JPH11513990A

JPH11513990A - 鮫軟骨エキス

Info

Publication number: JPH11513990A
Application number: JP9516934A
Authority: JP
Inventors: デュポン，エリック; ブラゾ，ポール; ジュノー，クリスティーナ; アシュ．マエス，ダニエル; メアナス，ケネス
Original assignee: レラボラトワールエテルナインコーポレイティド
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 1999-11-30
Also published as: ES2190475T3; CZ129398A3; IS4728A; DK0859622T3; RU2181292C2; PL187989B1; CA2236021A1; IL119030A; US6025334A; NZ313957A; BG102419A; EP0859622B1; NO981781D0; CO4750839A1; DE69625698T2; KR100296016B1; HK1015683A1; HUP9802604A2; HU225490B1; JP2003246740A

Abstract

(57)【要約】本発明は軟骨エキス及びその製造方法に関する。抗脈管形成、抗腫瘍、抗炎症及び抗コラーゲン溶解活性を有する鮫軟骨エキスが改善された方法により得られた。この方法は水性溶液中の軟骨のホモジネート品を得る、このホモジネート品を固体画分（固体エキス）と、０〜500kDaの分子量の分子を有する液体エキスを得るために更に分画した液体画分として分ける。この液体エキスの組成を様々な方法により調べた。このエキスの更なる分画はその活性成分の一部の一次特性決定を供する。その全液体エキスの生物活性の多重性により、それは腫瘍増殖、脈管形成、炎症及びコラーゲン溶解より成る群から選ばれる成分を有するような様々な病気又は症状の処置のために利用できる。皮膚バリヤー機能を高める液体エキスの能力に基づくいくつかの化粧用途も本発明の範囲に属する。これらのエキスは正常な身体機能に対して有害な効果を及ぼさない。従って、これらの鮫軟骨エキスは非常に有望な治療的価値を有する。軟骨エキスを得るための方法は簡単且つ効率的である。この方法により得られる驚べきほどに価値のある製品は従って新規であり、且つ自明でない方法の指標となる。

Description

【発明の詳細な説明】鮫軟骨エキス発明の背景軟骨は無血管組織であり、そして抗脈管形成因子を含む潜在的な候補として研究されている。これは腫瘍発症に対して比較的耐性である組織でもある。軟骨に関わる腫瘍である軟骨肉腫は最低限に脈管形成した固体腫瘍である。脈管形成は腫瘍の発症における重要な要因の一である。独立した固体腫瘍性塊は、腫瘍細胞が隣接し合う脈管ネットワークを広げてその栄養要求物を供給するようになったときに出現する。従って、脈管形成の刺激に関与する因子が腫瘍の発症におけるその役割について研究されており、そして抗脈管形成因子及び脈管形成阻害活性を有する薬剤も腫瘍の増殖をコントロールする又はその退化を及ぼすための手段として調べられている。子牛の肩甲軟骨が固体腫瘍の脈管形成を阻害する物質を含むことが発見されている（Langerら、1976）。その抗腫瘍剤としてのすばらしい潜在能力を理由に、軟骨のより多大な供給源が探されている。鮫はこの種の抗脈管形成性インヒビターの潜在的な起源であり、その理由はその外骨格が全体的に軟骨より成るからである（その体重の６％、それらに対し、子牛では0.6％）。鮫は腫瘍が発生しにくいという性質の興味ある特徴も有する。この鮫の腫瘍の低い発症率を説明する数多くの仮説が立てられている。Marcha lonisら（1990）は任意の攻撃性因子を容易に攻撃できるIgM抗体を示した。McKi nneyら（1990）は鮫が、新形成細胞から正常細胞を識別でき且つ前者を破壊できるマクロファージを有することを示した。Rosen an d Woodhead（1980）は板鰓類（鮫及びえいを含む群）における腫瘍の稀少性がその高い体温に匹敵するその組織の高いイオン強度に基づきうることを推定している。このような条件下で、これらの著者はこの免疫系が100％に近い免疫学的監視を発揮するものと信じている。Mooreら（1993）は鮫が抗菌及び抗原虫特性を有するアミノステロールを生成することを発見した。最後に、Lee及びLanger（1 983）並びにFolkman及びKlagsbrum(1987)は鮫が新生脈管形成を阻害する物質を生成することを示した。Lee及びLanger（前掲）はこの物質を鮫の軟骨から変性条件で抽出することにより単離した（グアニジン抽出）。しかしながら、この抽出工程は非常に長くかかり（41日）、変性した因子を有するエキスを供し得、そして活性成分の効率は優れたものからはほど遠いものである。子牛から単離した活性物質は約16キロダルトン（kd）の分子量を有するが、同じグループの再研究者は鮫において回収されたものの正確な分子量を得ていない。この物質は3500Da より大きい分子量を有するとしか定義されていない。Oikawaら（1990）はLee及びLangerにより発表のものと同じ抽出方法を適用したが、その時間ははるかに短いものである（41日ではなく、２日）。Oikawaらにより鮫軟骨から単離された抗脈管形成物質は1000〜10,000Daに範囲する分子量を有する分子に限定されている。Schinitsky(USP 4,473,551号)は粗粉末化鮫軟骨の水エキスを発表しており、その100,000Da以上の画分が単独で又はグルコサミンと組合さって抗炎症活性を有した。抗脈管形成又は抗腫瘍活性を有するこのエキスの成分の示唆はこの特許においてはなされていない。Kuetnerら(USP 4,746,729号)は牛軟骨から多形核好中球(PMN)エラスターゼインヒビターを単離した。このインヒビターは50,000Da 未満の分子量の分子の保持された軟骨の水性エキスより得られる。Sephacryl S- 200の分画は数多くの画分を供し、そのうちの10〜40kDaがプール後に抗エラスターゼ活性を発揮した。活性成分は9 .5の等電点を有し、そして約15,000Daの分子量を有し得る。Kuetnerら(USP 4,04 2,457号)は牛軟骨が、内皮細胞増殖に対して何ら活性のない細胞増殖阻害活性を有する50,000Da未満の分子量の成分を有することも示した。Balassaら(USP 4,82 2,607号)は水性溶液中の軟骨エキスを獲得しており、そのエキスは抗腫瘍活性を有する。しかしながら、我々はBalassaの方法の再現により得たエキスにおいて抗脈管形成活性を見い出せなかった。Spilburgら(USP 4,243,582号)は牛軟骨（グアニジン抽出）から65kDaの分子量及び3.8のpIを有する２種類の糖タンパク質を単離し、それらは抗トリプシン活性及び内皮細胞増殖阻害活性を示す。子牛及び鮫軟骨は数多くの生物活性、例えばプロ炎症活性、抗炎症活性、抗脈管形成活性、リゾチーム活性、細胞増殖促進活性、Ｉ及びIV型コラゲナーゼ、エラスターゼ、並びにその他のプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン及びプラスミンに対する阻害活性を含む。しかしながら、誰もまだ、臨床的に価値のある活性体のプールを含んで成る軟骨エキスを得ていない。鮫軟骨はウサギ角膜ポケットアッセイ又はヒヨコ漿尿膜(CAM)アッセイにおいて一般的に試験される。今日まで、完全粉末化軟骨がin vivoで腫瘍に対して直接、ヌードマウスに移植されたヒト黒色腫異種移植片に対して(USP 5,075,112号 )、並びにCAM試験でその抗脈管形成効果について試験されている。抗腫瘍効果は軟骨エキスに向けられているが、この効果は腫瘍に対する血液供給を枯渇させる抗脈管形成成分にほとんど寄与するものである。今日まで、鮫軟骨が腫瘍細胞増殖に対して直接的な効果を有するという証拠がなかった。鮫軟骨エキス及び画分を獲得するためのいく通りかの方法が既に知られている。そのいくつかは全抽出することなく粉末化粗軟骨を生成する(USP 5,075,112号)。その他はグアニジンの如き変性剤を使用する(USP 4,243,582号) 。その他は軟骨のまわりの任意の筋肉、神経又は脈管構造を除去するための酵素消化を介する軟骨の前処理を実施しており、その前処理段階に有機溶媒中での脂肪の除去、それに次ぐ活性成分を水性相の中での抽出が続く(Balassaら、USP 3, 478,146、4,350,682、4,656,137及び4,822,607号)。かかる前処理の生物活性軟骨成分の保全性の保持に対する効果はわかっていない。もし強すぎると、酵素消化は活性タンパク質成分を加水分解しうる。例えば、Balassaの方法(USP 4,822, 607号)は抗脈管形成活性のない液体エキスを供する。この損失はかかる酵素分解の結果でありうる。Balassaの方法はエキスを活性成分において更に濃厚にする分画段階を含まない。その他は単に不溶性材料の除去による軟骨の水性エキス（水中(USP 4,473,551)又は塩溶液(USP 4,746,729)を生成する。この中でとりわけ、特定の分子量の特定の画分が更なる研究及び精製のために保持されている。（上記を参照）。上記の方法はいくつかの欠点を有する。それらは一部の価値ある成分を変性しうる。このような場合でないとき、それらは実用的な目的のためには長すぎるという欠点を有する。更に、この長い方法は必ずしも十分な量の活性成分を供せず、そして回収された成分のうち、一部は全く回収されないかもしくは検出できるほどの活性を示すのには不十分な量で回収され、又は一部は特定の活性の獲得を焦点とすることにより廃棄されている。脈管形成は癌の発症に関与するのみでない。様々な生理系（かっこの中に示す）に影響する数多くの病気又は症状は脈管形成依存性であり、とりわけ下記に例示するものである：関節炎及びアテローム硬化性プラーク（骨及び靭帯）、糖尿病性網膜症、脈管新生緑内障（目）、乾癬、強皮症、しゅさ、血管腫及び過形成性瘢痕（皮膚）、脈管接着及び血管線維腫（血液系）。従って、任意の新規、且つ潜在的な抗脈管形成「因子」がこのような病気の処置、並びに癌治療及びそのその他の脈管形成依存性病の治療において有用でありうる。しかしながら、多くの上記の病気及び症状は抗炎症成分も伴うため、任意の新規且つ潜在的な抗炎症「因子」もこのような病気及び症状、並びに任意のその他の炎症性疾患又は病状に有用でありうる。更に、コラゲナーゼの如きプロテアーゼは癌及び早発性老化の如き様々な病気及び症状に関与するため、新規且つ潜在的な抗コラーゲン分解性「因子」がコラーゲン分解性成分を有する病気又は症状の処置において有用でありうる。脈管形成、炎症及びタンパク質分解は単独で、又は多種多様な病気又は症状を共に遭遇しうるため、正常な身体機能に悪影響を及ぼすことなく少なくともこれら全ての活性と対抗できる製品が偉大な治療価値を有するであろう。発明の記述本発明は、治療的に価値のある複数の活性を含む利点を有する軟骨エキスを生成する新規な方法を提供する。とりわけ、抗脈管形成、抗炎症、抗コラーゲン溶解、in vivo抗腫瘍増殖及び直接的in vitro抗腫瘍増殖活性が鮫軟骨エキスの中に満足たる濃度で存在することが確認された。その他の活性は同定又は確認が待たれる。活性は全て鮫軟骨の液体エキスにおいて得られ、そしてその一部はその固体エキスにおいて獲得又は確認された。本発明は完全軟骨の中に存在する生物学的に活性な水溶性成分の実体部分を有する軟骨の液体エキスの獲得のための新規の方法に関連し、この方法は下記の段階を含んで成る。ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性の保持に適合する条件下で、前記軟骨が約500μｍ以下のサイズの粒子にまで縮小され、粒子と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物が得られるまでホモジナイズする；ｂ）前記ホモジネート物を遠心分離して粒子を粗液体エキスから分離する；そしてｃ）約500kDa以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液体エキスが得られるように前記粗液体エキスを更に分離する。この新規の方法は実施し易い及び効率的であるという利点を有する。高収率の軟骨エキスが得られ、このエキスは特に鮫軟骨から得られたものであり、少なくとも上記の生物活性は全て含む。好ましくはこれは低温で（約０〜20℃）、非変性条件下で（好ましくは純水の中で）、中性付近のpHで（約５〜８）、未知の生理化学的特徴の化合物が回収できる可能性を最大限とするようにして実施する。本方法に従えば、軟骨成分は少容量の溶液（１kgの軟骨当り１Ｌ）で、短時間（ 10〜20分ほどの短さ）のホモジナイゼーションの後に得られる。固体エキスの回収のために同じ方法が利用されるが、ただしペレットを回収及び凍結乾燥し、上清液は捨てる。本発明は軟骨エキス、特に板鰓類の種、より詳しくは鮫に由来するエキスに関する。固体エキスは活性を示す。それはコラーゲン及び非水溶性成分を含みうる。これは全液体エキスの中に抽出されるものの残留活性も含みうる。この全液体エキスは活性に非常に富む。これはそのまま、又は濃縮して使用できうる。生物活性の維持を優先する濃縮工程が特によい。加熱エバポレーションの如き活性成分を劣化しうることを頼りとする方法は慎重に回避する。約１kDaの分子量カットオフ値を有する膜上での限外濾過が本発明の液体エキスの濃縮に利用される。約100Daの分子量カットオフ値を有する膜上でのナノ濾過は液体エキスの生物活性（抗脈管形成性、抗コラーゲン溶解性）を濃縮するのに更によい。その結果、約0.1〜約500kDaより成る分子量の分子を含む濃縮エキスを試験した。液体エキス（０〜500kDa）を更に分画してその活性成分を特性決定した。数多くの活性画分が様々な方法により得られた。腫瘍細胞系に対するその抗腫瘍活性について試験したその一部をその分子量及び等電点で大まかに特性決定した。その他は活性、特に抗コラーゲン分解性又は抗脈管形成性で割りふった。これらの画分は完璧な特性決定及び同定が待たれる。従って、価値ある活性は全液体エキス及びその画分において回収され、それは好適に利用されうる。多量の粉末型軟骨を投与する代わりに、より許容され且つ濃厚なエキスがこれにより投与できうる。本発明は更に上記の軟骨エキスのいづれかを有効な量で活性成分として含んで成る任意の治療用又は化粧用組成物に関する。最も関心あるのは皮膚学又は化粧学において有用な製剤にある。この関心は軟骨エキスの観察された活性に由来する。この観点において、観察された抗脈管形成、抗コラーゲン溶解及び抗炎症活性、並びにケラチノサイト中のタンパク質キナーゼＣの如きシグナル生成経路により媒介される細胞分化の対抗作用は、炎症又は刺激の低下、しわ又は皮膚萎縮の制御、早発性老化の遅延化、座瘡の軽減、皮膚バリヤー機能の向上、目のまわりの暗色輪の軽減、くも状静脈及び静脈瘤の削減、いぼの退縮、並びに皮膚円滑効果のための組成物及び方法における鮫軟骨エキスの利用の途を開くものと考えられる。かかる方法は本発明の範囲に属する。更に、鮫軟骨液体エキスは癌、関節炎、乾癬及び座瘡症例において有効に試験されているため、腫瘍増殖、脈管形成、炎症及びコラーゲン溶解より成る群から選ばれる１又は複数種成分の伴う病気又は症状を処置するための組成物及び方法が本発明の範囲に属する。発明の説明本発明は添付図面に示す特定の態様を介して一層良く理解されるであろう。この態様は例示であり、本発明を限定するものではない。図面の簡単な説明図１は液体エキスの特定のアミノ酸組成を示す。図２はZR75-1及びMCF-7細胞系に対する鮫軟骨（固体エキス）の用量−応答性阻害活性を示す。図３は２通りの濃度の固体軟骨エキスを有して又は有さないでの上昇していく濃度のエストラジオールの存在下でのMCF-7細胞の量の用量−応答性曲線を示す。図４ａ）及びｂ）はギャベージ水（Ａ）又は固体と液体軟骨エキスの組合せ（Ｂ）の投与されたラットの乳腺腫瘍切片の比較を示す。図５は腫瘍において脈管形成面積が50％縮小した軟骨処理ラットを示すヒストグラムである。図６は液体軟骨エキスが線維芽細胞増殖に対して何ら効果をもたないことを示す。図７はHUVEC増殖に対する液体軟骨エキスの用量−応答性曲線阻害を示す。図８は液体軟骨エキスがTPA−誘導化ケラチノサイト分化を阻害することを示す。図９はコラゲナーゼ活性に対する液体軟骨エキスの用量−応答性曲線阻害を示す。図10は胎芽脈管形成試験(ex vivo)に対する液体軟骨エキスの用量−応答性曲線阻害を示す。図11はマウスにおける腫瘍増殖阻害に対する液体軟骨エキスの様々な用量での効果を示す。図12は液体軟骨エキスの腹腔内投与が当該製品の腫瘍増殖を阻害する効能を有意に高めることができることを示す。図13はRotoforで分離した液体画分の非変性条件下での電気泳動プロフィールを示す；分子量マーカーは左にあり、それに単離画分の比較のための分画前の液体エキスサンプルが続く。図14は10,000Da未満の分子量を有する本発明の全液体エキスの画分のHPLC移動パターンを示し、その画分は濃縮され、そして５つのサブ画分に分けられている。図15は我々の発明の鮫軟骨の液体エキスの２つの画分で得られたEVT結果を示し(DUP)、一方は10,000Da未満の分子量を有するものであり、他方は10,000Daより大きい分子量を有するものである。図16は３種類の鮫軟骨のエキスのFPLC移動パターンを示す。パネルＡにおいて、DUPは本発明に係る鮫液体エキスである。パネルＢ及びＣにおいて、BAL及びOI KはそれぞれBalassaら及びOikawaら従来技術のエキスである。図17は図17の中に定義と同一のエキスのHPLC移動パターンを示す。図18は本発明と従来技術の液体エキスのCZE比較を示す。Ａ＝DUP ；Ｂ＝BAL ；Ｃ＝OIK。図19は本発明と従来技術の液体エキスのEVT比較を示す。図20は本発明と従来技術のアミノ酸含量の比較を示す。図21は、有効量の濃縮液体軟骨エキスを含む局所組成物で処置したときの（下部写真）、初期症状（上部写真）と対比しての、一方は角質増殖症を伴う（22ａ）及びｂ))、そして他方は角質増殖症を伴わない（22ｃ）及びｄ))乾癬に苦しむ２人の患者の症状の有意な改善を示す。図22は液体軟骨エキスで処置したヒトの顔におけるくも状静脈の外観の改善を示す。図23は液体軟骨エキスで処置したヒトの目のまわりの暗色輪の外観の改善を示す。図24は液体軟骨エキスで処置したヒトの足の静脈瘤の外観の改善を示す。図25は有効量の液体軟骨エキスを含む局所組成物で処置したときの（下部写真）、患者の初期症状（上部写真）と対比しての、座瘡に苦しむ彼女の症状の有意な改善を示す。図26はヒト皮膚に対する液体軟骨エキスの抗炎症性効能を示す。図27は液体軟骨エキスで処置したヒトの皮膚のバリヤー機能の改善を示す。特定の態様において、軟骨はブラック・スパイニー・ドッグ・フィッシュ（Bl ack Spiny Dog Fish）及びコモン・スパイニー・ドッグ・フィッシュ(Common Sp iny Dog Fish)の健康な鮫より得た。筋肉及び接続組織を全てエタノール処理したスパチラ及びハサミでかき取ることによって除去した。次いで軟骨をプラスチックバッグの中は真空充填し、そして更なる使用まで−20℃で凍結した。本方法の態様において、任意の軟骨起源が使用できうる。我々は背景の章に記載の理由により鮫軟骨を選定した。板鰓類軟骨（これはこの群の動物種として鮫及びえいを含む）から出発すると、ほぼ同等の製品が得られるであろうと信じている。これらの製品はおそらくは、哺乳動物軟骨起源を使用したとき、活性主成分の種類及び濃度の双方において異なるであろう。抽出前の軟骨の調製における任意のバリエーションはそれが注目の製品（全液体エキス又はその特定の画分等）の活性に実質的な影響を及ぼさない限り、利用してよい。いくつかの活性成分は軟骨の任意の周囲組織を除去するためのBalassaら(USP 4,822,607号)に教示の如きタンパク質分解消化に耐えることができ、一方その他はかかる処理に耐えないことがある。かかる前処理に耐えないようである活性の一つは抗脈管形成活性である（図19）。従って、別々の活性であると認定された水溶性活性成分の可能な限り全てを含む液体エキスを作ることを所望するなら、抽出手順の際の消化段階は過剰な加水分解又はタンパク質分解を阻止するために回避又は慎重にモニターすべきである。軟骨エキスの調製新鮮、４℃に融解又は凍結した清浄な軟骨を使用した。軟骨をエタノール殺菌したミートチョッパーの孔に適当な容量の水（当量（重量／容積）がほぼ最少容量であるが、価値ある成分の回収率に対して何ら影響を及ぼすことなく増やすことができる）と共に数回も（より詳しくは３回）通す。少容量が好ましく、なぜなら実用的な観点から、不必要な大容量よりも操作により好都合だからである。実際には、水は逆浸透及び0.1μｍフィルターに至る多重濾過により精製した。数多くの水性溶液（例えば塩を含む）が水の代わりに使用できる。複数の水溶性活性体の回収が完了したとき、中性pH付近及び非変性条件での作業が一部の軟骨活性成分の溶解又は変性のために好ましい。水性溶液中の未知のタンパク質の挙動は推定できない；一部は酸性pHの中で、そして一部は塩基性pHでより「快的」である。更に、一部のタンパク質はかかる変性が水性溶液中のこれらのタンパク質の再生に不可逆的な影響を及ぼさない限り、温和な変性条件下で抽出可能である。わかり易くは、生物活性水溶性軟骨成分の保持に適する任意の抽出条件が本発明の範囲に属する。従って、これらの要因の全てを考慮して、純水の中での軟骨活性成分の抽出工程は、構造及び挙動のまだ規定されていない成分を非常に良好な収率をもって回収するのに賢明な選択であることが示された。次に配合した軟骨／水をキッチンブレンダーで最大スピードで約４℃、20分かけて撹拌することによりホモジナイズした。ホモジナイゼーション中、ホモジナイゼーション温度はほぼ20℃まで高まる。むろん、撹拌スピード及び水性溶液の容量は抽出の時間及び収率の双方に影響しうる。従って、合理的な範囲のホモジナイゼーション時間(500μｍ未満の粒子に規定)は短くて約10分から長くて24時間であってよく、好ましくは約10〜60分である。この温度は酵素インヒビターを使用しないとき、内因性酵素による活性成分の任意の分解を回避するために約10 ℃未満に維持すべきである。理想的には、０℃に近い温度が所望されうる。通常かかる実験は温度が４〜10℃に維持された低温室で行われるため、この温度範囲は本方法において許容されるものとみなされる。わかり易くするため、「約４℃ 」なる語は以降この許容される温度範囲を示すために用いられている。このホモジネート品の液化は、ブレンダーが粒子サイズを十分に小さくしないなら、それをPolytron分解器に10分約４℃でかけることにより更に得られうる。他方、ブレンド品は単により機能的なブレンダー分解器の中でホモジナイズしてよく、我々はこれで液化工程を10分節約した。完了ホモジナイゼーション工程の終了時には、残留粒子サイズは約500μｍ未満となる。むろん、最初に粉砕した軟骨の獲得のために論じたのと同じ許容範囲の時間及び温度が同等に適用される。ホモジナイゼーション後の粒子のサイズは超微小である必要はない。従って、抽出前に軟骨を粉状化する必要性が回避できる。事実、それに反して、水性抽出前の粉末形態における軟骨の粉状化は、特にかかる粉状化を凍結乾燥状態及び／又は熱乾燥状態で実施するとき、価値ある活性を変性してしまいうる。ホモジネート品は13,600ｇで15分、約４℃で遠心分離し、その工程は上清液をペレットからす早く、且つ効率的に分離する一の手段である。これらのパラメーターのバリエーション及び調整は当業者の知識の範囲内であり、単にホモジネート品の容量及び使用する装置に依存する。得られるペレットを24〜48時間凍結乾燥した。この最初の画分は以下で凍結乾燥品又は固体エキスと定義する。この上清液は必要なら、24μｍ Whatmanフィルターで濾過し、限外濾過カラムの性能に影響され易い粒子を除いてよい。次いで濾過した材料を約500kDaの孔を有するタンゲンシャルフロー濾過カラムで約４℃にて限外濾過した。これは０〜約500kDaより成る分子量の水溶性成分を含んで成る第一粗浸透物の獲得を可能にする。この粗浸透エキスを0.22μｍのフィルターで濾過し、そして更なる使用のために無菌ボトルに小分けした。この画分を粗浸透物又は液体エキスと更に呼ぶ。他の高性能遠心分離手順がペレット及び上清液の獲得のために開発されている。13600×ｇで15分の遠心分離工程、それに次ぐWhatmanフィルターでの大まかな濾過を１μｍの孔のナイロンポケットの備ったCEPA遠心機での3000〜4000×ｇでの遠心分離に置き換えた。25kg／25ｌの調製品がこれにより30分以内に遠心分離でき、そして約29リットルの上清液が供される。得られる水性容量は出発水容量より多く、軟骨自体の水含有量の一部が回収されたことを示唆する。凍結乾燥品及び全液体エキスは下記のおよその組成を有し得、それはバッチ間で観察される、及び異なる材料を用いたときに観察されるバリエーションを大まかに考慮している：固体エキス：脂質 7.35％¹ タンパク質 46.2％² 水分 20.4％ナトリウム 4.16mg／ｇ³ カリウム 2.64mg／ｇカルシウム 114mg／ｇマグネシウム 1.49mg／ｇ亜鉛及び鉄微量液体エキス：脂質 0.10−0.20％¹ タンパク質 8−25mg／ml² 乾燥重量 8−25mg／ml 水分 97−99％ナトリウム 30−200 mg／ 100ｇ³ カリウム 30−40mg／ 100ｇカルシウム 2.0mg／ 100ｇマグネシウム 1.1mg／ 100ｇ亜鉛及び鉄微量 ^1,2AOAC Official(1984)章16.219−220及び2.055のそれぞれに公開の方法に従って測定。 ³ SAA手順に従って測定。タンパク質含有量はケルダール法により評価した。それは事実上有機窒素（Ｎ）を測定する。有機窒素は下記の式を利用して当量のタンパク質に変換する。タンパク質含有量（mg／ml）＝（％Ｎ×6.25）÷100 炭水化物は検出されず、それらがその他のエキスの中に存在し、プロテオグリカン及び／又はムコ多糖類の形態にあることを推定せしめうる。これらの化合物は測定されたレベルの水分の中に含まれる可能性がある。凍結乾燥品は予期できないレベルの水分を含み、それはOH基により測定される。20％の水分含量は軟骨において通常回収される炭水化物の％に近く、しかも凍結乾燥品の水分は０％に近いべきであるため、この仮説は確認する必要がある。液体軟骨エキスをそのアミノ酸含有量について分析した。全アミノ酸の平均量は約1.1mg／mlであり、遊離アミノ酸は0.67mg（61％）を占め、そしてタンパク質起源のアミノ酸は0.44mg（39％）を占めた。各アミノ酸の分布を図１に示す。有意な量のタウリンも検出された（図示せず）。液体エキス中に存在する主要アミノ酸は軟骨由来のタンパク質及びペプチドの代表である。例えば、リジン、グリシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸は液体エキスのアミノ酸含有量の大部分を示し、そしてコラーゲン中のＮ−テロペプチド分子内架橋の主成分である(Hansonら（1992）J.Bone & Min.Res．7 : 1251- 1258)。液体エキスの微生物限界値をUSP XX III＜61＞基準を適用して管理した。活性アッセイ固体エキス： in vitroアッセイ：これらのアッセイはホルモン依存性癌細胞系MCF-7及びZR75-1（ATCC(R)番号22 -HTB及び1500-CRL、それぞれ）で行った。ZR75-1 細胞：ａ．基礎RPMI培地：フェノールレッドの入っていない52ｇのRPMI 1640（Sigma R 8755）、17.875ｇのHepes(遊離酸；Sigma H0763)、0.55ｇのピルビン酸ナトリウム(Sigma P5280)及び10ｇのNaHCO₃を５ｌの純水の中で混合し、そしてNaOHでpH7.40にした。直ちに使用しないなら、この溶液を光不安定性物質を保存するために光から保護されなければならない。この溶液を濾過し、500mlの無菌ボトルに分注し、そして最長３ケ月間４℃で保存した。ｂ．細胞培養維持培地：基礎RPMI培地に10％（ｖ／ｖ）のFBS(胎児牛血清)、100 ＵのペニシリンＧ／50μｇの硫酸ストレプトマイシン(Sigma P0906)／ml培地、２mMのＬ−グルタミン(Sigma G1517)及び１nMのＥ₂(β−エストラジオール)(Sig ma E8875)を添加した。ｃ．実験用培地：基礎RPMI培地に５％のFBSA（デキストラン−チャーコールに吸着させた胎児牛血清）、２mMのＬ−グルタミン、100ＵのペニシリンＧ／50μｇの硫酸ストレプトマイシン／ml培地及び50ng／mlのインスリン(Sigma)を添加した。この培地に様々な濃度の上記の凍結乾燥品及び様々な濃度のＥ₂(10^-12〜10^- ⁵ ｍ)を添加した。MCF-7 細胞：ａ．基礎DME-F12培地： DME-F12培地(炭酸水素塩なし、且つフェノールレッドなし：Sigma)を製造者の仕様書に従って純水で再構築した。１リットル当り1.2ｇの炭酸水素ナトリウムを加え、そしてpHをNaOH／HClで7.40にした。この溶液を濾過し、500mlの無菌ボトルに分注し、そして４℃で最長３ケ月保存した。ｂ．細胞培養維持培地：基礎DME-F12培地に10％（ｖ／ｖ）のFBS(胎児牛血清)、 100ＵのペニシリンＧ／50μｇの硫酸ストレプトマイシン／ml培地、２mMのＬ− グルタミン(Sigma)及び１nMのＥ₂を添加した。ｃ．実験用培地：基礎DME-F12培地に５％のFBSA（デキストラン−チャーコールに吸着させた胎児牛血清）、２mMのＬ−グルタミン、100ＵのペニシリンＧ／50 μｇの硫酸ストレプトマイシン／ml培地及び50ng／mlのインスリン(Sigma)を添加した。ZR75-1細胞について前述した通り、凍結乾燥品及びＥ₂を同じ濃度で添加した。ｄ．FBSAの調製：胎児牛血清を１％（ｗ／ｖ）のチャーコール（炭素脱色用アルカリ）と混合した。デキストランＴ70の溶液をチャーコール血清溶液に加えて0. 1％（ｗ／ｖ）の濃度にした。この混合物を４℃で一夜撹拌した。４℃で30分10, 000×ｇで遠心分離後、血清をデカントし、再び同じ割合のチャーコール及びデキストランと混合し、室温で３時間撹拌し、そして再遠心分離した。次いでその血清を56℃で20分熱不活性化し、滅菌濾過し、そして無菌コニカルファルコンチューブに小分けした。実験用培養アッセイ及び結果： ZR75-1及びMCF-7細胞を24穴プラーク上で20000細胞／ウェルの集団密度又は６穴プラーク上で150000細胞／ウェルの集団密度に達するまで増殖させ、そして上記で調製した様々な濃度の凍結乾燥品の存在下又は非存在下で処理した。その後、固体軟骨エキスを培養培地に再懸濁し、そして滅菌濾過し、その水溶性成分を回収し、そして試験した。実験は全て三重測定で行った。２日毎に培養培地を抜き取り、そして新鮮培地と交換した。細胞を５％のCO₂を含む恒湿雰囲気下で37 ℃にて17，７，３又は３日間、第一、第二、第三又は第４実験に対応させて増殖させた。細胞増殖阻害は細胞の直接計測により、又はウェルの全DNA含量の測定により測定した。上記の細胞増殖阻害率は固体軟骨エキスが用量依存式にこれら２種類の細胞系の細胞の増殖を阻害できることを示す。図２は50及び100mg／mlの固体エキスが処理の３日後にこれらの細胞系に対して形成不全を明確に誘導することを示す。図３は、10^-12〜10^-9Ｍのエストラジオールの存在下で、処理細胞はこのようなホルモン用量率により刺激されていないことにより、コントロール細胞と同様に応答したことを示す。しかしながら、１nM以上では、コントロール細胞は強力に刺激され、そしてDNAの濃度は10^-7Ｍのエストラジオールの存在下で3.75μｇに達した（それに対し、エストラジオール抜きでは0.69μｇ）。30及び50mg／ml の凍結乾燥品により処理した細胞では、最大刺激で測定したDNAはそれぞれ1.9及び1.8μｇであった。図３はエストラジオールに関して処理した細胞の親和定数（Km）が、30及び50mg／mlの存在下でそれぞれ、コントロール細胞のKm値（11.7nM）よりも３及び16倍高い（31.3nM及び174.0nM）ことを示す。このことは、より高い濃度のエストラジオールが、固体軟骨エキスが存在しているときに同じ細胞増殖を達成するのに必要であることを意味する。従って、このエキスは最大応答（その90％の阻害）を小さくし、そしてエストラジオールに対する処理細胞の親和定数を高める。 in vivoアッセイ：DMBA 誘導化ラット乳癌モデルａ．試験方式の説明： 400匹の生後40日の雌Sprague-Dawleyラットに12日間かけて馴らした。その時点で、20mgのDMBA／１mlのコーン油（９，10− ジメチル−１，２−ベンズアントラセン；Sigma Chemical Co.より購入）をギャベージにより投与した。この処理の３ケ月後、乳癌の発症した240匹のラットを選び、そして２つのグループに分配した。第一グループは５匹のサブグループのラットより成る。処理グループのラットには８週間にわたって毎日３mlの水中の上昇していく濃度の凍結乾燥エキスを投与し、一方コントロールグループには同容量の水を与えた。第二グループは４匹のサブグループのラットより成る。処理グループのラットには10週間にわたり液体エキスと組合せた又は組合せていない３mlの水の中の凍結乾燥品を毎日投与し、一方コントロールグループには同容量の水を与えた。第二グループのラットのうちの一のサブグループのみに3000mg／ kg／日の濃度の凍結乾燥品で処理し、そして３mlの液体エキスもより少ない用量の液体エキス（１mlの水中約８mgのタンパク質）の腹腔内（i.p.）注射で与えた。ラットは２回の実験の始めには151〜175ｇの体重であり、そして食事及び水を適量与えた。第一グループのラットは平均直径0.9cmの腫瘍を有し、一方第二グループのラットは平均直径0.6cmの腫瘍を有した。ｂ．抗腫瘍活性：その結果を以下にまとめる：これらの結果は凍結乾燥品が胃腸管の中で吸収され、そして腫瘍の進行を遅める活性成分を含むことを示す。この阻害は腫瘍細胞に対する直接効果であるか、又は腫瘍増殖を妨げる抗脈管形成媒介効果でありうる。液体エキスは阻害活性も含み得、なぜならその投与は約６％の腫瘍サイズの更なる縮小を及ぼすからである。これらの結果は凍結乾燥品が水溶性でない活性成分を含みうる及び／又はそれが残留水溶性活性成分を含みうることも示唆する。従って、究極的には、収率をまだ改善したいない、水溶性成分を最大限に回収するようにペレットを水性溶液の中で再抽出してよい。ｃ．組織病理学：固体軟骨エキスの無毒性を評価するため、上記のin vivo実験で用いた動物を断頭により殺し、そして下記の組織を分析のために採取した：肝臓、肺、腎臓、心臓、脳、筋肉及び乳腺。これらの組織から脂肪を除去し、その後それらをBouin流体の中に２日間固定した。エタノールで脱水後、固定化組織をパラフィンに包埋した。その切片を獲得し、そしてガラススライドの上に載せ、ヘマトキシリンで染色し、そして顕微鏡で見た。組織学的検査は大用量の固体エキスのみを用いたとき又は液体エキスと組合せた固体エキスを用いたとき、有害な効果がないことを示した（データーは示さず）。このことは、凍結乾燥品及び液体エキスが選択的な腫瘍サイズ退縮活性を有することを示唆する。乳腺腫瘍において（図４ａ及びｂを参照）、血管の面積の重要な縮小（55％）が固体及び液体軟骨エキスを受容したラットのグループにおいて観察された（図５）。腫瘍サイズの縮小はその脈管形成の重要な低下、腫瘍細胞に対する直接的な効果、又は双方の現象の組合せに基づきうる。in vitroホルモン依存性細胞において直接的な形成不全効果が観察され、それはin vivoで確認する必要がある。上記の結果は液体エキスがZR75-1細胞に対する固体軟骨の効果を上わまわる上昇効果を有することを実証するため、その成分を更に調べた。液体エキス in vitroアッセイ：腫瘍細胞系：いくつかの腫瘍細胞系を液体軟骨エキスの存在下で増殖させて固体エキスにより観察される形成不全（上記章）があるかを調べた。簡単には、細胞を96穴プレートの中でプレート培養し、そして培養培地（各細胞タイプに特異的：例えば、MCF-7細胞を上記の章に記載の通りに増殖させた）の中で様々な液体エキスの存在下又は非存在下で増殖させた。細胞増殖は培養の３〜５日後にMTTアッセイを利用して測定した。腫瘍細胞系は下記の通りとした： CHANG ：腫瘍肝細胞 Hep-G₂：腫瘍肝細胞 A2780 ：卵巣アデノ癌腫細胞 MCF-7 ：乳アデノ癌腫細胞（エストロゲン依存性） MCF-7-ADR ：乳アデノ癌腫細胞アドリアマイシン耐性液体軟骨エキスは全ての腫瘍細胞系に対して抗増殖活性を示した。最後の阻害 50％及び80％がMCF-7及びA2780細胞のそれぞれに対して8.5mg／ml（乾燥重量液体エキス／培養培地１ml）の濃度で得られた。非凍結乾燥及び凍結乾燥液体軟骨エキスは腫瘍細胞増殖を阻害するその能力において同等であった。このことは、阻害因子がこの濃縮手順で変性しないことを示唆する。一次培養細胞：ａ．脈管新生緑内障：腫瘍細胞に対する活性の特異性を評価するため、限外濾過を経て得られる透過物を正常線維芽細胞である間葉起源細胞、ヒトTENON線維芽細胞(HTF)に対して試験した。２人の患者（一方は脈管新生緑内障NVGを有し、他方は一次開放角緑内障POAGを有する）由来のHTFのみを利用した。 HTFの継代培養及び維持：各集密培養物を0.5mlの0.05％のトリプシン／0.5mM のEDTA(Gibco 610-5300 AG)での37℃で５〜10分の洗浄及び脱離により継代した。15％の胎児牛血清(FBS)を含む1.5mlのDME／F-12 培地をトリプシン／EDTAを中和するために添加した。細胞の会合は、粉砕そして25cm²Ｔ−フラスコに移し入れ、それに10％(FBS)を含む更なる培地を添加することにより行った。集密に達したら、HTFを75cm²のＴ −フラスコに移し、そして最後に180cm²のＴ−フラスコに移した。十分な細胞が得られたら、一部の細胞を下記の実験のために利用し、そして残りは更なる実験のための同一の継代を保存するために同時に凍結した。実験プロトコール：集密に達したら、２又は３本の同一の180cm²のＴ−フラスコの中に増殖する一人の患者由来の細胞を上記の手順により解離させた。短時間の低速遠心分離の後、それらを256チャネライザーの備ったZMIカルターカウンター 216013で計測した。その後の全てのin vitro実験において、約50万個の細胞に１％のFBSを含む１m lのDME／F-12培地でそれぞれ16mmの皿及び12穴プレートの中で接種した。接種の 17時間後、１％のFBSの付加された１mlの新鮮な同じ培地を加えた。実験のデザインに応じて（上記及び下記参照）、１％のFBS培地にGF（成長因子）を添加するもしくはせず、及び液体軟骨エキスを添加し、そして滅菌濾過した。この日に（０日）、一部の細胞サンプルを計算してプレート効率を決定した（それは95％以上であるべきである）。実験の開始から48時間後、細胞をすすぎ、解離し、そして再び計測した。細胞の数は「絶対」コントロールで得られるものの％として表示した。１％又は５％のFBSをそれぞれ含む各「絶対」コントロール、並びに１％のFBS 及び個別にGF又は液体軟骨エキスを含む各実験グループは三重サンプルより成る。各実験は同時に１又は２人の患者の細胞に対して実施し、そして少なくとも２回繰り返した。これらの実験において、GF、ブタ血小板由来成長因子(pPDGF)及びヒト組換塩基性線維芽細胞成長因子(hr bFGF)(Farmitalia Carlo Erba，Milan，ItalyよりD r.P.Brazeauに贈呈)を１％のFBS中で10〜100ng／mlの濃度でそれぞれ加えた。実験の開始から48時間後、細胞をトリプシン−EDTAにより分散させ、そしてカルターカウンターで計測した。以下に示す三重測定値（第１，２及び３行）は全てウェル当りのカウント数の20分の１に相当する。結果：これらの結果を図６にまとめる。HIFは53才の男性の緑内障より獲得した。PDGF及びbFGFの如き成長因子はHTFに対する刺激活性を示したが（^*ｐ＜0.02，^** ｐ＜0.01；Student-Fisher検定により決定）、効果なし、陽性又は陰性がこれらの細胞を軟骨液体エキス（１kg／２ｌ）の存在下で増殖させたときに得られた。このことは、腫瘍細胞に対する液体軟骨エキスの形成不全活性が万能でなく、そして線維芽細胞の増殖に影響しないことを示す。この軟骨エキスはその他のタイプの線維芽細胞、HSF(ヒト皮膚線維芽細胞；データーは示さず)に対しても効果がなかった。たとえ試験していなくても、固体エキスも正常細胞に対して効果を及ぼさないと推定される。ｂ．ヒト臍帯静脈(HUVEC)由来の内皮細胞： HUVECをJaffeら（1973）に記載の通りにしてコラゲナーゼ調節消化により抽出した。14回の継代（各継代においてトリプシン−EDTA）前に純粋な内皮細胞を利用した。細胞の品質をジ−アセチル L DLを組込む能力及び第VIII因子でラベルされる能力について分析した。内皮細胞を2500細胞／cm²の密度でゼラチン被覆無菌皿でプレート培養した。細胞を完全培地(Med 199＋ヘパリン（90μｇ／ml）＋Ｌ−グルタミン（２mM）＋炭酸水素塩＋FBS(10％)＋ECGS(120μｇ／ml)で24ｈ培養し、細胞接着を確保する。次いで細胞をPBSで３回洗い、そして培養培地を実験条件に従って添加した。最後のPBS洗浄を０時間目とした。各実験を三重測定で実施し、そして統計学的分析を比較のために行った。培養培地を24ｈ後、そして１日置きに交換した。培養の168ｈ後、BrdU（最後10mM）を各培養培地に加え、そして37℃で２ｈインキュベーションした。次に細胞を短いトリプシン−EDTA消化により遊離し、そして96穴プレートに移してBrdUのELIS A検出を可能にした。ELISAはBoehringer Mannheim Kit及び方法で実施した。コントロールは細胞抜きで行い、バックグランドの基底レベルを決定した。別のコントロールは、液体軟骨エキスが細胞接着に影響するかどうかを排除するため、インキュベーション期間の終了時に培養培地中のDNA含有量を測定することにより実施した。細胞増殖はペトリ皿の中に存在するDNAの量でも評価した。各実験を三重測定で実施し、そして統計学的分析を比較のために実施した。培養培地は毎日交換した。培養の168ｈ後、細胞をNa−クエン酸−SDS溶液で溶解し、そしてHoescht 33 358とインキュベーションした。サンプルをスペクトロフルオロメーターで365nm で読んだ。最後に、ペトリ皿の中に存在する細胞の量を酸性ホスファターゼ活性を測定することにより評価した。各実験を三重測定で実施し、そして統計学的分析を比較のために行った。この酵素の活性はペトリ皿中の内皮細胞の数との強い相関を示した（BrdU組込及びHoeschtラベリング；データーは示さず）。酸性ホスファターゼ活性はSigma Chemical Company由来のキットで測定した（若干の改良を伴い、製造者の手順に従う）。結果は液体軟骨エキスによる内皮細胞増殖の用量依存式阻害を示した（図７）。得られるED₅₀は約90μｌの液体エキスである（液体エキス中に存在する約1.5m gの乾燥重量に相当）。ｃ．ケラチノサイト：液体軟骨エキスを、ケラチノサイトにおいて試験し、その細胞性形質導入経路の既知の作動因子であるトリホルボールアセテート(TPA)によりプロテインキナーゼＣ(PKC)は活性化しておいた。正常なヒト内皮ケラチノサイトは一次培養により樹立した(Matsuiら（1992）J.Invest.Dermatol．99 : 5 65-571)。培養は改良MCDB 153製剤中の内皮成長因子（10ng／ml）、インスリン（５μｇ／ml）、ヒドロコルチゾン(0.5μｇ／ml)及び牛下垂体エキス（70μｇ／ｍ）を含む無血清規定培地(KGM)の中で増殖させた。ケラチノサイトを70％の集密度まで増殖させ、そして新鮮培地を再供給してから48ｈ後、200ng／mlのTPA又は２μｌ／mlのDMSOにより、更なる追加の再供給抜きで処理した。様々な濃度の液体軟骨エキスを培養培地に加える又は加えなかった。これらの結果はケラチノサイト増殖に対する液体エキスの効果を示さなかった。それは増殖のTPA誘導阻害に対しても影響を及ぼさなかった。しかしながら、液体軟骨エキスはTPA誘導ケラチノサイト分化を阻害することができた（図８）。ケラチノサイトの分化レベルはTPAにより５倍上昇した。液体軟骨エキスそれ自体は角化封入形成に対して効果がなかった。しかしながら、その存在はTPA 誘導角化封入形成を約60％以上阻害した。近年の公開物はPKC活性化が正常なケラチノサイトを、増量したインターロイキン−８（IL-8）を生成させるようにすることを示した。インターロイキン−８は炎症の媒介因子である(Chabot-Flechterら（1994）J.Invest.Dermatol．103： 509-515)。更に、乾癬ケラチノサイトは非常に大量のIL-8を生成し、それは乾癬プラークにおける新生脈管形成を更に促進する(Nickoloffら（1994）Am.J.Pathol．144：820-828)。その他の成長因子及びインテグリンも関与し、そして関与しうる標的分子種を広げることが重要でありうる(IL-1, TNF、等)。我々はTPA誘導が乾癬ケラチノサイトを擬態することはわからない。もしそうなら、これらの結果は軟骨がin vivoで正常ケラチノサイトに対して効果がなく、一方それは乾癬（又は活性化）ケラチノサイトに対しては効果がありうることを示しうる。TPA活性化ケラチノサイト及び乾癬プラーク又はケラチノサイトにおける液体軟骨エキスによるIL-8の生成の阻害は確認する必要がある。IL-8及び／又はその他の成長因子のレベル低下はこのエキスの抗炎症性及び抗脈管形成効果を説明する興味深い可能性をもつ。コラゲナーゼアッセイ：ａ．アッセイ１：このアッセイはKnightら(1992)FEBS Let．296-266に記載されている。この方法は金属プロティナーゼの活性部位を擬態する蛍光原性ペプチド基質(Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂)を利用する。この基質は一端に蛍光基を、そして他端に蛍光クエンチング基(Dpa)を有する。完全基質において、クエンチング基は蛍光を効率的にマスクする。基質の分解により、試験管内の蛍光は高まる。コラゲナーゼ活性化はWeingartenら(1985)Biochemistry 24，6730に記載されている。１μｇを50mMのトリス−HCl、10mMのCaCl₂pH7.5で100μｌに希釈し、１ μｌの10mg／mlのトリプシン溶液（１mMのHCl中）を加え、そして20℃で15分インキュベーションした。活性化は10μｌのダイズトリプシンインヒビター(SBTI ５mg／ml)を加えることにより停止させた。各マイクロキュベットに以下を添加した： 25又は50μｌのインヒビター^*（水で50μｌにする）； 40μｌの50mMのトリス−HCl、200mMのNaCl、10mMのCaCl₂、pH7.5；８μｌの活性化コラゲナーゼ^**（最終67ng）；及び２μｌの基質（DMSO中で１mMのストック溶液；最終20μＭ）。蛍光はλ_ex＝328nm、λ_em＝393nmで記録した。 ^* ：インヒビターはコントロール物質（EDTA、オルト−フェナントロレン等）又は液体軟骨エキスと定義する。 ^**：コラゲナーゼはヒトＩ型、IV型及び両生類オタマジャクシコラゲナーゼと定義する；ゼラチナーゼも使用した。ｂ．アッセイ２：このアッセイはWelgusら（1979）JBC 256，9511-9516に記載されている。この方法はＩ型コラゲナーゼ（MMP1）による切断を調べるためにSDS- PAGEを利用する。Ｉ型コラゲナーゼは天然コラゲナーゼ分子を一回切ってもとのコラーゲンのサイズの75％及び25％の２本のフラグメントにする。数時間かけて切断後、反応はSDS-PAGEにより基質由来の生成物を分離することによりモニターする。切断、対、未切断コラーゲンの比をクマジーブルーによるゲルの染色（又は銀染色）の後に目視評価する。 21ngの活性化コラゲナーゼ（アッセイ１参照）を５μｇの牛皮コラーゲン(Wor thington)±インヒビターに加え、最終容量は20μｌとした。反応を35℃で16ｈインキュベーションし、次いで40mMのEDTAを含むSDS-PAGEサンプルの添加により反応を停止させ、煮沸し、そして８％のアクリルアミドゲル上に泳動させた。ｃ．用量−応答性阻害：液体軟骨エキスより得られる結果は双方のアッセイによるコラゲナーゼ活性用量−応答性阻害を示した。図９はアッセイで得られた結果を示す。ED₅₀は30μｌの液体エキス（又は30μｌの液体エキス中に存在する0.51 mgの乾燥重量）で得る。 in vivoアッセイ：胎芽脈管形成試験(EVT)：ａ．試験系の定義：ヒヨコ胎芽の正常発育は、発育中の胎芽に卵黄（卵の卵黄）由来の栄養素を運ぶ卵黄膜中に存在する外部血管系の形成を包含する。卵黄膜に載ると、抗脈管形成物質は卵黄膜中で起こる血管発達を阻害しうる。卵黄膜へのアクセスを促進するため、ヒヨコの胎芽を無菌培養箱（ペトリ皿）に移し、そして湿度及び温度制御インキュベーターに入れる。胎芽は数日にわたりex vivo条件でこの中で発育できる。液体軟骨エキスのアリコートをメチルセルロース溶液と混合し、そして薄ディスクにおいて風乾させる。この手順の間、液体軟骨エキス濃縮物の中には内性Na Clが存在しており、そしてディスク当りのその量が25μｇを超えるとEVTを妨害する。従って、液体エキスの脱塩が必要でありうる。100Da以下の膜カットオフによる透析又は電気透析が許容の方法であることが見い出された。メチルセルロースは液体エキスがそれからゆっくりと拡散しうる内部マトリックスを形成する。液体エキスを含むメチルセルロースディスクを、脈管形成過程が未だ活性である卵黄膜の脈管外周の外部境界に載せる。近位膜脈発育に対する液体軟骨エキス含有ディスクの効果は常に水及び当モル量のNaClを含むディスクのそれと比較しておく。ディスクをex vivo成長過程の０日又は１日目に胎芽卵黄膜の上に載せる。この時点で、主要血管の基端のみが卵黄に侵入している。胎芽を、脈管形成を評価するまで培養条件下で置く（約24 ｈ）。水及び液体エキス含有ディスクは常に同一の胎芽の卵黄膜上に同時に加える。双方のディスクは、鮫軟骨エキスをコントロールと比較するとき、個体間変差を最少限にするため、胎芽の頭尾方向軸を中心に対称となるように配置する。ｂ．抗脈管形成活性： EVTは陽性コントロール又は液体軟骨エキスとして様々な濃度のプロタミン（37，75及び150μｇ）を利用することにより実施した。１日の培養後、ディスクに覆われた領域における脈管形成レベルを通常の目かくし方式において一組の科学者により等級分けする。ディスクを配置し易くするため、それを卵黄膜の上に載せたらすぐに黒色Ｏリングをそのまわりに配置する。EVT 試験の評価スケールは１−２−３点に基づく：（３点）コントロール胎芽の対立する水平四分円又は対合四分円に比較したときの正常脈管形成；（２点）血管はディスクにより覆われた領域に侵入しているが、中間軌道においては消失している。主要血管はディスクにより覆われた領域を横断するが、その軌道は明らかに影響を及ぼされているか、又は側方枝分れ密度の減少が見られる；（１点）ディスクにより覆われた領域に血管は認められず、又はその経路はディスクにより覆われた領域から逃げるようにして直ちに偏向している。血管はディスクを迂回し、そしてそれを通り過ぎている場合を除き、ディスクにより覆われた領域を通り過ぎない。用量−応答性阻害はプロタミン（データーは示さず）及び液体軟骨エキス（図 10）により得られた。ED₅₀は約170μｇの乾燥液体エキス（液体エキス中に存在する乾燥重量）により得られた。Wilcoxonサイン式等級統計学的検査を同一の卵の上に載せた２枚のディスク（水及び軟骨エキス）との間の差の有意性を比較するために用いた。マウス乳アデノ癌腫モデル：ａ．試験系の説明：液体軟骨エキスの抗腫瘍性潜在能力をマウス乳アデノ癌腫モデル（同種移植片）で試験した。この試験系は１×10⁶個のDA３細胞によるBALB ／Ｃマウスの皮下接種より成る。これらの細胞は７，12−ジメチルベンズアントラセン（DMBA）により誘導されたマウス乳アデノ癌腫に由来する。このモデルはDaniel Medinaにより樹立された(J.Natl .Cancer Inst.(1969)42：303-310 ；前掲（1976）57：1185-1189)。接種した細胞はin vivoでゆっくりと成長し、そして低い代謝予後をもって固体腫瘍を形成した。 DA３細胞を１mMのメルカプトエタノール、１ＭのHepesバッファー溶液、100mM のピルビン酸Na、200mMのＬ−グルタミン、10mMの非必須アミノ酸、１Ｍのビタミン、10％の胎児牛血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシンの添加された RPMI 1640培地の中で37℃で５％のCO₂において維持した。腫瘍誘導化のため、細胞を完全培地の中で70％の集密度に至るまで増殖させ、次いでトリプシン−EDTA 溶液を利用して回収した。細胞を遠心分離し、そしてリン酸バッファー溶液で３回洗い、そして１×10⁶細胞／0.1mlの希釈率で再懸濁した。 DA３細胞接種マウス（ｎ＝15）に毎日鮫軟骨液体エキス又は偽薬（生理食塩水）の投与を与えた。処理はDA３細胞の接種の７日後に始めた。様々な濃度の液体エキスを試験した。投与する液体エキスの量は液体エキスの中に存在する乾燥重量で表示する。試験製品はここに記載の通りに調製した：液体エキスを凍結乾燥し、そして水の中に様々な濃度で再懸濁した（0.2，1.5，３，10及び20mg／ 200 μｌ）。毎日投与する最終容量は体重１kg当り10，75，150，500及び1000mgとした。ｂ．抗腫瘍活性：結果は、約75mg／kgの液体エキスの投与により最大の腫瘍進行阻害が得られることを示した（図11）。興味深いことに、より多い用量では効能が下った。このことは、液体エキスが腫瘍進行を阻害しうる物質及び腫瘍阻害の作用を阻害しうるその他の物質を含むことを示唆する。この現象は生物薬について既に報告されている。最後に、液体エキスの腹腔内投与は腫瘍増殖の阻害についての最大効能用量を劇的に（75分の１）に下げた（図12）。ｃ．毒性：全ての処理により、体重の減少又は液体エキス関連死はなかった。処理期間中マウスの毎日の検査で徴候又は挙動変化は認められなかった。処理の終了時に、マウスを殺し、そして全ての器官の大まかな形態を鑑定病理学者により分析させた。異常は認められなかった。血液分析は異常の徴候を全く示さなかった。ｄ．組織病理学：腫瘍組織病理学は偽薬又は液体エキス処理マウス由来の任意の大まかな変化を示さなかった。腫瘍活性の程度は全グループにおいてかなり高かった。様々な器官（肺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、小腸、卵巣、胸部、脳及び心臓）の分析は液体エキスに関連しうる任意の特定の変化を示さなかった。マウス超過敏性モデル(CHS) ａ．試験系の説明：ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）はBALB／Ｃマウスにおいて強力な炎症反応を誘導できうる強力な皮膚刺激因子である。０日目に、10匹のマウスを、その腹部にDNFBを塗布することにより感作せしめた。マウスの右耳にこの感作の５日後に10μｌのDNFBを塗布することで負荷した。耳の膨大化を組織刺激指数としていくつかの後曝露時間にわたり測定した。液体軟骨エキスをそれがマウスにおいてDNFBに対する炎症反応を抑制できるか否かを調べるために試験した。ビヒクルのみ(0.2mlの食塩水溶液：５匹)又は液体エキス（20mg／mlの乾燥重量を含む0.2mlの液体エキス：５匹）を感作前３日連続及び感作後４日連続で経口投与した。ｂ．超過敏性活性：耳負荷の１日後、ビヒクルのみで処理したマウスは厚さ8.2m mの耳膨大化を示した。興味深いことに、軟骨液体エキスで処理したマウスはわずか2.8mmの耳膨大化を示した。これらのデーターの統計学的有意差はｐ値＜0.001を有す。この結果は、液体軟骨エキスが強力な炎症インヒビターであることを示す。活性分子を含む液体画分の獲得 in vitroアッセイ：腫瘍細胞系：ａ．試験系の調製：鮫軟骨を回収し、そして前記と同じように処理した。遠心分離後、ペレットを捨て、そしてその上清液を上記の通りに限外濾過し、0.22μｍのフィルターで滅菌濾過した。このようにして得られた液体エキスを様々な方法により更に分画した。腫瘍細胞系を上記の章に記載の通りに増殖させた。ｂ．FPLC条件：カラム： Hiload 26mm×60cm Sephacryl S-300。FPLC系： Pharm acia由来。サンプルは全てカラムに装填する前に0.22μｍのフィルターで濾過した。溶出バッファーは、濾過し、そして15分間脱気したリン酸バッファー食塩水 (PBS)とした。装填するサンプルの容量は通常3.2mlとした（13mlにまですることができる）。流速は１ml／分とした。10mlの画分を集めた。溶出化合物はそのU. V.(280nm)吸収により検定した。較正チャートはSigma由来のMW-GF-1000較正キットを用いることにより得られ、この較正サンプルは分析する装填サンプルと同じ容量を有する(3.2ml)。サンプルの溶出容量は較正キットの化合物の分子量を、カラムのボイド容量を差し引いたその溶出容量に対してプロッティングすることにより推定した。ボイド容量はデキストランブルー(M.W.＝2,000,000)を注入することにより得た。画分をその活性についてZR75-1細胞に対して試験した。注目の画分を同定し、そして特性を更なる研究（以下）により確証した。透過物の活性成分の更なる特性決定はRotofor（Biorad 170-2950 ；下記の等電点電気泳動参照）並びに10〜30kDa，30〜100kDa及び100kDaより大きい分子量の画分を得るために様々なカットオフ値のAmiconフィルターで行った。ｃ．等電点電気泳動条件：鮫軟骨エキスの調製品（１kg／ｌの透過物46ml）をSp ectro pore #7 MWCO 3500kDa膜(Spectrum 132110)を用いて４℃にて５％のグリセリンを含む純水４リットルに対して一夜透析した。透析した溶液を2.75mlの両電解質（Pharmacia #80-1125-87）pH3.5〜10.0及び0.5ｇのCHAPS（Sigma C3023 ；３−〔（３−クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン− スルホネート）と混合した。この容量を純水で55mlにした。この溶液をRotofor に載せた。等電点電気泳動は４℃にて、12ワットの定常電力（3000xi電源 Biora d 165-0554）で、恒温を確実にするために水を循環させながら行った。分離の開始時に、電圧は380ボルト及び31mAのアンペアとした。等電点電気泳動を止め、そして20本の画分を集めた。これらのタンパク質の同定は電気泳動ゲル上でのその分子量の見積りにより行った（Laemmli，U.K.(1970)Nature（Lond.）227 : 680）。これらの画分を装填バッファー(Laemmli参照)で４倍に希釈し、そして８μｌのアリコートを非還元条件下で電気泳動にかけた。図13は各画分及び等電点電気泳動前の材料の電気泳動プロフィールを示す。画分は全て層流フードのもとでそれらを0.22μｍの孔を有する滅菌Millipack- 60フィルターに通すことにより無菌ボトル詰めした。ｄ．腫瘍細胞に対する阻害活性：画分のタンパク質をローリー用量法により評価した。１kg／２ｌの溶液（透過物１リットル当りの担軟骨重量で表示）を培養培地中の様々な濃度でZR75-1細胞に対して試験した。その結果を下記にまとめる。第１試験： Rotofor画分に対して実施した試験。（透過物はエバポレーションにより濃縮）。タンパク質同定：第２試験はFPLC画分で実施した（透過物はエバポレーションにより濃縮した）：第３試験はAmicon分フィルターで得た100μｌの画分で実施した： FPLC画分６及び７は非常に小さい分子量の活性成分を含む： 0.1〜2.5kDa。画分の形成不全効果は凍結乾燥で観察されるものの33000倍まででありうる。ｅ．溶出物の活性成分の更なる同定：活性画分を上記のFPLC及びrotofor手順を利用して直径10mm×長さ30cmのSuperose-12カラムでのこの透過物で出発する別のタイプの精製により決定した下記の範囲の分子量で、回収した（ZR75-1細胞で試験）。１ml／分の流速を選定した。１mlの画分45本を回収した。コラゲナーゼアッセイ：ａ．HPLCクロマトグラフィー：液体エキス(DUP)のサンプル980mlをタンゲンシャルフロー限外濾過ユニット（PELICON，Millipore）で10kDaのカットオフ膜で濾過した。このユニットをまず１ｌの水ですすいだ。最終収量は＞10kDa画分が480 ml、そして＜10kDa画分が1.8ｌであった。＜10kDaをコールドフィンガーエバポレーションにより180m lにまで濃縮（＜10−10×）。＜10−10×の８本の100μｌのアリコートをCDC-S Hexyl、５μｍのHPLCカラム（25×0.94cm）に載せ、そしてまず100％のH₂Oで４m l／minで、次いで100％のMeOHで8.5ml／minで溶出させた。OD₂₁₄ピークに対応する画分を集めた。５本の画分を集めた（図14）：Fr１，Fr２，Fr３，Fr４及びFr５。最初の３本の画分は少なくとも主要ピークを含んだ。ｂ．抗−コラーゲン溶解活性：この結果はFr１がコラゲナーゼを阻害する最も活性な画分であることを示す；低レベルの活性が全てのその他の画分の中に存在する：アッセイ１は図14参照；アッセイ２は下記の表参照。 EDTA 40mMはコラゲナーゼを阻害した。生液体エキスDUPは低い抗−コラーゲン溶解活性を示した。画分１〜５は活性であった。最大の活性は画分１であった。 10kDaより大きい分子量の画分は有意な阻害活性を示さなかった。ｃ．抗−コラーゲン溶解因子の更なる定義：液体軟骨エキスをタンゲンシャルフロー濾過装置及び10kDaのフィルター(Pellicon，Millipore)を用いて分画した。濾液（＜10kDaの画分）は全抗コラーゲナーゼ活性を含むことが見い出され、そして下記の通りに更に特性決定された。＜10kDa画分は100Daの見かけ分子量カットオフ膜(Spectra／ Por CE（セルロースエステル）MWCO：100Da，Cat # 13101 5)を用いて更に透析した。抗コラーゲン溶解活性が濾液の中で回収された（＜10 kDaの画分）。＜10kDaの画分をＣ８逆相カラム（EM Science Lichroprep RP-8， Cat # 9242）に載せ、そしてH₂O、次いで60％のメタノール、そして最後に100％のメタノールで溶出させた。抗コラーゲン溶解活性の大多数（98％）がH₂O溶出液において回収され、そして２％の活性が60％のメタノールで溶出した。まとめると、このエキス中の抗コラーゲン溶解活性は、透析されうる又はSpec tra／Por CE（セルロースエステル）MWCO：100膜を通り、そしてH₂Oを適用したときにＣ８逆相カラムマトリックス（Lichroprep）に吸着されない（１又は複数種の）低分子量化合物に基づく。 in vivoアッセイ：胎芽脈管形成試験(EVT)：液体軟骨エキスをタンゲンシャルフロー濾過装置及び10kDaのフィルター(Pell icon，Millipore)を用いて分画した。10kDaより小さい及び大きい液体軟骨エキスの画分を同じ条件下で試験した。それらは新生脈管形成を阻害するうえで同等の効能を示した（図15）。これは10kDaを超える画分の中に存在しない抗コラーゲン溶解活性と対称的である。ａ．画分＜10kDa ：本画分中の抗脈管形成因子は上記の精製工程の際に抗コラーゲン溶解因子として挙動した。ｂ．画分＞10kDa ：この画分はゲル浸透クロマトグラフィーカラム（Sephacryl S-300，Pharmacia）でクロマトグラフィーにかけた。抗脈管形成活性を有する画分（S300-4）をSDS-PAGEで特性決定した。活性画分（S300-4）は約８〜18kDaの分子量を有する数本のバンドを有した(BioRad SDS-PAGEマーカータンパク質で比較)。この画分を陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono-Q，Pharmacia)を用い、 25mmのトリス−HCl、pH8.0及び０〜1.0ＭのNaCl勾配により更に分画した。0.8〜 1.0ＭのNaClで溶出する画分は高い抗脈管形成活性を有した。0.3〜0.6ＭのNaCl 及び0.08〜0.2ＭのNaClで溶出する画分は弱い抗脈管形成活性を有した。従来技術の製品との比較従来技術の定義我々は軟骨エキスに多大な関心を寄せた最初の者ではないため、我々は本方法により調製した鮫軟骨液体エキスの固有の特徴を従来技術に記載されている又はそれより推定される２種類の製品、即ち、Balassa（USP 4,822,607）及びOikawa ら（前掲）の方法により調製された製品との横並び比較により確認した。 Oikawaらは２種類の主要画分であって、一方が１〜10kDaの分子量の分子を有し、そして第二が10kDaより重い分子量の分子を有するものが得られる方法を発表している。彼らは第一画分のみに抗脈管形成特性を認めており、他方はCAM試験において抗脈管形成活性が全くないと言っている。Oikawaらの製品の適当な比較のため、我々は我々の全液体エキスを２つの対応の画分に分画し、そして０〜 10kDaを有するものを保持した。 Balassaは全液体エキスを抽出するための方法を発表しているため、我々は出発材料として子牛軟骨を鮫軟骨に置き換えてBalassaの方法を再現することにより調製した製品と我々の液体軟骨エキス（０〜500kDa）を比較した。もしBalassa及びOikawaが我々と均等の方法を発表しているなら、FPLC，HPLC 及びCZEで得られるパターンが実質的に重なり合い、そして同じ抗脈管形成活性がEVTに対して発揮されうると仮定した。全てのサンプルを12μｇ／μｌの最終濃度（乾燥重量／容量溶液）にFPLC及びHPLCクロマトグラフィーの前にした。Oi kawaの製品はそれが不溶性材料を含むため遠心分離し、そして濾過してからクロマトグラフィーにかけた。サンプルの調製３通りの方法により抽出した鮫軟骨サンプルを下記の通りにラベル化した（溶液の容量当りの推定乾燥重量で）：１）DUPは０〜500kDaの分子を含むように分画した本発明の調製品である（12 μｇ／μｌ）；２）BALはBalassaらの方法に従う調製品である（12μｇ／μｌ）；３）OIKはOikawaらに従う画分らの調製品である。サンプルは全て任意の分析前に12μｇ／ml（乾燥重量／容量）の最終濃度にしてある。OIKサンプルは多量の不溶性材料を含み、それは13,200rpmでの遠心分離により容易にペレット化する、又は0.2μｍの膜で濾過してよい。不溶性材料の濾過による除去はFPLC，HPL C及びCZEの前に必須である（図16，17，18）。 FPLC比較条件： Superose 12（Pharmacia）；ゲル浸透カラム。サンプルをSuperose 12(10／30 )ゲル浸透カラムに溶出液としてリン酸緩衝食塩水(P BS)で0.5ml／minの流速において流した(チャートスピード＝0.25cm／min)。濃縮調整サンプルの100μｌのアリコートを注入の前に0.2μｍの膜で濾過した。OD₂₈ ₀ をモニターした。このカラムを下記の標準品（MWはDaで表示）で検量した：カタラーゼ(232,000 )、アルドラーゼ(158,000)、アルブミン（56,000）、オバルブミン（44,000）、キモトリブシン（25,700）、リボヌクレアーゼ（13,700）、インスリン(5,700) 、インスリンＢ鎖（3500）、インスリンＡ鎖（2500）、バシトラシン（1450）、ビタミンB-12（1355）。主要ピークの分子量は下記の式により計算した：Log₁₀ MW＝7.52− 0.212×RT（ここでRT＝ml表示の溶出容量、Ｒ²＝0.976である）。全カラム容量（Vt）はシチジン(246Da)を用いる決定により21.93mlであった。ボイド容積（Vo）はブルーデキストラン（２×10⁶Da）で8.38mlと決定された。結果のまとめ：図16ａ）において、我々のサンプルDUPは約3500Daの分子量である18.76mlで溶出する第一主要ピーク（１）を有した。その後の22.7（２）及び27.3ml（３）でのピークは全カラム容量（シチジンによる決定に従い、21.93ml）を超えていた。これらのピークはカラムマトリックスに対して若干の親和力を有していた。図16ｂ）において、BalassaのサンプルBALはカラムのVo付近で溶出する小さなピーク(１)(8.4ml)、18.5ml（4000Da）で溶出するピーク（２）、並びに22.6min (３)及び28.2ml（４）のVtの後に溶出する２本のピークを有した。図16ｃ）において、OikawaのサンプルOIKはVoでの小さなピーク（１）、18.9m l（3300Da）でのピーク（２）、21.5ml（1000Da）でのピーク（３）及び27.3ml での小さなピーク（４）を有した。サンプルの比較において、3500Daのピークとは別に、DUPサンプルの主要バンドがその他のサンプルにおいて同じ強度で観察されないことに注目すべきである。OIKサンプルは少量の27.3mlのピークを有することが認められた。BALサンプルは28.2mlで泳動するピークを有し、それはDUPサンプル中のささいなピークの一と相関しうる。 HPLC比較条件： CS-S−ヘキシルカラム５μｍ、25×0.94cm、CSC # 059-085 ；逆相カラム。結果のまとめ：ヘキシル逆相カラムでのHPLCに関し、OD₂₁₀びOD₂₈₀を同時にモニターした。遠心分離したサンプルの50μｌのアリコート（全て12μｇ／μｌ）を装填し、そして100％のH₂Oで溶出させた。OD₂₁₀に従ってラベルした各クロマトグラフィーについてのピーク（eg.1）及び対応のOD₂₈₀ピークは（eg.1）で表示する。このカラムのVoは5.5ml(1.4min)であった。図17ａ）において、DUPは３本の主要ピークを有し、それらはOD₂₁₀(１，２，３)及び２本のささいなピーク（４，５）を通じて観察された。２本の副次的なピークがピーク１の外れに観察され、ピーク１ａ及び１ｂとラベルした。有意な OD₂₈₀吸収がピーク１，１ａ，１ｂ及び３にまとまっていた。対して、ピーク２についての対応のOD₂₈₀吸収はOD₂₁₀と比べてはるかに小さかった。図17ｂ）において、BALはより多くのOD₂₁₀ピークを示したが、その強度はDUP ピークと比べて低かった。ピークの重なりが同じ分子の表示である限り、Balass aサンプルのピーク３及び７のみがDUPサンプル中のピークの保持時間と相関しているようであった（ピーク１ａ又は１ｂ及びピーク４のそれぞれ）。図17ｃ）において、OIKエキスの中には３本の主要ピークしか認められなかった（１，２，３）。ピーク１及び３はDUPサンプルのピーク１及び３に相関するが、１の副次的なピークがOIKクロマトグラフィーに観察された。OIKサンプル中のピークの高さはDUPよりも低かった。従って、FPLC及びHPLCパターンは異なる製品の特徴を有した。 CZE比較：条件：装置：goalソフトウェア（バージョン7.11Ｕ）の付いたBeckman系(place系2050) ；キャピラリー：Silice（TSPO 50375）、50μｍ×95cm；バッファー：２Ｍのギ酸；コート溶液、５％ｐ／ｖのヘキサジメトレンブロミド及び２％ｖ／ｖのエチレングルコール水溶液；検出器：UV(200nm)；電流：−30kV；注入：0.5psi、20 秒；温度22℃。キャピラリーを１ＭのNaOH（20psi，20min）、水（20psi，10min）、コート溶液（20psi，20min）及びバッファー（20psi，10min）でコンディショニングした。次にこの条件を泳動用に設定した：バッファー(20psi，２min)、サンプル注入（0.5psi，20sec.）、泳動(−30kV，45min)、１ＭのNaOH(29psi，3.5min)、水(2 0psi，3.5min)、コート溶液(20psi，４min)及びバッファー(20psi，４min)。各サンプル(BAL，DUP，OIK画分３)を16.5mg／mlに再懸濁した。各溶液のpHをB AL，DUP及びOIKのそれぞれの中で7.1，6.8及び8.2にした。各溶液のNaCl濃度をB AL，DUP及びOIKのそれぞれの中で2.08，4.37及び0.71mg／mlにした。結果のまとめ：各サンプルの分子量プロフィール（BAL，DUP及びOIK-3）を図18に示す。DUP及びBALサンプルの比較はBALサンプルが＜１の％面積を有する大きめの比率のピークを含むことを示した。BAL及びDUPはMT／EOF ＝ 1.06，1.54，1,59，1.66及び3.22においてピークを共有する。1.06，1.54及び3. 22の比を有するピークはBAL及びDUPにおいて類似の％面積を有し、ここで比1.59 のピークはBALのよりも８倍強く、そして比1.66ではその反対が認められた。 DUP及びOIKサンプルは非常に異なる電気クロマトグラフィーを示す。OIKは数本のささいなピークを有する１本の主要ピークを有する。これらのどのピークも DUPサンプルの１つと関連することができなかった。 EVT比較サンプルDUP，BAL及びOIKの抗脈管形成能力をEVTに対して分析した（図19）。有意な抗脈管形成活性はBalassaのエキスでは回収されなかった。DUP粗エキスを OikawaのOIKの画分３と比較した。DUK及びOIKは共にほぼ同等であった。Oikawa は本発明を何ら開示しておらず、なぜなら彼らは10kDaより大きい分子量画分において活性は何ら検出できないと述べており、これが図15の我々の結果と矛盾しているからである。従って、Balassaと我々の方法との間での類似にかかわらず、両方法により得られる製品は明らかに同じでない。アミノ酸比較 BAL，DUP及びOIKサンプル（全て16.5mg／mlの乾燥重量）のタンパク質含有量をローリー法により測定した；結果はBAL，DUP及びOIKサンプルのそれぞれについて3.31，0.27及び4.15mg／mlの値を示した。タンパク質／乾燥重量の比はDUP サンプルをBAL及びOIKと比較するときに非常に重要である。分析は各液体軟骨調製品のアミノ酸含有量を更に分析するために実施した。図 20はBAL，DUP及びOIKサンプル中の各アミノ酸の比率を示す。遊離アミノ酸の比率は各軟骨調製品間で異なる：BAL，DUP及びOIKサンプルのそれぞれにつき23％、73％及び４％。タンパク質起源由来のアミノ酸の比率は各軟骨調製品間でも異なる：BAL，DUP及びOIKサンプルにおいてそれぞれ77 ％、27％及び86％生データーについては下記の表を参照のこと：結論我々の製品(DUP)と比較した２の先行技術の製品（BAL，OIK）は、軟骨エキスを調製するための古典的な方法としてなお考慮される。上述の結果は、本方法(D UP)は、抗脈管形成、抗腫瘍、抗炎症及び抗膠原溶解活性が考慮される限り、予想されない優れた活性の製品を供する。我々は、本方法が、１つの単一エキス中の多数の水溶性の阻害因子を回収することに実際成功している。 BAL，DUP及びOIK分子プロフィール並びにタンパク質成分の直接の比較は、各々の軟骨調製物が特定の特徴を有することを証明した。それらは特定の構成物を共有するようであるが、それらの互いの比率は異なる。これはDUPが、約75mg／k g未満の投与範囲で経口的に投与した場合に抗腫瘍性であり、より高い投与量ではこの効果を次第に失うと考えることにおいて特に重要である。この結果は、単一因子を超える量がDUP液体軟骨エキス中で重大であることを示唆する。それゆえ、BAL，DUP及びOIKのような異なる軟骨調製物は、各々の個々の構成物の割合がそれらの間で種々であるので、極めて異なる生物特性を示し得る。臨床試験臨床試験のための液体エキスの調製本発明の鮫軟骨液体エキスで予備的臨床試験を行った。限外ろ過の後に得られた液体エキスを0.22μｍの多孔度のミリポアフィルターでろ過した。その液体エキスの微生物制限はUSP XX III＜61＞標準に従って制御した。その液体エキスを無菌フラスコ内の７mlのアリコート（約85mgのタンパク質）中に分配し、−60℃ で一晩、凍結し、そして利用するまで−20℃で更に保存した。抗脈管形成効果新脈管形成依存病を治療するために液体軟骨エキスを用いた。３つの異なるタイプの新脈管形成依存病の代表をヒトで実際にテストした；その第１のタイプは癌（前立腺癌）であり、第２のタイプは皮膚科学的疾患（乾癬）であり、そして第３のタイプは関節炎（慢性関節リウマチ及び変形性関節症）である。以下の例は少くとも本液体エキスの抗脈管形成活性を示す。以下に示す結果は、特にテストしたものばかりでなく全ての新脈管形成依存性の病気の治療における粗透過物及びその画分の有用性を極めて奨励し、そしてそれを予想させる。病気が脈管形成性の構成物を有する限り、本発明の軟骨エキスは、それがその有効量を含む組成物に入れられ、そしてこの組成物が正確な投与に適した形態であるならこの点において有効であろう。それゆえ、本発明は脈管形成の病気の治療に用いるための以下の特定の組成物に限られない。なぜなら、当業者は、その投与の態様及び標的の病気の組織によって選択することにより多数の組成物を誘導することができるであろうからである。組成物は、異なる経路、例えば局所的、経口的、舌下、直腸、静脈内、筋肉、眼内、腹腔内、拡散等により投与することができる。軟骨エキスの魚のような味及びにおいのため、芳香剤もしくは香料を加えてもよく、又は他のガレニック組成物（リポソーム、被包、パッチ等）を患者のコンプライアンシーを勧めるようにデザインすることができる。用語“患者”とは、ヒト又は動物の患者を意味する。癌：前立腺癌を患う１人の患者に液体軟骨エキスを加えた食事を与えると、以来大きな健康状態の改善を示す。1986年に腺癌を診断した。同時に放射線療法を行った。1991年に、PSA(前立腺血清抗原)レベルは138μｇ／ｌであった。その通常の許容される上限は４μｇ／ｌである。次に患者に、抗アンドロゲン療法（EUFLEx ）と組み合わせて去勢により、完全に異なる治療を行った。この治療は３年間有効であった。その後PSAレベルは再び上昇し始めた。1994年から、この患者にその食事に本液体軟骨エキスを加えて与えた（１日当り体重１kg当り約１〜1.5mg に等しい７mgのエキス当り約75mgの乾燥重量の毎日の経口投与）。そのPSAレベルは12から4.0μｇ／ml（通常の限界）未満に次第に減少した。最終的な結果を1 996年４月に得た。この投与管理は、投与の経路、活性成分の生物有効性及び病因が制御されるべき要求される攻撃性に従って、随意に変えなければならないであろう。この場合、本液体エキスはおそらく実質的な割合で胃腸管に吸収される。DMBA処置したラット及びDMBA接種したマウスで得られた結果によることもできる（上述）。同時に、ラット、マウス（先の例）、及びサル（データーは示さない）において、非毒性であることが確認された。 DMBA処理ラット及びDA３移植マウスにおける液体エキスの経口投与は、体重１ kg当り１〜300mg／kgの投与比がおそらく動物モデルにおける腫瘍の進展及び腫瘍の血管新生の阻害に大きく寄与することを示唆する。マウスにおける液体エキスの腹腔内投与（DA３−モデル）は、腫瘍の進行を阻害することにおいて有効な投与量を得るために、投与の経路が重要であることを証明した。これは、前立腺癌の場合において有効な１mg／kgの投与比率が、非経口投与経路が選択されるなら約0.01mg／kgに減らすことができることを示唆する。それゆえ、１日当り体重１kg当り約0.01〜約200mgの投与量が、少くとも部分的に新脈管形成を減らし又は完全になくすことにより、癌を治療するための半投与量（ED₅₀）のほぼ合理的な範囲であると仮定される。より古典的な療法（手術、化学療法、抗ホルモン療法等）と組み合わせて、いく人かの他の患者に液体軟骨エキスを加えた食事を与えた（１日当り体重１kg当り約１〜1.5mgに等しいエキス７ml当り約75mgの乾燥重量の毎日の経口投与）。いくつかの医療の場合の概要を以下の表に示す。その結果は、液体軟骨エキスとの組合せ治療が固体の腫瘍を患う患者の生存率及び生活の質を増加させることができることを示唆する。乾癬以下の皮膚科学的組成物を作り、乾癬を患う患者への効能の確認を試みた： −EMULGADE CLB 29％（ｗ／ｗ） −20×粗透過物 69.5％（ｗ／ｗ） −GERMABEN II １％（ｗ／ｗ）、及び −ラバンデュラ・アングスチホリア（Lavandula Angustifolia） 0.5％（ｗ／ｗ）。 EMULGADE CLB、ステアリン酸エステル類の混合物、脂肪アルコール及び非イオン性乳化剤(Henkel Canada Ltdから購入)を撹拌下で65〜70℃に加熱した。その混合物を撹拌したまま加熱をやめた。その混合物が45℃の温度に達した時、精油ラバンデュラ・アウグスチホリア及び防腐剤GERMABEN II（ジアゾニジル尿素30 ％、メチルパラベン11％、プロピルパラベン３％及びプロピレングリコール56％； Sutton Laboratories，NJ，U.S.Aから購入）を加えた。その混合物の温度が30℃ に達した時に、液体軟骨エキスを加えた。得られた組成物はなめらかな非脂肪性のクリームであり；EMULGADEの割合を変えることにより、製造元の指示に従って、他の形態の種々の粘度の皮膚科学的組成物を得ることができる（ミルク、ローション、軟膏）。ペースト、ゲル及び他の形態の経皮調製物を得るために他のビヒクル又は賦形剤を用いることができよう。慣用的な療法には応答したがしばらくしてそれらに応じなくなった乾癬を患う９人の患者のパネルに、12週間、毎日２回上述の製剤を供した。この研究のために、両側のメンバーに同様かつ対称的な程度の乾癬について患者を選択した。感染した方を軟膏エキスを含む組成物で治療し、そして一方を対照組成物で治療し、そのことを皮膚科医も患者も知らない二重ブラインド方式でこれらの試みを行った。その乾癬が過角化症を併わない５人の患者において著しい改善が観察され；過角化症を有する患者についてもその結果は適度に良好であった。２人の患者の体の一部の写真を図21に示す。図21ａ及びｂにおいては、過角化症を併う乾癬を患う患者は、たった１ケ月の治療の後で、そう痒もなく極めて大きな紅斑の減少を示した。しかしながら過角化症はまだ重大であった。過角化症を伴わない乾癬を患う第２の患者の写真（図21ａ及びｂ）は、３ケ月後に極めて優れた改善を示した。乾癬は多因子性の病気であるようなので、患者の応答は、樹立過程における新脈管形成及び炎症のような構成物の関与並びにこの病状の永続性の重大性によると仮定される。その抗脈管形成活性は、DMBA処理ラット（図５）、内皮細胞増殖（図７）及びEVT(図10)に示されるように我々のエキスにおいて実際、存在する。抗炎症活性も確認されている（マウスのCHSモデル）。この種の製剤に関連する他の因子に対する他の治療剤（角質溶解剤、付加的抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤等）が補われるなら、より優れた結果が得られることが予想される。この補足は、例えば製剤を有効量の角質溶解剤を含むようにする形態をとり得る。それは、このような補足治療剤の別個の投与、同時の投与、又は本局所製剤の適用との交互の投与によっても行うことができる。更に、補足薬物は同じ経路で投与する必要はない。上述の製剤は、液体軟骨エキスの高い割合にもかかわらず、全身的な効果を示さず（その効果は治療される領域に限定される）、そして二次的効果も示さなかった。関節炎：関節炎を患う患者に、有志に基づいて、数ケ月間、全７mlの液体エキスの１〜２単位を投与した。これらの患者は、関節機能の回復、痛み及び炎症の軽減により次第に改善した病状を示した（約60％まで）。関節炎は脈管形成性かつ炎症性の構成物を有するので、上述の効果は軟骨エキスの抗脈管形成及び抗炎症活性により得る。次にリウマチ学の専門家のグループによって、パイロット臨床研究を行った。年齢39〜60歳の慢性関節リウマチを患う７人の有志の教示した患者を本研究に登録した。American Rheumatism Association'sの改訂版（Arnett，F.C.ら、1988 ，Arthritis & Rheumatism，vol.31，315-325）における分類基準に基づいて診断を確立した。治療を30日続け、それは、21mlの液体鮫軟骨エキス（乾燥重量12mg／ml）の毎日の投与量を摂取することからなる。その治療の効能を、関節圧痛の評価のための関節インデックス(Ritchie，D.Mら、1968，Quaterly J.Med，New Series XXX VII，vol.147，393〜406)で決定した。そのインデックスは、関節の縁にわたって、又は特定の場合、関節を動かすことに基づいて加えられる圧力を関節にかけた時の患者の痛みのいくつかの定量的評価の合計に基づく。その結果は、液体軟骨エキスで治療した時に７人のうち４人が改善され（以下の表）、このことはその製品が慢性関節リウマチ又は慢性的炎症を併う他の病状の治療において有用であり得ることを示唆する。クモ状静脈全部で16人のパネリストを本研究のために補充した。そのパネリストは顔に目で見えるが過剰でない毛細血管拡張症を有している。そのパネルを各々８人の２つのグループに分けた。グループＡには５％の液体軟骨エキスを含むコレステロールリポソームベースを供し、他方第２のグループ（Ｂ）には、コレステロールリポソームベースのみを供した。その製品を３ケ月間、１日２回、顔全体に用いた。クモ状静脈を示す顔の最少で４つの部位の像を得るためにファイバー光学表面顕微鏡を用いた。Zeiss Ibas Image Analyzerによりグレー値について像を分析した。面積光学密度(IOD)を各々のパネリストについて各々の部位について計算した。各々のパネリスト上の４つの部位を各々の時点で平均化した。結果は、４週間後にIODの35％の減少があり、本研究の過程においてこの効果が維持されたことを示す（図22）。空のコレステロールリポソームベースは８及び12週間後に、各々５％及び８％のバックグラウンド改善を示した。眼窩周辺の暗色輪(dark circle) 皮膚の有色化は全てメラニンの存在又は欠如のためでなく、血液供給及び血漿成分のためでもある。血流が鈍くより多量の酸素が代謝から除かれる場合、皮膚は色が青っぽくなる。これらの色の差は、皮膚の厚さのため眼の領域において顕著である(Oresajoら（1987）Cosmetics & Toiletries 102：29-34)。眼の下に存在する中隔における脈管の変化は、暗色輪の外観を悪化させる。眼の周囲の暗色輪は脂肪沈着、眼瞼下の水腫及び眼の領域の周囲の血管の漏出のため出現することもある。眼の領域周囲の新脈管形成を制御し、それにより眼窩周囲の暗色輪の出現を削減することへの鮫軟骨液体エキスの効果を評価するよう臨床的研究をデザインした。 18〜65の年齢の合計で18人の女性の有志者で研究を行った。パネリストは、眼の周囲に明らかな暗色輪を示していた。全てのパネリストは皮膚科学的又は眼科学的問題を含む急性又は慢性の病気の証拠のない通常の健康状態であった。テスト結果の評価をじゃまし得る日焼け、発疹、かき傷、やけどのあと等を示す患者は本研究から排除した。妊娠し又は授乳中の女性も排除した。テスト部位は、観察に基づいて見られるいぼ、ほくろ、日焼け、斑痕、及び活性皮膚障害を避けた。パネルをグループＡに10人及びグループＢに８人に２つのグループに分けた。その各々は、５％液体軟骨エキスを含むビヒクル又はビヒクル単独に相当する。パネリストに12週間、１日少くとも２回、眼の領域周辺に適用するのに十分な産物を供した。ベースラインにおいて、並びに４，８、及び12週間後に測定結果を得た。各々の写真を得て像分析により分析した。皮膚の暗さ／明るさを示すグレー値について写真を分析した。液体軟骨エキスで治療したグループはグレー値の優れた増加を示したことが明らかである（それは暗色化を明るくしたことを示す）。４，８、及び12週間後、液体軟骨エキスで治療したグループの眼の領域下の皮膚の明るさは11％、21％及び14％であった。ビヒクルのみで処理したグループはいずれの変化も示さなかった（図23）。静脈瘤の静脈全部で20のパネリストで研究を行った。そのパネリストは脚に目で見えるが過剰ではない毛細血管拡張症を有している。そのパネルを２つのグループに分け、グループＡ（ｎ＝９）にはクリームを含む液体軟骨エキスを供し、グループＢ（ｎ＝11）にはビヒクルクリームのみを供し、それらを３ケ月間、１日２回、脚全体に用いた。ファイバー光学顕微鏡を用いて静脈瘤の静脈を示す脚の２〜４部位の像を得た。その像をZeiss Ibasアナライザーによりグレー値について分析した。面積光学密度(IOD)を、各々のパネリストについて各々の部位について計算した。各々のパネリスト上の全ての部位を各々の時点で平均化した。結果を図24に示す。使用の４，８及び12週間後に各々IODの21％、17％及び26 ％の減少があった。対照ビヒクルは使用の４，８及び12週間後に各々５％、０％及び０％のバックグラウンド改善を示した。他の臨床的及び獣医学的適用の可能性眼科学：視覚の減少及び盲目は、異常な血管増殖又は新生血管形成を特徴とするいくつかの病状によって引きおこされ得る。これらは、（化学的又は物理的刺激によって引きおこされる）角膜の新生血管形成、角膜の感染、角膜の移植片拒絶、血管新生緑内障、斑の退化、ヘルペスウィルス角膜炎、及び糖尿病網膜症を含む。液体軟骨エキスは、新しい血管の形成を阻害することにより、及び毛細血管拡張症及び炎症を削減することによりこれらの臨床状態に作用することができた。創傷修復：創傷修復後は細胞、生化学的媒介物、細胞外マトリックス分子、及び細胞の微小環境の間の複合体相互作用に関連する。厚み全体の創傷形成の後、肉芽組織（線維芽細胞、毛細管、及び炎症細胞）が特徴的な配列で創傷の端から最初に成長する。線維芽細胞は、24時間以内に創傷端において結合組織から創傷空間に移動し始める。それらが動く時、線維芽細胞は、細胞外マトリックスを形成するマトリックス分子（コラーゲン及びグリコサミノグリカン）を形成する。創傷形成後18時間程度の早さでその創傷端における灌注した微小循環において毛細管発芽が見られる。これらの発芽物は創傷空間内に成長し、創傷結合組織のための新しい毛細管ネットワークを供する。線維芽細胞増殖及び移動並びに毛細管成長は、創傷空間が新しい組織で完全に満たされるまで一単位として続く。肥大性斑痕形成のような肉芽因子の過剰発現を併う特定の創傷修復条件及びひどく火傷したヒトの治癒は、脈管形成過程を減らすことは創傷治癒の過程を遅くするであろうので、（経口的又は局所的）液体軟骨エキスの投与の利点であり得る。丘疹鱗屑性皮膚病：乾癬障害への液体軟骨エキスの有益な効果は、一般的特徴を有する他の病気が液体エキスの局所的又は全身的投与を利用することもできることを示唆する。丘疹鱗屑性皮膚病は表皮の厚層化及び／又は下の皮膚の炎症から生ずる赤ないし紫の丘疹及び斑を特徴とし、乾癬、ライター症候群、バラ色ひこう疹、扁平苔癬、毛孔性紅色ひこう疹、二期梅毒、菌状息肉腫、及び魚鱗癬型発疹を含む。脱毛症：血流を頭皮に導く小さな外側動脈の結紮は、アンドロゲン過剰露出により引きおこされる髪の損失を防ぐことに成功している。液体軟骨エキスの頭皮の特定領域への局所的適用は、脈管ネットワークを減少させ、結果としてホルモンへの露出を減らすことにより髪の損失を防ぐことができた。獣医学的適用：ヒトについて記載されているのと同じ治療的及び美容的適用のために固体及び／又は液体軟骨エキスを動物に投与することができる。非抗脈管形成効果座瘡：座瘡が脈管形成構成物を有する病気又は疾患として分類されるかは本発明者らの知るところでないが、本液体エキスが抗炎症性であることに基づいて、それを患う患者において液体軟骨エキスをテストした。座瘡を患う患者に軟骨エキスを与えるために、次のゲル製剤： CARBOPOL 1.2％精製水 77.2％ NaOH 0.3％ PHENOXETOL 0.3％ TWEEN 80 0.3％液体軟骨エキス 20.0％ 40×アロエエキス 0.5％を作った。液体軟骨エキスは９〜12mg／mlの乾燥重量を含んでいる。この製剤は、多少激しい形態の座瘡（炎症性座瘡及びカイスティック（kystic）座瘡）を患う患者の皮膚に関して著しい改善を示す。図25は、12週間、局所用液体エキス含有ビヒクルで処理した時の、座瘡を患う患者の病状の大きな改善を示す。これらの結果は、抗脈管形成効果のためであり得（これにより座瘡により脈管形成構成物があることを示す）、又はそれは抗脈管形成以外の効果を有する活性成分のためであり得る（例えば抗炎症効果）。先の臨床試験で得られた全ての結果は、新脈管形成依存の及び／又は炎症性の病気の治療における本軟骨液体エキスの優れた能力を示す。軟骨エキス及びその製剤の量は特定の必要性を満たすように随意的に種々であり得る。タンパク質の(proteic)成分に基づいて、局所的及び全ての他の組成物は広範囲の本軟骨エキスの投与量を含み得る。テストしたケースの３つの特定のカテゴリーの中で、極めて異なる投与量及び／又は製剤を用いた。皮膚刺激性：新脈管形成はしばしば多数の病気における炎症に関連するので、本軟骨エキスにおいて各々の活性を別個に割り当てることが要求されよう。この点において、新脈管形成がおこると予想されない皮膚刺激モデルを、その抗炎症及び鎮静活性についてエキスをテストするために選択した。本研究のためにペルーバルサムに対する感性の経歴を有する９人の有志者を選択した。テスト化合物は次の通り：１．D-MEM媒体中１×鮫軟骨50％２．D-MEM媒体中１×鮫軟骨20％３．D-MEM媒体中１×鮫軟骨10％４．コラ・ニチダ(Cola nitida)(Indena)10％ヒドロアルコールに１である。この４つのテスト化合物をパネリストの前腕腹側部に適用した。その材料を20 分、吸収させ、次にペルーバルサムの刺激をテスト部位に適用した。皮膚刺激を皮膚の赤みの増加に関して測定した。赤みの程度はMinolta Chromometerで測定し、それを陽性及び陰性対照と比較した。陽性対照はペルーバルサムで処理しただけの皮膚の色であり、陰性対照はコラ溶液で処理してテスト産物のように攻撃した皮膚部位であった。統計的な有意差を両側プロバビリティーテストで計算した。図26は、10％のコラが70％活性であったことを示す。鮫軟骨は20％及び10％濃度で抗刺激剤として各々58％及び60％であった。投与量に応じた効果はなかった。これらの効果は、本軟骨エキスが抗脈管形成効果とは別の抗炎症及び鎮静活性を含むことを示唆する。癌： 53歳の女性患者を、Ｂ型の巨細胞非ホジキンリンパ腫と診断した。CATスキャン分析は、頸動脈及び頸静脈周囲のアデノパシー（直径2.5cm）並びに右の腎臓の門上の大きなアデノパシーを示した。患者は化学療法を拒み、その食事に本液体軟膏エキスを加えた(1993年10月)(１日当り体重１kg当り約１〜1.5mgに等しい７mlのエキス当り約75mgの乾燥重量の毎日の経口投与)。３ケ月後（1994年１月）、CATスキャン分析は、完全に再吸収された頸部におけるアデノパシーを示した。1994年11月までに、腹のアデノパシーは75％だけその体積が減少した。以来その病気は安定し、患者は良好な健康状態である。この結果は、特定の固体でない癌も本液体軟膏エキスの抗腫瘍活性に応じ得ることを示唆する。皮膚のバリアー保護６人の健康な有志者パネルを本研究に参加させた。そのパネリストに、４週間、１日２回、本液体軟膏エキスを含むクリームを右上腕に適用し、ビヒクルのみを左上腕に適用した。パネリストは、皮膚科学的又は眼科学的問題を含む急性又は慢性の病気の証拠がない年齢21〜45歳の女性であった。テスト結果の評価をじゃまし得る日焼け、発疹、やけどのあと等を示す患者を本研究から排除した。テスト部位はいぼ、母斑、日焼け、斑痕及び実験で観察される活性な皮膚障害の部位を避けた。テストの日に、パネリストに、いずれのローション、クリーム又は他の製品も顔に用いることをやめるように伝えた。測定の間、パネリストは、20〜22℃ の温度及び40％の相対湿度の制御環境でテストする前少くとも30分間、安静にした。テスト部位は右及び左手掌上腕部であった。各々の腕上に小さな領域(3.5cm× ７cm)をマークし、基底経皮水損失（TEWL）測定値をこの領域内の３つの部位から得た(Pinnagodaら.（1990）Contact Dermatitis 22：164-178 ；Grove（1994 ）in The effects of aging in oral mucosa and skin，Ed．Squier & Hill，CR C Press，pp124-125)。粘着（Tuck）テープを用いてそのテスト領域を覆い、両方向にフィルムをなでた後、そのテープをはがした(Elias（1993）J.Invest.Dermatol．80：O44s-O49s )。全部で５つのストリッピングを得た。TEWLを再び記録した。５のグループにおいてストリッピングの後のTEWL測定を続けた。TEWLが18Ｇ／Ｍ²／Hrに達した時にストリッピングをやめた。最後のストリッピングの終りに再びTEWLを測定した。皮膚バリアーを傷つけるのに必要とされるストリッピングの数を、18Ｇ／Ｍ² ／Hr又はそれ超のTEWLを示す各々の時点について最大のストリッピングの数を記録することによって計算した。片側ランク係数Ｚテストを用いて、種々の時点での処置対ベースラインの間の統計的有意性について結果を分析した。ビヒクル処理した腕は、２週間及び４週間の処置の後各々26％及び21％だけ多くのストリッピングが皮膚を傷つけるために要求されたので、大きな改善を示さないようであった。２週間及び４週間の液体軟骨エキス産物での処置後のパネリストの各々のバリアー状態において、皮膚バリアーを破壊するのに各々60％及び55％多くのストリッピングが要求され、有意改善（ｐ＜0.05）があった（図27）。それゆえ、液体軟骨エキスは物理的損傷に対する皮膚バリアーを強化するのに役立つことが判明した。湿疹：本液体軟骨エキスを、湿疹によって引きおこされる炎症疾患を減少させる能力に基づいて、ビューティーサロンにおいてテストした。本液体エキス含有クリームを適用する美容師は長年にわたり手に慢性の湿疹を患っている。興味あることに、本軟骨含有クリームは手の湿疹の発現をかなり減少させた。彼女は現在、湿疹の発現を防ぐために上手く軟骨含有クリームを用いている。いぼ：足底いぼの経歴を有する36歳の女性に、いぼの進行及び関連する痛みを抑制するためにほぼ３年間、皮膚科学者により治療した。その治療は、液体窒素、サリチル酸（40％）、嫌気性菌、硝酸、及び硫酸であった。これらの治療は３ケ月間、ほぼ毎週であり、その結果はほとんどゼロであった。1996年３月に、彼女にそのいぼ上に直接、毎日（５分）鮮軟骨液体エキスを適用した；２週間後にいぼの周囲に新しい表皮のピンクのゾーンが形成され；次の週にいぼはとれた。それゆえ、この結果は本液体軟骨エキスがいぼの治療に役立ち得ることを示唆する。他の臨床的及び獣医学的適用の可能性：移植片拒絶：炎症は移植した細胞の死亡に関連する主な要因の１つである。それゆえ、移植片は我々の鮫軟骨液体エキス中に存在する抗炎症構成物から利益を得る。多発性硬化症：多発性硬化症の原因は知られていない。その組織応答は、静脈周囲単核細胞浸潤を併い、感染のいずれの明白な組織病理学的証拠もない免疫病理学的過程の特徴を有する。マトリックスメタロプロティナーゼは炎症応答に関連する重要な因子である。液体軟骨エキスはマトリックスプロティナーゼの強力なインヒビターであるので、それは多発性硬化症の治療に役立ち得る。線維症：現在の考えは、線維症は通常の創傷治癒に似るが、それを終了せず、通常組織の斑痕での置換を導く。ほとんどの線維症の反応は外傷、感染、炎症に２次的に現れるか、又は理由は知らないが遺伝構成物を有し得る。典型的にはTG F-βが過剰産生されて線維芽細胞の増殖及びコラーゲンの過剰生産を導く。コラーゲンの過剰な析出は線維症の証明であるので、我々は、肉芽組織の形成を遅らせることができる液体軟骨エキスが線維症反応において長期間、利益を有し得ることを示唆する。炎症性腸疾患：炎症性腸疾患の原因は未知であるが、胃腸免疫性がクローン病及び潰瘍性大腸炎の病因に関連する。粘膜単核細胞は、抗体生産、増殖、細胞毒性及びサイトカイン合成(FGF，PDGF，EGF，TNF)の変化を示す。液体軟骨エキスは抗炎症活性を示すので、その経口投与は、炎症性腸疾患の治療に役立つことが判明し得る。心臓病：冠状脈耐性脈管の内皮細胞機能不全は、冠状脈微小脈管構造並びにおそらく心筋虚血及び胸の痛みの異常を説明することができる。細胞レベルにおいて、内皮細胞機能不全は内皮細胞由来弛緩因子である酸化窒素の発現の減少に関連する。NO合成は、脈管システムが血管拡張の状態を維持し、それにより動脈圧を制御するのを許容する。NOの内在的合成の欠損は、動脈の高血圧、肺の高血圧及び心臓病のような病状を引きおこす。我々は、培養した内皮細胞から、本液体軟骨エキスがNO生産量を増加させるという予備的結果を有する。それゆえ本液体エキスは、NOにより、特定の心臓病において、及び肺動脈高血圧を併う先天的心臓病を有する小児において役立つことが判明し得よう。更に、液体軟骨エキスはアテローム性動脈硬化症における炎症関連の合併症を減らすことに役立ち得る。強皮症：強皮症（硬い皮膚）は皮膚及び内臓の器官の線維状結合組織の増加を特徴とする。それはしばしば局所的な皮膚のパッチ過角化症として現れる。過角化症は皮膚のケラチノサイトが完全に分化して剛性のケラチン線維を蓄積する細胞の過程である。この皮膚の状態は、関節周囲の領域の皮膚が感染したなら関節の動きを限定し得るであろう。ケラチノサイト分化が促進されている実験システムに加えた場合、本液体軟骨エキスは分化又は角化過程を部分的に防止する。それゆえ、本液体エキスは完全に分化したケラチノサイトの過剰蓄積を防止することによってこのような皮膚の状態のために有益であり得よう。獣医学的適用：固体及び／又は液体軟骨エキスはヒトについて記載されるのと同じ治療及び美容的適用のために動物に投与することができる。美容的適用及び組成物：上述のテスト及び試験は、本発明の軟骨エキスが多数の医療的適用を見い出し得ることを示した。このエキスで回収された別個の活性の中で、抗脈管形成、抗コラーゲン溶解、抗炎症及びPKC誘導性分化への阻害効果が美容的適用に特に要求される。本発明の軟骨エキスはPKCが媒介する現象のアンタゴニスト効果を示したので、及びこのようなアンタゴニスト効果は皮膚バリアー機能を改善するものとして当該技術で示唆されているので、本軟骨エキス及び医薬として許容される担体を含む組成物を皮膚に適用するステップを含む哺乳動物のバリアー機能を改善するための方法を供する。他の又は同様の組成物も皮膚を静めるため又は哺乳動物の炎症を削減するための方法に用いられると予想することができる。炎症は、種々の因子、例えば化学的刺激剤、物理的な擦過症及び紫外線への露出によって引きおこされ得る。皮膚においてコラゲナーゼを阻害するための組成物及び方法も考慮される。コラゲナーゼ及び炎症は早発の老化（コラーゲンのデグラテンション）に関連し、それゆえ本軟骨エキスで回収されたアンタゴニスト活性は、早発性の老化を遅らせるため、及び哺乳動物におけるしわ又は萎縮を抑制するための組成物及び方法にも寄与し得よう。しわ又は萎縮の原因を列記すれば、例えば年をとること、紫外線又は環境汚染物への露出である。局所用組成物は、各々の特定の適用について決定される有効量の鮫軟骨を含み得る。一般に、これらの組成物は、約0.1〜約75重量％の液体鮫軟骨エキスと、約25〜99. 9重量％の医薬として許容されるビヒクルと、を含み得る。これらの組成物は酸化防止剤、例えば皮膚中の脂肪ペルオキシドの形成を防ぐ剤を含み得る。このような酸化防止剤の例は、トコフェロール、トコフェロール誘導体、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体及びBHTである。本組成物には、ホスホリパーゼＡ２インヒビター又は植物由来の抗刺激剤コラ及び緑茶エキスのような抗炎症剤を補足することができる。局所用組成物は、溶液、懸濁液、ローション、チンキ、ゲル、クリーム、スプレー、エマルション、スティック、軟膏又はリポソーム（本液体軟骨エキスの少くとも一部がリポソーム内に存在するもの）のような別個の形態をとることができる。他の美容的な適用は、眼のまわりの暗色輪及び皮膚バリアー機能を含む。結論本発明の方法は、優れた臨床的評価を有する軟骨エキスの生産のための方法を提供するものとして証明された。この新規方法によって製造された鮫軟骨エキスは、優れた収率で回収される多重の活性を含む。本軟骨エキス、特に液体エキス及びその画分は、多くの種類の病気又は病状に有効でありながら、通常の細胞に非毒性であるので、優れた能力を有する。全ての予想される適用（眼薬から皮膚及び癌製剤まで）のために、全液体エキスの最少の最終的タンパク質濃度は極めて低く（約0.01mg／mlから）であり得た。この低範囲の投与量はアクセシビリティー及び活性成分の作用の部位への浸透に、並びにこれらの成分の有効な捕獲及び脈管形成インヒビターに対する組織のセンシティビティー又は応答に依存する。特定の適用についての製剤中の最終タンパク質濃度の上限はまだわかっていない。試みた最も高い最終濃度は乾癬の場合の製剤中約９mg／mlのタンパク質の局所的投与、並びに癌の場合７ml及び関節炎の場合21mlの毎日の投与の投与単位中約12mg／mlの経口投与であった。本鮫軟骨液体エキスは凍結乾燥した場合、その活性のいくつかを失い得る。しかしながら、凍結乾燥前に当該技術で周知であるような安定剤又は保護剤の添加がセンシティブな活性を保護し、乾燥状態での軟骨エキスのより高い投与量での投与を可能にし得る。必要な材料： −クーラー −手術道具 −ミートチョッパー −プラスチックバッグ −工業用ブレンダー(Fisher Scientificから購入したWaring 3-s peed blender) −水の精製のシステム（逆浸透及び0.1Emろ過；Fischer Scientific，Montrea l，Quebecから購入したContinental Water System,model PRE 2202，Serial num ber 91089，Modulab Bioscience RQ／Polishing System）。このシステムは高品質の非発熱性水を供する。 −Fisher Scientificから購入したprecision balance Mettler −DuPont Canadaから購入したCentrifuge Sorval，RC-285 −Centrifuge CEPA −１μＭの多孔度のNylonポケット −オートクレーブ（自動蒸発滅菌器Sanyo，model MAC 350P） −10分間132℃で滅菌し、35分、乾燥したNalgene 500ml容器 −24μｍ多孔度のコンカルフィルター（Whatman Reeve Angel） −超遠心カラム（分子量カットオフ：500kDa及び１kDa適用可；面積：25平方フィート；流速： 130ｌ／分；入力圧：30psi ；出力圧：５psi ；Koch Membran e System Inc.，Wilmington，MA，USAから購入） −130ｌ／分流量を供するためのサニタリー遠心ポンプ（Monarch Industries ，model ACE-S100，Type A） −滅菌室(Ingram & Bellから購入した層状流ハットNuAire) −Millipack-60 0.22μｍ滅菌フィルター −滅菌透明又はアンバーガラスボトル −Concentrator DC-10 Amicon −Rotofor Biorad 170-2950 −各々10，30及び100kDaのカットオフ値のAmiconフィルターSIOY10，SIOY30及びSIOY100 −FPLC Pharmacia 216007(コンピューターPharmacia 216014) −Hilstand S-300 26mm／60cm（Pharmacia） −Superose S-12 10mm／30cm（Pharmacia） −Lyophilizer Labconco 10273 A 本発明は本明細書に先に記載されており、本開示の教授から離れることなく、当業者の能力及び知識内で、同じ目的を達成するであろう等価物で行われるように本発明の特定の要素を置換することにより改良することができることが十分に認められるはずである。これらの明らかなバリエーションは本願に含まれると考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月２２日【補正内容】 17．請求項12の方法により製造した抗脈管形成軟骨エキス。 18．腫瘍増殖、脈管形成、炎症及びコラーゲン溶解より成る群から選ばれる１又は複数種の成分を有する病気又は症状を処置するための組成物であって、請求項13，14及び15のいづれか１項記載の方法により製造された有効量の軟骨エキス並びに薬理学的に許容されるビヒクルを含んで成る組成物。 19．コラーゲン溶解成分を有する病気又は症状を処置するための組成物であって、有効量の請求項16記載の軟骨エキスを含んで成る組成物。 20．脈管形成成分を有する病気又は症状を処置するための方法であって、有効量の請求項16又は17記載の軟骨エキス、又は請求項16及び17記載の軟骨エキスの組合せを含んで成る組成物。 21．腹腔内、皮下、経眼、経鼻、経口、経直腸、舌下、筋肉内、皮内又は経皮用途のための請求項18記載の組成物。 22．局所組成物である請求項18記載の組成物。 23．前記軟骨エキスを約１〜約50mg／mlの組成物の最終固体重量含有量が達成されるように添加する、請求項22記載の組成物。 24．座瘡を処置するための局所組成物であって、治療的に有効な成分として組成物１ml当り固体重量含有量で約２mgの請求項７，８及び９のいづれか１項記載の方法により得られる軟骨エキスを、薬理学的に適当なビヒクルと一緒に含んで成る局所組成物。 25．乾癬を処置するための局所組成物であって、治療的に有効な成分として組成物１ml当り固体重量含量で約30〜50mgの請求項７，８及び９のいづれか１項記載の方法により得られる軟骨エキスを、薬理学的に適当なビヒクルと一緒に含んで成る局所組成物。 26．癌を処置するための組成物であって、治療的に有効な量の請求項７，８及び９のいづれか１項記載の軟骨エキスを、薬理学的に適当なビヒクルと一緒に含んで成る局所組成物。 27．前記軟骨エキスを患者の体重１キログラム当り0.01〜200mgの総乾燥重量が達成されるように投与する、請求項26記載の組成物。 28．前記処置を必要とする患者に経口又は舌下投与する組成物である、請求項 27記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブラゾ，ポールカナダ国，ケベックアシュ２エル３エム８，モントリオール，パルクラフォンテンヌアブニュ 4054 (72)発明者ジュノー，クリスティーナカナダ国，ケベックジェ１イクス３テ５，サント−フォワ，ジングラストリート 787，アパルトマン 203 (72)発明者マエス，ダニエルアシュ. アメリカ合衆国，ニューヨーク 11743, ハンティントン，ナサロード 273エー (72)発明者メアナス，ケネスアメリカ合衆国，ニューヨーク 11746, ディクスヒルズ，マククローチドライブ 62

Claims

【特許請求の範囲】１．完全軟骨中に存在する実質的な割合の生物活性水溶性成分を有する液体鮫エキスの獲得方法であって：下記の段階：ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性の保持に適する条件下で、前記軟骨が約500μｍ以下のサイズの粒子へと縮小されるまでホモジナイズし、粒子と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物を得る；ｂ）前記ホモジネート品を遠心分離して粒子を前記粗液体エキスから分離する；ｃ）前記粗液体エキスを更に分離して、約500キロダルトン(kDa)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液体エキスを得る；そしてｄ）前記最終液体エキスを濃縮する；を含んで成り、ここで前記最終液体エキスの前記生物活性水溶性成分の実質的な損失が起こらない、前記方法。２．前記条件が、段階ａ）については約０〜20℃、そして段階ｂ），ｃ）及びｄ）については約０〜10℃の作業温度を含んで成る、請求項１記載の方法。３．前記条件が前記水性溶液に関して約６〜約８に範囲する作業pHを含んで成る、請求項１記載の方法。４．段階ａ）を15分〜24時間で行う、請求項１記載の方法。５．段階ａ）を15分〜１時間で行う、請求項４記載の方法。６．前記軟骨及び水性溶液が少なくとも約１リットルにつき１キログラムの割合である、請求項１記載の方法。７．前記濃縮段階ｄ）が約0.1kDaの分子量カットオフ値を有する膜上で前記最終液体エキスを濾過することにより行い、これによりこのカットオフ値より小さい分子量を有する分子を除去する、請求項１記載の方法。８．前記濃縮段階ｄ）が前記最終液体エキスの凍結乾燥を含んで成る、請求項１記載の方法。９．前記凍結乾燥が、前記生物活性成分の保全性の保持を高めるのに十分な量で前記液体エキスに添加された安定化剤又は保護剤の存在で行う、請求項８記載の方法。 10．前記軟骨が鮫から回収されたものである、請求項８又は９記載の方法。 11．完全軟骨中に存在する抗コラーゲン溶解性及び抗脈管形成性水溶性成分を有する液体鮫エキスの獲得方法であって：下記の段階ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性の保持に適する条件下で、前記軟骨が約500μｍ以下のサイズの粒子へと縮小されるまでホモジナイズし、粒子と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物を得る；ｂ）前記ホモジネート品を遠心分離して粒子を前記粗液体エキスから分離する；ｃ）前記粗液体エキスを更に分離して、約500キロダルトン(kDa)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液体エキスを得る；ｄ）前記最終液体エキスを約100ダルトンの分子量カットオフ値を有する膜上で濾過する；そしてｅ）約０〜約0.1kDaの分子量を有する分子を含んで成る画分を回収するを含んで成る方法。 12．完全軟骨中に存在する抗脈管形成水溶性成分を有する液体鮫エキスの獲得方法であって：下記の段階：ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性の保持に適する条件下で、前記軟骨が約500μｍ以下のサイズの粒子へと縮小されるまでホモジナイズし、粒子と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物を得る；ｂ）前記ホモジネート品を遠心分離して粒子を前記粗液体エキスから分離する；ｃ）前記粗液体エキスを更に分離して、約500キロダルトン(kDa)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液体エキスを得る；ｄ）前記最終液体エキスを約10kDaの分子量カットオフ値を有する膜上で濾過する；ｅ）約10kDaより大きい分子量を有する分子を含んで成る画分を回収する；ｆ）この画分をアニオン交換クロマトグラフィーで分画する；そしてｇ）約0.8〜1.0ＭのNaClで溶出する画分を回収する；を含んで成る方法。 13．鮫より得られ、且つ請求項１〜６のいづれか１項記載の方法により製造した軟骨エキス。 14．鮫より得られ、且つ請求項７記載の方法により製造した軟骨エキス。 15．請求項10記載の方法により製造した軟骨エキス。 16．請求項11記載の方法により製造した抗コラーゲン溶解及び抗脈管形成軟骨エキス。 17．請求項12の方法により製造した抗脈管形成軟骨エキス。 18．腫瘍増殖、脈管形成、炎症及びコラーゲン溶解より成る群から選ばれる１又は複数種の成分を有する病気又は症状を処置するための組成物であって、鮫に由来し、且つ請求項13，14及び15のいづれか１項記載の方法により製造された有効量の軟骨エキス並びに薬理学的に許容されるビヒクルを含んで成る組成物。 19．コラーゲン溶解成分を有する病気又は症状を処置するための組成物であって、有効量の請求項16記載の軟骨エキスを含んで成る組成物。 20．脈管形成成分を有する病気又は症状を処置するための方法であって、有効量の請求項16又は17記載の軟骨エキス、又は請求項16及び17記載の軟骨エキスの組合せを含んで成る組成物。 21．腹腔内、皮下、経眼、経鼻、経口、経直腸、舌下、筋肉内、皮内又は経皮用途のための請求項18記載の組成物。 22．局所組成物である請求項18記載の組成物。 23．前記軟骨エキスを約１〜約50mg／mlの組成物の最終固体重量含有量が達成されるように添加する、請求項22記載の組成物。 24．座瘡を処置するための局所組成物であって、治療的に有効な成分として組成物１ml当り固体重量含有量で約２mgの請求項７，８及び９のいづれか１項記載の軟骨エキスを、薬理学的に適当なビヒクルと一緒に含んで成る局所組成物。 25．乾癬を処置するための局所組成物であって、治療的に有効な成分として組成物１ml当り固体重量含量で約30〜50mgの請求項７，８及び９のいづれか１項記載の軟骨エキスを、薬理学的に適当なビヒクルと一緒に含んで成る局所組成物。 26．癌を処置するための組成物であって、治療的に有効な量の請求項７，８及び９のいづれか１項記載の軟骨エキスを、薬理学的に適当なビヒクルと一緒に含んで成る局所組成物。 27．前記軟骨エキスを患者の体重１キログラム当り0.01〜200mgの総乾燥重量が達成されるように投与する、請求項26記載の組成物。 28．前記処置を必要とする患者に経口又は舌下投与する組成物である、請求項 27記載の組成物。 29．炎症の処置と必要とする患者のかかる処置のための方法であって、抗炎症有効量の請求項13，14及び15のいづれか１項記載の軟骨エキスを薬理学的に許容されるビヒクルと一緒に経口投与することを含んで成る方法。 30．脈管形成の阻害を必要とする患者のかかる処置のための方法であって、抗脈管形成有効量の請求項13，14及び15のいづれか１項記載の軟骨エキスを薬理学的に許容されるビヒクルと一緒に経口投与することを含んで成る方法。 31．哺乳動物の皮膚の皮膚バリヤー機能を高めるための方法であって、皮膚に請求項22記載の組成物を適用する工程を含んで成る方法。 32．哺乳動物の皮膚を滑らかにするための方法であって、皮膚に請求項22記載の組成物を適用する工程を含んで成る方法。 33．哺乳動物の皮膚の炎症を抑制するための方法であって、皮膚に請求項22記載の組成物を適用する工程を含んで成る方法。 34．前記炎症が物理的研磨により引き起こされたものである、請求項33記載の方法。 35．前記炎症が化学刺激により引き起こされたものである、請求項33記載の方法。 36．哺乳動物のコラゲナーゼ活性を阻害するための方法であって、皮膚に請求項22記載の組成物を適用することを含んで成る方法。 37．哺乳動物の皮膚のしわ又は萎縮を制御するための方法であって、皮膚に請求項22記載の組成物を適用することを含んで成る方法。 38．哺乳動物の座瘡を抑制するための方法であって、皮膚に請求項24記載の組成物を適用することを含んで成る方法。 39．哺乳動物の乾癬を処置するための方法であって、皮膚に請求項25記載の組成物を適用することを含んで成る方法。 40．哺乳動物の早発性老化を遅らせるための方法であって、皮膚に請求項22記載の組成物を適用することを含んで成る方法。 41．腫瘍増殖、脈管形成、炎症及びコラーゲン溶解より成る群から選ばれる１又は複数の成分を有する病気又は症状を処置するための方法であって、かかる処置を必要とする患者に請求項18記載の組成物を投与することを含んで成る方法。 42．前記病気又は症状が、癌、丘疹鱗屑性皮膚病、関節炎、座瘡、くも状静脈、静脈瘤性静脈、眼窩周囲暗色輪、肥大性瘢痕、脱毛症、湿疹、いぼ、多発性硬化症、線維症、炎症性腸疾患、強皮症、血管収縮性病、角膜新生脈管形成症、角膜感染症、脈管新生緑内障、ヘルペスウィルス角膜炎、糖尿病網膜症及び移植片拒絶より成る群から選ばれる、請求項41記載の方法。 43．内皮細胞増殖を阻害する方法であって、請求項13，14及び15のいづれか１項記載の軟骨エキスを含んで成る組成物に前記内皮細胞を接触させることを含んで成る方法。 44．活性化ケラチノサイト分化を阻害する方法であって、請求項13，14及び15 のいづれか１項記載の軟骨エキスを含んで成る組成物にケラチノサイトを接触させることを含んで成る方法。