RO118567B1 - Procedeu de obtinere a unui extract de cartilagiu de rechin - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la procedeul de obtinere a unui extract de cartilagiu de rechin, utilizat in medicina. Procedeul de obtinere a unui extract de cartilagiu de rechin, conform inventiei, care consta din: a) omogenizarea cartilagiului de rechin intr-o solutie apoasa pana la reducerea lui la particule a caror dimensiune este mai mica decat, sau egala cu 500 microni, b) extragerea, in solutie apoasa, rezultand un amestec de particule si un extract lichid brut; c) separarea particulelor din extractul lichid brut; d) indepartarea moleculelor de cartilagiu de rechin cu greutate moleculara mai marede 500 Kda, astfel incat sa se obtina un extract lichid final, cu molecule de cartilagiu de rechin cu greutate moleculara mai mica sau egala cu 500 Kda, iar extractul lichid final se filtreaza pe o membrana cu valoarea de fragmentare a greutatii moleculare de 100 Da, astfel incat moleculele, avand greutate mai mica decat valoarea de fragmentare, sunt indepartate, sau extractul final se liofilizeaza in prezenta stabilizatorilor sau a agentilor crioprotectivi sau extractul lichid final se filtreaza pe o membrana cu valoarea de fragmentare a greutatii moleculare de 10 Kda, se recupereaza fractiunea care cuprinde molecule cu greutate moleculara cuprinsa intre 10 si 500 Kda, se fractioneaza fractiunea pe o coloana cromatografica schimbatoare de anioni si se recupereaza fractiunea, care se elueaza cu NaCl 0,8 la 1N.

Description

Invenția se referă la procedeul de obținere al unui extract de cartilagiu de rechin utilizat în medicină.

Cartilagiul este un țesut nevascularizat și a fost studiat drept un candidat potențial conținând factori antiangiogenici. El este, de asemenea, un țesut relativ rezistent la dezvoltarea tumorilor. Angiogeneza este unul dintre factorii importanți în dezvoltarea unei tumori. Masele tumorale distinctive apar dacă celulele tumorale pot provoca o rețea vasculară adiacentă pentru a se expanda în vederea alimentării cu necesitățile lor nutriționale. Ca urmare, factorii implicați în stimularea angiogenezei au fost studiați în ceea ce privește rolul lor în dezvoltarea tumorii și factorii antiangiogenici precum și medicamentele având o activitate inhibitoare angiogenică au fost de asemenea investigați ca mijloace privind controlul creșterii sau pentru efectuarea regresiei tumorilor.

S-a descoperit că, cartilagiul scapular la viței conține o substanță care inhibă vascularitatea tumorilor solide (Langer și colab., 1976). Datorită potențialului său încurajator că agent antitumoral, au fost investigate surse care să asigure o alimentare în cantități mai mari de cartilagii.

Rechinii sunt animale reprezentând o sursă potențială de un asemenea tip de inhibitor al angiogenezei întrucât endoscheletul acestora este format în întregime din cartilagiu (6% din greutatea corpului lor în comparație cu 0,6% la viței).

Rechinii prezintă de asemenea drept o caracteristică interesantă o înclinare scăzută către dezvoltarea tumorilor. Au fost elaborate multe ipoteze pentru a explica această posibilitate scăzută de dezvoltare a tumorilor la rechini. Marchalonis și colab. (1990) au demonstrat că anticorpii IgM sunt capabili să atace cu ușurință orice agent agresiv. McKinney și colab. (1990) au demonstrat că rechinii au macrofage capabile să diferențieze celulele normale de celulele neoplazice și să le distrugă pe acestea din urmă. Rosen și Woodhead (1980) au arătat faptul că raritatea tumorilor la elasmobranchiale (un grup căruia îi aparțin rechinii și calcanul) se poate datora rezistenței ionice ridicate a țesutului lor, ceea ce este echivalent cu o temperatură ridicată a corpului. în aceste condiții, acești autori cred că sistemul imunologic exercită o supraveghere imunologică apropiată de 100%. Moore și colab. (1993) au descoperit că rechinii produc un aminosterol având proprietăți antibacteriene și antiprotozoale. în fine, Lee și Langer (1983) și Folkman și Klagsbrun (1987) au demonstrat că rechinii produc o substanță care inhibă neovascularizarea. Lee și Langer au izolat această substanță prin extragerea ei din cartilagiul de rechin în condiții de denaturare (extracție a guanidinei). Acest procedeu de extracție este totuși foarte lung ca durată (41 de zile), poate genera extracte având factori de denaturare, iar randamentul în ceea ce privește produșii activi este departe de a fi excelent. întrucât substanța activă izolată de la viței are o greutate moleculară de aproximativ 16 kiloDas (kd), aceeași grupă de cercetători nu a dat o greutate moleculară precisă față de una regăsită la rechini. Această substanță este definită doar ca având o greutate moleculară mai mare decât 3500 Da. Oikawa și colab. (1990) au aplicat aceeași metodă de extracție ca cea descrisă de Lee și Langer, dar într-o durată de timp mult mai scurtă (2 zile în loc de 41 de zile). Substanța antiangiogenică izolată din cartilagiul de rechin de către Oikawa și colab. este limitată la o moleculă având o greutate moleculară cuprinsă în domeniul de la 1000 până la 10000 Da. Schinitsky (US 4473551) a descris un extract apos de cartilagiu de rechin brut sub formă de pulbere cu fracțiuni având mai mult de 100000 Da și având o activitate antiinflamatoare, luat singur sau în combinație cu glucozamină. Nu s-a făcut nici o sugestie privind un anume component din acest extract având o activitate antiangiogenică sau antitumorală în acest brevet. Kuether și colab. (US 4746729) au izolat un inhibitor elastază polimorfonuclear neutrofil (PMN) din cartilagiul de bovine. Acest inhibitor a fost obținut dintr-un extras apos de cartilagiu din care au fost reținute molecule cu o greutate moleculară de mai puțin de 50000 Da. Fracționarea pe Sephacril S-200 a condus la numeroase fracțiuni, dintre care cele de 10...40 kDa au fost puse de acord, după ce acestea au demonstrat o activitate antielastază. Componentul activ are un punct

RO 118567 Β1 izoelectric de 9,5 și ar putea avea o greutate moleculară de aproximativ 15000 Da. Kuetner și colab. (US 4042457) au demonstrat, de asemenea că, cartilagiul de bovine posedă un component cu o greutate moleculară mai mică de 50000 Da, care are o activitate inhibitoare a proliferării celulelor, fără vreo activitate asupra creșterii celulelor endoteliale. Balassa și co- 55 lab. (US 4822607) au obținut un extract de cartilagiu într-o soluție apoasă, extract care posedă o activitate antitumorală. Cu toate acestea, noi nu am observat nici o activitate antiangiogenică în extractul obținut prin reproducerea metodei Balassa. Spilburg și colab. (US 4243582) au izolat două glicoproteine cu greutate moleculară de 65 kDa și având pi de 3,8 din cartilagiu de bovine (extracție guanidinică), care au demonstrat o activitate antitripsină 60 și o activitate inhibitoare a creșterii celulelor endoteliale.

Cartilagiile de vițel și de rechin conțin multe activități biologice, cum este activitatea proinflamatoare, activitatea antiinflamatoare, activitatea antiangiogenică, activitatea lizozimă, activitatea de promotare a creșterii celulelor, activitatea inhibitoare împotriva colagenazei de tipul I și IV, a elastazei, și a altor proteaze, cum ar fi tripsina, chimotripsina și plasmina. Cu 65 toate acestea, nimeni nu a obținut încă un extract de cartilagiu care să conțină un mănunchi de activități valoroase din punct de vedere clinic.

Componentul antiangiogenic din cartilagiul de rechin a fost în general testat în buzunarul cornean de iepure sau în testul membranei chorioalantoice de la pui de găină (CAMchick chorioallantoic membrane). Până în prezent, întreg cartilagiul sub formă de pulbere 70 a fost testat direct asupra tumorilor in vivo, pe xenograft de melanom uman implantat la șoarece fără păr (US 5075112), precum și testat cu testul membranei corioalantoice la pui (testul CAM), în ceea ce privește efectul său antiangiogenic. Cu toate că au efect antitumoral, atribuit extractelor de cartilagiu, acest efect a fost cel mai des atribuit componentului antiangiogenic care separă tumoarea de alimentarea ei cu sânge. Până în prezent, nu există o evi- 75 dență precum că cartilagiul de rechin are un efect direct asupra celulelor tumorale în proliferare.

Câteva procedee de obținere a extractelor de cartilagiu și a unor fracții ale acestora sunt deja cunoscute. Unele din ele produc un cartilagiu brut sub formă de pulbere fără vreo extracție (US 5075112). Altele utilizează agenți denaturați, cum este guanidina (US 80 4243582). Altele efectuează un pretratament al cartilagiului pe calea unei digestii enzimatice, pentru a-l elibera de structuri musculare, nervoase sau vasculare, care înconjoară cartilagiul, faza de pretratare fiind urmată de eliminarea grăsimilor în solvenți organici, și apoi componenții activi sunt extrași într-o fază apoasă. (Balassa și alții, US 3478146,4350682,4656137 și 4822607). Efectul acestei faze de pretratare asupra prezervării integrității componentelor 85 din cartilagiu, active din punct de vedere biologic, nu este cunoscut. în cazul în care este prea extensivă, digestia enzimatică poate hidroliză componentele proteice active. De exemplu, procedeul Balassa (US 4822607) produce un extract lichid fără vreo activitate antiangiogenică; această pierdere poate fi rezultatul unei asemenea degradări enzimatice. Procedeul Ballassa nu include o fază de fracționare, care ar îmbogăți suplimentar extractul în ceea ce 90 privește componenții activi. Alte metode produc simplu extracte apoase (în apă, US 4473551) sau soluții ale sărurilor (US 4746729) de cartilagiu prin eliminarea materialului insolubilizat. Printre acestea din urmă, fracțiuni specifice cu greutate moleculară specifică au fost în mod deosebit reținute pentru o studiere și o purificare ulterioară (vezi discuțiile de mai înainte). 95

Procedeele menționate mai sus prezintă o serie de dezavantaje. Ele pot denatura unele componente valoroase. Când nu se întâmplă aceasta, ele pot prezenta dezavantajul de a fi prea lungi ca durată de timp, pentru a avea un scop practic. Mai mult decât atât, metodele care necesită o durată mare de timp nu conduc. în mod necesar, la cantități suficiente de componente active, și dintre componentele recuperate, unele nu sunt recuperatede- 100 loc sau într-o măsură insuficientă pentru a demonstra o activitate detectabilă, sau unele dintre ele pot fi neluate în considerare în ceea ce privește obținerea unor activități specifice.

RO 118567 Β1

Angiogeneza nu este implicată numai în dezvoltarea cancerului. Multe maladii sau condiții care afectează diferite sisteme fiziologice (care sunt indicate aici mai jos în paranteze) sunt dependente de angiogeneză, printre care putem menționa următoarele exemple: artrită și plăci aterosclerotice (oase și ligamente), retinopatie diabetică, glaucom neovascular, degenerare masculară, herpes ocular, traboma și neovascularizarea grefei corneene (ochi), psoriazis, scleroderma, rozaceea, hemangiom și cicatrice hipertrofică (la piele), adeziuni vasculare și angiofibrom (în sistemul sanguin). Ca urmare, orice “factor” antiangiogenic nou sau potent își poate găsi utilizare în tratamentul acestor maladii, precum și în terapia cancerului și a altor maladii dependente de angiogen. Mai mult decât atât, întrucât multe dintre maladiile mai sus menționate sau condiții au și o componentă antiinflamatoare, orice “factor” antiinflamator nou și potent își poate găsi utilizare în tratamentul acestor maladii și condiții, precum și în orice alte maladii sau condiții inflamatorii. Mai mult decât atât, întrucât proteazele, cum este colageneza, sunt implicate într-un număr mare de maladii și condiții, cum este cancerul, și care îmbătrânesc prematur, întrucât colagenul lor își degradează activitatea, un “factor” anticolagenolitic nou și potent își găsește utilizare în tratamentul maladiilor sau condițiilor având o componentă colagenolitică. întrucât angiogeneza poate fi întâlnită singură sau în combinație cu o multitudine de maladii și condiții, un produs capabil să antagonizeze cel puțin toate aceste activități, fără să afecteze funcțiunile unui corp normal, prezintă o mare valoare terapeutică.

Prezenta invenție asigură un procedeu nou de producere a extractelor de cartilagii, care prezintă avantajul de a conține o multitudine de activități valoroase din punct de vedere terapeutic. Printre acestea, activitățile, antiangiogenice, anticolagenolitice, activitățile de antiproliferare a tumorilor in vivo și antiproliferare a tumorilor direct în vitro au fost confirmate a fi prezente în concentrații satisfăcătoare în extractul de cartilagiu de rechin. Alte activități își așteaptă identificarea sau confirmarea. Toate activitățile au fost obținute în extractul lichid al cartilagiului de rechin, iar unele din ele au fost obținute sau verificate în extractul solid al cartilagiului de rechin.

Prezenta invenție se referă la un nou procedeu de obținere a unui extract de cartilagiu, având o porțiune substanțială de componente hidrosolubile, active din punct de vedere biologic, prezente în cartilagiul intact, procedeu care cuprinde următoarele faze:

a) omogenizarea cartilagiului de rechin într-o soluție apoasă, până la reducerea lui la particule a căror dimensiune este mai mică decât, sau egală cu 500 μ;

b) extragerea, în soluție apoasă, rezultând un amestec de particule și un extract lichid brut;

c) separarea particulelor din extractul lichid brut;

d) îndepărtarea moleculelor de cartilagiu de rechin cu greutate moleculară mai mare de 500 Kda, astfel încât să se obțină un extract lichid final cu molecule de cartilagiu de rechin cu greutate moleculară mai mică sau egală cu 500 Kda. Extractul lichid final se filtrează pe o membrană cu valoarea de fragmentare a greutății moleculare de 100 Da, astfel încât moleculele, având greutate mai mică decât valoarea de fragmentare, sunt îndepărtate sau extractul final se liofilizează în prezența stabilizatorilor sau a agenților crioprotectivi.

Acest nou procedeu prezintă avantajul de a fi ușor de efectuat și în același timp eficient. S-au obținut randamente ridicate de extract de cartilagiu, extract care, în special cel obținut din cartilagiu de rechin, conține cel puțin toate activitățile biologice menționate mai înainte. Este de preferat ca acesta să fie efectuat la o temperatură scăzută (aproximativ de la 0 până la 20°C), în condiții lipsite de denaturare (preferabil în apă pură), la o valoare a pH-ului aproape de cea neutrală (aproximativ 5 până la 8) pentru a maximiza posibilitatea recuperării compușilor cu caracteristici fizico-chimice necunoscute. în conformitate cu acest procedeu, componentele cartilagiului pot fi extrase într-un volum mic de soluție (atât de mic încât să reprezinte 1 litru pentru 1 kilogram de cartilagiu), și după o scurtă perioadă de omogenizare (atât de scurtă, încât să reprezinte 10 până la 20 de min). Pentru recuperarea extractului solid, se utilizează același procedeu, exceptând faptul că peletele sunt recuperate și liofilizate, fără a lua în considerare astfel supernatantul.

RO 118567 Β1

160

Un alt procedeu de obținere a unui extract de cartilagiu de rechin, conform invenției, constă în următoarele etape:

a) omogenizarea cartilagiului de rechin într-o soluție apoasă până la reducerea lui la particule a căror dimensiune este mai mică decât, sau egală cu 500 μ;

b) extragerea, în soluție apoasă, rezultând un amestec de particule și un extract lichid brut;

c) separarea particulelor din extractul lichid brut;

d) separarea, în continuare, a extractului lichid brut astfel încât să se obțină un extract lichid cu molecule de cartilagiu de rechin cu greutate moleculară mai mică sau egală cu 500 Kda. Extractul lichid final se filtrează pe o membrană cu valoarea de fragmentare a greutății moleculare de 10 Kda, se recuperează fracțiunea care cuprinde molecule cu greutate moleculară cuprinsă între 10 și 500 Kda, se fracționează fracțiunea pe o coloană cromatografică schimbătoare de anioni și se recuperează fracțiunea care se eluează cu NaCI 0,8 la 1 N.

Această invenție se referă la extracte de cartilagiu, în mod deosebit la extracte din speciile din ramura elasmo (elasmobranch), în mod deosebit la rechin. Extractul solid a dovedit activitate. El poate conține colagen și componente nehidrosolubile. El poate prezenta, de asemenea, o activitate reziduală din ceea ce a fost extras în extractul lichid total. Extractul lichid total este foarte bogat în ceea de privește activitatea. El poate fi utilizat ca atare sau el poate fi concentrat. O fază de concentrare, care favorizează menținerea activităților biologice, constituie un privilegiu. Recurgerea la metode care ar putea deteriora componentele active, cum ar fi evaporarea cu ajutorul căldurii, trebuie să fie evitate cu prudență. A fost folosită ultrafiltrarea pe o membrană având o greutate moleculară ca valoare limită de 1 kDa, pentru a concentra extractul lichid al acestei invenții. Nanofiltrarea pe o membrană având o greutate moleculară cu o valoare limită de aproximativ 100 Da, a fost chiar mai bună pentru concentrarea activităților biologice ale extractului lichid (antiangiogenic, anticolagenolitic). Drept rezultat, un extract concentrat, conținând molecule cu greutate moleculară cuprinsă între aproximativ 0,1 și aproximativ 500 kDa, a fost testat.

Extractul lichid (0 până la 500 kDa) a fost apoi fracționat pentru a caracteriza componentele active ale acestuia. Au fost obținute numeroase fracțiuni active, folosind diferite metode. Unele dintre acestea, testate în ceea ce privește activitatea lor antitumorală asupra liniilor de celule tumorale, au fost, în mare, caracterizate prin greutatea lor moleculară și punctul izoelectric. Altora li s-a atribuit o activitate, îndeosebi anticolagenolitică sau antiangiogenică. Aceste fracțiuni își așteaptă o completă identificare și o caracterizare. Ca urmare, activitățile valoroase din punct de vedere biologic sunt recuperate în extractul lichid total și în fracțiunile acestuia, activități care pot fi în mod avantajos utilizate. în locul administrării unor cantități mari de cartilagiu sub formă de pulbere, în prezent, sunt administrate extracte îmbogățite mult mai acceptabile.

Extractul de cartilagiu de rechin face parte din unele compoziții cosmetice sau terapeutice. Cel mai mare interes l-au prezentat formulările preparate în scopuri dermatologice sau cosmetice. Acest interes a rezultat ca urmare a observării activităților prezentate de extractele de cartilagiu. Sub acest aspect, activitățile antiangiogenice, anticolagenolitice și antiinflamatorii observate și efectul antagonistic al diferențierii celulare mediat de treceri de semnalizare, cum este Protein chinaza C în cheratinocite, a fost considerat ca deschizător de drumuri în utilizarea extractelor de cartilagiu de rechin în compoziții și metode pentru reducerea inflamațiilor sau iritațiilor, reglarea zbârciturilor sau a atrofiei pielii, întârzierea îmbătrânirii premature, reducerea acneei, îmbunătățirea funcției de barieră a pielii, reducerea cearcănelor negre din jurul ochilor, reducerea venelor încrucișate și varicozelor, regresia negilor, și un efect de calmare a pielii. întrucât extractul lichid de cartilagiu de rechin a fost testat cu succes în cancer, artrită, psoriazis și în cazurile de acnee, compozițiile și metodele pentru tratamentul maladiilor și condițiilor având una sau mai multe componente selectate dintr-un grup constând din proliferarea tumorală, angiogeneza, inflamații și colagenoliză, sunt de asemenea sub incidența scopului prezentei invenții.

165

170

175

180

185

190

195

200

205

RO 118567 Β1

Prezenta invenție va fi mai bine și mai ușor înțeleasă cu ajutorul unor moduri de realizare, care sunt ilustrate în figurile anexate, de la 1 la 27, și care reprezintă exemple de realizare, fără a limita scopul invenției de față:

Se prezintă, în continuare, fig. 1...27, în legătură cu exemplele de realizare ale invenției:

- fig.1 ilustrează compoziția de amino acid specifică, a extractului lichid;

- fig.2 ilustrează o activitate inhibitoare a răspunsului la doză a cartilagiului de rechin (extractul solid) asupra liniilor celulare ZR 75 -1 și MCF - 7;

- fig.3 ilustrează curbele de răspuns la doză a cantității de celule MCF-7, în prezența creșterii concentrațiilor de estradiol, cu sau fără două concentrații de extract de cartilagiu solid;

- fig.4 a) și 4 b) indică o comparație a secțiunilor tumorii de glandă mamară la șobolanii cărora li s-a administrat apă (A) sau o combinație de extract de cartilagiu solid și lichid (B);

- fig.5 este o histogramă care ilustrează faptul că șobolanii tratați cu cartilagiu prezintă o scădere cu 50% a zonei de vascularizare a tumorilor lor;

- fig.6 ilustrează faptul că extractul lichid de cartilagiu nu are efect asupra proliferării celulelor fibroblaste;

- fig.7 indică o curbă de inhibare ca răspuns la doză a extractului de cartilagiu lichid asupra proliferării HUVECS;

- fig.8 ilustrează faptul că extractul de cartilagiu lichid inhibă diferențierea cheratinocitelor induse de TPA;

- fig.9 ilustrează o curbă de răspuns la doză privind inhibarea extractului de cartilagiu lichid asupra activității colagenazei;

- fig. 10 ilustrează o curbă de răspuns la doză privind inhibarea extractului de cartilagiu lichid asupra testului de vascularizare embrionară (ex ovo);

- fig.11 prezintă efectul diferitelor doze de extract de cartilagiu lichid asupra inhibării creșterii tumorale la șoareci;

- fig. 12 ilustrează faptul că administrarea interperitoneală a extractului de cartilagiu lichid poate conduce la creșterea substanțială a eficacității produsului în ceea ce privește inhibarea creșterii tumorale;

- fig.13 reprezintă profilul electroforetic în condiții de nedenaturare a fracțiunilor lichid separate pe Rotofor; indicatorii de greutate moleculară apar în stânga, urmați de o probă de extract lichid, înainte de fracționare, în vederea comparației cu fracțiunile izolate;

- fig.14 indică un model de migrare în cromatograma de lichid de înaltă presiune al unei fracțiuni din extractul lichid total al acestei invenții, având o greutate moleculară mai mică de 10000 Da, fracțiune care a fost concentrată și separată în cinci sub-fracțiuni;

- fig.15 ilustrează rezultatele EVT obținute cu două fracțiuni de extract lichid din cartilagiu de rechin din prezenta invenție (DUP), una având o greutate moleculară mai mică de 10000 Da, cealaltă având o greutate moleculară mai mare de 10000 Da;

- fig.16 ilustrează un model de migrare în cromatograma de lichid de înaltă presiune, a trei extracte diferite de cartilagiu de rechin. în diagrama A, DUP simbolizează un extract lichid de cartilagiu în conformitate cu prezenta invenție. în diagramele B și C, BAL și OIK, simbolizează extracte din practica anterioară, Balassa și alții, și, respectiv, Oikawa și alții;

- fig. 17 ilustrează un model de migrare în cromatograma de lichid de înaltă presiune ale acelorași extracte definite în fig.16;

- fig. 18 ilustrează o comparație CZE a extractului lichid din prezenta invenție și a celui din practica anterioară. A = DUP; B = BAL; C = OIK;

- fig.19 ilustrează o comparație EVT a extractului lichid din prezenta invenție cu cel din practica anterioară;

RO 118567 Β1

260

- fig.20 ilustrează o comparație a conținutului de aminoacid din prezenta invenție cu cel obținut în practica anterioară;

- fig.21 ilustrează îmbunătățirea semnificativă a condiției a doi pacienți suferind de psoriazis, unul cu hipercheratoză 22 a) și b), iar celălalt fără hipercheratoză 22 c) și d), atunci când sunt tratați cu o compoziție topică conținând o cantitate eficientă de extract de cartilagiu lichid concentrat (fotografia de jos), comparativ cu condiția lor inițială (fotografia de sus);

- fig.22 ilustrează îmbunătățirea în ceea ce privește apariția venelor încrucișate în fața umană la persoanele tratate cu extract de cartilagiu lichid;

- fig.23 indică îmbunătățirea realizată în ceea ce privește apariția unor cearcăne de culoare închisă în jurul ochilor la persoane tratate cu extract de cartilagiu lichid;

- fig.24 indică îmbunătățirea obținută în apariția venelor cu varicoză pe picioarele persoanelor tratate cu extract de cartilagiu lichid;

- fig.25 ilustrează îmbunătățirea semnificativă a condiției unui pacient suferind de acnee, atunci când este tratat cu o compoziție topică conținând o cantitate eficientă de extract de cartilagiu lichid (fotografia din partea superioară), comparativ cu condiția lui inițială (fotografia din partea superioară);

- fig.26 indică potențialul antiinflamator al extractului de cartilagiu lichid asupra pielii umane;

- fig.27 ilustrează îmbunătățirea funcției de barieră a pielii la persoanele tratate cu compoziții conținând extract de cartilagiu lichid.

într-un mod de realizare specific, cartilagiu! a fost obținut de la rechini sănătoși din specia Black Spiny Dog Fish (rechin mic cu spinarea neagră și Common Spiny dog fish (rechin mic cu spinarea comună). Orice țesut muscular și conectiv a fost îndepărtat prin răzuire cu scalpel tratat cu alcool etilic și prin tăiere cu foarfecă. Cartilagiul a fost apoi împachetat sub vacuum m pungi din masă plastică și congelat la temperatura de - 20°C, în vederea unei utilizări ulterioare. A fost ales un cartilagiu de rechin, în scopurile menționate, în secțiunea situației practicii actuale. Se consideră că pornind de la cartilagiul “elasmobranch” (care include rechini și calcan ca specie de animal din această grupă), se pot obține produse aproape echivalente. Produsele vor fi probabil diferite atât ca natură, cât și ca concentrație a principiilor active, în cazul în care se folosesc surse de cartilagiu de la mamifere.

Se poate folosi orice variațiune de preparare a cartilagiului înainte de extracția lui, atâta timp cât această operație nu afectează în mod substanțial activitatea produsului care prezintă interes (de exemplu, un extras de lichid total sau o fracțiune specială a acestuia). Unii componenți activi pot rezista la digestia proteolitică, așa cum admite Balassa și colab. (US 4822607) pentru a curăța cartilagiul de orice țesut înconjurător, în timp ce alte componente nu pot rezista la asemenea tratament. Una dintre activități, care nu pare să reziste la un asemenea tratament, este activitatea antiangiogenică (fig. 19). Prin urmare, în cazul în care se dorește a se produce un extract lichid conținând pe cât posibil toți componenții activi hidrosolubili cărora li se atribuie activități diferite, o asemenea fază de digestie în timpul procedurii de extracție trebuie evitată sau monitorizată cu multă grijă, pentru a preveni hidroliza extensivă sau proteoliza.

Exemplu de obținere a extractelor de cartilagiu

Cartilagiul curățat a fost utilizat proaspăt, dezghețat până la temperatura de 4°C, sau congelat. Cartilagiul a fost trecut apoi de nenumărate ori (mai obișnuit de trei ori) prin găurile unei mașini de tocat carne aseptizată cu alcool etilic, împreună cu un volum adecvat de apă (în cantități egale (greutate/volum) reprezintă un volum minim, dar el poate fi crescut fără ca să aibă vreun efect asupra randamentului de recuperare al componentelor valoroase). Un volum mai mic este preferat întrucât el este mai convenabil de manipulat decât volume mari nenecesare, din punct de vedere practic. în practică, apa a fost purificată prin osmoză inversă și multiple filtrări până la 0,1 pm de filtru. Multe soluții apoase (conținând săruri,

265

270

275

280

285

290

295

300

305

RO 118567 Β1 de exemplu) pot fi utilizate în loc de apă. Atunci când este examinată recuperarea unei multitudini de activități hidrosolubile, operarea în condiții de pH aproape neutral (5,0 până la 8,0) și în condiții de nedenaturare este preferată, pentru a evita liza sau denaturarea unor componente active din cartilagiu. Comportarea proteinelor necunoscute în solvenți apoși nu este previzibilă; unele dintre ele pot fi mai “confortabile” la un pH acidic, altele la un pH bazic. Mai mult decât atât, unele proteine pot fi extractibile în condiții blânde de denaturare, dacă această denaturare nu afectează în mod ireversibil denaturarea acestor proteine în soluții apoase. Din motive de claritate, orice condiții de extracție care sunt compatibile cu prezervarea componentului hidrosolubil, activ din punct de vedere biologic, din cartilagiu, intră sub incidența scopului acestei invenții. Ca urmare, luând în considerație toți acești factori, efectuarea procesului de extracție a componentelor active din cartilagiu, în apă purificată, s-a dovedit a fi o alegere judicioasă pentru a recupera, cu randamente foarte bune, componentele având o structură și o comportare ce poate fi definită.

Amestecul cartilagiu/apă a fost apoi omogenizat prin agitare cu turație maximă întrun amestecător de tip bucătărie, la o temperatură de aproximativ 4°C, timp de 20 min; în timpul omogenizării, temperatura omogenizatului crește până aproape de 20°C. Desigur, viteza de rotație precum și volumul soluției apoase pot influența atât durata, cât și randamentul extracției. Ca urmare, un domeniu rezonabil pentru durata de omogenizare (definită ca cea care conduce la particule mai mici de 500 pm) ar fi cel cuprins între aproximativ 10 min până la aproximativ 24 h, preferabil între aproximativ 10 și 60 de min. Temperatura ar trebui menținută la valori mai scăzute de aproximativ 10°C, pentru a evita orice degradare a componentelor active de către enzimele endogene, atunci când nu se utilizează inhibitori de enzime. în mod ideal, ar trebui luată în considerare o temperatură apropiată de 0°C. întrucât în mod normal, o asemenea experimentare se realizează într-o încăpere rece, în care temperatura este menținută între 4 și 10°C, acest domeniu privind temperatura poate fi considerat ca acceptabil în procedeul din prezenta invenție. Din motive de claritate și în același timp din motive de abreviere, termenul de “aproximativ 4°C”, utilizat aici, în continuare, reprezintă domeniul de temperaturi acceptabil.

O lichefiere a acestui omogenizat poate fi în continuare obținută prin supunerea acestuia din urmă la un dezintegrator Polytron, timp de 10 min, la o temperatură de aproximativ 4°C, în cazul în care amestecătorul nu reduce în mod suficient dimensiunea particulelor. Ca o alternativă, amestecul poate fi omogenizat într-un mod simplu într-un amestecător-dezintegrator de performanță mai ridicată care, la dispoziția noastră, reduce cu 10 min faza de lichefiere. La sfârșitul fazei de omogenizare completă, dimensiunea particulelor reziduale este mai mică de aproximativ 500 pm. Desigur, se poate aplica de asemenea același domeniu de durată de timp și temperatură analizat pentru obținerea primului cartilagiu mărunții. Dimensiunea particulelor după operația de omogenizare nu trebuie să fie ultramică. Prin urmare, necesitatea de a pulveriza cartilagiul înainte de extracție trebuie evitată sau poate fi evitată. într-adevăr, pulverizarea cartilagiului până la aducerea lui sub forma unei pulberi înainte de extracția apoasă, poate din contră să denatureze activități valoroase, în special atunci când o asemenea pulverizare este efectuată într-o stare de congelat-uscat și/sau într-o stare de uscat datorită căldurii.

Omogenizatul a fost centrifugat la o turație de 13600 de tur/min, timp de 15 min, la o temperatură de aproximativ 4°C, fază ce reprezintă o cale de separare rapidă și eficientă a supernatantului de pelete. Variații și ajustări ale acestor parametri se pot face de către specialiștii în acest domeniu cu un stadiu de practică, depinzând în întregime de volumul omogenizatului și de echipamentul utilizat.

Peletele rezultate au fost liofilizate timp de 24 până la 48 h. Prima fracțiune va fi definită aici în continuare drept liofilizat sau EXTRACT SOLID.

RO 118567 Β1

360

Supernatantul poate fi filtrat pe un filtru Whatman de 24 pm, în cazul în care este necesar, pentru a mărunți particulele susceptibile de a afecta performanțele unei coloane de ultrafiltrare. Materialul filtrat a fost apoi supus ultrafiltrării la o temperatură de aproximativ 4°C pe o coloană de filtrare cu flux tangențial, având o porozitate de aproximativ 500 kDa, care permite obținerea unui prim permeat brut cuprinzând molecule hidrosolubile cu o greutate moleculară cuprinsă între 0 și aproximativ 500 kDa. Acest extract permeat brut a fost filtrat pe un filtru de 2,22 pm și s-au preluat alicoți în sticle aseptice în vederea unei utilizări ulterioare. Această fracțiune va fi denumită în continuare drept permeat brut sau EXTRACT LICHID.

Pentru obținerea de pelete și supernatant, a fost dezvoltată o procedură de centrifugare de înaltă performanță. Faza de centrifugare la o turație de 13600 tur/min, timp de 15 min, urmată de o filtrare grosieră pe filtre Whatman, a fost înlocuită de o centrifugare pe o centrifugă CEPA echipată cu un buzunar de nylon cu o porozitate de 1 pm, la turații de

3000...4000 tur/min (x g). Un preparat de 25 kg/251 poate fi centrifugat, în această manieră, în decurs de 30 min, asigurând aproximativ 29 I de supernatant. Volumul apos obținut este mai mare decât volumul de pornire al apei, admițând că o parte din apa conținută în cartilagiu a fost și ea recoltată. Liofilizatul și extractul lichid total pot avea următoarea compoziție aproximativă, care în mare, ia în considerație variațiile observate de la șarjă la șarjă, precum și atunci când se folosesc materiale diferite.

365

370

375

EXTRACTUL SOLID
Lipide	7,35%(1)
Proteine	46,2%(2)
Umiditate	20,4%
Sodiu	4,16 mg/g(3)
Potasiu	2,64 mg/g
Calciu	114 mg/g
Magneziu	1,49 mg/g
Zinc și fier	urme
EXTRACTUL LICHID
Lipide	0,10 - 0,20%(1)
Proteine	8 - 25 mg/ml(2)
Greutate în stare uscată	8-25 mg/ml
Umiditate	97 - 99%
Sodiu	30 - 220 mg/100 g(3)
Potasiu	30 - 40 mg/100 g
Calciu	2,0 mg/100 g
Magneziu	1,1 mg/100 g
Zinc și fier	urme

380

385

390

395 ^(l|,^,2)Măsurate în conformitate cu directivele publicate în AOAC Oficial (1984), secțiunile 16, 219...220 și respectiv

2055;

(3) Măsurate în conformitate cu procedura SAA.

400

RO 118567 Β1

Conținutul de proteine este evaluat prin metoda Kjaldahl, care măsoară într-adevăr azotul organic (N). Azotul organic este convertit în proteina echivalentă prin utilizarea relației care urmează:

Conținut de proteine (mg/ml) =[%N x 6,25] pentru 100

Carbohidrații nefiind detectabili, se poate presupune că ei se găsesc într-unul sau altul dintre extracte, dar sub forma de proteoglicani și/sau mucopolizaharide. Este posibil ca acești compuși să fie incluși în nivelul de umiditate măsurat. Lipofilizatul conține un nivel neașteptat de umiditate care a fost măsurat prin grupările - OH. întrucât conținutul de 20% apă este apropiat de procentajul carbohidraților recuperați în mod normal din cartilagiu, în timp ce umiditatea liofilizatului trebuie să fie aproape de 0%, această ipoteză rămâne să fie verificată.

Extractul de cartilagiu lichid a fost analizat în ceea ce privește conținutul lui în aminoacizi. Cantitatea medie de total aminoacizi a fost de aproximativ 1,1 mg per ml, cu aminoacizi liberi numărând 0,67 mg (61%) și aminoacizi de origine proteinică numărând 0,44 mg (39%). Distribuția fiecăruia dintre aminoacizi este arătată în fig.1. Au fost detectate cantități semnificative de taurină (care însă nu este arătată).

Cea mai mare parte dintre aminoacizii prezenți în extractul lichid sunt reprezentativi pentru proteice și peptide din cartilagiu. De exemplu, Lizină, Glicina, Acidul aspartic și Acidul glutamic reprezintă o proporție mare a conținutului de aminoacizi din extractul lichid și sunt componenții principali ai N-telopeptidelor reticulate intermolecular în colagen (Hanson și colab. (1992) J. Bone & Min. Res. 7:1251 -1258).

A fost controlată limita microbiană a extractului lichid, aplicând standardele USP XXIII 61.

TESTE PRIVIND ACTIVITATEA

EXTRACTUL SOLID

Teste in vitro

Aceste teste au fost efectuate pe linii celulare de cancer dependent de hormoni MCF - 7 și ZR 75-1 (ATCC (R), numerele 22-HTS și, respectiv, 1500-CRL).

Celule ZR 75-1

a) Mediu de bază RPMT g RPMI 1640 lipsit de fenol roșu (Sigma R 8555), 17,875 h Hepes (acid liber: Sigma DO 763), 0,55 g piruvat de sodiu (Sigma P 5280) și 10 g de bicarbonat de sodiu au fost amestecate în 5 I de apă purificată și aduse la o valoare a pH-ului de 7,40 cu ajutorul hidroxidului de sodiu.

în cazul în care nu este utilizată imediat, această soluție trebuie să fie protejată de lumină pentru a prezerva substanțele fotolabile. Această soluție a fost filtrată, distribuită în butelii sterile de capacitate 500 ml și depozitate la temperatura de 4°C o perioadă maximă de timp de trei luni.

b) Mediu de menținere a culturii celulelor

Mediul de bază RPMI a fost suplimentat cu 10% (vol/vol) de FBS (fetal bovine serum -ser fetal de bovine), 100 U de penicilină G/50 pg de streptomicină sulfat (Sigma PO 906)/ml de mediu, 2 mM glutamină (Sigma G 1517) și 1 nM E₂ (befâ-estradiol, Sigma E 8875).

c) Mediu experimental

Mediul de bază RPMI a fost suplimentat cu 5% FESA (fetal bovine serum adsorbed cu dextran - charocal - ser fetal de bovine adsorbit pe dextran - cărbune activ), 2 mM de

RO 118567 Β1

450

L - glutamină, 100 U de penicilină G/50 pg de streptomicină sulfat/ml de mediu și 50 mg/ml insulină (Sigma). La acest mediu, s-au adăugat concentrații din ce în ce mai mari de liofilizat descris mai înainte, precum și concentrații diferite de E₂ (10^-12 până la -5 M=.

Celule MCF - 7

a) . Mediu de bază DME - F 12

Mediul DME - F12 și lipsit de bicarbonat și de fenol roșu; (Sigma) a fost reconstituit urmărind directivele fabricantului în apă purificată. La 1 I, s-au adăugat 1,2 g de bicarbonat de sodiu, iar pH-ul a fost adus la valoarea de 7,40 cu ajutorul hidroxidului de sodiu și acidului clorhidric. Această soluție a fost filtrată, distribuită în sticle sterile de capacitate 500 ml și depozitate la temperatura de 4°C pentru o perioadă maximă de timp de trei luni.

b) . Mediu de menținere a culturii celulelor

Mediul de bază DME - F12 a fost suplimentat cu 10% (vol/vol) de FBS (fetal bovine serum - ser fetal de bovine), 100 U de penicilină G/50 pg de streptomicinp sulfat/ml de mediu, 2 mM L - glutamină (Sigma) și 1 nM de E₂.

c) . Mediu experimental

Mediul de bază DME - F12 a fost suplimentat cu 55 FBSA (fetal bovine serum adsorbed cu dextran - charcoal - ser de bovine fetal adsorbit pe dextran - cărbune activ), 2 nM L Glutamină, 100 U de penicilină G/50 pg de streptomicină sulfat/ml de mediu și 50 mg/ml insulină (Sigma). Așa cum a fost descris mai înainte, pentru celulele ZR 75 -1, liofilizatul și E2 s-au adăugat în aceleași concentrații.

d) . Prepararea FBSA

Serul fetal de bovine a fost amestecat cu 1% cărbune activ (cărbune decolorizat alcalin). A fost adăugată o soluție de dextran T 70 la soluția de cărbune activ/ser pentru a se obține o concentrație de 0,1 % (greutate/volum). Amestecul a fost agitat peste noapte la temperatura de 4°C. După centrifugare la temperatura de 4°C, timp de 30 de min, la o turație de 10000 tur/min (x g), serul a fost decantat, amestecat din nou cu aceleași proporții de cărbune activ și dextran, agitat la temperatura camerei, timp de 3 h și apoi recentrifugat. Serul a fost apoi inactivat prin încălzire la temperatura de 56°C, timp de 20 min, filtrat steril și distribuit în alicoți în tuburi Falcon conice, sterile.

Teste de cultură experimentală și rezultate

Celule ZH 75 -1 și MCT - 7 au fost crescute până la atingerea unei densități a populației de 20000 celule/cavitate pe plăci cu 24 cavități sau 150000 celule/cavitate pe plăci cu 6 cavități, și tratate în prezența sau în absența diferitelor concentrații de liofilizat, așa cum a fost preparat mai înainte. La acest efect, extractul de cartilagiu solid este resuspendat în mediul de cultură și filtrat steril, astfel încât componenții hidrosolubili ai acestuia să fie recuperați și testați. Toate experimentele au fost efectuate în triplicat. Mediile de cultură au fost scoase și înlocuite cu medii proaspete la fiecare două zile. Celulele au fost crescute într-un incubator într-o atmosferă umidificată constant, conținând 5% bioxid de carbon, la temperatura de 37°C, timp de 17, 7, 3, sau 3 zile, corespunzător primului, celui de-al doilea, celui de-al treilea și celui de-al patrulea experiment. Inhibarea creșterii celulelor a fost măsurată prin numărarea directă a celulelor sau prin măsurarea conținutului total de DNA a cavității.

455

460

465

470

475

480

485

RO 118567 Β1

Concentrația liofilizatului	Inhibarea celulelor (%)
MCF-7	ZR 75-1
Primul experiment: 17 zile
1 mg/ml	1,5	2,0
5 mg/ml	14,33	33,6
10 mg/ml	62,66	90,8
Al doilea experiment: 7 zile
1 mg/ml	3,73	0,97
5 mg/ml	15,7	29,0
10 mg/ml	68,37	66,0
Al treilea experiment: 3 zile
50 mg/ml	95,8	95,0
100 mg/ml	94,6	98,0
Al patrulea experiment: 3 zile
10 mg/ml	34,5	51,5
20 mg/ml	62,5	70,5
50 mg/ml	95,8	95,0
100 mg/ml	94,6	98,0

Procentajele de mai sus, privind inhibarea creșterii celulelor, demonstrează că extractul solid de cartilagiu poate inhiba, într-o manieră dependentă de doză, creșterea celulelor din aceste două linii celulare.

Fig.2 arată că doze de 50 mg/ml și de 100 mg/ml din extractul solid provoacă în mod evident hipoplasia asupra acestor linii celulare, după trei zile de tratament.

Fig.3 arată faptul că, în prezența a 10’¹² până la 10‘⁹ M estradiol, celulele tratate răspund ca și celulele de control, a nu fi stimulate de aceste rații de dozare a hormonilor. Cu toate acestea, peste 1 nM, celulele de control sunt puternic stimulate, iar concentrația de DNA atinge 3,75 pg în prezența a 10'⁷ estradiol (față de 0,69 pg la cele de control fără estradiol). La celulele tratate cu 30 și 50 mg/ml deliofilizat, DNA, măsurat la stimulare maximă, este 1,9 și 1,8 pg. Fig.3 arată faptul că constanta de afinitate (K_m) a celulelor tratate pentru estradiol este de 3 și 16 ori mai mare (31,3 nM și 174,0 nM) decât valoarea lui Kh, a celulelor de control (11,7 nM), în prezența a 30 și 50 mg/ml. Aceasta înseamnă că concentrații mai mari de estradiol sunt necesare pentru a realiza aceeași creștere a celulelor, atunci când este prezent extractul solid de cartilagiu. Prin urmare, acesta diminuează răspunsul maxim (90% inhibare a acestuia) și conduce la creșterea constantei de afinitate a celulelor tratate cu estradiol.

Teste efectuate in vivo

Modelul de cancer mamar la sân la șobolani indus de DMBA

a). Descrierea sistemului de testare

Șobolani femelă în vârstă de patru sute patru zeci de zile, din specia Sprague Dawley (comandați de la Charles River Co., St - Constant, Quebec) au fost adaptați la mediul înconjurător timp de 12 zile.

RO 118567 Β1

535 în acest timp s-au administrat 20 mg DMBA/1 ml ulei de porumb (9,10-dimetil -1,2benzantracem; aprovizionat de la Sigma Chemical Co.). Trei luni după acest tratament, 240 de șobolani care au prezentat un cancer mamar la sân au fost selectați și distribuiți în două grupe. Prima grupă a fost constituită din cinci subgrupe de șobolani. Șobolanilor din grupele tratate li s-a administrat o doză zilnică de concentrații crescânde de extract liofilizat în 3 ml de apă, timp de opt săptămâni, în timp ce grupa de control a primit același volum de apă. Cea de-a doua grupă a fost constituită din patru subgrupe de șobolani. Șobolanii din grupele tratate au primit de asemenea o doză zilnică de liofilizat în 3 ml de apă, combinat, cu sau fără extract lichid, timp de zece săptămâni, în care timp grupa de control a primit același volum de apă. Numai o subgrupă din cea de-a doua grupă de șobolani a fost tratată cu o concentrație de 3000 mg/kg/zi de liofilizat și 3 ml de extract lichid au fost de asemenea administrați prin injecții intraperitoneale (i.p.) Dintr-o doză mai mică de extract lichid (aproximativ 8 mg de proteină într-un mililitru de apă).

Șobolanii au fost cântăriți, având 151 ...173 g la începutul primelor două experimente, și au primit mâncare și apă ad libidum. Prima grupă de șobolani a prezentat tumori cu diametrul mediu de 0,9 cm, în timp ce cea de-a doua grupă de șobolani a prezentat tumori cu diametrul mediu de 0,6 cm.

540

545

b) Activitatea antitu morală

Doze zilnice de extract de cartilagiu administrat	Inhibarea creșterii tumorii (%) (descreșterea diametrului tumorii față de grupa de control)
Primul experiment: durata 8 săptămâni
Placebo	0
500 mg/kg/zi	2
1000 mg/kg/zi	4
3000 mg/kg/zi	14
5000 mg/kg/zi	15
Cel de-al doilea experiment: durata 10 săptămâni
Placebo	0
3000 mg/kg/zi	12
3000 mg/kg/zi + 3 ml extract lichid	18
3000 mg/kg/zi + 3 ml extract lichid +1 ml injectabil	20

550

555

560

565

570

Aceste rezultate au demonstrat faptul că liofilizatul conține un component activ care este absorbit în tractul gastrointestinal și încetinește progresul tumorii. Această inhibare poate fi un efect direct asupra celulelor tumorii sau un efect mediat de antiangiogeneza care interferează cu dezvoltarea tumorii.

Extractul lichid prezintă de asemenea o activitate inhibitoare întrucât administrarea lui a condus la o reducere suplimentară a dimensiunii tumorii cu aproximativ 6%.

Aceste rezultate sugerează de asemenea faptul că liofilizatul ar putea conține componenți activi, care nu sunt hidrosolubili și/sau care ar putea conține componenți activi hidrosolubili reziduali. Prin urmare, într-o ultimă eventualitate, se poate considera că peletele ar putea fi reextrase într-o soluție apoasă, pentru a recupera la maximum componenții hidrosolubili, dacă randamentul ar putea fi îmbunătățit în continuare.

575

RO 118567 Β1

C) HISTOPATOLOGIA

Pentru evaluarea lipsei de toxicitate a extractului de cartilagiu solid, animalele utilizate în experimentele in vivode mai sus au fost omorâte prin decapitare și următoarele țesuturi au fost luate în vederea analizei: ficatul, plămânii, rinichii, inima, creierul, mușchiul și glandele mamare. A fost îndepărtată grăsimea de pe aceste organe, după care ele au fost fixate timp de două zile în fluid Bouin. După dezhidratare în alcool etilic, țesuturile fixate au fost învelite în parafină. Au fost obținute secțiuni ale acestora și așezate pe plăcuțe de sticlă, colorate cu hematoxilin și vizualizate sub microscop.

Examinarea histologică a scos în evidență faptul că nu a fost vizibil nici un efect dăunător atunci când s-au utilizat cele mai mari doze de extract solid singur, sau atunci când s-a utilizat extract solid în combinație cu extractul lichid (datele nu sunt arătate).

Aceasta sugerează faptul că liofilizatul și extractul lichid posedă o activitate selectivă regresivă a dimensiunilor tumorii.

în tumorile glandei mamare (vezi fig.4a și 4b), s-a observat o importantă diminuare (cu 55%) a zonei cu vase sanguine în grupa de șobolani care a primit extract de cartilagiu solid și lichid (fig.5).

Diminuarea dimensiunilor tumorii ar putea fi datorată unei scăderi importante în vascularizarea acesteia, la un efect direct asupra celulelor tumorale, sau o combinație a celor două fenomene. Efectul antiangiogenic al acestor extracte este bine înfățișat mai sus. Efectul hipoplasiant direct a fost observat in vitro la celule dependente de hormoni, ceea ce rămâne a fi confirmat in vivo.

întrucât rezultatele mai sus menționate au arătat faptul că extractul lichid a avut un efect crescând, în plus față de efectul extractului solid de cartilagiu asupra celulelor ZR 75-1, componenții acestuia au fost investigați în continuare.

EXTRACTUL LICHID

Testul in vitro

Linii celulare tumorale

Mai multe linii de celule tumorale au fost dezvoltate în prezența extractului lichid de cartilagiu, pentru a examina dacă activitatea hipoplasiantă observată la extractul solid (secțiunea de mai sus) a fost prezentă.

Pe scurt, celulele au fost placate pe plăci cu 96 de cavități și crescute în mediul de cultură (specific pentru fiecare tip de celule; de exemplu, celulele MCF - 7 au fost crescute așa cum este descris în secțiunea de mai sus) în prezența sau nu a unor concentrații diferite de extract lichid. Proliferarea celulelor a fost măsurată folosind un test MTT, urmat de 3 până la 5 zile de cultură. Liniile celulare tumorale au fost:

CHANG:	Hepatocite tumorale
Hep-G2:	Hepatocite tumorale
A2780	Celule adenocarcinom ovariene
MCF - 7:	Celule adenocarcinom ale sânului
	(dependente de estrogen)
MCF - 7 - ADR:	Celule adenocarcinom ale sânului rezistente la Adriamicină

Extractul lichid de cartilagiu a dovedit o activitate antiproliferativă asupra tuturor liniilor de celule tumorale. inhibările cele mai puternice, 50% și 80%, au fost obținute la concentrații de 8,5 mg/ml (greutate în stare uscată a extractului lichid/ml de mediu de cultură) asupra MCF - 7 și respectiv asupra celulelor A 2780.

Extractul de cartilagiu lichid neliofilizat și liofilizat au fost echipotente în ceea ce privește abilitatea lor de a inhiba proliferarea celulelor tumorale. Aceasta sugerează faptul că factorul de inhibare (s) nu este denaturat ca urmare a acestei proceduri de concentrare.

RO 118567 Β1

Celule cultivate primare

a) Fibroblaste din glaucom neovascular în scopul de a evalua specificitatea activității asupra celulelor tumorale, permeatul obținut după operația de ultrafiltrare a fost testat asupra celulelor care generează mesenchime, fibroblaste umane TENON(HTFs), care sunt fibroblaste normale. Numai fibroblastele TENON de la doi pacienți (unul cu glaucom neovascular, NVC (Neovascular glaucoma), iar celălalt cu glaucom primar în unghi deschis, POAG - (Primary open angler glaucoma) au fost utilizate.

Subcultura și întreținerea fibroblastelor TENON.

Fiecare cultură confluentă a fost trecută prin faza de spălare și detașare cu 0,5 ml de tripsină 0,05%/0,5 mM EDTA (Giboo 610 - 5300 AG), timp de 5...10 min, la temperatura de 37°C. S-au adăugat apoi 1,5 ml de DME/F -12 ca mediu conținând 15% ser de bovine fetal (FBS - fetal bovine serum) pentru a neutraliza tripsina/EDTA.

Asocierea celulelor a fost realizată prin triturare și transferare în baloane - T de capacitate 25 cm³, în care s-a adăugat mediu suplimentar conținând 10% FBS). După ce confluența a fost atinsă, fibroblastele umane TENON au fost transferate în baloane - T de 75 cm² și eventual în baloane - T de 180 cm². Atunci când s-au obținut destule celule, o parte din celule a fost utilizată pentru experimente, așa cum este descris mai jos, iar altele au fost congelate în mod simultan pentru a prezerva trecerile identice în vederea unor experimente viitoare.

Protocol experimental

Atunci când confluența a fost atinsă, celulele de la un pacient, crescute în două sau trei flacoane - T identice de 180 cm², au fost disociate prin procedura descrisă mai înainte. După o centrifugare scurtă cu turație mică, ele au fost numărate cu un contur de tipul ZMI Coulter 216013, echipat cu un 256 - Channelyzer.

Pentru toate experimentele in vitro, care urmează, au fost aproximativ cincizeci de mii de celule într-un mililitru de mediu DME/F -12 conținând 1% FBS (ser fetal de bovine) în fiecare disc și placă cu 12 cavități. 17 h după însămânțare, a fost adăugat 1 ml de mediu identic proaspăt, suplimentat cu 1% FBS (control “absolut”). în funcție de concepția de experimentare (vezi mai sus și mai jos), mediul cu 1% FBS a fost suplimentat sau nu cu factor de creștere (Gfs - Growth Factors) sau un extract lichid de cartilagiu, și a fost filtrat steril. în această zi (ziua 0), unele probe de celule au fost de asemenea numărate, pentru a determina eficiența placării (care trebuie să fie egală sau mai mare de 95%).

h după începerea experimentelor, celulele au fost spălate, disociate și numărate din nou. Numărul de celule a fost exprimat ca un procentaj din cel obținut în controalele “absolute”.

Fiecare control “absolut”, conținând 1 sau 5% ser fetal de bovine (FBS), precum și fiecare grup experimental, suplimentat cu 1% ser fetal de bovine (FBS) și cu un GF individual sau cu extract lichid de cartilagiu, a fost constituit din probe triplicat.

Fiecare experiment a fost efectuat pe celule luate de la unul sau doi pacienți dintr-o dată, și a fost repetat cel puțin de două ori.

în aceste experimente, Gfs, factorul de creștere derivat din platelet de porcine (pPDGF - porcine platelet - derived growth factor) și factorul de creștere a fibroblastelor bazic recombinant uman (hr bFGF - human recombinant bazic fibroblast growth factor) au fost adăugate în concentrații de la 10 până la 100 ng/ml în 1% ser fetal de bovine (FBS). 48 h după începerea experimentului, celulele au fost dispersate cu Tripsin - EDTA și numărate pe un contor de tipul Coulter. Toate valorile triplicat (coloanele 1,2 și 3), care apar mai jos, sunt egale cu 1/20 din numărătoarea per cavitate.

625

630

635

640

645

650

655

660

665

670

RO 118567 Β1

Rezultate

Rezultatele sunt recapitulate în fig.6. HTF au fost obținute din glaucomul unei persoane în vârstă de 53 de ani. Cu toate că factorii de creștere ca PDGF și bFGF au arătat o activitate de stimulare asupra HTFS (^XP mai mic de 0,02, “P mai mic de 0,01; determinat prin testul Student -Fisher Test) nu a fost obținut nici un fel de efect pozitiv sau negativ, atunci când aceste celule au fost crescute în prezența extractului lichid de cartilaj (1 kg/21). Acesta sugerează că activitatea hipoplasiantă a extractului lichid de cartilagiu asupra celulelor tumorale nu este universală și nu afectează creșterea fibroblastelor. Același extract de cartilagiu nu are nici un efect asupra unui alt tip de celule fibroblaste, HSF (Human Skin Fibroblaste - Fibroblaste ale pielii umane). Pentru acest tip de fibroblaste, datele nu sunt arătate. Chiar dacă nu a fost testat, se estimează că extractul solid nu produce de asemenea nici un efect asupra celulelor normale.

b) Celule endoteliale din vena ombilicală umană (HUVEC)

Celulele endoteliale din vena obilicală umană (HUVEC - Endothelial cells from human umbilical vein) au fost extrase cu digestie controlată de colagenază așa cum este descris de Jaff și alții. (1973). Celule endoteliale pure au fost utilizate înainte de trecerea a patra (tripsin - EDTA la fiecare trecere). Calitatea celulelor a fost analizată în ceea ce privește capacitatea lor de încorpora di-aceil LDL și de a fi marcate cu factorul VIII.

Celulele endoteliale au fost placate la o densitate de 2 2500 celule/cm² pe discuri sterile acoperite cu gelatină. Celulele au fost cultivate cu mediu complet (Med 199 Heparină (90 pg/ml) + L - glutamină (2 mM) + bicarbonat + ser fetal de bovine ((FBS) + ECGS (120 pg/ml)), timp de 24 h, pentru a asigura adeziunea celulelor. Apoi, celulele au fost spălate de trei ori cu PBS, iar mediul de cultură a fost adăugat în conformitate cu condițiile experimentale. Ultima spălare cu PBS a fost considerată ca fiind timpul zero.

Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și a fost efectuată analiza statistică pentru comparație. Mediul de cultură a fost schimbat după 24 h și în fiecare altă zi. După 168 h de cultură, s-a adăugat BrdU (10 mM final) la fiecare mediu de cultură și s-a incubat timp de 2 h, la temperatura de 37°C. Apoi celulele au fost libere, cu o scurtă digestie tripsină EDTA și transferate pe plăci cu 96 de cavități, pentru a permite detectarea ELISA a BrdU. ELISA a fost efectuată cu trusă și metoda Boehringer Mannheim. A fost efectuat un control fără celule, pentru a determina nivelul de bază al planului din fund. Un alt control a fost efectuat prin măsurarea conținutului de DNA în mediul de cultură la sfârșitul perioadei de incubație, pentru a stabili dacă extractul de cartilagiu lichid a afectat adeziunea celulelor.

Proliferarea celulelor a fost de asemenea evaluată cu cantitatea de DNA prezentă pe discurile Petri. Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și a fost efectuată analiza statistică în vederea comparației. Mediul de cultură a fost schimbat zilnic. După 168 h de cultură, celulele au fost lizate cu soluție Na-citrat-SDS și incubate cu Hoescht 3358. Probele au fost analizate la 365 mm cu un spectrofluorometru.

în final, cantitatea de celule prezente pe discurile Petri a fost de asemenea evaluată prin măsurarea activității fosfatazei acid. Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și s-a efectuat analiza statistică în vederea comparației. Activitatea acestei enzime a arătat o strânsă corelare cu numărul de celule endoteliale pe discurile Petri (încorporarea BrdU și marcarea Hoescht; datele nu sunt prezentate). Activitatea fosfatazei acid a fost măsurată cu o trusă de la Sigma Chemical Co. (în conformitate cu procedurile și instrucțiunile fabricantului, cu unele modificări).

Rezultatele au demonstrat o inhibare, ca răspuns la doză, a proliferării celulelor endoteliale cu extractul de cartilagiu lichid (fig.7). Valoarea ED₅₀ obținută a fost de aproximativ μΙ de extract lichid (echivalent cu aproximativ 1,5 mg greutate uscată prezent în extractul lichid).

RO 118567 Β1

725

c) Cheratinocite

Extractul de cartilagiu lichid a fost testat în ceea ce privește cheratinocitele, dintre care Protein chinaza C (PKC) a fost activată cu triforbol acetat (TPA), un agonist cunoscut al acestei căi de transducție celulară. Cheratinocitele epidermale umane normale au fost stabilite drept culturi primare (Matsui și colab. (1992), J.lnvest.Dermatol. 99: 565 - 571). Culturile au fost crescute în mediu definit ca liber de ser (KGM - Serum free defined medium), conținând factor de creștere epidermal (10 ng/ml), insulină (5 pg/ml), hidrocortizon (0,5 pg/ml) și extract pituitar de bovine (70 pg/ml) într-o formulare MCDB 153 modificată.

Cheratinocitele au fost crescute până la confluența de 70%, și la 48 h de la realimentarea cu mediu proaspăt, au fost tratate fie cu 200 nanograme/ml TPA, fie cu 2 pg/ml DHSO fără o realimentare adițională. Au fost adăugate sau nu diferite concentrații de extract lichid de cartilagiu la mediul de cultură. Rezultatele nu au arătat nici un efect al extractului lichid asupra proliferării cheratinocitelor; el nu a prezentat de asemenea nici un efect asupra'inhibării proliferării induse de TPA. Totuși, extractul lichid de cartilagiu a fost capabil să inhibe diferențierea cheratinocitelor indusă de TPA (fig.8). Nivelul diferențierii cheratinocitelor a fost crescut de 5 ori de către TPA. Extractul lichid de cartilagiu, el însuși, nu are un efect asupra formării învelișului cheratinizat. Cu toate acestea, prezența lui inhibă formarea învelișului cheratinizat indusă de TPA cu mai mult de 60%.

Publicații recente au arătat că activarea PKC a făcut ca normal cheratinocitele să producă cantități crescute de interleukin - 8 (IL - 8), un mediator al inflamației (Chabot Fletcher și colab. (1994)), J.lnvest.Dermatol. 103.509 - 516). Mai mult decât atât, cheratinocitele psoriatice produc cantități foarte mari de iL - 8, care în continuare promotează neovascularizarea în plăcile psoriatice (Nicholoff și colab. (1994), Am.J.Pathol. 144: 820-828). Alți factori de creștere și integrine sunt de asemenea implicați și ar fi important a lărgi familia de molecule țintă care poate fi implicată (IL-1, TNF etc.). Nu se cunoaște dacă inducția - TPA simulează cheratinocitele psoriatice. Dacă acesta este cazul, rezultatele sugerează faptul că cartilagiul s-ar putea să nu aibă efect asupra cheratinocitelor psoriatice (sau activate). Inhibarea producerii de interleukin - 8 în cheratinocitele activate cu Tpa precum și în plăcile psoriatice sau cheratinocite de către extractul lichid de cartilagiu rămâne a fi verificată. Nivele scăzute de interleukin - 8 și/sau alți factori de creștere reprezintă o posibilitate interesantă de a explica efectele antiinflamator și antiangiogenic al acestui extract.

Teste de colagenază

a) Testul 1

Acest test este descris de Kinight și colab. (1992), FEBS Let. 296,263 - 266. Metoda utilizează un substrat de peptidă fluorogenică (Moa-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂) simulând partea activă a metaloproteinazei. Acest substrat are o grupare fluorescentă la celălalt capăt (Dpa). în substratul intact, gruparea de întrerupere maschează în mod efectiv fluorescența. în urma clivajului enzimei substratului, fluorescența în tubul de testare crește. Activarea colagenazei este descrisă de Weingarten și colab.(1985), Biochemistry 24, 6730. 1 pg diluat la 100 pl cu 50 mM Tris - Hcl, 10 mM clorură de calciu (CaCI₂) pH= 7,5,1 pl la 10 mg/ml soluție de tripsină (în 1 mH acid clorhidric) s-a adăugat și s-a incubat timp de 15 min, la temperatura de 20°C. Activarea a fost terminată prin adăugarea de 10 pl de inhibitor tripsină Soygean (SBTI, 5 mg/ml). La fiecare microchiuvetă, s-au adăugat:

sau 50 pl de inhibitor’⁰ (produs până la 50 pl cu apă);

pl 50 nM tris-HCI, 200 nM clorură de sodiu, 10 mM clorură de calciu, pH=7,5;

pl de colagenază activată”⁰ (67 nanograme final); și pl substrat (1 mM soluție stoc în DMSO, 20 pM final).

Fluorescența a fost înregistrată la lambda_ex = 328 nm. Lambda = 393 nm.

^x): inhibitorul este definit drept substanță de control (cum este EDT, orto-fenantrolenă) sau extract lichid de cartilagiu.

^a}: colagenaza este definită cu colagenază de tipul I uman, tipul IV uman și colagenază de tipul mormoloc amfibian: s-a folosit, de asemenea, gelatinază.

730

735

740

745

750

755

760

765

770

RO 118567 Β1

b) Testul 2

Acest test este descris de Welgus și alții. (1979), JBC 256: 9511 - 9516. Metoda utilizează SDS - PAGE pentru a examina separarea de colagenază, tipul 1 (MMPI). Colagenaza de tipul 1 produce o singură tăiere în molecula de colagen nativă, dând două fragmente de 75 și 25% din dimensiunea colagenului original. După separare (scindare) timp de mai multe ore, reacția este monitorizată prin separarea produselor de substrat prin SDSPAGE. Raportul dintre colagenul scindat față de cel nescindat este apreciat pe cale vizuală după colorarea gelurilor cu albastru Comassie (sau colorarea cu argint).

nanograme de colagenază activată (vezi testul 1) s-au adăugat la 5 pg de colagen din piele de vițel (Worthington), inhibitor ±, într-un volum final de 20 de pl. Reacțiile au fost incubate timp de 16 h la temperatura de 35°C, apoi stopate prin adăugare de SDS - PAGE probe cu 40 mM EDTA, supuse fierberii și încărcate pe gel cu 8% acrilamidă.

c) Inhibarea răspunsului la doză

Rezultatele obținute cu extracte lichide de cartilagiu au prezentat o inhibare a răspunsurilor la doză a activității colagenazei la ambele teste. Fig.9 arată rezultatele obținute cu testul 1. Valoarea ED 50 este obținută cu 30 pl de extract lichid (sau 0,51 mg greutate în stare uscată prezent în 30 pl de extract lichid).

Teste in vivo

Test de vascularizare embrionică (EVT)

a) Definirea sistemului de testare

Dezvoltarea normală a embrionului pui implică formarea unui sistem vascular extern localizat în membrana vitalină care poartă nutrienții de la gălbenușul de ou (vitelus) către embrionul în dezvoltare. Atunci când sunt plasate în membrana vitalină, substanțele angiogenice pot inhiba dezvoltarea vaselor sanguine care apar în membrana vitalină. Pentru a facilita accesul la membrana vitalină, embrionul este transferat la o cutie de cultură sterilă (discul Petri) și plasat într-un incubator controlat din punct de vedere al umidității și al temperaturii. Embrioanele se pot apoi dezvolta în aceste condiții ex ovo timp de mai multe zile.

Un alicot de extract lichid de cartilagiu este amestecat cu o soluție de metilceluloză și lăsat să se usuce în aer pe un disc subțire. în timpul acestei proceduri, clorură de sodiu intrinsecă, prezentă în extractul lichid de cartilagiu, se concentrează și interferează cu EVT, atunci când cantitatea per disc este mai mare de 25 pg. Ca urmare, desalizarea extractului lichid ar putea fi necesară; dializa cu o membrană de tăiere mai mică de 100 Da sau electrodializa au fost considerate ca fiind metode acceptabile.

Metilceluloză formează o rețea inertă din care extractul lichid poate difuza treptat. Discurile de metilceluloză conținând extract lichid sunt plasate la marginea exterioară a perimetrului vascular a membranei vitaline unde procesul angiogenic este încă activ.

Efectul extractului lichid de cartilagiu, conținut în discuri, asupra dezvoltării vasculare din vecinătate este permanent comparat cu cel al discurilor conținând apă plus o cantitate echimoleculară de clorură de sodiu. Discurile sunt plasate pe membrana vitalină a embrionului în ziua 0 sau ziua 1 a procesului de creștere ex ovo: în acest moment, doar începuturi ale vaselor sanguine principale invadaseră vitelus. Embrioanele sunt puse apoi în condiții de cultură până când este stabilită vascularizarea (aproximativ 24 h). Discurile cu apă și cele conținând extract lichid sunt adăugate încontinuu în mod simultan pe membrana vitalină a aceluiași embrion. Ambele discuri sunt aranjate într-o manieră simetrică în raport cu axa cefalo-caudală a embrionului în scopul de a reduce la minimum variațiile interindividuale atunci când se compară extractele de cartilagiu de rechin cu cele de control.

RO 118567 Β1

820

b) Activitatea antiangiogenică

EVT au fost efectuate folosind diferite concentrații de protamină (37, 75 și 150 pg) drept control pozitiv sau extract lichid de cartilagiu. După o zi de cultură, nivelul vascularizării în aria acoperită de disc este gradată de o pereche de specialiști într-o manieră oarbă obișnuită. Pentru a facilita localizarea discurilor; un inel de forma - 0, de culoare neagră, este plasat în jurul acestuia, chiar imediat după depunerea lui pe membrana vitalină. Scala de evaluare pentru testul EVT este bazată pe marcajul 1-2-3: (marcaj = 3). Vascularizare normală atunci când este comparată cu cvadrantul orizontal opus sau cu cvadrantul pereche al embrionului de control; (marcaj = 2= Vasele sanguine intră în aria acoperită de disc, dar dispar (se estompează) la jumătate cursă. Vasele sanguine principale traversează aria acoperită de disc, dar traiectoria lor este în mod clar afectată sau se observă o scădere în densitatea ramificată lateral; (marcajul = 1). Nu se observă nici un vas sanguin în aria acoperită de disc sau parcursul lor este deviat rapid într-o manieră de a evada din zona acoperită de disc. Vasele sanguine nu prezintă o creștere în spatele ariei acoperite de disc, exceptând faptul că ele ocolesc această arie și continuă în spatele ei.

O inhibare a răspunsului la doză a fost obținută cu protamină (datele nu sunt prezentate) și cu extractul lichid de cartilagiu (fig.10). Valoarea ND 50 a fost obținută cu aproximativ 170 pg de extract lichid uscat (greutate în stare uscată prezentă în extractul lichid). Testul statistic de grad marcat Wilcoxon a fost utilizat pentru a compara semnificația diferențelor dintre două discuri (apă și extract de cartilagiu) plasate pe același ou.

Modelul carcinomului mamar la șoarece

a) Descrierea sistemului de testare

Potențialul antitumoral al extractului lichid de cartilagiu a fost testat cu un model adenocarcinom mamar la șoarece (alograft). Sistemul de testare constă în inocularea subcutanată a șoarecelui BALB/C cu 1 x 10⁶ celule DA 3. Aceste celule au fost generate de la un adenocarcinom mamar indus de către 7,12 - dimetilbenzantracen (DMBA). Modelul a fost stabilit de Daniel Medina, (J.Natl.Cancer Inst. (1969) 42:303-310: ibidem (1976) 57; 11851189). Celulele inoculate au crescut treptat in vivo și au format o tumoare solidă cu o prognoză de metastazare coborâtă.

Celulele DA 3 au fost menținute în mediu RPM11640 suplimentat cu 1 mM mercaptoetanol, 1 M soluție tampon Hepes, 100 mM piruvat de sodiu, 200 mM L - glutamină, 10 mM aminoacizi neesențiali, 1 mM vitamină, 10% ser fetal de bovine, 1% penicilină - streptomicină, la temperatura de 37°C, cu 5% bioxid de carbon. Pentru inducerea tumorii, celulele au fost crescute până la 70% confluență într-un mediu complet și apoi colectate folosind soluție tripsin - EDTA. Celulele au fost apoi centrifugate și spălate de trei ori cu soluție tampon de fosfat, și resuspendate la o diluție de 1 x 16® celule/0,1 ml.

Șoarecilor inoculați cu celule DA 3 (n = 15) li s-a administrat zilnic, oral, extract lichid de cartilagiu de rechin sau placebo (soluție salină). Tratamentele au început la 7 zile de la inocularea celulelor DA 3. Au fost testate diferite concentrații de extract lichid. Cantitatea de >

extract lichid administrată este exprimată ca greutate în stare uscată prezentă în extractul lichid. Articolele de testare au fost preparate, după cum este descris aici: extractul lichid a fost liofilizat și resuspendat în apă la diferite concentrații (0,2,1,5, 3,10 și 20 mg per 200 pl). Dozele finale, care au fost administrate zilnic, au fost de 10, 75, 150, 500 și 1000 mg/kg greutate corp.

b) Activitatea antitumorală

Rezultatele arată că inhibarea maximă a progresiei tumorale a fost obținută la administrarea a aproximativ 75 mg/kg de extract lichid (fig.11). Este interesant faptul că dozele mai mari au fost mai puțin potente. Aceasta sugerează faptul că extractul lichid conține substanțe care inhibă progresia tumorală, dar și alte substanțe care pot inhiba acțiunea inhibitorilor tumorali. Acest fenomen a fost deja raportat pentru unele medicamente biologice.

825

830

835

840

845

850

855

860

865

RO 118567 Β1 în final, administrarea pe cale intraperitoneală a extractului lichid a scăzut în mod drastic (de 75 de ori) față de doza de eficiență maximă pentru inhibarea creșterii tumorii (fig.12).

c) Toxicitate

La toate tratamentele nu s-au înregistrat pierderi în greutatea corpului sau decese legate de folosirea extractului lichid. Nu s-au înregistrat simptome sau modificări în comportare la examinarea zilnică a șoarecilor în timpul perioadei de tratament. La sfârșitul tratamentului, șoarecii au fost sacrificați și a fost analizată morfologia grosieră a tuturor organelor de către un patologist certificat ca având experiență în domeniu; nu s-a detectat nici o anormalitate. Analizele de sânge nu au arătat nici un semn de anormalitate.

d) Histopatologia

Histopatologia tumorii nu a scos în evidență diferențe mari între tumoarea din placebo sau din șoarecii testați cu extract lichid. Extinderea viabilității tumorii a fost destul de mare în toate grupele. Analiza diferitelor organe (plămân, ficat, rinichi, pancreas, stomac, intestine, ovare, sân, creier și inimă) nu a scos în evidență vreo modificare specifică, care să poată fi raportată extractului lichid.

Modelul hipersensibilității la șoareci (CHS)

a) Descrierea sistemului de testare

Dinitrofluorbenzenul (DNFB) este un iritant puternic al pielii, care induce o reacție puternic inflamatorie la șoarecii BALB/C. în ziua 0,10 șoareci au fost sensibilizați prin colorarea pântecului lor cu DNFB. Șoarecii au fost provocați pe urechea dreaptă prin vopsirea acesteia cu 10 μΙ de DNFB la 5 zile după sensibilizare. Inflamarea urechii a fost măsurată după mai multe zile după expunere, drept un indice al iritării țesutului.

Extractul lichid de cartilagiu a fost testat pentru a examina dacă el poate reduce răspunsul inflamatoriu față de DNFB la șoareci. Vehiculul singur (0,2 ml de soluție salină, 5 șoareci) sau extract lichid (0,2 ml de extract lichid conținând 20 mg/ml greutate în stare uscată; 5 șoareci) a fost administrat pe cale orală timp de 3 zile consecutive, înainte de sensibilizare, și următoarele patru zile.

b) Activitate antihipersensibilitate

O zi după provocare, șoarecii care au fost tratați cu vehicul singur, au prezentat o inflamare a urechii de 8,2 mm grosime. Este interesant faptul că șoarecii tratați cu extract lichid de cartilagiu au prezentat o inflamare a urechii de numai 2,8 mm. Semnificația statistică a acestor date are o valoare mai mică de 0,001. Aceste rezultate au demonstrat că extractul lichid de cartilagiu este un inhibitor puternic al inflamațiilor.

Obținerea fracțiunilor de lichid conținând molecule active » » I

Teste realizate in vitro

Linii de celule tumorale

a) Prepararea sistemului de testare

Cartilagiul de rechin a fost cultivat și prelucrat în același mod cu cel descris anterior. După centrifugare, peletele a fost îndepărtate și supernatantul a fost supus ultrafiltrării, așa cum s-a descris, până la o filtrare sterilă pe filtru de 0,22 pm. Extractul lichid, astfel obținut, a fost în continuare fracționat prin diferite metode. Liniile celulare tumorale au fost crescute așa cum s-a descris în secțiunile anterioare.

b) Condițiile FPLC

Coloană: Hiload 26 mm x 60 cm Sephacril S - 300 Sistem: Cromatografie de lichid (FPLC): de la Pharmacia. Toate probele au fost filtrate pe un filtru de 0,22 pm înainte de încărcare în coloană. Eluția tampon a fost o soluție de sare (salină) tamponată cu fosfat (PBS

- Phosphate buffer solution), filtrată și degazată timp de 15 min. Volumul probei ce s-a

RO 118567 Β1 încărcat, a fost în mod obișnuit de 3,2 ml (ar putea fi până la 13 ml). Debitul de curgere a fost de 1 ml/min. Au fost colectate fracțiuni de câte 10 ml. Compușii elutați au fost detectați prin absorbanța de ultraviolete a acestora (280 nanometri). A fost obținută o hartă de caii- 920 brare, utilizând trusa de calibrare MW - GF -1000 de la Sigma, această probă de calibrare având același volum ca și proba încărcată pentru analiză (3,2 ml). Volumul de eluție al unei probe a fost dedus din diagrama greutății moleculare a compușilor trusei de calibrare față de volumul de eluție al acestora, din care s-a scăzut volumul liber al coloanei. Volumul liber al coloanei a fost obținut prin injectare de dextran albastru (greutate moleculară = 2000000). 925

Fracțiunile au fost testate pe celule ZR 75-1 în ceea ce privește activitatea lor. Fracțiunile care prezintă interes au fost identificate și caracteristicile lor au fost coroborate prin studii ulterioare (aici mai jos).

Caracterizarea suplimentară a componenților activi ai permeatului a fost realizată pe

Rotofor (Biorad 170-2950); vezi izoelectrofocalizarea de mai jos) și pe filtre Amicon cu dife- 930 rite valori de tăiere pentru a se obține fracțiuni cu greutate moleculară cuprinsă între 10 și 30 kDa, 30 și 100 kDa și peste 100 kDa.

c) Condiții de izoelectrofocalizare

Un preparat de extract lichid de cartilagiu de rechin (46 ml de permeat 1 kg/l) a fost dializat peste noapte față de 41 de apă purificată conținând 5% glicerină, la temperatura de 935 4°C, folosind o membrană Spectra pori 7 MWCO 3500 kDa (Spectrum 132110). Soluția de dializă a fost amestecată cu 2,75 ml de amfolite (Pharmacia 80 -1125 - 87) pH 3,5-10,0 și 0,5 g CHAPS (Sigma C 3023:37(3-Colamidopropil)-dimetilamonic/-1-propan-sulfonat). Volumul a fost completat până la 55 ml cu apă purificată. Soluția a fost încărcată pe Rotofor. Izoelectrofocalizarea a fost condusă la temperatura de 4°C la o putere constantă de 12 W 940 (de 3000 de ori puterea alimentată Biorad 165-0554), sub o circulație constantă de apă, pentru a asigura menținerea temperaturii. La începutul separării, voltajul a fost de 380 V, iar amperajul de 31 mA. Atunci când amperajul a fost stabilizat (la 14 mA), voltajul citit a fost de 870 V. Izoelectrofocalizarea a fost întreruptă și s-au colectat 20 de fracțiuni.

945

Fracțiunea	Volumul (ml)	PH
1	3,7	3,56
2	2,1	4,01
3	2,2	4,18
4	2,3	4,31
5	2,2	4,63
6	2,1	5,03
7	2,5	5,30
8	2,1	5,50
9	2,4	5,81
10	2,5	6,26
11	2,3	7,00
12	2,4	7,29
13	2,4	7,64
14	2,5	7,94

RO 118567 Β1

Fracțiunea	Volumul (ml)	PH
13	2,4	7,64
14	2,5	7,94
15	2,3	8,32
16	2,5	8,62
17	2,4	8,94
18	2,9	9,30
19	3,1	9,88
20	3,6	10,71

Identificarea acestor proteine a fost făcută prin estimarea greutății lor moleculare pe un gel de electroforeză (Laemli, U.K. (1970), Nature (Londra) 227:680).

Aceste fracțiuni au fost diluate de patru ori cu o soluție tampon de încărcare (vezi Laemli) și alicoți de câte 8 μΙ au fost supuși electroforezei în condiții nonreductive. Fig.13 arată profilul electroforetic al fiecărei fracțiuni și al materialului înainte de izoelectro-focalizare.

Toate fracțiunile au fost îmbuteliate steril sub nișă cu flux laminar prin trecerea lor printr-un filtru steril Millipack-60 având o porozitate de 0,22 pm.

d) Activitatea de inhibare asupra celulelor tumorale

Conținutul în proteine al fracțiunilor a fost evaluat prin metoda de dozare Lowry. Soluțiile de 1 kg/21 (exprimate ca greutate de cartilagiu brut per litru de permeat) au fost testate pe celule ZR 75-1 la diferite concentrații în mediul de cultură. Rezultatele sunt recapitulate, după cum urmează:

Primul test

Teste efectuate pe fracțiuni Rotofor (permeatul a fost concentrat prin evaporare).

Identificarea proteinelor:
Fracțiuni identificate	Punctul izoelectric	Valoare medie	Greutate moleculară
7-8-9-10	5,30 până la 6,26	5,78	29 ± 1 kDa
7-8-9	5,30 până la 6,26	5,68	60 ± 1 kDa
12-13-14	7,29 până la 7,94	7,62	48 ± 1 kDa
13-14	7,64 până la 7,94	7,79	35 ± 1 kDa

Al treilea test

A fost efectuat asupra fracțiunilor de 100 μΙ obținute pe filtre moleculare Amicon:

100 /zg/ml	mai mare de 100 kDa	64%
100 /K|/ml	mai mică de 100 kDa
	mai mare de 30 kDa	114%
100 ^g/ml	mai mare de 10 kDa
	mai mică de 30 kDa	127%
100 μρ/ηηΙ	mai mică de 10 kDa	149%

fracțiunile 5 și 7 obținute cu ajutorul cromatografiei de lichid (FPLC) conțin componenți activi cu o greutate moleculară foarte mică: 0,1 până la 2,5 kDa.

RO 118567 Β1

1010

Efectul hipoplasiant al fracțiunilor poate fi până la 33000 ori mai mare decât cel observat în cazul liofilizatului.

e) Identificarea suplimentară a componenților activi din eluat

Fracțiunile active (testate pe celule ZR 75-1) sunt recuperate în următorul domeniu de greutăți moleclare, determinat printr-un alt tip de purificare, pornind de la același permeat (1 kg/1) pe un diametru de 10 mm x 30 cm lungime coloană Superose-12 utilizând cromatografia de lichid (FPLC) și procedurile rotofor descrise mai înainte. A fost selectat un debit de curgere de 1 ml/min. Au fost colectate 45 de fracțiuni a câte 1 ml:

Fracțiunile » 20-21	Activitatea în fracțiuni corespunzând la o greutate moleculară de 70 până la 120 kDa
Fracțiunea 22 1	Activitatea în fracțiuni corespunzând la o greutate moleculară de 60 până la 70 kDa
Fracțiunile 29-32	Activitatea în fracțiuni corespunzând la o greutate moleculară de 35 până la 46 kDa
Fracțiunile » 34-35	Activitatea în fracțiuni corespunzând la o greutate moleculară de 29 kDa
Fracțiunile > 30-39	Activitatea în fracțiuni corespunzând la o greutate moleculară de 0 până la 25 kDa

1015

1020

Testul de colagenază

a) Cromatografia HPLC

O probă de 980 ml de extract lichid (DUP) a fost filtrată printr-o membrană de tăiere 10 kDa într-o unitate de ultrafiltrare cu curgere tangențială (PELLICON, Millipore).

Unitatea a fost mai întâi spălată cu 11 de apă. Randamentele finale au fost de 480 ml de fracțiuni mai mari de 10 kDa și 1,81 de fracțiuni mai mici de 10 kDa. Fracțiunile cu greutate moleculară mai mică de 10 kDa au fost concentrate prin evaporare până la 180 ml (mai mic de 10 -10 ori). De zece ori alicoți de 100 pl de mai mic de 10 -10 ori au fost încărcați pe o coloană cromatografică HPLC 5 pm, CDC-s Hexyl, (25 x 0,94 cm) și eluată mai întâi cu 100% apă la un debit de curgere de 4 ml/min; apoi la un debit de curgere de 8,5 ml/min cu 100% metanol. Fracțiunile au fost colectate corespunzător vârfurilor (peaks) OD₂₁₄.

Au fost colectate cinci fracțiuni (fig. 14): Fr 1, Fr 2, Fr 3, Fr 4 și Fr 5. Primele trei fracțiuni includ cel puțin un vârf (peak) principal.

b) Activitatea anticolagenolitică

Rezultatele arată că Fr 1 reprezintă fracțiunea cea mai activă pentru a inhiba colagenaza: în toate celelalte fracții este prezent un nivel mai scăzut al activității; pentru testul 1, vezi fig.14; pentru testul 2, vezi tabelul care urmează.

1025

1030

1035

1040

Proba	Colorarea colagenului	Colorarea fragmentului de colagen
Colagen singur (C)	++++	-
Colagen + Enzimă	+	+++
Colagen + Enzimă + EDTA	++++	-
Colagen + Enzimă + DUP	+	++
Colagen + Enzimă + Fr 1	++++	-

1045

RO 118567 Β1

Proba	Colorarea colagenului	Colorarea fragmentului de colagen
Colagen + Enzimă + Fr 2	+++	+
Colagen + Enzimă + Fr 3	+++	+
Colagen + Enzimă + Fr 4	+++	+
Colagen + Enzimă + Fr 5	+++	+
Colagen + Enzimă + Fracțiunea mai mare de kDa + +++ >

EDTA 40 mM a inhibat colagenaza. Extractul lichid total DUP a arătat o activitate anticolagenolitică mai slabă. Fracțiunile 1 până la 5 au fost active. Fracțiunea cu greutate moleculară mai mare de 10 kDa nu a dovedit o activitate inhibitoare semnificativă.

c) Definirea suplimentară a factorului anticolagenolitic

Extractul lichid de cartilagiu a fost fracționat folosind un aparat de filtrare cu curgere tangențială și un filtru de 10 kDa (Pellicon, Millipore). Filtratul (fracțiunea cu greutate moleculară mai mică de 10 kDa) a fost găsit că conține întreaga activitate anticolagenolitică și a fost caracterizat în continuare, după cum urmează: fracțiunea cu greutate moleculară mai mică de 10 kDa a fost dializată suplimentar folosind o membrană de tăiere cu greutate moleculară nominală de 100 Da (Spectra/Por CE (celuloză ester) MWC0.100 Da, Cat 131015). Activitatea anticolagenolitică a fost recuperată în filtrat (în fracțiunea cu greutate moleculară mai mică de 100 Da). Fracțiunea cu greutate moleculară mai mică de 10 Da a fost încărcată într-o coloană cu fază inversă (EM Science Lichroprep RP-8, Cat 9242), eluția făcându-se cu apă, apoi cu metanol 60% și în final cu metanol 100%. Majoritatea activității anticolagenolitice (98%) a fost recuperată în eluatul apă, restul de 2% din activitate fiind eluat cu metanol 60%.

Recapitulând, activitatea anticolagenolitică în extract se datorează compusului (sau compușilor) cu greutate moleculară mică, care pot dializa sau trece printr-o membrană Spectra/Por CE(celuloză ester) MWCO: membrana 100, și nu se adsoarbe într-o rețea coloană cu fază inversă C 8 (Lichroprep), atunci când este aplicată în apă.

Testul in vivo

Testul de vascularizare embrionică (EVT)

Extractul lichid de cartilagiu a fost fracționat folosind un aparat de filtrare cu curgere tangențială și un filtru de 10 kDa (Pellicon, Millipore). Fracțiunile cu greutate moleculară mai mică și mai mare de 10 kDa din extractul de cartilagiu lichid au fost testate în aceleași condiții. Ele au dovedit o potență egală (fig.15) în inhibarea neovascularizării. Aceasta contrastează cu activitatea anticolagenolitică care nu este prezentă în fracțiunea cu greutate moleculară mai mare de 10 kDa.

a) Fracțiunea cu greutatea moleculară mai mică de 10 kDa

Factorul antiangiogenic, în această fracțiune, s-a comportat ca și factorul anticolagenolitic pe durata fazei de purificare descrisă mai înainte.

Fracțiunea cu greutate moleculară mai mare de 10 kDa

Fracțiunea a fost supusă cromatografiei pe o coloană cromatografică permeativă cu gel (Sephacryl S-300. Pharmacia). O fracțiune (S 300-4), având activitate antiangiogenică, a fost caracterizată pe SDS-PAGE. Fracțiunea activă (S 300-4) a prezentat numeroase benzi proteinice, având greutăți moleculare cuprinse între aproximativ 8 și 18 kDa (în comparație cu indicatorul de proteine bioRad SDS - PAGE). Această fracțiune a fost fracționată suplimentar folosind cromatografia cu schimb de anioni (Mono-Q, Pharmacia) cu utilizarea

RO 118567 Β1 a 25 mm Tris-HCI pH 8,0 și un gradient de clorură de sodiu de la 0 până la 1,0 M. Fracțiunea care a eluat între 0,8 și 1,0 M clorură de sodiu, a prezentat o activitate antiangiogenică ridicată. Fracțiunile care au elutat între 0,3 și 0,6 M clorură de sodiu, au prezentat o activitate antiangiogenică mai scăzută.

Comparație cu produsele din practica anterioară

Definirea practicii anterioare

Cu toate că noi nu suntem primii care au prezentat un interes deosebit pentru extractele de cartilagiu, noi am verificat caracterul unic al extractului lichid de cartilagiu de rechin preparat ca urmare a prezentului procedeu prin teste comparative parte - cu - parte, cu două produse descrise sau deductibile din practica curentă, și anume produsele preparate prin procedeul Balassa (US 4822607) și Oikawa și alții (operă citată).

Oikawa și alții descriu o metodă prin care se obțin două fracțiuni principale, una având molecule cu greutate moleculară cuprinsă între 1 și 10 kDa, cea de-a doua având componenți mai grei de 10 kDa. Ei au atribuit proprietăți antiangiogenice numai primei fracțiuni, cealaltă fiind considerată ca lipsită de vreo activitate antiangiogenică în testul CAM.

în vederea unei comparații adecvate a produselor Oikawa, noi am fracționat extractul lichid total obținut de noi în două fracțiuni corespunzătoare, și am reținut una având greutate moleculară între 0 și 10 kDa.

întrucât Balassa descrie un procedeu pentru extragerea extractului lichid total, noi am comparat extractul lichid total de cartilagiu obținut de noi (0 până la 500 kda) cu produsul preparat prin reproducerea metodei Balassa, înlocuind cartilagiul de vițel cu un cartilagiu de rechin ca material de pornire.

Noi considerăm că dacă Balassa și Oikawa descriu un procedeu care este echivalent cu al nostru, modelele obținute cu ajutorul FPLC, HPLC și CZE, ar trebui să se suprapună în mod substanțial, și ar trebui să demonstreze aceeași activitate antiangiogenică în testul de vascularizare embrionică (EVT). Toate probele au fost preparate pentru o concentrație finală de 12 pg/μΙ (greutate în stare uscată/volum soluție) înainte de a fi supuse cromatografiei FPLC și HPLC. Produsul Oikawa a fost centrifugat și filtrat înainte de a fi supus cromatografiei, întrucât el conținea material insolubil.

Prepararea probelor

Probele de cartilagiu de rechin, extrase prin trei metode, au fost marcate (cu o greutate în stare uscată per volum de soluție estimată), după cum urmează:

1/ DUP reprezintă preparatul din prezenta invenție fracționat astfel încât să conțină molecule cu greutate moleculară cuprinsă între 0 și 500 kDa (12 pg/pl);

2/ BAL reprezintă preparatul în conformitate cu receptura lui Balassa și alții., (12 pg/μΙ);

3/ OIK este preparatul din 3 fracțiuni în conformitate cu Oikawa și alții. Toate probele au fost preparate la o concentrație finală de 12 pg/μΙ (greutate în stare uscată/volum) înainte de orice analiză. Proba OIK a avut o cantitate mare de material insolubil, care a putut fi peletat cu ușurință prin centrifugare la o turație de 13200 rot/min sau filtrat printr-o membrană de 0,2 pm. îndepărtarea prin filtrare a materialului insolubil s-a făcut practic înainte de FPLC, HPLC și CZE (fig. 16,17 și 18).

Comparația FPLC

Condiții

Superose 12 (Pharmacia); coloană permeativă cu gel. Probele au fost efectuate pe o coloană permeativă cu gel Superose 12 (10/30) cu soluție de clorură de sodiu (salină) tamponată cu fosfat (PBS - Phosphate buffered saline) ca eluent la un debit de curgere de

0,5 ml/min (diagrama de viteză = 0,25 cm/min). Un alicot de 100 μΙ de probă ajustată din punct de vedere al concentrației a fost filtrat printr-o membrană de 0,2 pm înainte de injecție.

OD₂₈₀ a fost monitorizat.

1100

1105

1110

1115

1120

1125

1130

1135

1140

1145

RO 118567 Β1

Coloana a fost calibrată cu următoarele standarde (greutate moleculară în Das): catalază (232000), aldolază (158000), albumină (56000), ovalbumină (44000), chimotripsină (25700), ribonuclează (13700), insulină (5700), lanț de insulină B (3500), lanț de insulină A (2500), bacitracin (1450), vitamină B -12 (1355).

Greutățile moleculare ale vârfurilor (pesks) principale au fost calculate prin următoarea relație:

!

Log₁₀ MW = 7,52 - 0,212 x RT, în care:

RT = volumul de eluție în ml; R² = 0,976

MW = greutate moleculară (Molecular weight)

Volumul total al coloanei (V_t) a fost 21,93 ml, așa cum a fost determinat folosind citidină (246 Da). Volumul liber (V_o) a fost determinat a fi 8,38 ml cu dextran albastru (2 x 10⁶Da).

Recapitularea rezultatelor în fig.16a), proba DUP a noastră a prezentat un vârf (peak) principal (1), care a eluat la 18,76 ml, dând o greutate moleculară de aproximativ 3500 Da. Vârfurile care urmează la

22,7 (2) și 27,3 ml (3) au fost dincolo de volumul total al coloanei (21,93 ml, așa cum s-a determinat în cazul citidinei). Aceste vârfuri (peaks) par să aibă o anumită afinitate pentru rețeaua coloanei.

în fig.16b), proba Balassa BAL a prezentat un vârf (peak) mic (1), eluând aproape de valoarea V_o a coloanei (8,4 ml), un vârf (2) la 18,5 ml (4000 Da) și două vârfuri eluând după V_t (3) 22,6 ml și (4) 28,2 ml.

în fig.16 c), proba Oikawa OIK a prezentat de asemenea un vârf mic (1) la valoarea V_o, un vârf (2) la 18,9 ml (3300 Da), un vârf (3) la 21,5 ml (1000 Da) și un vârf mic (4) la

27,3 ml.

Comparând probele este de remarcat că, în afară de vârful de 3500 Da, benzile principale ale probei DUP nu au fost observate la aceeași intensitate la celelalte probe. Proba OIK pare să aibă o cantitate mică a vârfului de 27,3 ml. Proba BAL a prezentat un vârf migrând la 26,2 ml, care s-ar putea corela cu unul dintre vârfurile minore din proba DUP.

Comparația HPLC

Condiții *

Coloană CS-S-hexil, 5 pm, 25 x 0,894 cm, CSC 059 - 085; coloană cu fază inversă. Recapitularea rezultatelor

Pentru HPLC (Cromatografie de lichid de înaltă presiune - High Pressure Liquid Chromatography), pe o coloană cu fază inversă - hexil, au fost monitorizate simultan OD₂₁₀ și OD₂₈₀. Alicoți de 50 μΙ din probele centrifugate (toate la 12 pg/μΙ) au fost încărcați și eluați cu apă 100%. Vârfurile pentru fiecare cromatogramă au fost marcate în conformitate cu OD₂₁₀ (eg, 1) și cu vârfurile corespunzătoare OD₂₈₀ și sunt notate cu (eg.1). Volumul liber V_o al acestei coloane a fost de 5,5 ml (1,4 min.).

în fig.17 a), DUP a prezentat trei vârfuri principale care au fost observate prin intermediul OD₂₁₀ (1,2, 3) și două vârfuri minore (4, 5). Două vârfuri de margine au fost observate în afara vârfului 1, marcate 1a și 1b. Absorbanțe semnificative OD₂₈₀ au fost asociate vârfurilor 1,1a, 1b și 3. Prin comparație, absorbția corespunzătoare OD₂₈₀ pentru vârful 2 este mult mai scăzută față de OD₂₁₀ în fig.17b), BAL a prezentat mai multe vârfuri OD₂₁₀, dar intensitățile au fost mai scăzute față de vârfurile DUP. Atâta timp cât suprapunerea vârfurilor a putut da o indicație asupra identității moleculelor, numai vârfurile 3 și 7 din proba Balassa par să se coreleze cu timpurile de retenție în proba DUP (vârful 1a sau 1b și respectiv vârful 4).

RO 118567 Β1 în fig.17c), numai trei vârfuri principale au fost observate (1,2, 3) în extractul OIK. Vârfurile 1 și 3 s-ar putea corela cu vârfurile 1 și 3 din proba DUP, dar nu s-au observat vârfuri de margine 1 în cromatograma OIK.

înălțimea vârfului în proba OIK a fost mai mică decât cea din proba DUP. Ca urmare, modelele FPLC și HPLC sunt caracteristici ale produselor distincte.

Condiții

Aparatură

Sistem Beckman (p/ace sistem 2050) cu software (versiunea 7.11 U); Capilaritate; Silice (TSPO 50375) 50 pm x 97 cm; soluția tampon: acid formic 2M; soluție de acoperire p/v hexadimetren bromură și 2% vol/vol etilen glicol în apă; Detector: ultraviolete (200 nanometri); Curent: - 30 Kw; Injecție: 0,5 psi, 20 s; Temperatură: 22°C.

Capilarul a fost condiționat cu hidroxid de sodiu 1M (20 psi, 20 min), apă (2Q psi, 10 min), soluție de acoperire (20 psi, 20 min), și soluție tampon (20 psi, 10 min). Apoi au fost pregătite condițiile pentru operare: tampon (20 psi, 2 min), injecția probei (0,5 psi, 20 s), operare (-30 kV, 45 min), hidroxid de sodiu 1M (20 psi, 3,5 min), apă (20 psi, 3,5 min), soluție de acoperire (20 psi, 4 min), și soluție tampon (20 psi, 4 min).

Fiecare probă (BAL, DUP, OIK fracțiunea 3) a fost resuspendată la 16,5 mg/ml, pH-ul fiecărei soluții a fost 7,1, 6,8 și 8,2 în BAL, DUP și respectiv OIK. Concentrația clorurii de sodiu, a fiecărei soluții, a fost de 2,08, 4,37, și 0,71 mg/ml în BAL, DUP, și respectiv OIK.

Recapitularea rezultatelor

Profilul molecular al fiecărei probe (BAL, DUP, și OIK - 3) este arătat în fig.18. Comparația dintre probele DUP și BAL a scos în evidență faptul că proba BAL conținea o proporție mai mare de vârfuri cu un procent de suprafață mai mic decât 1. BAL și DUP au împărțit vârfurile cu un raport de 1,06,1,54, și 3,22 au avut un procent de suprafață similar în BAL și DUP în timp ce vârfurile cu raport 1,59 sunt de opt ori mai intense decât în BAL, iar cel opus este observat la un raport de 1,66.

Probele DUP și OIK prezintă electrocromatograme foarte diferite. OIK prezintă un vârf principal I cu mai multe vârfuri minore. Nici unul dintre aceste vârfuri nu poate fi raportat la unul al probei DUP.

Comparația EVT

Potențialul antiangiogenic al probelor DUP, BAL și OIK a fost analizat pe testul de vascularizare embrionică - EVT (fig. 19). Nici un fel de activitate antiangiogenică semnificativă nu a fost regăsită în extractul Balassa. Extractul brut DUO a fost comparat cu fracțiunea 3 din Oikawa. Atât DUP, cât și Oikawa au fost aproape echivalente. Oikawa și colab., totuși s-au îndepărtat de prezenta invenție, întrucât ei au menționat faptul că nici o activitate nu a fost detectabilă în fracțiunea cu greutatea moleculară mai mare de kDa, ceea ce este în contradicție cu rezultatele noastre prezentate în fig.15.

Ca urmare, în ciuda similarităților dintre procedeele Balassa și procedeul nostru, produsele obținute prin ambele procedee nu sunt în mod evident aceleași.

COMPARAȚIA CONȚINUTULUI DE AMINOACIZI

I

Conținutul de proteine al probelor BAL, DUP și OIK (toate de 16,5 mg/ml greutate în stare uscată) a fost măsurat folosind metoda lui Lowry; rezultatele arată valori de 3,31, 0,27 și 4,15 mg/ml pentru probele BAL, DUP și respectiv OIK. Raportul dintre proteine și greutate, în stare uscată, este foarte diferit, atunci când proba DUP este comparată cu BAL și OIK.

Analizele au fost efectuate în vederea unei analizări suplimentare a conținutului de aminoacizi al fiecărui preparat lichid de cartilagiu. Fig. 20 ilustrează proporția fiecărui aminoacid în probele BAL, DUP și OIK. Proporția de aminoacizi liberi variază între fiecare

1195

1200

1205

1210

1215

1220

1225

1230

1235

1240

RO 118567 Β1 preparat de cartilagiu: 23, 73 și 4% în probele BAL, DUP și respectiv OIK. în mod evident, proporția de aminoacid de origine proteinică variază de asemenea între fiecare preparat de cartilagiu: 77,27 și 86% în BAL, DUP, și respectiv, în proba OIK. Vezi tabelul care urmează privind datele brute.

Preparatul de cartilagiu	Conținutul de aminoacizi liberi (pg/ml)	Aminoacizi de origine proteinică (pg/ml)
BAL	675	2314
DUP	604	223
OIK	181	3910

CONCLUZII

Cele două produse din practica anterioară (BAL, OIK) care au fost comparate cu cele ale noastre (DUP) sunt considerate încă drept procedee clasice pentru prepararea extractelor de cartilagiu. Rezultatele de mai sus arată că prezentul procedeu (DUP) asigură un produs cu o activitate neașteptat de bună, atât în ceea ce privește activitatea antiangiogenică, antitumorală, antiinflamatorie, cât și activitatea anticolagenolitică. Se poate considera că prezentul procedeu a reușit într-adevăr să recupereze o multitudine de factori inhibitori hidrosolubili într-un singur extract.

Comparația directă a profilelor moleculare a BAL, DUP și OIK, precum și a conținutului de proteine au demonstrat faptul că preparatele din cartilagiu prezintă caracteristici deosebite. Cu toate că ele par să împartă între ele unii constituenți, este evident că raportul lor, unul față de celălalt, este diferit. Aceasta este în mod deosebit important, dacă se ia în considerare faptul că DUP este antitumoral atunci când este administrat pe cale orală într-o doză variabilă sub aproximativ 75 mg/kg și pierde în mod gradat acest efect la un dozaj mai ridicat. Acest rezultat sugerează faptul că o cantitate mai mare decât un factor singular este critică în extractul lichid de cartilagiu DUP. Ca urmare, diferitele preparate din cartilagiu, cum sunt BAL, DUP și OIK, pot prezenta proprietăți biologice foarte diferite, dacă proporția fiecărui component individual variază.

ÎNCERCĂRI CLINICE

PREPARAREA EXTRACTELOR LICHIDE PENTRU ÎNCERCĂRI CLINICE încercările clinice preliminare au fost efectuate cu extract lichid de cartilagiu de rechin conform prezentei invenții. Extractul lichid obținut după operația de ultrafiltrare a fost filtrat pe un filtru millipore cu o porozitate de 0,22 pm. Limita microbiană a extractului lichid a fost controlată în conformitate cu standardul USP XXIII 61. Extractul lichid a fost distribuit în alicoți de câte 7 ml (aproximativ 85 mg de proteine) în baloane aseptice, congelate la temperatura de - 60°C peste noapte și depozitate în continuare la temperatura de - 20°C până în momentul utilizării.

EFECTUL ANTIANGIOGENIC

Extractul lichid de cartilagiu a fost utilizat pentru tratarea bolilor dependente de angiogeneză. Au fost testate în practică, pe oameni, trei tipuri diferite reprezentative de boli dependente de angiogeneză. Primul fiind cancer (cancer de prostată), cel de-al doilea tip reprezentând tulburări dermatologice (psoriazis), iar cel de-al treilea tip fiind artrita (artrita reumatoidă și osteoartrită). Exemplele de mai jos ilustrează și indică cel puțin activitatea antiangiogenică a extractului lichid.

Rezultatele prezentate aici mai jos sunt foarte încurajatoare și sunt considerate ca fiind predictive privind utilizarea permeatului brut și a fracțiunilor acestuia în tratamentul tuturor bolilor dependente de angiogeneză, și nu numai a acelora care au fost testate în mod

RO 118567 Β1

1290 specific. Atâta timp cât o maladie prezintă un component angiogenic, se consideră că extractul de cartilagiu din prezenta invenție este eficient în acest caz, considerând că el intră în compoziția ce conține o cantitate eficientă a acestuia și că această compoziție este prezentată într-o formă corespunzătoare unei administrări adecvate. Ca urmare trebuie apreciat că prezenta invenție nu este limitată la compozițiile specifice care urmează pentru utilizare în tratamentul maladiilor angiogenice, și că persoanele specializate în acest domeniu sunt capabile să propună numeroase compoziții derivate, în care alegerea este dirijată de modul de administrare al acestora și de țesutul bolnav care reprezintă obiectul tratamentului. Compozițiile pot fi administrate pe diferite căi, de exemplu, pe cale topică, orală, sublinguală, rectală, intravenoasă, intramusculară, intraoculară, intraperitoneală, prin difuzie etc.

Datorită gustului și mirosului de pește al extractului de cartilagiu de rechin, pot fi adăugați agenți ce reprezintă arome sau parfumuri sau alte compoziții galenice (lipozomi, încapsulări, plasture etc.). Pot fi concepute pentru a încuraja acordul pacientului. Termenul de “pacient” se referă atât la un pacient uman, cât și la unul animal.

CANCER

Unui pacient suferind de cancer de prostată i s-a adăugat în dietă extract lichid de cartilagiu și s-a observat o îmbunătățire semnificativă a sănătății acestuia. Un adenocarcinom a fost diagnozat în anul 1986. La acea vreme, a fost întreprinsă o radiografie. în 1991, nivelul PSA (Prostatic serum antigen - ser antigen prostatic) a fost de 138 pg/l, pe când limita normală maximă acceptabilă este de 4 pg/l. Pacientul a fost apoi supus unei terapii complet diferite prin castrare combinată cu terapie antiandrogen (EUPLEX). Acest tratament a fost eficient timp de trei ani, după care nivelul PSA a început să crească din nou. începând cu luna iunie 1994, acest pacient a adăugat extract lichid de cartilagiu la dieta sa (o doză orală zilnică de aproximativ 75 mg greutate în stare uscată/7 ml de extract, echivalent cu aproximativ 1-1,5 mg/kg greutate corp/zi). Nivelele de ser prostatic antigen au scăzut gradat de la 12 până la mai puțin de 4,0 pg/ml (limită normală), ultimul rezultat fiind obținut în luna aprilie 1996. Această doză de regim ar putea fi modificată după dorință, în conformitate cu calea de administrare, biodisponibilitatea ingredienților activi și agresivitatea dorită cu care patologia urmează a fi controlată. în acest caz, extractul lichid este probabil absorbit în tractul gastro-intestinal în proporții substanțiale. Se poate baza pe rezultatele obținute pe șobolani tratați cu DMBA sau cu șoareci inoculați (vezi mai sus). în acest timp, a fost verificată lipsa de toxicitate și la maimuțe (pentru acestea, datele nu sunt arătate).

Administrarea orală a extractului lichid la șobolani tratați cu DMBA și la șoareci implantați cu DA 3 a sugerat o doză cuprinsă între 1 și 300 mg/kg greutate corp, care în mod prezumtiv a avut o mare contribuție în inhibarea progresării tumorii și vascularizării tumorale la modele de animale. Administrarea intraperitoneală a extractului lichid la șoareci (modelul DA 3) a demonstrat că, calea de administrare este importantă pentru a obține un dozaj eficient în inhibarea progresiei tumorale. Aceasta sugerează faptul că o rație de doză de 1 mg pe kilogram este eficientă în cazul cancerului de prostată și ea poate fi coborâtă până la aproape 0,01 mg/kg, dacă este selectată o cale de administrare parenterală. Se consideră prin urmare că o doză de aproximativ 0,01 până la aproximativ 200 mg/kg greutate corp/zi, este un domeniu aproximativ rezonabil al dozelor medii ED^, pentru tratarea cancerului, cel puțin parțial prin reducerea sau abolirea angiogenezei.

Numeroși alți pacienți au adăugat extract lichid de cartilagiu la dieta lor zilnică (doză zilnică orală de aproximativ 75 mg de greutate în stare uscată/per 7 mg de extract, echivalent cu aproximativ 1 ...1,5 mg/kg greutate corp/zi, în combinație cu terapii mai tradiționale:

intervenții chirurgicale, chemoterapie, antihormonoterapie etc.). O recapitulație a unor cazuri medicale este prevăzută în tabelul care urmează. Rezultatele obținute sugerează faptul că o terapie combinată cu extract lichid de cartilagiu poate conduce la creșterea ratei de supraviețuire și la creșterea calității vieții pacienților suferinzi de tumori solide.

1295

1300

1305

1310

1315

1320

1325

1330

1335

RO 118567 Β1

Tipul de cancer	Anamneză medicală (istoric)
La vezica urinară	Vezică urinară la un bărbat în vârstă de 70 de ani; supus unei intervenții chirurgicale ablative a mai multor leziuni (2 cm și 1,5 cm) și s-a adăugat extract lichid de cartilagiu la dieta acestuia; nici un carcinom rezidual din 09/94.
Adenocarcinom ovarian	Femeie în vârstă de 47 de ani; leziuni de 15 cm (drept), 11 cm (stâng); supusă intervenției chirurgicale și chemoterapiei în 1991; recidivă tratată prin chemoterapie în 1992; o a doua recidivă tratată prin chemoterapie în 1993: adăugare de extract lichid de cartilagiu la dietă în 1994; de atunci neoplasm malignizant de masă redusă.
Rhabdomyosaroom	Bărbat în vârstă de 63 de ani; tumoare de infiltrație de 11 cm în diametru (450 g); supus intervenției chirurgicale și chemoterapiei; recidivă tratată cu radioterapie și adăugare de extract lichid de cartilagiu la dietă; de atunci tumoarea prezintă un țesut necrozat și stabilitate.
Adenocarcinom mamar	Femeie în vârstă de 67 de ani; intervenție chirurgicală în 1978; recidivă și metastază la plămân (1994); Megace și adăugare de extract lichid de cartilagiu la dietă; de atunci regresie parțială a tumorilor în dimensiune (1,5 cm până la 1 cm) și ca număr (de la 12 până la 6).

Psoriazis

Următoarea compoziție dermatologică a fost preparată și s-a încercat verificarea eficienței ei la bolnavi suferind de psoriazis:

- EMULGADE CLB 29% (g/g)

- 20 X permeat brut 69,5% (g/g)

- GERMABEN II 1% (g/g)

- Lavandula Angustifolia 0,5% (g/g).

EMULGADE CLB, un amestec de esteri stearat, alcooli grași și emulsifianți neionici (aprovizionați de la Henkel Canada Ltd.) au fost încălziți la temperatura de 65,..70°C sub agitare. încălzirea a fost întreruptă în timp ce amestecul a fost ținut în continuare sub agitare. Atunci când amestecul a atins temperatura de 45°C, s-a adăugat esență de ulei de Lavandula Angustifolia și agenți de prezervare GERMABEN II (diazodinil uree 30%, metilparaben 11%, propilparaben 3% și propilen glicol 56%; aprovizionat de la Sutton Laboratories, NJ, Statele Unite). Atunci când temperatura amestecului a atins 30°C, s-a adăugat extract de cartilagiu lichid. Compoziția astfel obținută a fost o cremă omogenă negrăsoasă; prin variația procentajului de EMULGADE pot fi obținute alte compoziții dermatologice ca formă, cu viscozități diferite, în conformitate cu directivele producătorului (lapte, loțiune, unguent). Alți agenți purtători (vehicule) sau excipienți pot fi utilizați pentru a se obține paste, geluri și orice alte forme de preparate transdermale.

Formularea de mai sus a fost administrată de două ori pe zi pe durata unei perioade de timp de 12 săptămâni unui panou de 9 pacienți (aplicare topică) suferind de psoriazis care au fost entuziaști față de terapia convențională încercată, dar care au devenit refractari față de aceasta după un anumit timp. Pentru acest studiu, pacienții au fost selectați având o extindere similară și simetrică a psoriazisului pe ambele părți ale membrelor. Aceste teste au fost conduse într-o manieră dublu-oarbă, nici medicul dermatolog și nici pacienții neștiind care parte afectată a fost tratată cu compoziția conținând extract de cartilagiu și care parte

RO 118567 Β1

1385 a fost tratată cu o compoziție de control. O îmbunătățire remarcabilă a fost observată la cinci pacienți al căror psoriazis nu a fost complicat prin hipercheratoză; în cazul celor având hipercheratoză, rezultatele au fost moderat de bune. Fotografii ale unor părți de la doi pacienți, părți ale corpului, sunt arătate în fig.21. în fig.21 a) și b), este demonstrat faptul că un pacient afectat de psoriazis cu hipercheratoză a prezentat, cu toate acestea, o reducere foarte semnificativă a eritemei, asociată cu lipsa pruritului, numai după o lună de la tratament. Hipercheratoză a rămas, totuși, importantă. Fotografiile celui de-al doilea pacient suferind de psoriazis fără a fi complicat cu hipercheratoză (fig.21 c) și d)) au arătat o îmbunătățire mult mai bună după o perioadă de tratament de trei luni. întrucât psoriazisul pare a fi o maladie multifactorială, se admite că răspunsul pacienților depinde de importanța implicării componentelor, cum este angiogeneză și inflamațiile, în stabilirea și în perpetuarea acestei condiții. Activitatea antiangiogenică este într-adevăr prezentată în exteriorul nostru, așa cum s-a arătat în cazul șobolanilor tratați cu DMBA (fig.5), proliferării celulelor endoteliale (fig.7) și EVT (fig. 10). Activitatea antiinflamatorie a fost, de asemenea, verificată (modelul CHS la șoareci). Este probabil că rezultate mai bune ar putea fi obținute dacă acest tip de formulare ar fi complementat cu alți agenți terapeutici, care să se adreseze unor alți factori implicați (agenți cheratolitici, agenți antiinflamatori adiționali, antihistaminice, imunosupresoare etc.).

Această complementare ar putea lua forma de amendare a formulării pentru a include o cantitate eficientă de agent cheratolitic, ca exemplu. Aceasta poate fi realizată printr-o administrare separată a unui astfel de agent terapeutic complementar, în același timp sau prin alternare cu aplicarea prezentei formulări topice. Mai mult decât atât, medicația complementară nu trebuie să fie neapărat administrată pe aceeași cale.

Formularea de mai sus nu a dovedit efecte sistemice (efectul fiind limitat la aria tratată) și nici efecte secundare, chiar în cazul unor proporții mari de extract lichid de cartilagiu.

Artrita

Pacienți suferind de artrită au probat, pe bază de voluntariat, una până la două unități de 7 ml de extract lichid total zilnic, timp de mai multe luni. Acești pacienți au constatat o îmbunătățire a condiției lor prin recuperarea în mod gradat a funcțiunii articulațiilor, diminuarea durerilor și inflamațiilor (până la aproximativ 60%). întrucât artrita prezintă componente angiogenice și inflamatorii, efectul de mai sus poate fi atribuit activităților antiangiogenică și antiinflamatorie a extractului de cartilagiu.

Un studiu clinic pilot a fost apoi condus de un grup de specialiști în reumatologie. Șapte subiecți voluntari și instruiți, cu vârste cuprinse între 39 și 60 de ani, și suferind de artrită reumatoidă, s-au înrolat în acest studiu. Diagnosticul a fost stabilit bazat pe criteriile de clasificare din ediția revizuită a Asociației americane de reumatism (American Rheumatism Association) (Arnett, F.C., și alții., 1988, Arthritis & Rh eumatism, voi. 31,315 - 325).

Tratamentul a durat 30 de zile și a constat în ingestia unei doze zilnice de 21 ml de extract lichid de cartilagiu (12 mg/ml de substanță în stare uscată), cartilagiu! fiind de rechin. Eficacitatea tratamentului a fost determinată cu un index articular privind evaluarea sensibilității articulațiilor (Ritchie, D.M., și alții, 1968, QuaterlyJ. Med New Series XXXVIII, vol.147, 393-406). Indexul este bazat pe însumarea unui număr de evaluări cantitative ale durerilor suferite de pacient atunci când articulațiile sunt supuse unei presiuni ferme exercitate asupra limitei articulare, sau în unele cazuri asupra mișcării articulației. Rezultatele arată că 4 pacienți din 7 au prezentat îmbunătățiri atunci când au fost tratați cu extract lichid de cartilagiu (conform tabelului de mai jos), sugerând faptul că produsul poate fi utilizabil în tratamentul artritei reumatoidei sau al altor condiții complicate de o inflamație cronică.

1390

1395

1400

1405

1410

1415

1420

1425

RO 118567 Β1

Pacientul nr.	Vârsta (ani)	INDEX Ritchie	îmbunătățiri
ZiuaO	Ziua 30
1	60	30	22	Da
2	43	8	8	Nu
3	52	12	12	Nu
4	41	15	19	Nu
5	46	5	3	Da
6	39	6	2	Da
7	55	14	7	Da

Vene încrucișate (de păianjen)

Un total de 16 participanți au fost recrutați pentru acest studiu. Participanții au prezentat telengectasii vizibile, dar nu excesive pe față. Participanții au fost divizați în două grupe a câte 8 fiecare. Grupa A a fost asigurată cu o bază de liposomal colesterol conținând 5% extract lichid de cartilagiu, în timp ce, cea de-a doua grupă (grupa B) a fost asigurată numai cu o bază de liposomal colesterol. Produsele au fost utilizate pe întreaga față, de două ori zilnic, timp de trei luni. Un microscop cu suprafață de fibră optică a fost utilizat pentru a se obține imagini din minimum patru părți ale feței, arătând venele încrucișate (sub formă de păianjen. Imaginile au fost analizate privind valorile cenușii (grey values) prin intermediul unui analizor de imagini de tipul Zeiss Ibas Image Analyser. Densitatea optică integrată (IOD - Integrated Optical Density) a fost calculată pentru fiecare parte la fiecare participant. Celor patru părți ale fiecărui participant li s-au stabilit o medie pentru fiecare moment de timp.

Rezultatele au arătat că s-a produs o scădere cu 35% a valorilor densității optice integrate (IOD) după patru săptămâni și acest efect s-a menținut pe întreaga durată a studiului (fig.22). Baza de liposomal colesterol goală a prezentat o îmbunătățire de fond de 5 și 8% după 8 și 12 săptămâni de utilizare.

Cearcăne întunecate periorbitale

Colorarea pielii nu se datorează în întregime prezenței sau absenței melaninei, ci și alimentării cu sânge și conținutului de plasmă. Atunci când fluxul sanguin este leneș și cantități mai mari de oxigen sunt îndepărtate pentru metabolism, pielea apare albăstruie ca culoare. Aceste diferențe de culoare sunt exagerate în zona ochilor din cauza subțirimii pielii (Oresajo, și alții.)1987), Cosmetics & Toiletries 102:29 -34). Modificări vasculare, în septurile care sunt prezente sub ochi, pot exacerba, de asemenea, apariția cearcănelor întunecate. Cearcăne întunecate în jurul ochilor apar, de asemenea, datorită depunerilor de grăsime, edemului de sub pleoape, precum și lipsei unor vase sanguine în jurul zonei ochilor. Au fost concepute studii clinice pentru evaluarea efectului extractului lichid de cartilagiu de rechin asupra controlului angiogenezei în jurul zonei ochilor, reducând în acest fel cearcănele întunecate periorbitale.

Un număr total de 18 femei voluntare, având vârsta cuprinsă între 18 și 65 de ani, au participat la acest studiu. Participantele au prezentat cearcăne întunecate distincte în jurul ochilor. Toate participantele au prezentat o stare de sănătate normală, fără vreo evidență de boli acute sau cronice, incluzând probleme dermatologice sau oftalmologice.

Subiecții care au prezentat arcuri solare, erupții (spuzeală), zgârieturi, pete de arsuri etc., care ar fi putut interfera cu evaluările rezultatelor testului, au fost de la început excluși din studiu. De asemenea, femeile însărcinate sau care alăptau au fost și ele excluse. Partea testată a fost liberă de negi, alunițe, arsuri datorită soarelui, părți bronzate, cicatrici sau leziuni dermale active, care s-au putut remarca în timpul observațiilor efectuate.

RO 118567 Β1

1480

Participantele au fost divizate în două grupe, 10 în grupa A și 8 în grupa B, fiecare grupă corespunzând unui agent purtător (vehicul) conținând 5% extract lichid de cartilagiu, sau respectiv agent purtător (vehicul) singur. Participantele au fost asigurate cu produs suficient pentru a fi aplicat în jurul zonei ochilor cel puțin de două ori zilnic, timp de 12 săptămâni. Măsurătorile au fost efectuate din ziua’de pornire (ziua zero), și după 4, 8 și 12 săptămâni. La fiecare vizită medicală, s-au efectuat fotografii care s-au analizat prin intermediul analizei imaginii.

Fotografiile au fost analizate privind valorile cenușii (grey values), care reprezintă sau provoacă întunecimea/luminozitatea pielii. Este clar că grupa care a fost tratată cu extract lichid de cartilagiu a prezentat o creștere bună a valorilor cenușii (grey values) care determină colorarea întunecată sau luminoasă a pielii. După 4, 8 și 12 săptămâni, s-a observat o creștere a luminozității pielii în jurul zonei ochilor de 11,21, și respectiv 14%, la grupa care a fost tratată cu extract lichid de cartilagiu. Grupa tratată doar cu agent purtător (vehicul) nu a prezentat nici un fel de modificare (fig. 23).

Vene varicoase

Un total de 20 de participanți a completat acest studiu. Participanții au prezentat telangiectazii vizibile, dar nu excesive, pe picioare. Participanții au fost divizați în două grupe, grupa A (un număr de 9 participanți) a fost tratată cu o cremă conținând extract lichid de cartilagiu, în timp ce grupa B (cu un număr de 11 participanți) a fost tratată doar cu o cremă reprezentând agentul purtător ce urma a fi repartizat pe toată suprafața picioarelor, de două ori zilnic, timp de trei luni. S-a utilizat un microscop cu fibre optice, pentru a obține imagini a 2...4 părți ale piciorului prezentând vene varicoase. Imaginile au fost analizate privind valorile cenușii (gray values) cu ajutorul analizorului de tipul Zeise Ibas. Densitatea optică integrată (IOD) a fost calculată pentru fiecare parte, pentru fiecare participant. Toate părțile fiecărui participant au fost calculate ca o medie a acestora pentru fiecare moment de timp.

Rezultatele sunt ilustrate în fig. 24. S-au constatat descreșteri de 21,17 și 26% ale densității optice integrate (LOD) după 4, 8 și respectiv 12 săptămâni de utilizare. Agentul purtător (vehiculul) a prezentat o îmbunătățire de fond de 5, 0 și respectiv 0%, după 4, 8 și respectiv 12 săptămâni de utilizare.

Alte aplicații clinice potențiale și veterinare

Oftalmologie

O scădere a vederii sau chiar orbirea poate fi cauzată de un număr de condiții caracterizate prin creșterea anormală a vaselor sanguine sau neovascularizare. Aceasta include neovascularizarea corneană (provocată de iritații fizice sau chimice), infecții corneene, rejecția grefei corneene, glaucom neovascular, degenerare maclară, cheratită a virusului herpes și retinopatie diabetică. Extractul lichid de cartilagiu poate acționa asupra acestor condiții clinice prin inhibarea formării de noi vase sanguine, și prin reducerea telangectahziei și inflamărilor.

Vindecarea rănilor

Vindecarea rănilor implică o interacțiune complexă între celule, mediatori biochimici, molecule ale rețelei extracelulare, și micromediul înconjurător celular. După o rănire pe întreaga grosime, țesutul de granulare (fibroblaste, capilare, și celule inflamatorii) crește mai întâi de la limita rănii printr-o secvență caracteristică. Fibroblastele încep să migreze în interiorul spațiului rănii de la țesutul conectiv la limita rănii în timp de 24 h. în timpul mișcării lor, fibroblastele produc molecule de rețea (colagen și glicozaminoglicani), care formează o rețea (matrice) extracelulară. Primii germeni capilari pot fi observați în microcirculația perfuzată la muchia rănii mai devreme de 18 h de la rănire. Acești germeni cresc în spațiul rănii și determină o nouă rețea capilară pentru țesutul conectiv al rănii. Proliferarea fibroblastelor și

1485

1490

1495

1500

1505

1510

1515

1520

RO 118567 Β1 migrarea lor și creșterea capilarelor continuă ca un tot, până când spațiul rănii este complet umplut cu un țesut nou. Unele condiții de vindecare a rănii, care sunt complicate de superexpresia factorilor de granulare, cum este cicatrizarea hipertrofică și vindecarea rănilor de pe piele a persoanelor cu arsuri grave, pot beneficia de administrarea extractului lichid de cartilagiu (pe cale orală sau topică), în timp ce descreșterea procesului angiogenic ar încetini procesul de vindecare a rănii.

Maladia pielii papuloscuamoase

Efectul benefic al extractului de cartilagiu lichid asupra leziunilor psoriazitice sugerează faptul că alte maladii având caracteristici comune ar putea, de asemenea, profita de administrarea locală sau sistemică a extractului lichid de cartilagiu. Maladia privind pielea papuloscuamoasă (Papulosquamous ski) este caracterizată prin papule și plăci de culoare roșie până la violacee care rezultă de la îngroșarea epidermei și/sau inflamarea dermajă subcutanată și include psoriazis, sindromul Reiter, pityriazis roșea, lichen planus, pityriazis rubra pilaris, sifilis secundar, fungolide micosice, și erupții ichtiosiforme.

Alopecia

Ligatura arterelor laterale mici, care transportă fluxul de sânge la scalp (pielea capului), au avut succes în prevenirea pierderii părului cauzată de o supraexpunere androgenă. Aplicarea locală a extractului lichid de cartilagiu pe anumite regiuni ale scalpului poate preveni căderea părului prin descreșterea rețelei vasculare și ca urmare expunerii la hormoni.

Aplicații veterinare

Extracte lichide sau/și solide de cartilagiu pot fi administrate la animale pentru aceleași aplicații terapeutice și cosmetice care au fost descrise pentru oameni.

EFECTUL NON-ANTIANGIOGENIC

Acnee

Cu toate că acneea nu este, după cunoștințele inventatorilor, clasificată drept o maladie sau o tulburare având o componentă angiogenică, este totuși tentant a se testa extractul lichid de cartilagiu la pacienți astfel afectați, pe baza faptului că extractul lichid de cartilagiu este, de asemenea, antiinflamator. Pentru experimentarea extractului de cartilagiu la pacienți afectați de acnee, a fost produsă următoarea formulare de gel:

- CARBOPOL 1,2%;

- Apă purificată 77,1%;

- Hidroxid de sodiu 0,3%;

- PHENOXETOL 0,3%;

- TWEEN 80 0,3 %;

- Extract lichid de cartilagiu 20,0%;

- 40 X Extract de aloe 0,5%.

Extractul lichid de cartilagiu conține 9...12 mg/ml greutate în stare uscată. Această formulare a dovedit o îmbunătățire remarcabilă a aspectului pielii la pacienții afectați de forme mai mult sau mai puțin severe de acnee (acnee inflamatorie și acnee chistică). Fig. 25 arată îmbunătățirile semnificative ale condiției unui pacient suferind de acnee atunci când este tratat pe cale topică cu extract lichid de cartilagiu înglobat într-un agent purtător (vehicul) pe o perioadă de 12 săptămâni.

Aceste rezultate se pot datora unui efect antiangiogenic (demonstrând în acest fel o componentă angiogenică în acnee) sau ele se pot datora ingredienților activi care au prezentat un efect, altul decât cel antiangiogenic (un efect antiinflamator, de exemplu). Toate rezultatele obținute în testele clinice de mai sus arată un potențial ridicat al extractului lichid de cartilagiu în tratamentul maladiilor dependente de angiogeneză și/sau maladiilor inflamatorii. Cantitatea de extract lichid de cartilagiu precum și formulările cu acesta pot fi variate după dorință, pentru a îndeplini necesitățile specifice.

RO 118567 Β1

Se poate menționa faptul că, pe o bază cu conținut proteic, compoziția topică și alte compoziții pot conține un domeniu larg de doze privind extractul de cartilagiu. Dintre cele trei categorii de cazuri testate, au fost utilizate dozaje și/sau formulări foarte diferite.

Iritabilitatea pielii întrucât angiogeneza este deseori asociată cu inflamația în numeroase maladii, ar fi de dorit a se atribui extractului de cartilagiu câte o activitate separată. Din acest punct de vedere, s-a ales un model de iritabilitate a pielii, în care angiogeneza nu este suspectată că poate apare, pentru a testa extractul în ceea ce privește activitatea sa antiinflamatoare și de liniștire (alinare). Nouă voluntari cu un trecut de sensibilizare a pielii cu balsam de Peru au fost aleși pentru studiu. Compușii testați au fost, după cum urmează:

1.1 X Cartilagiu de rechin 50% în mediu D - MEM;

2.1 X Cartilagiu de rechin 20% în mediu D - MEM;

3.1 X Cartilagiu de rechin 10% în mediu D - MEM;

4. Cola nitida (Indena) 10% în Hidroalcool în raport de 1:1.

Cei patru compuși testați au fost aplicați pe antebrațele ventrale ale participanților. Materialul a fost lăsat să se absoarbă timp de 20 de min, apoi s-a aplicat Balsam de Peru, un iritant, pe părțile testate. Iritarea pielii a fost măsurată în termeni de creștere a roșeței pielii. Gradul de înroșire a pielii a fost măsurat cu un romametru de tip Minolta și comparat cu controalele pozitive și negative. Controlul pozitiv a constat în culoarea pielii tratată numai cu Balsam de Peru, iar controlul negativ a constat în partea de piele tratată cu soluție cola și provocată la fel ca și produsele de testat. Semnificația statistică a fost calculată prin intermediul testului - T de probabilitate dublu cauzată. Fig. 26 arată faptul că, cola a fost activă 70% la o concentrație de 10%. Cartilagiul de rechin a fost antiiritant în proporție de 58 și 60% la concentrații de 20 și, respectiv, 10%. Nu s-a observat un efect al răspunsului la doză. Aceste rezultate sugerează faptul că extractul de cartilagiu posedă o activitate antiinflamatorie și o activitate de alinare, care este separată de efectul antiangiogenic.

Cancer

Unui pacient - femeie în vârstă de 53 de ani i s-a pus diagnosticul de limfom nonHodgkin cu celule mari de tipul B, analiza de examinare CAT a scos în evidență adenopatii în jurul carotidei și a venei jugulare (2,5 cm în diametru 9 și o adenopatie voluminoasă peste hilul renal drept. Pacientul a refuzat chemoterapia și a adăugat extract lichid de cartilagiu la dieta sa (octombrie 1993) (doza zilnică orală de aproximativ 75 mg greutate substanță uscată/7 ml de extract, echivalentă cu aproximativ 1...1,5 mg/kg greutate corp/zi). Trei luni mai târziu (ianuarie 1994), analiza de examinare CAT a scos în evidență faptul că adenopatiile de la gât au fost complet resorbite. Din noiembrie 1994, adenopatia abdominală a scăzut în volum cu aproximativ 75%. De atunci boala este stabilă, iar pacienta se simte într-o stare de sănătate bună.

Acest rezultat sugerează faptul că unele tipuri de cancer non-solide pot răspunde de asemenea la activitatea antitumorală a extractului lichid de cartilagiu.

Bariera de protecție a pielii

Un număr de 6 voluntari sănătoși au participat la studiu. Participanții au primit fiecare o cremă conținând extract lichid de cartilagiu ce urma să fie aplicată pe antebrațul drept și doar agentul purtător (vehicul) care urma să fie aplicat pe antebrațul stâng, de două ori pe zi, timp de 4 săptămâni.

Participanții au fost femei având vârste între 21 și 45 de ani, neavând evidențiată vreo maladie acută sau cronică, incluzând probleme dermatologice sau oftalmologice. Subiecții care au prezentat arsuri curente, datorită soarelui, urticarie (spuzeală), semne de arsuri etc., care ar putea interfera cu evaluarea rezultatelor testului, au fost de la început excluși din acest studiu. Partea testată a fost liberă de negi, alunițe, arsuri datorită soarelui,

1575

1580

1585

1590

1595

1600

1605

1610

1615

1620

RO 118567 Β1 o bronzare a pielii datorită soarelui, cicatrice și leziuni dermale active observate după o examinare atentă. în ziua testului, participanții au fost instruiți să se rețină de a utiliza orice fel de loțiuni, creme sau alte produse pe suprafața feței. în cursul măsurătorilor, participanții au fost echilibrați timp de cel puțin 30 de min, înainte de testare, într-un mediu înconjurător controlat, la temperatura de 2O...22°C și la o umiditate relativă de 40%.

Partea testată a fost antebrațul palmar drept și stâng. O arie mică (3,5 cm x 7 cm) a fost marcată pe fiecare braț și s-au efectuat măsurători de bază privind pierderea de apă transepidermală (TEWL - Transepidermal water loas) din trei locuri din interiorul zonei (Pinago, și alții., (1990), contact Dermatitis 22:164 -178; Grove, (1994), în The effects of aging în oral mucosa and skin (Efectele îmbătrânirii în mucoasa orală și piele), Ed. Squier & Hill, CRC Press, PP 124 -125).

A fost utilizată o bandă adezivă (Tuck) pentru a acoperi zona testată și după o lovitură fermă în ambele direcții, banda a fost dezlipită (Elisa (1993) J. Invest. Dermatol. 80: 0,44s-049s). Au fost obținute în total un număr de cinci dezlipiri. Pierderea de apă transepidermală a (TEWL) a fost din nou înregistrată. Dezlipiri urmate de măsurători ale pierderii de apă transepidermală au continuat în grupe de 5. Dezlipirile au fost întrerupte atunci când valorile pierderii de apă transepidermală (TEWL) s-au apropiat de 18 g/m²/h. Pierderea de apă transepidermală (TEWL) a fost din nou măsurată la finele ultimei secvențe de dezlipire (stripping). Numărul de dezlipiri necesare pentru a vătăma bariera pielii a fost calculat prin notarea numărului maxim de dezlipiri pentru fiecare braț, la fiecare moment de timp care a prezentat o pierdere de apă transepidermală de 18 g/m²/h sau mai mare. Rezultatele au fost analizate privind semnificația statistică între tratamente la diferite momente de timp față de punctul de pornire folosind testul coeficientului Z de rang monocaudat.

Brațul, tratat doar cu agent purtător (vehicul), nu a prezentat o îmbunătățire prea mare, întrucât doar un procent de 26 și 21 % mai mare de dezlipiri a fost necesar pentru a vătăma pielea după tratamente de două săptămâni și respectiv de patru săptămâni. S-a observat o îmbunătățire semnificativă (p mai mic de 0,05) în ceea ce privește condiția de barieră a fiecăreia dintre participante după tratamentul cu produs extract lichid de cartilagiu, timp de două și patru săptămâni, când au fost necesare cu 60 și respectiv cu 55% mai multe dezlipiri (strippings) pentru a distruge barierele pielii (fig. 27).

Prin urmare, extractul lichid de cartilagiu s-a dovedit a fi utilizabil în creșterea rezistenței pielii ca barieră împotriva unor vătămări fizice.

Eczeme

Extractul lichid de cartilagiu a fost testat în saloane de înfrumusețare pe baza abilității lui de a descrește leziunile inflamatorii provocate de eczeme. Esteticianul care aplică crema conținând extract lichid de cartilagiu suferă de mai mulți ani de eczemă cronică la mâinile sale. Este interesant de remarcat faptul că utilizarea cremei conținând extract de cartilagiu a coborât în mod semnificativ expresia eczemei la mâinile sale. Este interesant de remarcat faptul că utilizarea cremei conținând extract de cartilagiu a coborât în mod semnificativ expresia eczemei la mâinile sale. Esteticiana folosește acum cu succes crema conținând extract de cartilagiu pentru a preveni expresia eczemelor.

Negi

O femeie în vârstă de 36 de ani, cu un trecut de negi plantari, a fost tratată de către un dermatolog timp de trei ani, pentru a-i controla progresarea negilor și durerea asociată cu aceștia. Printre tratamente au fost cele cu azot lichid, acid salicilic (40%), Anaerobia, acid azotic, și acid sulfuric. Acest tratament a fost efectuat în general pe o durată de timp de trei luni, iar rezultatele au fost aproape nule. în martie 1996, ea a aplicat zilnic (timp de 5 min) extract lichid de cartilagiu de rechin direct asupra negilor; două săptămâni mai târziu o zonă roză de epidermă nouă s-a format în jurul negilor; în următoarea săptămână negii am dispărut. Ca urmare, aceste rezultate sugerează faptul că extractul de cartilagiu lichid poate fi folositor în tratamentul negilor.

RO 118567 Β1

Alte aplicații clinice potențiale și veterinare

Rejecția grefelor

Inflamarea reprezintă unul dintre factorii principali implicați în mortalitatea celulelor transplantate. Prin urmare, grefa de țesuturi ar putea beneficia de componentele antiinflamatorii prezente în extractul nostru lichid de cartilagiu de rechin.

Scleroză multiplă

Cauza sclerozei multiple nu este cunoscută. Răspunsul țesutului are caracteristicile unui proces imunopatologic, cu infiltrarea celulelor mononucleare perivenulare și absența oricărei evidențe histopatologice clare ale unei infecții. Rețeaua metaloproteinazelor reprezintă factorul important implicat în răspunsul inflamatoriu. întrucât extractul lichid de cartilagiu este un inhibitor puternic al rețelei de metaloproteinază, el ar putea fi utilizabil în tratamentul sclerozei multiple.

Fibroza

Conceptele curente sugerează faptul că fibroza este asemănătoare vindecării rănii normale, dar scapă din vedere de a adăuga că ea conduce la înlocuirea țesutului normal cu cicatrice. Cele mai multe reacții fibrotice apar în secundar la traume, infecții, inflamații sau, din motive necunoscute, pot avea o componentă genetică. în general, TGF - beta este supraprodus și induce proliferarea celulelor fibroblastice și o supraproducție de colagen. întrucât o depunere excesivă de colagen este caracteristică fibrozei, noi sugerăm faptul că extractul lichid de cartilagiu care poate întârzia formarea țesutului de granulație, ar putea conduce pe termen lung la avantaje în suprimarea reacțiilor fibrotice.

Maladii inflamatorii ale intestinului

Etiologia maladiei intestinului inflamat este necunoscută, dar imunitatea intestinală anormală este implicată în patogeneza maladică Crohn și a colitei ulcerative. Celulele mononucleare mucozale manifestă producerea de anticorpi modificați, proliferarea lor, citotoxicitatea și sinteza citokinelor (FGF, PDGF, EGF, TNF). Extractul lichid de cartilagiu a dovedit o activitate antiinflamatoare și deci administrarea orală se poate dovedi a fi folositoare în tratamentul terapeutic al maladiei de inflamare a intestinului.

Boli de inimă

Disfuncția endotelială a vaselor rezistenței coronariene se poate număra printre anomaliile microvasculaturii coronariene și posibil ischemie miocardică și dureri în piept. La nivel celular, disfuncția endotelială este asociată cu expresia redusă a oxidului nitric (NO), un factor de relaxare derivat din endoteliu. Sinteza oxidului nitric permite sistemului vascular să mențină o stare de vasodilatație, reglând în acest fel presiunea arterială. Un deficit în sinteza endogenă a oxidului nitric contribuie la asemenea condiții, cum este hipertensiunea arterială, hipertensiunea pulmonară și maladia de inimă. Noi posedăm rezultate preliminare de la celule endoteliale cultivate că extractul lichid de cartilagiu conduce la creșterea producției de oxid nitric. Extractul lichid de cartilagiu s-ar putea prin urmare dovedi, prin oxidul nitric, a fi folositor în unele condiții ale bolii de inimă, precum și la pacienți pediatrici cu maladii de inimă congenitale complicate de hipertensiunea arterială pulmonară.

Mai mult decât atât, extractul lichid de cartilagiu poate ajuta la reducerea complicațiilor asociate cu inflamații în ateroscleroză.

Scleroderma

Scleroderma (Hard skin - piele dură) este o maladie neobișnuită caracterizată prin creșterea țesutului conectiv fibrotic al pielii și adesea și al organelor viscerale. Ea apare adesea ca o hiperkeratinizare a unor pete localizate pe piele. Hiperkeratinizarea este un proces celular în care keratinocitele pielii se diferențiază total și acumulează fibre de keratină rigidă.

Această condiție a pielii ar putea conduce la o mobilitate limitată a articulației dacă este

1675

1680

1685

1690

1695

1700

1705

1710

1715

1720

RO 118567 Β1 afectată pielea în zona periarticulară. Atunci când este adăugată la un sistem experimental în care este încurajată diferențierea keratinocitei, extractul lichid de cartilagiu previne diferențierea, sau procesul de heratinizare. Prin urmare, extractul lichid de cartilagiu ar putea fi benefic pentru asemenea condiții ale pielii prin prevenirea asupra acumulării keratinocitelor complet diferențiate.

Aplicații veterinare

Extractele solide și/sau lichide de cartilagiu ar putea fi administrate la animale pentru unele aplicații terapeutice și cosmetice care au fost descrise mai înainte pentru oameni.

APLICAȚII Șl COMPOZIȚII COSMETICE

Testele și încercările de mai sus arată că extractul de cartilagiu din prezenta invenție poate găsi numeroase aplicații medicale. Printre diversele activități recuperate din acest extract, efectul antiangiogenic, anticolagenolitic, antiinflamator și inhibitor asupra diferențierii induse de PKO sunt în mod deosebit dezirabile în aplicații cosmetice. întrucât extractul de cartilagiu din prezenta invenție a dovedit un efect antagonist al cazurilor celulare mediate de PKC, și întrucât un asemenea efect antagonist este sugerat în practica curentă ca fiind unul care îmbunătățește funcțiunea de barieră a pielii, o metodă de îmbunătățire a funcției de barieră în pielea mamiferelor care să cuprindă o fază de aplicare pe piele a unei compoziții ce conține extract de cartilagiu și un agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Alte compoziții similare pot fi de asemenea imaginate a fi utilizate într-o metodă de calmare a pielii sau pentru reducerea inflamațiilor din pielea mamiferelor. Inflamațiile pot fi provocate de diferiți agenți, cum este un iritant de natură chimică, abraziune fizică și expunere la radiații ultraviolete. Compoziții și metode pentru inhibarea colagenazei în piele sunt de asemenea menționate. Colagenaza și inflamația sunt legate de o îmbătrânire prematură (degradarea colagenului), și prin urmare activitățile de antagonist recuperate din extractul de cartilagiu ar putea, de asemenea, contribui în compozițiile și metodele privind întârzierea îmbătrânirii premature, și pentru reglarea zbârciturilor sau atrofiei în pielea mamiferelor. Asemenea cazuri de zbârcituri sau atrofie se pot datora, cu titlu de exemplu, vârstei, expunerii la radiații ultraviolete sau expunere la poluanții din mediul înconjurător. Compozițiile topice pot cuprinde o cantitate eficientă de extract de cartilagiu de rechin pentru a fi utilizate pentru fiecare aplicație specifică. în general, aceste compoziții pot conține de la aproximativ 0,1 până la aproximativ 75% în greutate de extract lichid de cartilagiu și de la aproximativ 25 până la 99,9% în greutate un agent purtător (vehicul) acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Aceste compoziții pot conține un antioxidant, cum ar fi un agent care previne formarea peroxizilor de lipide în piele. Exemple de asemenea agenți antioxidanți sunt tocoferol, derivați ai tocoferolului, acid ascorbic, derivați ai acidului ascorbic și BHT. Compozițiile pot fi complementate cu agenți antiinflamatori, cum este inhibitorul fosfolipazei A 2 sau extractul de origine botanică cola antio-iritant sau ceaiul verde. Compozițiile topice pot lua diferite forme, cum ar fi soluții, suspensii, loțiuni, tincturi, geluri, creme, spray-uri, emulsii, cleiuri, unguente sau lipozoame (cel puțin o porțiune de extract de cartilagiu lichid fiind prezentă în lipozom). Alte aplicații cosmetice includ cearcănele întunecate din jurul ochilor și funcțiunea de barieră a pielii.

CONCLUZII

Procedeul din prezenta invenție a fost demonstrat ca fiind unul care asigură producerea extractelor de cartilagiu de o mare însemnătate clinică. Extractele de cartilagiu de rechin produse prin acest procedeu nou cuprind o multitudine de activități care sunt recuperate cu randamente bune. Extractele de cartilagiu, în mod deosebit, extractul lichid de cartilagiu și fracțiunile acestuia posedă un important potențial, întrucât ele nu sunt toxice față de celulele normale, în timp ce ele sunt eficiente într-un număr mare și variat de maladii sau condiții.

RO 118567 Β1

1770

Pentru toate aplicațiile prezumate (de la picături oftalmice până la formulări dermatologice și medicamente pentru cancer), se estimează că, concentrația minimală a proteinei finale din extractul lichid total ar fi foarte scăzută (de la aproximativ 0,01 mg/μΙ). Acest domeniu scăzut al dozelor depinde de accesibilitatea și de permeativitatea ingredienților activi către locul de acționare ca și de capturarea eficientă a acestor ingredienți și de sensibilitatea sau răspunsul țesutului la inhibitorii angiogenici. O limită mai ridicată a concentrației proteinei finale, în formulări pentru unele aplicații, nu este în mod curent cunoscută. Concentrațiile finale cele mai ridicate, testate, au fost în administrări topice de aproximativ 9 mg/ml de proteine în formulările pentru cazuri de psoriazis și în administrările orale de aproximativ 12 mg/ml în doză unică zilnică de 7 ml administrată în cazurile de cancer și de 21 ml în testele privind artrita.

MATERIALUL NECESAR:

- Refrigerenți;

- Instrumente chirurgicale;

- Mașini de tocat carne;

- Saci din masă plastică;

- Amestecător industrial (amestecător cu 3 viteze Waring, cumpărat de la Fisher Scientific);

- Sistem de purificare a apei (osmoză inversă și 0,1 Em filtrare; Continental Water System, model PRE 2202, seria număr 91089. Modulab Bioscience RQ/Polishing System, cumpărat de la Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Acest sistem asigură o apă irogenică de înaltă calitate;

- O balanță de precizie Mettler, seria AE, cumpărată de la Fisher Scientific;

- Centrifugă Sorvall RC - 285, achiziționată de la Du Pont Canada;

- Centrifugă tip m CEPA;

- Filtru-buzunar de nylon având o porozitate de 1 pm;

- Autoclavă (sterilizator automat cu vapori Sanyo, model MAC 350 P);

- Containere Nalgene sterilizate la temperatura de 132°C timp de 10 min și apoi uscate timp de 35 de min, de capacitate 500 ml;

- Filtre conice cu porozitate de 24 pm de tipul Whatman Reeve Angel;

- Coloană de ultrafiltrare (greutate moleculară de tăiere 9 500 kDa și 1 kDa atunci când este aplicabil; suprafață: 25 picioare pătrate; debit: 130 l/min; presiune de intrare 9 30 psi; presiune de ieșire: 5 psi, achiziționat de la Koch Membrane Systems Inc., Wilmington, MA, Statele Unite);

- Pompă centrifugală de tip sanitar (Monarch Industries, model ACE - S100 - Tip A) pentru asigurarea unui debit de 130 l/min;

- Nișă sterilă (curgere laminară de tip NuAire, achiziționată de la Ingram & Beli;

- Filtre sterile Millipack - 60 cu porozitate de 0,22 pm;

- Containere de sticlă, clare (transparente) sau de culoarea chihlimbarului, sterile;

- Concentrator de tipul DC -10 Amicon;

- Rotofor Biorad 170 - 2950;

- Filtre Amicon STOY 10 și STOY 100 cu valori de tăiere de 10, 30 și 100 kDa;

- Cromatograf tip FPLC Pharmacia 216007 (computer tip Pharmacia 216014);

- Hilstand S - 300 26 mm/60 cm (Pharmacia);

- Superose S -12 10 mm/30 cm (Pharmacia);

- Aparat de liofilizare de tipul Labconco 10273 A.

Această invenție a fost descrisă mai sus, dar ar trebui apreciat că, în conformitate cu abilitatea și cunoștințele persoanelor specializate în acest domeniu și având o experiență practică îndelungată, fără a se îndepărta de obiectul acestei invenții, se pot aduce modificări

1775

1780

1785

1790

1795

1800

1805

1810

1815

RO 118567 Β1 prin înlocuirea unor elemente ale acestei invenții, așa cum se practică cu echivalenți ai acestora, care să conducă la același obiectiv. Aceste variațiuni se consideră prin urmare că ar cădea sub incidența prezentei cereri de brevet.

Claims (7)

Revendicări

1. Procedeu de obținere a unui extract de cartilagiu de rechin, care constă din:

a) omogenizarea cartilagiului de rechin într-o soluție apoasă până la reducerea lui la particule a căror dimensiune este mai mică decât sau egală cu 500 μ;

b) extragerea, în soluție apoasă, rezultând un amestec de particule și un extract lichid brut;

c) separarea particulelor din extractul lichid brut;

d) îndepărtarea moleculelor de cartilagiu de rechin cu greutate moleculară mai mare de 500 Kda, astfel încât să se obțină un extract lichid final cu molecule de cartilagiu de rechin cu greutate moleculară mai mică sau egală cu 500 Kda, caracterizat prin aceea că extractul lichid final se filtrează pe o membrană cu valoarea de fragmentare a greutății moleculare de 100 Da, astfel încât moleculele, având greutate mai mică decât valoarea de fragmentare, sunt îndepărtate, sau extractul final se liofilizează în prezența stabilizatorilor sau a agenților crioprotectivi.

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că fazele de la a) la d) sunt efectuate la o temperatură cuprinsă între 0 și 10°C.

3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că soluția apoasă are un pH cuprins între 6 și 8.

4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că faza b) este efectuată într-un interval de timp cuprins între 15 min și 24 h.

5. Procedeu conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că faza b) este efectuată într-un interval de timp cuprins între 15 min și 1 h.

6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cartilagiul de rechin și soluția apoasă sunt în proporție de 1 kg pentru cel puțin 1 I.

7. Procedeu de obținere a unui extract de cartilagiu de rechin, care constă din:

a) omogenizarea cartilagiului de rechin într-o soluție apoasă până la reducerea lui la particule a căror dimensiune este mai mică decât sau egală cu 500 μ;

b) extragerea, în soluție apoasă, rezultând un amestec de particule și un extract lichid brut;

c) separarea particulelor din extractul lichid brut;

d) separarea, în continuare, a extractului lichid brut astfel încât să se obțină un extract lichid cu molecule de cartilagiu de rechin cu greutate moleculară mai mică sau egală cu 500 Kda, conform revendicării 1, caracterizat prin aceeea că extractul lichid final se filtrează pe o membrană cu valoarea de fragmentare a greutății moleculare de 10 Kda, se recuperează fracțiunea care cuprinde molecule cu greutate moleculară cuprinsă între 10 și 500 Kda, se fracționează fracțiunea pe o coloană cromatografică schimbătoare de anioni și se recuperează fracțiunea care se eluează cu NaCI 0,8 la 1 N.