子在HTFs上顯 示出一種刺激活性（*Ρ<〇· 02，〃Ρ〈0· 01 ;以 Student-Fisher 試驗予以測定之），當此等細胞傺生長在有軟骨液體抽出 物（lKg/2L)之存在下時，沒有得到正或負之作用。這暗示 本案液體軟骨油出物對腫瘤細胞之發育不良作用不是普遍 的，而且對成纖維細胞之生長沒有影響。該相同的軟骨油 - 30 - (請先閲讀背面之注意事_ 裝-- 寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ：297公釐） 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7五、發明説明p ) 出物對於另一種類型的成纖維細胞HSF (人類皮膚成纖維細 胞）（數據未示出）亦不具作用。即令未被測試之，據信本 案固體抽出物對正常的細胞亦不會産生作用。 b.源自於人類臍靜脈之内皮細胞（HUVECs):依據Jaffe等 人（1973)所述，利用膠原酶-控制的消化來萃取HUVECs。 使用第四次繼代培養（在每次繼代培養用胰蛋白酶-EDTA來 處理）之前的純質内皮細胞。利用該等細胞併入二-乙醯基 LDL以及被第VI因子所標識之能力而予以分析之。 以一為2,500細胞/cm3之密度將内皮細胞盤種至被塗 覆以明膠之無菌培養皿内。在24小時期間内以完全培養基 [Medl99 +肝素（90拉8/!!11)+1^穀胺醯胺+磺酸氫鹽+FBS(10%) + ECGS(12〇Mg/mO]來培養細胞以確保細胞附著。而後，細 胞以PBS予以清洗3次，並依據實驗條件來添加細胞培養基 。最後的PBS清洗被視為是時間為零。 每値實驗予以進行3次重複並予以統計分析以供比較 。在24小時之後更換細胞培養基，並每隔兩天予以更換一 次。在168小時的培養之後，於各個細胞培養物培養基内 加入BrdU (最終濃度為ΙΟιπΜ)，並在37°C下予以纟台苜2小時 。而後，以短暫胰蛋白酶-EDTA消化使細胞脱離並將之轉 移至96井培養盤内以容許BrdU之ELISA測定。進行一未加 細胞之對照組以測定背景之基線位準。進行另一値對照組 之進行係藉由測定培育時間結束時的細胞培養培養基内之 DNA含量，侔以找出本案液體軟骨抽出物是否會影響細胞 的附著。 -31 - (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 裝· -訂

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1、發明説明ρ ) 細胞增殖亦以培養皿内所存在的DNA數量予以評估之 。每個實驗予以進行3次重複並予以統計分析以供比較。 每天更換培養基。在168小時的培養之後，使用Na-擰檬酸 鹽-SDS溶液來溶解細胞，並與Hoescht 33358—起培育之 。使用一螢光分光計在365nm下讀取細胞。 最後，培養皿内所存在的細胞之數量亦藉由測定酸性 磷酸酶而予以評估之。每値實驗予以進行3次重複並予以 統計分析以供比較。此酵素之活性與培養皿内内皮細胞之 數目（BrdU併入與Hoescht標識；數據未示出）顯示出一極 強的相關性°利用一得自於S i g m a C h e m i c a 1 C 〇 in p a n y之套 組（依據製造商之操作程序並加上某些修改）來測定酸性磷 酸酶。 這些結果證實本案液體軟骨抽出物對内皮細胞之一劑 量-依賴性抑制作用（第7圖）。所獲得之EDu約為90/U的液 體油出物（大約等於存在於液體抽出物内之1.5®g乾重）。 c.角質細胞：液體軟骨抽出物之測試像以角質細胞為之， 其中蛋白質激酶C (PKC)為三彿波醇乙酸酯（TPA)所活化， 而TP A偽為此細胞轉導途徑之一已知的同效拮抗劑。正常 的人類表皮角質細胞被建立成一種初級細胞培養物（Matsu i et a 1., J > Invest ： Dermatol .. 99：565-571, 1992) ° 該細胞培養物生長在一不含血清的限定培養基（KGM)内， 該限定培養基係配於一改良的MDCB153配方内並含有表皮 生長因子（10 n g / m 1)、胰島素（5 M g / m 1)、氫化可體松（〇 . 5 Mg/ml)以及牛腦下垂體抽出物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事 —裝-- \^^寫本頁) -訂 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（29 ) 令角質細胞生長至70¾之匯合，並於再飼以新鮮培養 基48小時之後，在未加額外的再饋飼下以200ng/ml TPA或 2m1/is1 DMS0予以處理之。細胞培養物培養基内被加入或 不加入各種不同濃度的液體軟骨抽出物。結果顯示，該液 體抽出物對角質細胞增殖不産生作用；其對TPA-誘發的增 殖抑制作用亦産生作用。但是，液體軟骨抽出物能夠抑制 TPA-誘發的角質細胞分化作用（第8圖）。TPA會使角質細胞 之分化程度提高5倍。液髏軟骨抽出物本身對角質化胞質 鞘形成不産生作用。但是，其存在會抑制TPA-誘發的角質 化胞質鞘形成達60¾。 最近之文獻顯示，PKC活化作用導引正常的角質細胞 會生成增高數量的間白素-δ (IL-δ)，一種發炎作用之調 節子（Chabot-Fletocher et al·, J > Invest. Dermatol. > 509-515, 1994)。更甚者，牛皮癬角質細胞生成非常 高量之IL-8，這進一步促成牛皮癣病瘢内之新生血管化。 (Nickoloff et al. (1994), Am. J. Pathol., 144 >820-828)。其他的生長因子以及整合素（integrins)亦有渉及 在内，且對於放寬可能被涉及的檫的分子族（IL-1、TNF等 等）而言可能是很重要的。本案發明人不知TPA-誘發作用 是否模擬牛皮癖角質細胞。若是如此，這些結果暗示了軟 骨可能於活體内對正常的角質細胞不産生作用，而可能對 牛皮癖（或經活化的）角質細胞産生作用。本案液體軟骨抽 出物對TPA-活化的角質細胞以及牛皮癖病瘢或角質細胞内 之IL-8的生成之抑制作用留待證實之。降低的IL-8位準和 -33 - (請先閲讀背面之注意事_ 裝 :寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公嫠） 83.3.10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明p〇 ) /或其他的生長因子是解釋本案抽出物之抗發炎作用與抗 血管形成作用之一令人感興趣的可能性。 _原隨分桥： a .分析法1 :此分析法像敘述於K n i g h t e t a 1 . (19 9 2), FEBS Let·, 2H 263-266。該方法使用一値模擬金屬蛋白 酶之活性位的螢光性胜肽基質（Mca-pro-leu_glu-leu-Dpa-ala-arg-NH2)。此基質在其一端具有一個螢光基團（Mca) 而在另一端具有一個螢光消光基團（Dpa)。在該完整的基 質中，該消光基團有效地遮掩住螢光。一旦該基質被酵素 切開，試管内之螢光即增高。 膠原酶的活化像敘述於Weingarten et al. (1985), Biochemistry. 24 : 6730。1/ttg被稀釋於 1〇〇m1的含有 50mM Tris-HCl、ΙΟιπΜ CaCl2之溶液（pH 7·5)内，並加入 U1 的 濃度為lOmg/ml之胰蛋白酶（配於IfflM HCL内），且在20°C下 予以培育15分鐘。該活化作用之終止偽藉由加入1〇Μ 1的大 豆胰蛋白酶抑制子（SETI，5mg/mU而為之。對各値黴比色 管加入下列： 25或50m1的抑制子”以水配成50μΠ ; 40m1 50Mm Tris-HC1/200mM HaCl/lOmM CaCl2, pH 7.5； 8m1的經活化的膠原酶最終為67ng);以及 2m1的基質（ImM的配於DMSO内之原液，最終為20mM)。 在入ex = 328nm與λ em = 393nm之下記錄螢光° :::·•該抑制子被界定為對照組物質（諸如EDTA、鄰二氮 雜菲）或液體軟骨抽出物。 :膠原酶被界定為人類第I型、第W型以及兩棲類蝌 蚪膠原酶；凝膠酶亦被使用之。 (請先聞讀背面之注意事Pf填寫本頁) 裝· 太 訂 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 B7 五、發明説明（31 ) b .分析法2 ··此分析法像敘述於We 1 gus e t a 1 . , JB£ , 256 : 95Π-9516, 1979。此方法使用SDS-PAGE來撿查第I型膠 原酶（MMP1)所為之切割。第I型膠原酶於天然的膠原分子 上産生一個單一的切割而生成兩個各為原來膠原的尺寸之 75¾與25¾的片段。在切割數小時之後，利用SDS-PAGE會將 産物與基質分開來監測反應。在使用孔瑪西藍（C 〇 in m a s s i e blue)(或銀染色法）來染色凝膠之後，藉由被視觀來評估 被切割與未被切割的膠原之比例。 將21 ng之經活化的膠原酶（參照分析法1)加入至5ms之 小牛皮膚膠原（Worthington) +/-抑制子内，其最終容積 為20m1。反應在35 °C下予以培育16小時，接而藉由加入含 有40mM的SDS-PAGE樣品來終止反應，將之煮沸並瑱載至一 値8¾丙烯醯胺凝膠上。 c.劑量-反應抑制作用：使用液體軟骨抽出物所得之結果 顯示出，以該二種分析法所測的膠原酶活性之一劑量-反 應抑制作用。EDsa傺使用30m 1的液體抽出物（或存在於30m 1 的液體抽出物内之0.51 mg乾重）所獲得者。 沃聽肉分析： 杯袢rfn管化試驗（EVT)： a .試驗条統之定義：雞胚的正常發育涉及了 一位在卵黃膜 内之外血管条統的形成，該血管条統將卵黃之養分帶至發 育中的胚胎。當被置於該卵黃膜上時，抗血管形成物質可 抑制發生在卵黃膜内的血管發育。為便於接近卵黃膜，雞 胚被移至一無菌的培養盒（培養皿:)内，並置於一値濕度與 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意Ϋ 裝— 寫本頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7五、發明説明F ) 溫度都受控制的培育箱内。於是胚胎可在此離體（ex ovo) 狀況發育數天。 令一份的液體軟骨抽出物與一甲基纖維素溶液混合， 並使之乾燥成薄圓盤。在此過程中液體軟骨抽出物内所存 在之本有的NaC 1會變濃並在每盤之數量超過25ms時會干擾 EVT。因此，將該液體抽出物脱鹽可能有需要；使用一低 於lOODa的膜薄截留之透析或電透析已被發現是可接受之 方法。 甲基纖維素形成一個本案液體抽出物可緩慢的擴散之 惰性基質。將含有本案液體抽出物之甲基纖維素圓盤置放 在卵黃膜之血管周界的外邊緣上，於該處血管形成仍為有 活力的。 含液體軟骨抽出物的圓盤對近端血管發育之作用要與 含水加上等莫耳數量的NaCl之圓盤所具之作用作比較。該. 等圓盤於離體生長過程之第零天或第1天時被置放在胚胎 之卵黃膜上；於該時，只有主要血管之起端會侵入卵黃。 接而將該等胚胎置於塔養條件内直至要進行血管化之評估 (大約24小時）。在相同胚胎的卵黃膜上要同時放上含水與 含液體抽出物之圓盤。該二種圓盤以一相對於胚苔之頭尾 軸的對稱方式予以安置之，俾以在比較鯊魚軟骨抽出物與 對照組時，個體間之差異能被減至最低。 b.抗血管形成活性：使用具不同濃度（37、75與15〇Mg)的 精蛋白（作為正對照組）或者液體軟骨抽出物來進行EVT。 在一天的培養之後，由一對研究人員以一平常的盲試驗方 -36 - (請先閱讀背面之注意事 丨_裝丨 寫本買 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 J^l〇8 A7 B7 五、 發明説明戶3 式來計分被覆蓋以該圓盤之區域内的血管化之程度。為方 便該等圓盤之置放，在該圓盤被放妥在卵黃膜上後即於其 外加套一黑色0-璟。有關EVT-試驗之評估計分傺依據1-2-3 計分：計分3表示，當與對立之水平四分體或一對照組胚 胎之配對的四分體相較時，顯示出正常的血管化；計分2 表示，血管侵入該圓盤所覆蓋之區域但是於中期時消失。 主要血管橫跨為該圓盤所覆蓋之區域但其軌道明顯地受到 影響，或是觀察到側分枝密度之一減少；計分1表示，未 觀察到在為該圓盤所覆蓋之區域内有血管，或其途徑以一 從該圓盤所覆蓋之區域逸脫出之方式被快速地偏離之。血 管不會超過該圓盤所覆蓋之區域而生長，除非其能從該區 域繞道而過並超出該區域。 在使用精蛋白（數據未示出）與本案液體軟骨抽出物時 ，獲得一劑量-反應抑制作用（第10圖）。EDsd偽使用17〇Mg 的乾燥液體抽出物（存在於該液體抽出物内之乾重）所獲得 者。使用Wilcoxon-制定的分級統計試驗來比較被放在相 同胚胎上的這兩種圓盤（水與軟骨抽出物）之間的差異之顯 著性。 小白鼠乳瞧腺癌椹型： a .試驗-条統之說明：以一小白鼠乳腺腺癌模型（異體移植 物）來測試本案液體軟骨抽出物之抗腫瘤潛力。此試驗-条 統包括將1x10s DA3細胞皮下接種至BALB/C小白鼠身上。 這些細胞源自於一種由7, 12-二甲基苯並M (DMBA)所誘發 之小白鼠乳腺腺癌。該模型偽由Dan ie 1 Medina (J. Natl. 37 - (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 五、 發明説明p4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 42：303-310, 1969； J. Natl. Cancer Inst^, 57:1185-1189, 1976)。被接種之細胞於活體内緩慢的生 長並形成一値具一低度的轉移預後之固態瘤。 在37°C與5IC〇2下，DA3細胞被雒持於添加有ΙπιΜ巯基 乙醇、1Μ Hepes緩衝液溶液、100mM丙酮酸鈉、200mM L-榖胺醯胺、ΙΟιπΜ非必要胺基酸、1M雒生素、10¾胎牛血清 、1¾青黴素-鏈黴素之RPMI 1640培養基内。關於腫瘤誘發 ’令細胞於完全培養基内生長至70¾的匯合，並接而使用 胰蛋白酶-EDTA溶液來收集細胞。之後將細胞離心，並以 磷酸鹽緩衝液清洗予以3次，再以一為1x10s細胞/0.1ml之 稀釋度令細胞散浮之。 被接種以DA3細胞的小白鼠（n = 15)每天接受口服投藥 之一鯊魚軟骨液體油出物或一安慰劑（生理鹽液）。在DA3 細胞接種後7天開始該等處理。試驗各種不同濃度之液體 抽出物。液體抽出物之投藥量以液體抽出物内所存在的該 重數量來表示。試驗物品之製備像如下所述：冷凍乾燥液 體抽出物並以水將之再散浮成具不同之濃度（每200W含有 0.2、1.5、3、10、以及20mg)。每天所投藥之最終劑量是 每公斤體重為10、75、150、500與lOOOmg。 b .抗腫瘤活性：結果顯示，腫瘤進展之最大抑制作用傜為 使用大約75ing/kg的液體油出物之投藥而獲得者（第11圔） 。令人感興趣地，較高之劑量效果較差。這暗示本案液體 抽出物含有可抑制腫瘤進展之物質以及其他會抑制該腫瘤 抑制子之物質。此現象在有關生物性藥物上_被報導過。 38 - (請先閱讀背面之注意事- —U裝！ 寫本頁) -訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 __B7_ 五、發明説明（35 ) 最後，本案液體油出物之腹膜腔内投藥顯著地減低用 於抑制腫瘤生長之最大有效劑量（75X)(第12圖）。 c. 毒性··對於所有的處理組，沒有發生體重損失或液體抽 出物-相關的死亡。於處理期内在小白鼠之每日撿查中沒 有觀察到症狀或行為變化。在處理終止時，犧牲小白鼠並 由一符合資格的病理學家來分析所有器官之大體形態；結 果是未撿測到異常現象。血液分析未顯示出異常之徽兆。 d. 組織病理學：腫瘤組織病理學未顯示出源自於安慰劑-或液體油出物處理的小白鼠之腫瘤之間有任何實體的變化 。腫瘤存活性之程度在所有組別中均相當的高。各種器官 (肺、肝、腎、胰臟、胃、小腸、卵巢、乳房、腦及心臟） 之分析未顯示出可被認為是與本案液體抽出物有關之待定 改變。 小向鼠富渦输件糍型（CHS): a.試驗-条統之說明：二硝氣苯（DNFB)是一有力的皮膚剌 激劑，其會於BALB/C小白鼠體内誘發一強烈的發炎反應。 在第零天時，10隻小白鼠藉由以DNFB來塗覆其腹部而使之 産生過敏。在致敏化之後第5天時*藉由以5m 1的DNFB來塗 覆小白鼠之右耳而令小白鼠被挑戰之。測定在數次之後暴 露時耳朵腫脹程度以作為組織剌激之一指數。 測試本案液體軟骨抽出物以撿定其是否可降低小白鼠 對DNFB之發炎反應。在致敏之前的連續3天以及隨後之4天 ，以口服投藥載劑本身（0.2ml之一生理鹽液，5隻小白鼠) 或本案液體油出物（0.2ιη 1之含有20mg/ml乾重的液體抽出 -39 - (請先聞讀背面之注意事Ϊ填寫本頁) 裝· 填寫太 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7 五、發明説明（36 ) 物，5隻小白鼠）。 b.抗高過敏性活性：在耳朵挑戰之後1天，經載劑本身處 理過之小白鼠顯示出耳朵腫脹至8.2mm厚。令人感興趣地 ，經液體軟骨抽出物處理過之小白鼠僅顯示出2.8ππη之耳 朵腫脹。此等數據之統計顯著性具有一 Ρ值<〇.〇〇1。此等 結果證實液體軟骨抽出物傺為一有力的發炎抑制劑。 含有活袢分罕 > 液聽分離部分^耩煜 活鵲外分析： 腫瘤細胞妷： a .試驗-条統之製備：如遣所述來收獲及處理鯊魚軟骨。 在離心之後，棄置沉澱九，並如前述在〇.22μ過濾器上將 上澄液超過濾成無菌過濾液。如此所得之液體抽出物藉由 各種不同的方法被進一步分部分離之。腫瘤細胞株之生長 傺如前所述而為之。 b.FPLC條件：管柱：Hiload 26fflin X 60ffim Sephacryl S-300 。FPLC条統：得自於Pharmacia。在填放至管柱上之前， 所有的樣品先於0.22mib過濾器上過濾之。洗提緩衝液傺為 經過濾及脫氣15分鐘之磷酸鹽緩衝生理鹽液（PBS)。瑱放 樣品之容積通常偽為3.2ml (可高至13ml)。流速為1ml/mi η 。以10ml之量來收集分離部分。被洗提出之化合物偽以其 U.V.吸收度（280nni)予以偵測之。藉由使用得自於Sigma之 M W - G F -10 0 0校正套組而獲得一 te正圔，該校正樣品具有相 1 同於要分析的填放樣品之容積（3.2ml)。一樣品之洗提容 ' 積傺從該校正套組之化合物的分子量相對於其扣除掉管柱 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事^填寫本買) 裝· 訂 ^^108 ^^108 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明F ) 空隙容積之洗提容積所繪圖行而予以推衍出。該空隙容積 之獲得偽藉由注入葡聚糖藍（M.W.=2,000,000)。 該等分離部分像藉由其對ZR75-1細胞之活性而予以測 試之。感興趣之分離部分被鑑定出且其持擻藉由進一步之 研究而被確證之（如下文）。 在Rotofor (Biorad 170-2950,參照以下之等電聚焦 作用）以及具不同截留值之Am i con過濾器上進行滲透液之 活性組份的額外特徽鑑定，俾以獲得具有介於10-30kDa、 30-lOOkDa以及超過lOOkDa之分子量的分離部分。 c.等電聚焦作用之條件：在4°C下使用一薄膜Spectra pore tf7 MWCO 3500 kDa (Spectrum 132110)，令一鯊魚軟骨液 體抽出物之製品（46πι 1的IKg/L滲透液）對4公升之含有5¾甘 油之純水進行透析過夜。該經透析過.之溶液被混合以2.75 ml 的兩性電解質（Pharmacia #80-1125-87)(ρΗ 3.5-10.0) 與 0.5g 的 CHAPS (Sigma C3023, 3-[(3_ 膽醯胺基丙基）-二 甲銨基]-1-丙烷-磺酸酯。以純水將容積調成55ml。將該 溶液瑱放至1?(^()1*(^上。等電聚焦作用之進行傜在4°(：，使 用一為12瓦特之功率（3000xi電源Biorad 165-0554)，有 恆定之水循環以確保溫度之維持。在分離之開始時，電壓 為380伏特而電流量為31mA。當電流量變穩定（在14mA下） 時，讀得電壓值為870伏特。停止等電聚焦作用，並收集 得20個分離部分。 -41 - (請先閲讀背面之注意事β填寫本頁) 裝- ¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 83. 3.10,000 503t08 A7 B7 五、發明説明P8 分離部分 容積（ml)

pH

2345678901234567890 1Χ 1χ 1± 11 ii 11 1χ ii 1—- ii CNJ 71232151453445354916 32222222222222222233 61813300160944224081 50136035820269369387 34444555567777888990 (請先閱讀背面之注意事1填寫本頁) 裝· 填寫太 此等蛋白質之待徵鑑定係藉由評估其在一電泳凝膠上 之分子量（Laemml i, U· K. H a t, u.,r_£, ^27_：680, 1970)而予以 進行之ϋ (參照Ueinin 1 i)以一瑱放緩衝液將此等分離部分作4倍 稀釋，並將各為8iu 1的整份引至處於非還原條件的電泳。 第13圖顯示出各個分離部分以及在等電聚焦作用之前的物 質之電泳圖形。 在一無鋪通風櫥内，藉由令所有的分離部分通經一具 一孔隙度為0 · 22ϋΐη之無菌的M i 11 ipack-60過濾器而將之無 菌裝瓶。 d ·對腫瘤細胞之抑制活性：該等分離部分之蛋白質含量藉 由Lowry劑量法予以評估之於ZR75-1細胞上，以配於細 胞培養基内不同之濃度來測試具lKg/2L (以每公升的滲透 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八顿養（210X297公釐） 83. 3.10,000 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7__五、發明説明p ) 液所含粗製的軟骨重量來表示）之溶液。結果總結如下： 在Rotof (^分離部分（該滲透液以蒸發予以濃縮之）上所進 行的第1値試驗，蛋白質特徽鑑定： 被鑑定的 等電點 平均值 分子量 分離部分 7-8-9.10 7-8-9 12-13-14 13 -14 至至至至 0 0 9 4 3 3 2 6 5 5 7 7 6 6 4 4 2 2 9 9 D D D D k k k k 1X 1X 1x 應 . I 參 //// ++ ++ 9 0 8 5 2 6 4 3 8 8 2 0 7 6 6 7 (請先閱讀背面之注意事 在FPLC分離部分（該滲透液以蒸發予以濃縮之）上進行的第 2値試驗：

分離部分 分子量 6與7 0.1 - 2.5 kDA 對Am icon分子量過濾器上所獲得之lOOiil分離部分所進行 的第3痼試驗： 被測試 分子量 ZR75-1細胞培養 的濃度 物之抑制作用

訂 .¾ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 11 11 11 n mmmln //// g g g g β Μ Μ M o o o o o o o o IX 1i ii Ax MW>100kDa 30kDa<MW<100kDa 10kDa<MW<30kDa MW<10kDa 4 4 7 9 6 12 4 111 FPLC分離部分6與7含有具一極低的分子量（0.1至2.5 kDa)之活性組份。 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 _B7_ 五、發明説明（40 ) 該等分離部分之發育不全作用比在冷凍乾燥物所觀察 到者要高出30,000倍之多。 e.該洗提液之活性組份的進一步特徵鑑定：該等活性分離 部分（以ZR75-1細胞予以測試過者）以下列分子量範圍被收 集之，此偽藉由使用相同的滲透液（lkg/L)，以另一種型 式之純化方法，應用如上述之FPLC與rotofor程序，在一 値10mm(直徑）x30cm(長度）的Superose-12管柱上進行者。 選擇一為lml/分鐘之流速。收集45個lml之分離部分。 (請先閲讀背面之注意事 裝-- 填寫本頁) 分離部分20-21 分離部分内之活性相應於一具 70至120 kDa之分子量 分離部分22 分離部分内之活性相應於一具 60至70 kDa之分子量 分離部分29-32 分離部分内之活性相應於一具 35至46 kDa之分子量 分離部分34-35 分離部分内之活性相應於一具 29 kDa之分子量 分離部分38-39 分離部分内之活性相應於一具 0至2.5 kDa之分子量 -訂 麵原_活件： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 a.HPLC色層分析：令一値980ial的液體抽出物（DUP)樣品通 經一個位於一正切流動超過濾單元（PELLIC0H, Μί 1 1 ipore) 之1 OkDa截留膜而予以過濾之。該單元首先以1公升的水予 以浸潤之。最終産率為480ml的大於lOkDa之分離部分以及 1.8公升的小於10kDa之分離部分。該小於10kDa之分離部分 藉由冷指（cold-f inger)蒸發被濃縮成180ml K10-10X)。 一 44 一 83. 3.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503108 A7 B7 ----------------— 五、發明説明（41 ) 將 8値 100d 整份之〈10-10X 瑱放至 CDC-S Hexyl, 5μπι HPLC 管柱（25父0.94<：111)上，並首先以100%}120於41111/111丨《下予以 洗提之；接而以100¾ MeOH於4inl/inifi下予以洗提之。收集 相應於0D 2 i 4波峰之分離部分。 收集得5個分離部分（第14圖）：Frl、Fr2、Fr3、Fr4 以及Fr5。前3個分離部分含有至少一主要的波峰。 b .抗溶膠原活性：結果顯示Fr 1傺為會抑制膠原_之最具 活性的分離部分；所有其他的分離部分存在有一較低的活 性位準；分析1參照第14圖；分析2參照下表： C请先聞讀背面之注意事 裝丨I :寫本頁) 樣品 膠原染色 膠原片段染色 只有膠原（C) + + + + - C + Enz + + + + C+Enz+EDTA + + + + - C+Enz+DUP + + + OEnz + Frl + + + + - C+Enz+Fr2 + + + OEnz + Fr3 + + + + C+Enz+Fr4 + + + + C+Enz+Fr5 + + + + C+Enz+>10kDa + + + + -訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 EDTA抑制膠原酶。該總液體抽出物DUP顯示出一種低 抗溶膠原活性。分離部分1至5傺為有活性昀；最具活性的 是分離部分1。具一大於lOkDa分子量的分離部分顯示出無 明顯的抑制活性。 c .抗溶膠原因子之進一步界定：使用一値正切流動過滹裝 置以及一丨固lOkDa過濾器（PELLICON, Mi 1丨ipore)將本案液 體軟骨抽出物予以分部分離之。該過濾液（<l〇kDa的分離 一 45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 83:3 10,000 503108 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（42 ) 部分）被發現含有所有的抗溶膠原活性，且如下述被進一 步地特徵鑑定之：藉由使用一個100Da表稱分子量截留膜 (Spectra/Por_CE (纖維素酯）MWC0:100Da, Cattfl31015)來 進一步透析該〈lOkDa的分離部分。於過濾液(<10kDa的分 離部分）中回收得抗溶膠原活性。將該< 1 OkDa的分離部分 施加至一個 C8逆相管柱（EM Science Linchroprep — Rp-8, Cattf9242)，並以H2〇、繼而為60¾甲醇最後為100¾甲醇予 以洗提之。主要的抗溶膠原活性於H2〇洗提液中被回收之 ，而有20¾的活性係以60%甲醇予以洗提出。 總括而論，該抽出物内之抗溶膠原活性傺歸因於一種 低分子量之化合物，該化合物可透析或通經一値S p e c t r a / Por_CE(纖維素酯）MWC0:100Da薄膜，當配於水内被施加時 ，且不會吸附至一値C8逆相管柱基質（Linchroprepj。 沃體肉分柝： 怀袢ffn管仆試驗（RVT): 藉由使用一個正切流動過濾裝置以及一値lOkDa過濾 器（PELL ICON, Mil lipore)將本案液體軟骨抽出物予以分 部分離之。該液體軟骨抽出物之低於以及高於1 0 k D a的分 離部分以相同之條件與以測試之。在抑制新血管化上，其 等被顯示是同樣有效的（第1 5圖）。這與抗溶膠原活性成對 比，在超過lOkDa的分離部分不存在有抗溶膠原活性。 a. <10 kDa的分離部分：此分離部分内之抗血管形成因子的 行為有如上述純化步驟中之抗溶膠原因子。 b. MOkDa的分離部分：在一個凝膠過濾層析管柱（Sephaery 1 一 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 訂 I線· 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（43 ) S-300, Pharmacia)上層析此分離部分。於SDS-PAGE上進 行一個具有抗血管形成活性之分離部分（S300-4)之特徵鑑 定。該分離部分（S300-4)具有，相較於Biorad SDS-PAGE 標記蛋白，分子量在大約8-18kDa之間的數種蛋白質帶。 藉由陰離子交換層析（Mo no-Q, Pharmacia)，以25 niM Tr is-HC1 (pH 8.0)以及0至1.0Μ NaCl梯度來進一步分部分離此 分離部分。一値在0.8-1. 0M HaCl之間洗提出的分離部分 具有高抗血管形成活性。在0.3-0· 6M NaCl以及0.08-0.2M NaC 1之間洗提出的分離部分具有較低得多的抗血管形成活

ijJL 性0 海習知産物夕hh較 習知持Μ 界宏 雖然本案發明人不是第一個發現軟骨抽出物之一重大 的重要性，本案發明人已證實，在與兩種載述於習知技術 或可由習知技術衍生而得的産物，亦即依據Balassa (USP 4,822,607)與Oikawa等人（如前引述的）之方法所製得之産 物作並排的比較試驗後，藉由本案方法製備的鯊魚軟骨液 體抽出物顯示出有獨特的待徽。 0 i ka wa等人描述一種可獲得兩値主要分離部分之方法 ，其中一者具有分子量在1-1 〇kDa之間的分子，而另一者 具有高於lOkDa的分子量之分子。他們只將抗血管形成活 性指定給第一個分離部分，而另一者於CAM試驗中是不具 抗血管形成活性者。為與〇 i kawa之産物做適當的比較，本 案發明人將本案之總液體抽出物分部分離成兩個相應的分 一 47 - 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事^填寫本頁) 裝· 訂 叫丄08 A7 B7 五、 發明説明？4 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 離部分，並保留具有0-1 〇kDa之分離部分。 由於Balassa傺描述一種用以萃取一總液體抽出物之 方法，本案發明人拿本案之總液體軟骨抽出物（〇-500kDa) 與重複Ba lassa之方法並以鯊魚軟骨取代小牛軟骨以作為 起始物質所製得的産物作比較。 本案發明人假設，如果Balassa與Oikawa係敘述一種 相等於本案之方法，在FPLC、HPLC以及CZE上所獲得之圔 形即應大體上會重疊，而且相同的抗血管形成活性應會於 EVT上顯示出。在FPLCHPLC色層分析之前，所有的樣品被 做成具一最終濃度為12Mg/Ml (乾重/容積溶液）。Oikawa之 産物在色層分析之前被離心及過濾之，因為其含有不溶性 物質。 樣品的製備 由三種方法萃取出之鯊魚軟骨樣品（每一容積溶液含有經 估計之乾重）被標識如下： 1) DUP傺為本發明之製品，其被分離部分成含有介於 0-500 kDa之分子（12Mg/Ml); 2) BAL傺為依據Balassa等人之處方的製品（12Mg/iil); 3) OIK傺為依據Oikawa等人之分離部分3的製品。在任 何分析之前，所有的樣品被做成具一最終濃度為12 Mg/Ml (乾重/容積溶液）。該0ΙΚ樣品具有一高量之 不溶性物質，該物質可藉由在1 3, 200RPM下離心或 經由一個0.22μιπ薄膜來過濾而被沉澱成九。在FPLC 、HPLC以及CZE (第16、17、18圖）之前藉由過濾移 除不溶性物質是必要的。 FPLChh m 修件 u p e r r 〇 s e 1 2 ( P h a r m a c i a );凝膠滲透管柱。令樣品 48 一 (請先閲讀背面之注意事^|^寫本頁) 、\一" Γ

本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 B7_ 五、發明説明（45 ) 在一個Superrose 12 (10/30)凝膠滲透管柱上，以磷酸缓 衝的生理鹽液（PBS)作為洗提液，在一為0· 5ml/min之流速 (圖形速度=0.2 5c m/in in)下進行電泳。在注入之前，令一 個1 00m 1整份之濃度調整過的樣品過濾通經一値0.2〃in薄膜 。監測 OD 2 8 0。 以下列標準[以道耳頓（Da)表示分子量（MW)]來校正管 柱：過氧化酶（232,000)、醛縮酶（158,000)、白蛋白（56, 〇〇〇)、卵白蛋白（44,000)、胰凝乳蛋白酶（25,700)、核糖 核酸酶（13,7 00)、胰島素（5,700)、維生素 B-12 (1355)。 主要波峰之分子量傺藉由下列等式予以計算之：

Loglt3=7.52-0.212xRT，其中RT =以ml表示之洗提容積。 R 2 =0.976。使用胞苷（246Da)所測得之總管柱容積（Vt )為 21 · 93 ml。使用籃葡聚糖（2x10 s Da)所測得之空隙容積（V。） 為 8 ♦ 3 8 m 1 〇 結果總益 * 在第16a圔中，本案樣品DUP具有一個在18.76ml被洗 提出並具一約為3500Da之分子量的第一主要波峰（1)。在 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 22 . 7m 1 (2)與27.3m 1 (3)被洗提出之隨後的波峰超出總管柱 容積（使用胞苷（246Da)所測得值為21.93ml)。這些波峰似 乎對管柱基質具有某種親和力。 在第16b圖中，Balassa之樣品BAL具有一値於接近管 柱之V。（8.4ml)被洗提出之小波峰（1)，一個在18. 5ml被洗 提出之波峰（2 )(4000Da)，和兩個在Vt之後（22.¢5ml與28.2 in ί)被洗提出的波峰（3 )與（4)。 -49 - 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐〉 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 J^l〇8 A7 __Ξ_ 五、發明説明f6 ) 在第16c圖中，Oikawa之樣品OIK亦具有一個位於V。處 之小波峰（1)，在18· 9ml之波峰（2) (3300Da)，在21.5ml之 波峰（3)(100003)以及在27.31111之小波峰（4)。 在比較該等樣品時，可注意到除開該3500Da波峰，本 案DUP樣品之主要帶區，於其他樣品内觀察不到有相同之 強度。該0IK樣品看起來是具有一小量的27.3ml波峰。該 BAL樣品具有一個在28.2ml處移動之波峰，其可對應於本 案DUP樣品内的小波峰之一者。 Η P L C屮較： 條伴： CS-S-Hexyl 管柱 5mih，25 x0.94cm, CSC #059-085;逆 相管柱。 結果缠益 * 關於在一 hexyl-逆相管柱上之HPLC，同時監測〇D210 與0 D 2 8 a ° 5 0 1整份之經離心的樣品（主部為12/^//111)被填 放，並以100¾ Η 2〇予以洗提之。各層析圖依據0D2 ί 0來標 識波峰（例如1)以及相應的〇D28q波峰（例如1)被標明之。 此管柱之V。值為5 . 5 in 1 (1 · 4 m i η )。 在第17a圖中，DUP具有3個經由〇〇2^觀察到之主要波 峰（1、2、3)以及2個小波峰（4、5)。波峰1之旁有兩個側 峰被檫識為1 a與1 b。明顯的〇 D 2 8 d吸光度與波峰1、1 a、工b 與3有關。經比較，關於波峰2之0D 2 8 Q吸光度比〇D 2 i Q者要 低得多。 在第1 7 b圖中，B A L顯示出更多的〇 D 2 1 a波峰，但其強 -50 — (請先聞讀背面之注意事ριρ填寫本頁) 裝- -訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公嫠） 83. 3.10,000 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7_ 五、發明説明（47 ) 度相較於DUP波峰則較低。儘量使波峰重疊以提供分子鑑 定之一指標，只有Balassa樣品中之波峰3與7似乎與DUP樣 品中滯留時間的波峰（分別為波峰la、lb以及4)有相關。 在第17c圔中，於0ΙΚ抽出物内只觀察到3値主要的波 峰（1、2、3)。波峰1與3可能與DUP樣品之波峰1與3相關， 但在0ΙΚ層析圔中未觀察到波峰1有側峰。0ΙΚ樣品中波峰 的高度較DUP者為低。因此，FPLC與HPLC圖形是不相同的 産物之特徽。 CZRhh m ： 條件： 裝置：設有目標軟體（版本：7.11 U)之Beckman条統（p/ace 条統 2050);毛細管：SiHce (TSP0 50375)，50iiinx97cin ;緩衝液：2 Μ甲酸、塗覆溶液：5 % p / v h e x a d i in e t h r e n e溴 化物以及配於水内之2¾ (v/v)乙二醇，·偵測器：UV (200nm) ;電流：- 30kV ;注射：0 . 5 psi , 20秒；溫度：22°C。 毛細管以下列予以調理之：1M NaOH (20psi, 20min) 、水（2 0 p s ί , 1 0 m i η)、塗覆溶液（2 0 p s i , 2 0 si i η)以及緩衝 液（20psi , lOmin)。接而設定條件以供進行一次跑程：緩 衝液（2 0 p s i , 2 m i η )、樣品注射液（0 . 5 p s i , 2 0秒）、跑程 (-30kV, 45min)、1M NaOH (20psi, 3·5ιηίη)、水（20psi, 3 . 5 m i η)、塗覆溶液（2 0 p s i，4 in i η )和緩衝液（2 0 p s i , 4 m i η)

O 將各個樣品（BAL、DUP、OIK分離部分3)再散浮成16. 5 mg/ml 〇在BAL、DUP與0IK中各溶液之pH值分別為7· 1、6· 8 一 51 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事$填寫本頁) 裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 _；_B7__ 五、發明説明（48 ) 與δ· 2。在BAL、DUP與0ΙΚ中各溶液之NaCl濃度分別為2. 08 、4·37與 0.71mg/ml 。 結果總益 : 各個樣品（BAL、DUP與0IK-3)之分子圖形示於第18圖 中。DUP與BAL樣品之比較顯示出BAL樣品含有一較高比例 之波峰（帶有一面積百分比〈1)。BAL和DUP均有位在MT/E0F = 1·06、1·54、1. 59、1. 66 與 3· 22之波峰。在 BAL 和 DUP 中 帶有1.06、1.54與3. 22之比例的波峰具有一類似的面積百 分比，而在比例為1.59處之波峰則是DUP要比BAL強8倍以 上，而在比例為1 . 66處之情況則是相反。 DUP與Olf(樣品存在一非常不同的電泳層析圔。0ΙΚ具 有一値主要波峰加上幾個小波峰。這些波峰中無一者可對 應於DUP樣品之一波峰。 EVThh 較： 樣品DUP、BAL、0ΙΚ之抗血管形成潛力像在EVT上予以 分析之（第19圖）。在BAL抽出物中未收取得顯著的抗血管 形成活性。該DUP粗製的抽出物與Oikawa 0ΙΚ之分離部分3 作比較。DUP與0ΙΚ此二者幾乎是相等的。但是，Oikawa等 人之教示逸脫出本發明，因為他們提及在高於lOkDa的分 子量之分離部分中沒有可測得的活性，這與本發明第15圖 所得之結果相反。 因此，雖然Ba lassa的方法和本案方法之間有類似之 處，由此二種方法所製得之産物卻很清楚地是不同的。 胺某酴含量hh較： 一 52 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 83. 3. !〇,〇〇〇 (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 丨_裝· 寫太 -訂 503108 A7 B7 五、發明説明（49 ) · BAL、DUP與0ΙΚ樣品（全部為16.511^/1111的乾重）之蛋白 質含量傺藉由Lowry之方法予以測定的；結果顯示相關於 BAL、DUP與 0ΙΚ樣品之值分別為 3.31、0.27與 4. 15mg/ml。 當DUP對BAL和0ΙΚ作比較時，在蛋白質/乾重之比例上有極 大之差異。 進行分析以進一步分析各個液體軟骨製品之胺基酸含 量。第20圖例示BAL、DUP與0ΙΚ樣品中各値胺基酸之比例 。自由胺基酸在各個軟骨製品之間的比例有變化：在BAL 、DUP與0ΙΚ樣品中，分別為23¾、73¾與《。明顯地，源自 於蛋白質來源的胺基酸之比例在各個軟骨製品之間亦有變 化：在BAL、DUP與0ΙΚ樣品中，分別為77¾、27¾與86¾。參 照下表之原數據： (請先聞讀背面之注意事_ 裝— 寫本頁 訂 軟骨製品 自由胺基酸 源自於蛋白質的胺 含量Ug/ml) 基酸含量（jig/ml) 2314 223 3910

經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 結論 ： 已與本發明（DUP)作過比較之該二種習知産物（BAL與 〇 IK)仍被認為是製備軟骨抽出物之傳統方法。上述之結果 顯示，就抗血管形成活性、抗腫瘤活性、抗發炎活性、抗 溶膠原活性而論，本案方法（DUP)提供一種具有意想不到 的良好活性之産物。本案發明人推測本案方法確實成功地 於一單一的抽出物中回收得多樣的水可溶性抑制因子，:， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7 五、發明说明（50 ) BAL、DUP與0ΙΚ分子圖形與蛋白質含量之直接比較證 ，實各値軟骨製品具有特定的特徵。雖然其等似乎共有若干 組份，很明顯地其間之比例是互不相同的。當考慮到DUP 以一低於大約75mg/kg之劑量被口服投藥時具有抗腫瘤活 性而在較高之劑量下即逐漸地失去此作用時，這是特別重 要的。此結果暗示在本案DUP液體軟骨抽出物中，高於一 種單一因子之數量是關鍵點。因此，像BAL、DUP與011(之 不同的軟骨製品可能顯示出極為不同的生物性質，因為其 等之間的値別組份之比例有變化。 臨床試驗： 供臨床試驗用的液體抽m物夕製備： 以本發明之鯊魚軟骨液體抽出物來進行初期的臨床試 驗。使用一値具一孔隙度為0.22㈣的Mi 1 lop ore過濾器來 纖維在超過濾後所獲得之液體抽出物。該液體抽出物之黴 生物限制傺依據USP X X I <61>標準而予以控制之。該液 體抽出物以每份含7ml (大約85mg的蛋白質）而被分裝在無 菌瓶内，於-60 °C下予以冷凍過夜並進而儲存在-20 °C直至 要用之時。 抗ifn管形成作用： 本案液體軟骨抽出物被應用在治療血管形成-依賴型 疾病上。在人體上施行血管形成-依賴型疾病之三種不同 類型代表的試驗：第一種類型是癌症（攝護腺癌），第二種 類型是皮膚障礙，以及第三種類型是關節炎（類風溼性關 節炎與骨關節炎）。以下之實施例將會例示與出示本案液 一 54 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐〉 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事填寫本頁) 裝· -訂 503108 A7 __B7_ 五、發明説明（51 ) 體抽出物之至少一種抗血管形成活性。 以下所示之結果是相當令人振奮的且被視為是本案粗 製的渗透液及其分離部分在治療，除了經特別試驗者之外 ，所有的血管形成-依賴型疾病上的有用性之預告。對於 一具有一血管形成組份之疾病，據信，本發明之軟骨抽出 物在此方面會是有效的，只要一組成物内能包含有一有效 量的本案軟骨抽出物且此組成物像呈一適當之形式以供合 宜的投藥。因此，可理解到，本發明並不限於下列用於治 療血管形成疾病之特定組成物，因為熟於此項技藝人士可 視投藥模式之選擇以及被標的的疾病組織而自行衍生出許 多組成物。組成物可藉由不同的途徑而被投藥，例如局部 的、口服的、舌下的、直腸的、靜脈内的、肌内的、眼内 的與腹膜腔内的投藥、藉由擴散等等。 * 由於軟骨抽出物之魚腥味，可予以添加調味劑或香味 劑或設計出其他的gall enic組成物（脂質體、包囊劑、貼 藥等等），俾以鼓勵病人之順從。> 病人〃此詞意指有病 的人類或動物。 癌症 ： 對於一罹患攝護腺癌之病人，已在其飲食中添加液體 軟骨抽出物，且在此之後顯示出健康之改善。於1986年診 斷出有一腺癌。於當時，病人接受放射治療。在1991年， 病人之攝護腺血清抗原（PSA)位準為138Mg/L，而當時正常 的可接受高標值係為4ug/L。該專利接而接受一經由去勢 合併抗-雄激素（ΕϋFLEX)治療之完全不同的治療。此治療 -55 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事 裝— 項 寫本頁 訂 經濟部中夬榡準局員工消費合作社印製 83. 3.1〇,〇〇〇 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7 五、發明説明（52 ) 在3年之期間中是有效的，之後PSA位準再度開始升高。自 1994年6月起，在此病人的飲食中添加液體軟骨抽出物（每 天的口服劑量大約為75mg的乾重/ml的抽出物，相當於大 約l-1.5mg/kg體重/天）。其PSA位準逐漸地由12降至4Mg/ml (正常的限度），其最後的結果是在1996年4月獲得的。此 劑量攝生法可依據下列而予以隨意地修改：投藥途徑、活 性組份之生物可用性、對於所要控制的病變所欲達成之進 展。就此案例而言，本案液體抽出物可能以實質之比例在 腸胃道被吸收之。一熟於此項技藝人士可以信賴（在前述） 從DMBA-處理的大白鼠以及被接種的小白鼠所獲得之結果 。在此，無毒性已於大白鼠、小白鼠（參照前述實施例）以 及猴（數據未示出）身上獲得確認。 DMBA-處理的大白鼠以及DA3-接種的小白鼠之液體抽 出物的口服投藥暗示一介於l-300mg/kg體重之劑量率，該 劑量率對於動物模型中之腫瘤進展的抑制以及腫瘤的血管 化很可能具有一極大之貢獻。本發明之液體抽出物在小白 鼠（DA3-模型）之腹膜腔内投藥證實了該投藥途徑對於要獲 得一抑制腫瘤的進展之有效劑量而言是很重要的°這暗示 ，在該攝護腺癌案例中像為有效的Img/ml劑量率，若是選 用一種腸道外之投藥途徑，可予以降低至幾乎 。因此，本案本發明人推想，一大約為0 · 0 1至2 0 0 m g / k g體 重/天之劑量在治療癌症（至少部分地減少或消除血管形成 上），是一相當合理的中間劑量（ED 5 。 有幾脑其他病人在其飲食中添加液體軟骨抽出物（每 - 56 - ί紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 83. 3.10,000 -hn *nl —λτ In ϋκ ϋ— nn βϋ (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 訂 503108 A7 B7 五、發明説明P3 ) 天的口服劑量大約為75mg的乾重/ml的抽出物’相當於大 約l-1.5mg/kg體重/天），並合併其他傳統的治療法（手術 治療、化學治療、抗激素治療治療等等）。下表提供一些 醫療案例之總結。該等結果暗示加有液體軟骨抽出物之合 併治療可以提高罹患固態腫瘤的病人之存活率以及生活品 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 腫瘤類型 醫療史 勝胱 患勝胱癌之70歲老年男性；接受過數次的損害（1cm 與1.5cn〇切除手術治療以及在其飲食中添加液體軟 骨抽出物；自09/94起無殘存的癌。 卵巢腺癌 47歲之年長女性；15cm的損害（右側）以及11cm的損 害（左側）以及數個2cm的損害；於1991年接受過手 術治療與化學治療；在1992年以化學治療法來治療 復發；在1993年以化學治療法來治療第二次復發； 在1994年於其飲食中添加液體軟骨油出物；之後展 現減小的質塊之惡性贅生物。 橫紋肌 肉瘤 63歲之年老男性；直徑為llcffl的浸潤腫瘤（450g); 接受過手術治療與化學治療；以放射治療法以及於 其飲食中添加液體軟骨抽出物來治療復發；之後腫 瘤顯示出壞死的組織以及安定性。 帶有肝 轉移之 胰臟癌 47歲之年長女性；胰臓損害（9cin)+肝轉移；化學治 療以及於其飲食中添加液體軟骨抽出物；於1994年 腫瘤受抑制達80¾ ;於1995年腫瘤消失。 乳腺腺癌 67歲之年長女性；於1978年接受手術治療；復發及 肺轉移（1994年）；Megace以及於其飲食中添加液體 軟骨抽出物；之後有部分的腫瘤受抑制現象：尺寸 由 1 · 5cni—;以及數目由 12—>6。 半皮癬； 製備下列之皮膚組成物並以之用來試驗其對患有牛皮 癖的病人之有效性： -EMULGADE CLB 29¾ (Μ/Ψ) - 20X粗製的滲透液69.5¾ (tf/W) -GERMABEN I 1¾ (li/W) - Lavandula armusUfol ia 0.5¾ (W/y) (一種M衣草屬物種） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝. 寫本 訂 4 . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 .. _B7_ 五、發明説明（54 ) 在65-70°C下加熱並攪拌EMULGADE CLB (—種由硬脂 酸酯、脂肪醇以及非離子性乳化劑所構成之混合物）（購自 於Henkel Canada Ltd.)。當該混合物仍在攪拌之時，終 止加熱。當該混合物之溫度趨近一為45°C之溫度時，予以 加入Lavandula a n g u s t i f ο 1 la (一種薰衣草屬物種）精油以 及防腐劑GERMABEN E (二氮雜環壬四烯基脲30¾ •、對羥基 苯甲酸甲酯11¾、對羥基苯甲酸丙酯3¾以及丙二醇56¾)(購 自於Sutton Laboratories, NJ, USA)。當該混合物之溫 度趨近一為30°C之溫度時，予以加入本案液體軟骨抽出物 。如此所得之組成物係為一平滑不油腻的乳霜；依據製造 商之指引，藉由變化EMULGADE之百分比，可獲得其他形式 (乳、洗劑、油膏）之具不同黏度的皮膚組成物。亦可使用 其他載劑或賦形劑，俾以獲得藥膏、凝膠或其他形式之透 皮性製劑。 在一為12週之期間内，對一組共9個患有牛皮癖的病 人（曾對傳統的治療有反應但在一段時間之後變成有抗性） ，每天給予兩次局部施用上述之配方。關於此研究，選擇 在兩側肢體具有相似或對稱程度的牛皮癖之病人。此等臨 床試驗以一雙盲試驗方式為之，亦即皮膚科醫師與病人均 不知是那一患部接受·含有軟骨抽出物之組成物的治療以及 不知是何者接受對照組組成物治療者。在5値未併發有角 化過度症之牛皮癬病人身上觀察到顯著的改善；對於那些 帶有角化過度症者，所得結果是稍為良好。第21圖中顯示 兩個病人的身體部位之相Η。在第21a與b圖中，其證實一 -58 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 訂 503108 A7 B7 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 五、發明説明p5 ) 種帶有角化過度症之牛皮癖病人，僅在1個月之治療後’ 就已顯示出一非常顯著的紅斑消退且無搔癢。但是，其仍 展現有角化過度症。第2値未併發有角化過度症之牛皮癖 病人的相片（第21c與d圖）顯示出在一為3個月之治療後有 一更佳之改善。由於牛皮癖似為一種多因子性疾病，本案 發明人推想，病人之反應偽依此病症之建立與永存中所涉 及之組份（諸如血管形成與發炎）的重要性而定。如DMBA-處理的大白鼠實驗（第5圖）、内皮細胞增殖實驗（第7圖）以 及EVT實驗（第10圖）中所顯示的，本發明之抽出物中確實 存在有抗血管形成活性。抗發炎活性亦被證實之（小白鼠 之CHS模型）。很有可能地，若此形式之配方再輔以其他針 對他種有涉及的因子之治療劑（角質溶解劑、額外的抗發 炎劑、抗組織胺劑、免疫抑制劑等等），可以獲得更佳之 結果。 此互補作用可採行，例如修正該配方之形式以包含一 有效量之角質溶解劑。其達成亦可藉由與本案之局部配方 之施用，同時地或交替地將該一互補性治療劑分開地投藥 。再者，該互補性醫療並不需要藉由相同的途徑來投藥。 縱使含有高比例之液體軟骨抽出物，上述配方未顯示 出有全身性作用（該作用僅限於要治療之區域）以及次要的 作用。 關節炎： 患有關節炎之病人係以自願為基礎，每天嘗試1至2單 位的7 m i總液體油出物歴時數個月之久。這些病人顯示出 一 59 - (請先聞讀背面之注意事 裝— 填寫本頁) 訂 ¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明P ) 逐漸地藉由關節功能之恢復、疼痛與發炎之消除（高至60¾) 而顯示出其狀況之改善。由於關節炎是含有血管形成與發 炎組份，上述作用可歸因於本案軟骨抽出物之抗血管形成 與抗發炎活性。 接而藉由一組風濕病學專家來進行一試驗性臨床研究 。此研究中登記有7個自願且明瞭的個體，其等之年齡在 39至60歲之間且患有類風濕性關節炎。撿驗之建立像依據 美國風濕學會（American Rheumatism Association)之修 正販中所制定的分類標準（F*C· Arnett et al· (1988), Arthritis & R hrumat i sπι_> 2_L: 315-325) 0 治療持續30天並包括每日攝入一劑量為21ml的液體軟 骨抽出物（12mg/ml的乾重）。治療有效性之判定僳依據一 有關於關節敏感性（joint tenderness)的關節指數（D. M. Ritchie et a 1 . (1968), Quater 1 v J. Med.· New Series X X X VB , 147:393-406)。該指數傺依據如下所作成之總 結：當關節受到施加在關節周緣上堅實壓力或在某些情況 是在移動關節時，病人所經驗到的疼痛之一群定量性評估 。該等結果顯示出，7個病人中有4個在接受本案液體軟骨 油出物之治療後已有改善（下表），這暗示本案産物可能可 用於治療類風濕性關節炎或其他併發有慢性發炎之病症。 -60 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事_ —ip 裝-- 寫本頁) -、1Τ 503108 A7 B7 五、發明説明（57 ) 病人 (編號） 年齡 (歲數） Ritchie氏指數 改善 第0天 第30天 1 60 30 22 是 2 43 8 8 否 3 52 12 12 否 4 41 15 19 否 5 46 5 3 是 6 39 6 2 是 7 55 14 7 是 蛛網靜脈： (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 裝* 招募一總數為16個病人來供研究之用。名單中之病人 於其臉上具有可眼見但不嚴重的毛細管擴張。該名單被分 成兩組，每組δ個病人。A組被給予一含有5¾液體軟骨抽出 物之膽固醇脂質體基藥，而β組則僅只給予膽固醇脂質體 基藥而已。該等産物被應用在整個臉部上’每天兩次歷時 3値月。使用一種光纖表面顯徼鏡以獲得一具有最少4値顯 示出蛛網靜脈的臉部部位之映像°藉由Zeiss Ibas Image Analyzer來分析 該等映像之灰色值（grey values)。對名 單内之每個人，計算其每一部位之經積分的光密度（I〇D) 。將名單内每値人的4個部位在各値時間點之數值予以平 均之。 該等結果顯示出，在4週之後，I0D有35¾之下降，且 在研究之期間中維持有此作用（第22圖）。該空白的膽固醇 一 61 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503108 A7 B7 五、發明説明（[: S). 脂質體基藥在使用8週與12週後，展現出一分別為5%與8¾ 的背景改善。 眼樞固里眼團： 皮膚著色並不全然是因為黑色素的存在或不存在之故 ，而亦有可能是由於血液供應以及血漿之組成所致。當血 液流動緩慢且因為代謝而有大量的氧被移出時，皮膚之顔 色即顯現出變青。此等膚色差異在眼部區域更為顯明，因 為該處之皮膚較薄（Oresajo et al. (1987) , Cosmetics L—Toiletries, m: 29-34)。存在於眼下方之中隔内的血 管變化亦會加重黑眼圏之出現。眼部周圍之黑眼圏亦會因 為脂肪沉積、眼瞼之下的水腫以及環繞眼部區域的血液露 出而出現。設計臨床研究以評估鯊魚軟骨液體抽出物對於 控制環繞眼部區域的血管形成之作用，俾以減少眼框周之 黑眼圈的出現。 一總數為18個人且年齡在18至65歲之間的女性自願者 參與此研究°名單中之人展現出環繞眼部的黑眼圏。名單 中所有的人均健康良好而無急性或慢性疾病（包括皮膚學 或眼科學上的問題）之實證。 此研究排除掉展現出當前的曬傷、疹、抓傷、燒傷痕 等（此等可能會干擾試驗結果之評估）之個體。懷孕或哺乳 之女性亦被排除之。試驗位置不能有於觀察時可看到之疣 、胎記、曬傷、曬黑、疤痕以及活躍中的皮膚損害。 該名單被分成兩組，A組10個病人而B組8値病人，各 組分別對應於含有5¾液體軟骨油出物之載劑或只有載劑本 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） 83. 3.10,000 (請先聞讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 訂 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（59) 身。名單中之人被給予足量之産物以供施加至眼部周遭之 區域，每天至少兩次歷時12週。在基線之時以及在4、8與 12週之後獲得測量值。在每次拜訪時進行抬照並經由映像 分析法來分析所得之相片。 以表示皮膚之暗度/明度的灰色值來分析相片。清楚 可見地，以液體軟骨抽出物予以治療之組在灰色值（此表 示暗色之淡化）上展現出一良好提高。在4、8與12週之後 ，以液體軟骨抽出物予以治療之組在眼部區域之下的皮膚 有11¾、21¾及121之淡化。僅以載劑予以治療之組沒有顯 示出任何變化（第23圖）。 _腸（曲餱）的靜脈： 以一總數為20個人之名單來完成此研究。名單中之人 具有可眼見但不嚴重的毛細管擴張。該名單被分成兩組， A組（η = 9)給予一含有5¾液體軟骨抽出物之乳霜而B組（η = 11) 則只給予一載劑乳霜，整肢腿都要擦上乳霜，每天兩次歴 時3個月。使用一種光纖表面顯徼鏡以獲得具有2-4値顯示 出腫脹（曲張）的靜脈的腿部部位之映像。藉由Zeiss Ibas Image Analyzer來分析該等映像之灰色值：對名單内之每 個人，計算其每一部位之經積分的光密度（I0D)。將名單 内每個人的所有部位在各個時間點之數值予以平均之。 結果例示於第24圖中。在使用在4、8與12週之後，I〇D 分別有21¾、17%與26¾之下降。該對照組載劑在使用4、8 週與12週之後，展現出一分別為5¾、0¾與0%的背景改善。 其他有潛力的臨床h IS獸醫學上之應用： m —^1« In t^n —ϋ Im n n<— i-il1 HI t 丨"UP (請先閎讀背面之注意事寫本頁) -、ΤΓ -線' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210Χ297公釐） 83. 3. 10,000 503108 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（6Q ) KM..M......:許多特徵在於不正常的血管生長或新血管化之病 症會造成視力之減低或眼盲。這些包括角膜新血管化（由 化學性或物理性剌激所造成者）、角膜感染、角膜移植排 斥作用、血管化青光眼、黃斑性退化、疱疹病毒角膜炎以 及糖尿性視網糢病。本案液體軟骨抽出物可藉由抑制新血 管之形成以及藉由減少毛細管擴張與發炎而對此等臨床病 症産生作用。 傷η _ iUI :傷口修補渉及細胞、生物化學調節子、細胞外 基質分子以及細胞微環境之間的一個複雜的相互作用。在 完全-厚度（full-thickness)創傷之後，肉芽發生組織（成 纖維細胞、毛細管以及發炎細胞）以一有特徵之順序首先 自傷口邊緣生長出。在24小時之内，成纖維細胞從位在傷 口邊緣處之結締組織開始移向傷口空間。當其移動時，成 纖維細胞生成基質分子（膠原以及葡糖胺基聚糖），該等基 質分子會形成一種細胞外基質。在受傷之後最快在18小時 卽可於傷口邊緣處看到位在被灌注的微循環内之最先的毛 細管芽。此等芽生長進入至傷口空間内並對傷口結締組織 提供新的毛細管網路。成纖維細胞增殖與移動以及毛細管 生長如同一個單位般持續進行著，直到傷口空間被完全地 瑱滿以新組織。某些併發有肉芽發生因子之過度表現的傷 口修補，例如被嚴重燒傷的個體之肥大的疤痕與皮膚的癒 合，可因液體軟骨油出物之（口服或局部）投藥而獲益，因 為降低血管形成程序可以減缓傷口癒合之程序。 Ff疹鳞展件皮慮疰病：液體軟骨油出物對牛皮癖損害之有 -64 - (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 訂-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（61 ) 益作用暗示了具有共同特徵之其他疾病亦可從本案液體抽 出物之局部或全身性投藥而獲益。丘疹鱗屑性皮膚疾病之 特徵為由表皮之增厚和/或下層的真皮發炎所造成之紅色 至青紫色丘疹以及病斑，並包括了牛皮癖、萊持爾氏症候 . 群（Reiter’s syndrome)、玫瑰糠疹、扁平笞癬、毛髮紅 糠疹、二期梅毒、輦樣真菌病以及鱗癖狀疹。 【髮.:驅動血液流至頭皮的小側動脈之結紮，在防止由雄 激素過度暴露所造成之頭髮減少上，已獲成功。液體軟骨 抽出物對頭皮的某個區域之局部施用可藉由降低血管網路 繼而降低激素之暴露而防止頭髮減少。 獸醫學上的應用：固體和/或液體軟骨抽出物可被投藥至 動物以供用在相同於前面就人類而敘述之治療性或美容性 應用。 非-抗tfn管形成作用： 瘅瘡： 雖然痤瘡不屬本案發明人所知之知識，在被分類為一 具有一血管形成組份之疾病或障礙下，可以本案液體軟 骨抽出物亦能抗發炎為基礎，來試驗患有此疾之病人對本 案液體抽出物之反應。為實驗軟骨抽出物在患有痤瘡的病 人身上之應用，依據下列來配製凝膠配方： ^,^1 nn nil —mmmmmmmmm tmmtmi mK ml n n (請先聞讀背面之注意事寫本頁) CARB0P0L 1. ,2% 純水 77. .2% NaOH 0. .2% PHEN0XET0L 0, .3% TWEEN 80 0 ‘ .3¾ 液體軟骨抽出物 20. 40X蘆薈油出物 0, .5¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.10,000 503108 A7 B7 五、發明説明（62 ) 該液體軟骨抽出物含有9-12mg/ml的乾重。對於患有 多少有些嚴重形式的痤瘡（發炎性痤瘡以及囊性痤瘡）之病 人，此配方顯示出一顯著的皮膚改善效用。第25圖顯示， 當以含有液體抽出物之載劑予以治療12週時，一患有痤瘡 的病人之症狀有明顯之改善。 此等結果可能傺導因於一種抗血管形成作用（因而顯 示痤瘡有一血管形成組份），或有可能導因於具有抗血管 形成以外之一作用（例如抗發炎作用）之活性成份。在上述 臨床試驗中所得之所有結果顯示，本案液體軟骨抽出物在 治療血管形成-依賴型和/或發炎性疾病上有極大之潛力。 軟骨抽出物之數量及其配方可隨意地予以變化以符合特殊 之需要。 可注意到的是，以蛋白質含量為基礎，局部的和所有 其他的組成物可含有一廣範圍之軟骨抽出物劑量。在所試 驗之3類特殊案例中，極為不同之劑量和/或配方被應用之 Ο 皮膚刺激件： 由於血管形成通常傺與許多疾病中之發炎有關，將軟 骨抽出物内之各個活性予以分開，是為所欲者。在此方面 ，選擇一値被認為其中不會發生血管形成的皮膚刺激性模 型來試驗本案抽出物之抗發炎活性以及緩解活性。此研究 中選擇9個帶有對秘魯香膠具皮膚敏感性之病史的自願者 。試驗化合物如下所示： -66 一 本紙張又度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事 裝-- ^^寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 503108 A7 ___B7______ 五、發明説明（63 ) 1. IX鯊魚軟骨50¾，配於D-MEM培養基内 ， 2. IX鯊魚軟骨20¾，配於D-MEM培養基内 3. IX鯊魚軟骨10¾，配於D-MEM培養基内 4. Cola nit ida (Indena) 10%，配於水-醇 1 : 1 内 將這4種化合物施用至名箪中的人之側腹前臂上。容 許該物質被吸收20分鐘，接而將秘魯香膠——種刺激劑一 施用至受測位置上。皮膚剌激程度偽以皮膚發紅之增加來 作估量。發紅之程度偽以一種Minolta比色計予以測定， 並與正及負對照組作比較。正對照組偽為僅以秘魯香膠予 以處理的皮膚之顔色，而負對照組偽為一個以Co la溶液予 以處理並像試驗産物一樣被挑戰之皮膚位置。統計顯著性 之計算偽藉由雙尾的機率T-試驗。第26圖顯示10%的col a 有70¾的活性。鯊魚軟骨在20¾與10¾濃度下，分別有58¾與 60%之抗剌激性。不存在有劑量-反應作用。此等結果暗示 本案軟骨抽出物含有與抗血管形成活性極不相關之抗發炎 與緩解活性。 癌症 * 一個53歲的女性病人被診斷偽為一種B型大細胞非-何 杰金氏淋巴瘤（non-Hodgkinfs lymphoma)。CAT掃描分析 顯示出有環繞頸動脈與頸靜脈之腺病（直徑為2.5cm)以及 在右腎門有一大容積的腺病。該病人拒絶化學治療並於其 飲食中加入本案液體軟骨油出物（1993年10月）（每天口服 劑量為大約75mg/inl的乾重/7ml抽出物，相當於大約1-1.5 m g / k g體重/天）：，3値月之後（19 9 4年1月），C A T掃描分析顯 -67 - 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閎讀背面之注意事' X裝-- 寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 83. 3.10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（64 ) 示頸部内之腺病被完全地吸收。至1994年11月，腹部的腺 病之容積降低了 75¾。之後，該病是穩定的且病人覺得健 康良好D 此結果暗示某些固態腫瘤亦對本案液體軟骨抽出物之 抗腫瘤活性有反應。 皮膚的瞳壁保講作用： 一為6個健康自願者之名單參與此研究。名單中之人 接受一含有本案液體抽出物之乳霜，並將之施用至右前臂 上，而左前臂則僅施用載劑，每天兩次歴時4週。 名單中之人為21至45歲之女性，且而無急性或慢性疾 病（包括皮膚學或眼科學上的問題）之實證。此研究排除掉 展現出當前的曬傷、疹、燒傷痕等（此等可能會干擾試驗 結果之評估）之個體。試驗位置不能有於撿察時可看到之 疣、痣、胎記、曬傷、曬黑、疤痕以及活躍中的皮膚損害 。在試驗之日，令名單中之人不得於臉上接受任何洗劑、 乳霜或其他産品。在評估之期間中，於試驗之前，令名單 中之人待在一經控制的環境（20-22°C以及40¾相對濕度）内 經過至少30分鐘之平衡。 試驗位置偽為右及左掌前臂。於各臂上標出一痼小區 域（3.5cmX7Cm)，並於此區域之3處位置獲得基本的經表皮 水損失（TEWL)測定值（P i ηnag〇da et a 1 . (1990) , Contact Dermatitis, 2_2.: 164-178 ； Grove (1984) in ,TThe Effects of aging in oral mucosa and skin," Ed. Sq u i er & Hi 11, CRC Press, pp· 124-125)。 (請先聞讀背面之注意事寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A 7 B7五、發明説明（65 ) 一種黏性（Tuck)膠布被用來覆蓋試驗區域，並在一次 堅實之重撃之後，撕掉該膠布（Elias (1993), J. Tnv^s. Dermato 1. ·趾·· 044s-049s)。得到一總數為5次之剝脱。 再次記錄TEWL。在TEWL測量之後繼續進行每組為5次之剝 脫。當TEWL趨近於18 G/M2/Hr時，停止剝脱。在最後的剝 脫順序結束之後，再次記錄TEWL。藉由登記在各個展現一 為18 G/M2/Hr或更高之TEWL的時間點下，各臂之最高剝脫 數目來計算損害皮慮障壁所需之剝脫數目。所得結果使用 單尾的等级像數Z試驗來分析在不同的時間點下之處理組 相對於基線之統計顯著性。 載體處理之臂似乎未顯出多少改善，因為在2及4週之 處理後，其分別只需要再多261與21¾之剝脫即可損害皮膚 障壁。在以液體軟骨油出物處理2及4週之後，名單中之每 個人的障壁狀況有一明顯之改善（P<0.05) *因其需要再多 60¾與55%之剝脫才可損害皮慮障壁（第27圔）。 因此，液體軟骨抽出物已經證實可用於強化皮虜障壁 以對抗物理性損害。 濕疼： 依據本案液體軟骨油出物會降低由濕疹所造成的發炎 性損害之能力，於美容沙龍内予以試驗之。美容師因其手 部多年來之濕疹而施用含有本案液體軟骨抽出物之乳霜。 令人感興趣地，含軟骨乳霜之使用顯著地減少其手上之濕 痿。其現在成功地使用含軟骨乳霜來防止濕疹之表現。 (請先閲讀背面之注意事^寫本頁) Μ 裝·

、tT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（66 ) 一値36歲帶有扁平疣病史之女性接受一値皮膚科翳師 予以治療幾乎有3年之久，俾以控制疣之進展以及相關之 疼痛。在治療之中包含有液態氮、水揚酸（40¾)、厭氧、 硝酸以及硫酸。這些治療在一歴時3値月之期間通常極為 微弱且幾乎沒有結果。在1996年3月，該病人每天直接在 疣上施用本案液體軟骨抽出物（5分鐘）；兩週之後，在疣 之周圍形成一個粉紅色新表皮區；再一週之後，疣不見了 。因此，此結果暗示本案液體軟骨抽出物可有助於疣之治 療。 其他有潜力的臨床h廊獸翳璺k之應用： 務棺桃斤:發炎是被移植的細胞之死亡中所涉及之一主要 因子。因此，組織移植可從本案鯊魚軟骨液體抽出物中所 存在的抗發炎活性而獲益。 多發袢碑化症:多發性硬化症之病因不明。其組織反應之 特徵為有一免疫病理程序，帶有小靜脈周邊單核細胞浸潤 以及缺乏感染之任何明顯的組織病理證據。基質金屬蛋白 酶是發炎反應中所涉及之重要因子°由於液體軟骨抽出物 是基質金屬蛋白酶之一有力的抑制劑，其可供用於多發性 硬化症之治療。 纖維變件:目前的觀念暗示纖維變性類似於正常的傷口癒 合，但無法終止而造成正常組織被疤痕所取代。大多數的 纖維變性反應出現在外傷、感染、發炎之後，或因為不明 的原因而可能具有一種遣傳組份。典型地，TGF-3被過量 生成並誘發成纖維細胞之增殖以及膠原之過量生成。由於 -70 - (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝· 訂 .¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. !〇,〇〇〇 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ B7_ 五、發明説明（67 ) 一過量的膠原沉積是纖維變性之一檫記，本案發明人推想 ，能夠延缓肉芽發生組織的形成之本案液體軟骨抽出物， 在抑制纖維變性反應上會有常期之益處。 發炎袢_痪：發炎性腸疾之病因學不明，但在克隆氏疾病 (C r 〇 h n f s d i s e a s e)與潰瘍相結腸炎中渉及有異常的小腸 免疫力。黏膜單核細胞展現出被改變的抗體生成、增殖、 細胞毒性以及細胞激素合成（FGF、PDGF、EGF、TNF)。液 體軟骨抽出物已顯示出抗發炎活性，於是口服投藥在發炎 性腸疾之治療上可證實是有用的。 心臟疾病:冠狀抗性血管的内皮功能障礙可以解釋冠狀微 血管之異常以及可能地心肌局部缺血和胸痛。在一細胞级 層下，内皮功能障礙與一氧化氮（N0)(—種内皮衍生的鬆 弛因子）之減少的表現有關聯。無合成容許血管条統可維 持一血管舒張俾以調節動脈壓之狀態。N0之内生性合成的 缺陷會造成諸如高血壓、肺部高血壓以及心臟病之病狀。 本案發明人已有源自於培養的内皮細胞之初步結果而證實 本案液體軟骨抽出物會增加H0生成。因此，在某些心臟病 病狀以及併發有肺動脈高血壓之先天性心臟病的小兒科病 人之治療上，本案液體抽出物可經由N0而達到治療效果。 更甚者，液體軟骨抽出物可有助於降低動脈硬化之發 炎-相關的併發症。 硬—化1:硬化病（硬皮）是一種不常見的疾病，其特歡是皮 膚以及通常亦包括内臓之纖維變性結缔組織之增加。其經 常顯現出一種局部皮膚斑之角化過度。角化過度是一種細 -71 - (請先閲讀背面之注意事 —jm-裝—· 寫本頁 訂 ir.線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明) 胞過程，其中皮膚之角質細胞完全地分化並蓄積堅硬的角 蛋白纖維。若一關節周圍區域之皮膚受感染，此皮膚病狀 可導致有限的關節移動。當被添加至一其中角質細胞分化 作用受到鼓舞的實驗条統内時，本案液體軟骨抽出物部分 地防止該分化或角質化過程。因此，本案可藉由防止被完 全地分化之角質細胞的過度蓄積而對該等皮膚病狀而言是 有用的。 獸醫學上的應1:固體和/或液體軟骨抽出物可被投藥至 動物以供用在相同於前面就人類而敘述之治療性或美容性 應用。 垄茲袢應用以及紐成物： 上述之試驗及臨床試驗顯示出本案之軟骨抽出物可有 多種醫療上之應用。在本案袖出物中所回收的各種活性之 中，抗血管形成活性、抗溶膠原活性、抗發炎活性以及對 PKC-誘發的分化之抑制作用，在美容性應用上是特別所欲 者。由於本案之軟骨抽出物已顯示出PKO調節的細胞現象 之一拮抗作用，且由於該拮抗作用在本技藝中被推測是會 改善皮膚障壁功能，一種用以改善哺乳動物皮膚之障壁功 能的方法，該方法包括對皮膚施用以一包含有軟骨抽出物 與一藥學上可接受的載劑之組成物，以及該組成物均落在 本發明之範圍内。其他或類似的組成物亦可被想到可供用 於一種用以舒緩皮膚或減低哺乳動物皮膚之發炎的方法。 發炎可為各種不同的因素所造成，例如化學剌激劑、物理 性磨擦以及暴露於紫外線幅射。用以抑制皮膚内之膠原酶 (請先聞讀背面之注意. 事 裝-- :寫本頁)

、tT ·«線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 503108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（69) 的方法與組成物亦有被意想到。膠原酶與發炎和過早老化 (_原之降解）被連在一起，因此，本案軟骨抽出物内所回 收之拮抗活性亦可被用在用以邐延過早老化以及調節哺乳 動物皮膚之皺紋或萎縮的組成物與方法由於。舉例而言， 可列出的皺紋或萎縮之原因包含有：老化、暴露於紫外線 或環境污染。局部組成物可包含有，就各個特定之應用而 測定的一有效量之軟骨軟骨。一般而吕，此等組成物可含 有0.1之一液體軟骨抽出物以及25-99.9；^«之一藥 學上可接受的載劑。此等組成物可含有一抗氧化劑，例如 一可防止皮膚内的脂質過氧化物之形成的試劑。該抗氧化 劑之實例有維生素E (生育酚）、維生素E衍生物、維生素C 、維生素C衍生物以及BHT。該等組成物可補充以抗發炎劑 (如磷脂酶A2抑制劑或植物衍生的抗剌激劑co 1 a以及綠茶 抽出物）。局部組成物可呈各種之形式，例如溶液、懸浮 液、洗劑、藥酊、凝膠、乳霜、噴劑、乳化液、籤棒、油 膏或脂質體（至少一部分的液體軟骨抽出物存在於脂質體 内）。其他的美容應用包括眼周圍之黑眼圏以及皮膚障壁 功能。 結益: 本案之方法已經證實偽為一種能提供具極高臨床價值 之軟骨抽出物的生成者。由本案新穎方法所生成之鯊魚軟 骨抽出物包含有能以良好産率予以回收之多樣性活性。本 案軟骨油出物，待別是液體抽出物及其部分具有一極大之 潛力，因為其等對於正常細胞而言是無毒的並同時對一大 -73 - (請先聞讀背面之注意事 -ml-裝-- 寫本頁) 、tr 線. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X；297公釐） 83. 3. 10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（7〇) 堆的疾病或病狀是有效的。 關於所有預期的應用（從眼用滴劑至皮膚科以及癌症 藥物配方），本案發明人推測一本案總液體抽出物之最低 的最終蛋白質濃度可以極低（從大約〇.〇1 mg/ml)。此低範 圍之劑量視活性成份至發生作用之位置之可接近性與滲透 性以及此等成份之有效的捕獲，還有組織對血管形成抑制 劑之敏感性或反應就某些應用而言，配方内最終蛋白質 濃度之最高限值目前尚不知。所嘗試之配方中，最高的最 終濃度像為一供牛皮癖之用的含有9mg/inl的蛋白質之局部 應用配方，以及大約12mg/ml之口服投藥，在癌症案例中 每天為7ml的劑量單位以及在關節炎之臨床試驗中每天為 21 m 1的劑量單位。 當予以冷凍乾燥時，本案鯊魚軟骨液體油出物可能會 喪失其某些活性。但是*在冷凍乾燥之前，添加本技藝中 已知的安定劑或保護劑可保存住敏感的活性，並使呈乾燥 狀態之軟骨抽出物的較高劑量之投藥成為可能。 所需要的材料： -冷卻器/冷氣機 -外科儀器 -碎肉機 -塑膠袋 -工業用攪拌器（購自於Fisher Scientific之Waring 3-段式攬拌器 -一種水純化条統（逆滲透以及0 . 1 £ πι過濾；C ο n t i n e n t a 1 -74 - (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 訂 _線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 83. 3.10,000 503108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_^___五、發明説明（71 ) Water System, model PRE 2202, Serial no. 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing System,購自於 Fisher Scientific, Montreal, Quebec) Q 此条統 供一具高品質之無發熱性水。 -購自於Fisher Scientific 之一 precision balance Mett 1 er, series AE -購自於DuPont Canada 之離心機 Sorvall Rc-285 -離心機CEPA -具一孔隙度為1/iM之尼龍袋 ——個高溫高壓滅菌鍋（自動蒸器滅_機33^〇, model MAC 350P) -Halgene 500ml容器，在132°C下予以滅菌處理10分鐘 並予以乾燥35分鐘 -具24jum孔隙度之Whatman Reeve Angel錐形過濾器 -超過濾管柱（分子量截留值：500kDa以及lkDa，當適 用之時；表面：25平方英尺；流速：130L/rain ;入口壓 力：30psi;出 口壓力：5psi;購自於Koch Membrance Systems Inc., Wilminton, MA, USA) -無菌離心泵（Monarch Industries，model ACE-S100, type A)以供提供一為130L/min之流速 -無菌櫥（無菌通風櫥NuA ire，購自於Ingram & Bel 1) -MilliPack-60 0.22μιπ無鐘過濾器 -無菌透明或琥珀色玻璃瓶 -濃縮器 DC-10 Amicon -75 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4规格（2i〇X297公釐） 83.3·1〇,〇〇〇 (請先聞讀背面之注意· I 事 裝— 窝本頁) 訂 503108- A7 B7 五、發明説明（72 ) -Rotofor Biorad 170-2950 - Amicon 過濾器 SI0Y10, SI0Y30 以及 SI0Y100,分別具 10、30與lOOkDa之截留值 - FPLC Pharmacia 216007 (電腦 Pharmacia 216014) -Hilstand S-300 26mffl/60cm (Pharmacia) -Superose S-12 10mm/30cm (Pharmacia)

-冷凍乾燥機Labconco 10273A 本發明已於上面作一敘述，而應了解的是，在未逸脱 本發明之教示下，熟習此藝者可依其能力及知識，藉由替 換本發明之某些要素而作出改變以為其實施之等效物，而 達到相同之目的。這些顯而易見的變化被視為落在本案所 涵括之範圍内。 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) wit 裝· 訂 ·!_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.1〇,〇〇0

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 ^ il ¥ 13 / 六、申請專利範圍 第85109647號專利再審查案申請專利範圍修正本 1· 修正日期·· 90年6月 -種用以獲得軟骨之一液體抽出物之方法，該軟骨之液 肢抽出物具有一實質部分之存在於完整的軟骨中之具 4物#性之可水解的組份’該方法包括下列步驟·· a) 在能與該等具生物活性的組份之完整性的保存 相容之狀況下，於-水性溶液内將軟骨均質化、直至該 軟骨被減縮成具低於或等於約5〇〇//m之尺寸的顆粒 體’並容許萃取發生，而形成—由顆粒體與—由該等具 生物活性之組份的粗製液體抽出物所構成之混合物； b) 將該等顆粒體與由該粗製液體抽出物分開； 〇進-步分離該粗製的液體抽出_，俾以獲得一含 有具低於或等於大約500千道耳頓（kDa)之分子量的軟 骨分子之純化液體抽出物；以及 d)移除包括水分子在㈣大部分具有低於⑽道耳 頓之分子，藉此，獲得_且有針 — 八有對抗發炎、膠原溶解、血 2. 官形成與腫瘤增殖之活性的濃縮抽出物。 如申請專利範圍第1項之方法，並 n ^ OA〇 /、中5亥條件包括一位在 0至20 C之操作溫度。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中 水m ^ ^ 條件包括，對該 f生，合，夜而έ，一位在約6至約g 4. , 乾圚的操作pH值。 如甲明專利乾圍第1項之方法，Α 分鐘至24小時内實施。 ，、中遠步驟a)係在15 如申請專利範圍第4項之方法，苴中 八干该步驟a)係在15 5. 、申請專利範圍 分鐘至1小時内實施。 6· 如申請專利範圍第1項之方法，其中該軟骨與該水性溶 液係呈1公斤相對於至少約1公升之比例。 7.如中請專利範圍第！項之方法，其中該水性溶液為經純 化之本。 / ........................裝…… (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 8·如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟d)包含冷康乾 燥"亥冷束乾燥係在有被添加至該液艘抽出物之安定劑 或保護劑的存在下予以進行者，該添加之數Κ以改善 該等有生物活性的組份之完整性的維持。 申<«專利fe圍第1項之方法，其中步驟d)包含藉由於 —個具n約G.lkDa之表觀分子量截留值的膜上過 濾該純化液體抽出物’藉此，可得一被增富以具有—介 於約〇. 1至500 kDa之分子量之分子的最終液體抽出物。 10.如申請專利範圍第8或9項之方法其中該軟骨係收獲 自鯊魚。 :線· U.如中請專利範圍第1項之方法，其進—步包括—個步驟 e).分部分離該最終液體抽出物，俾以獲才寻該液體抽出 物之一液體分離部分。 汝申4專利範圍帛1項之方法，其中該軟骨係收獲自鯊 魚，且其中在步驟d)中，一包含具有一為低於約〇」kDa 之分子量之分子的分離部分被回收。 13.如申請專利範圍第11項之方法，其中該軟骨係收獲自 鯊魚，且其中該分部分離步驟6)包含有下列次步驟：於 具一約為lOkDe之表觀分子量截留值的薄膜上過濾該

   -134 睛專利範園 最終液體抽出物 離部分，於一陰 及回收一在大約 離部分。 ，回收含有高於約10kDa之分子量的分 雄子層析管柱上分部分離此分離部分以 0.8至1·〇 M NaCl之間被洗提出的分 利靶圍第1至6項中任-項之方法所製造者。 出物’其係獲自於f魚且係藉由—如申請 乾圍弟7項之方法所製造者。 之=1::出物’其係藉由一如申請專利範圍第1〇 3 之方法所製造者。 -種抗溶膠原與抗血管形成的軟骨抽出 如申請專利範圍第項之方法所製造者。丁、糟由- 血管形成的款骨抽出物，其係藉由-如申物 乾圍弟13項之方法所製造者。 二重=治療具有—或多種擇自於下列群中 疾病或病況的藥學組成物··腫 以及膠原溶解，該藥學組成物包含= 魚魚且係藉由一如申請專利範圍第“ -方' 骨抽出物’以及-藥學上可接受的載劑。項之軟 -種用於治療具有一膠原溶解的組份之 藥學組成物’其包含有一右1旦 、病或病況的 項所界定的軟骨抽出物㈣請專利範圍第p —種用於治療具有—血管形成的組 藥學組成物’其包含有一有效量之如申請專 刈 3108 A8 88 C8 D8 、申請專利範圍 或18項所界定的軟骨抽出物。 22·如申請專利範圍第19項之藥學組成物，其係要供腹膜 腔内的、皮下的、眼内的、鼻内的、口服的、直腸的、 舌下的、肌内的、皮内的或經皮的使用。 23·却申靖專利範圍第19項之藥學組成物，其係為一種局 部藥學組成物。 24·如申請專利範圍第23項之藥學組成物，其中該軟骨抽 出物被添加至達成一最終固體重量含量為約1 -50mg/ml 的組成。 25· —種用於治療座瘡之局部藥學組成物，其包含有約2邶 的具有一如申請專利範圍第14、15或16項所界定之固 體重量含量的軟骨抽出物以作為一治療有效成份，以及 加上一種藥學上可接受的載劑。 26, 種用於治療癌症之藥學組成物，其包含有一治療有效 量之一如申請專利範圍第14、15或16項所界定的軟骨 抽出物，以及加上一種藥學上可接受的載劑。 27·如申清專利範圍第26項之藥學組成物，其中該軟骨抽 出物之劑量係要達成病人每公斤體重有0.0卜200mg的 該抽出物之總乾重。 28·如申請專利範圍第27項之藥學組成物，其係為要被口 服或舌下投藥給一需要該治療的病人之藥學組成物。 29· 種用以治療一需要該治療的病人體内之發炎的藥學 組成物，其包含一抗發炎有效量之一如申請專利範圍第 14、15或16項所界定之軟骨抽出物，以及加上一種藥 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、ΤΓ_ 線·

   -136- 、申請專利範圍 學上可接受的载劑 30 A8 B8 C8 D8 一種用以治療一雲主士女.、二H山 ^ 而要忒冶療的病人體内之血管形成的 樂學組成物’其包括一抗血管形成有效量之一如申請專 利乾圍第14至18項中任一項所界定之軟骨抽出物，以 及加_上一種藥學上可接受的載劑。 種用以改善哺乳動物皮膚之障壁功能的藥學組成 物，其包括一如申請專利範圍第14、15或16項所界定 之軟骨抽出物，以及加上一種藥學上可接受的載劑。 -種用以舒緩哺乳動物皮膚之藥學組成物，其包含一如 申請專利範圍第14、15或16項所界定之軟骨括出物， 以及加上一種藥學上可接受的載劑。 —種用以降低哺乳動物皮膚之發炎的藥學組成物，其包 括一如申請專利範圍第14、15或16項所界定之軟骨抽 出物，以及加上一種藥學上可接受的載劑。 34·如申請專利範圍第33項之藥學組成物，其中該藥學組 成物係用於治療由物理性磨擦所造成的發炎。 35·如申請專利範圍第33項之藥學組成物，其中該藥學組 成物係用於治療由化學性刺激劑所造成的發炎。 36·種用以抑制哺乳動物皮膚之膠原酶活性的藥學組成 物，其包括一如申請專利範圍第14、15或16項所界定 之軟骨抽出物，以及加上一種藥學上可接受的载劑。 37·種用以調節哺乳動物皮膚之皺紋或萎縮的藥學組成 物，其包括一如利範圍第14、15或16項=界定 之軟骨抽出物，以及加上一種藥學上可接受的载劑。 31 32. 33 本紙張尺度適用中國國家標準（⑽）遞格（2獻297公爱) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂丨 # - 137- AS BS