BG63907B1

BG63907B1 - Екстракти от хрущял на акула

Info

Publication number: BG63907B1
Application number: BG102419A
Authority: BG
Inventors: Eric Dupont; Paul Brazeau; Christina Juneau; Daniel MEAS; Kenneth Marenus
Original assignee: Les Laboratoires Aeterna Inc.
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 2003-06-30
Also published as: ES2190475T3; CZ129398A3; IS4728A; DK0859622T3; RU2181292C2; PL187989B1; CA2236021A1; IL119030A; US6025334A; NZ313957A; BG102419A; EP0859622B1; NO981781D0; CO4750839A1; DE69625698T2; KR100296016B1; HK1015683A1; HUP9802604A2; HU225490B1; JP2003246740A

Abstract

Екстрактите имат антиколагенолитична активност и са приложими при лечение на туморна пролиферация, ангиогенезис, възпаление и колагенолиза, а също така и в козметиката за подобряване на предпазващатафункция на кожата. Изобретението се отнася и до метод за тяхното получаване, включващ етапи на получаване на хомогенат от хрущял във воден разтвор. Хомогенатът е отделен в твърда фракция (твърд екстракт) и течна фракция, която по-нататък се подлага на допълнително фракциониране за получаване на течен екстракт с молекули с молекулно тегло от 0 до 500 кDa. По-нататъшното фракциониране на течния екстракт води до характеризиране на някои от неговите активни компоненти.

Description

(54) ЕКСТРАКТИ ОТ ХРУЩЯЛ НА АКУЛА

Област на приложение

Изобретението се отнася до екстракти от хрущял на акула, които проявяват антиколагенолитична, противовъзпалителна, антиашиогенна и антитуморна активност, до метод за получаване, методи за приложение и състави.

Предшестващо състояние на техниката

Хрущялът е аваскуларна тъкан, която е изследвана като потенциален кандидат, съдържащ антиангиогенни фактори. Тъканта е относително устойчива на туморно развитие. Туморът, асоцииран с хрущяла, хондросаркома, е единственият васкуларизиран от твърдите тумори. Ангиогенезата е един от важните фактори в туморното развитие. Дискретни твърди туморни маси се появяват, ако туморните клетки могат да провокират съседната васкуларна тъкан да се разшири за удовлетворяване на хранителните им нужди. Поради това факторите, включени в стимулирането на ангиогенезата, са изследвани за ролята им в развитието на тумор и антиангиогенни фактори. Изследвани са и лекарствата с ангиогенна инхибиторна активност като средства за контролиране развитието или ефективната регресия на туморите.

Установено е, че телешкият скапуларен хрущял съдържа вещество, което инхибира васкуларизацията на твърди тумори (Langer et al., 1976). Поради окуражителните му качества като антитуморен агент, се търсят източници за по-голямо снабдяване с хрущял.

Акулите като бозайници са потенциален източник на този вид инхибитор на ангиогенезата, тъй като техният ендоскелет е съставен изцяло от хрущял (6% от тяхното телесно тегло спрямо 0,6% от това на телетата). Освен това интересна особеност е, че акулите имат ниска способност за развиване на тумори. Създадени са много хипотези за обяснение на тази ниска възможност за развиване на тумори в акулите. Marchalonis et al. (1990) са показали IgM антитела, способни да атакуват всеки агресивен агент. McKinney et al. (1990) показват, че акулите имат макрофаги, способни да диференцират нормалните клетки от неопластичните клетки и да ги разрушават. Rosen and Woodhead (1980) са определили, че по-рядката поява на тумори в организми от разред Elasmobranchiata (трупа, към която принадлежат акули и скатове) може да се дължи на високата йонна сила на техните тъкани, което е еквивалентно на високата телесна температура. При такова състояние тези автори считат, че имунната система се напряга до близо 100%. Moore et al. (1993) установяват, че акулите продуцират имуностерол с антибактериални и антипротозойни свойства. Lee and Langer (1983) and Folkman and Klagsbrun (1987) показват, че акулите продуцират вещество, което инхибира неоваскуларизация. Lee and Langer (цитирани по-горе) са изолирали това вещество чрез екстрахирането му от акулов хрущял в денатуриращи условия (гуанидинова екстракция) . Този метод на екстракция обаче е много продължителен (41 дни), може да генерира екстракти с денатуриращи фактори и добивът на активното вещество е далече от много добър. Докато активното вещество, изолирано от телета, е с молекулно тегло около 16 kd, същата група изследователи не дава точното молекулно тегло на извлеченото от акула. Това вещество е определено само като имащо молекулно тегло, по-високо от 3500 Da. Oikawa et al. (1990) прилагат същия метод на екстракция, както описания от Lee and Langer, но за много по-малка продължителност (2 дни, вместо 41 дена). Антиангиогенното вещество, изолирано от акулов хрущял от Oikawa et al., се ограничава до молекула с молекулно тегло от 1000 до 10 000 Da. Schinitsky (USP 4 473 551) описва воден екстракт на суров разпратен акулов хрущял с фракция, по-галяма от 100 000 Da, имаща противовъзпалителна активност самостоятелно или в комбинация с глюкозамин. Няма предположение за компонент на този екстракт с антиангиогенна или антитуморна активност. Kuetner et al. (USP 4 746 729) е изолирал полиморфонуклеарен неутрофилен (PMN) еластазен инхибитор от говежди хрущял. Този инхибитор е получен от воден екстракт на хрущял, от които са получени молекули с молекулно тегло, по-малко от 50 000 Da. Фракциониране върху Sephacryl S-200 дава множество фракции, от които тези с 10-40 kDa се събират, след като са показали антиеластазна активност. Активният компонент има изоелектрична точка от 9,5 и може да има молекулно тегло от около 15 000 Da. Kuetner et al. (USP 4 042 457) са показали, че говеждият хрущял има компонент с молекулно тегло поне 50 000 Da, който има клетъчна пролиферационна инхибиторна активност без каквато и да е активност за развитието на ендотелните клетки. Balassa et al. (USP 4 822 607) са получили хрущялен екстракт във воден разт вор, който има противотуморна активност. Но не се наблюдава никаква антиангиогенна активност в екстракт, получен чрез възпроизвеждане метода на Balassa. Spilburg et al. (USP 4 243 582) са изолирали два гликопротеина с молекулно тегло 65 kDa и pl 3,8 от говежди хрущял (гуанидинова екстракция), които показват антитрипсинова активност и активност за инхибиране растежа на ендотелните клетки.

Телешкият и акуловият хрущял имат много биологични активности като провъзпалителна активност, противовъзпалителна активност, антиангиогенна активност, лизозимна активност, стимулираща клетъчния растеж активност, инхибиторна активност срещу колагеназа, типове I и IV, еластаза и други протеази като трипсин, химотрипсин и плазмин. Обаче, никой още не е получил хрущялен екстракт, който има набор от клинично ценни активности.

Антианпюгенните компоненти на акуловия хрущял са тестувани предимно в заешка корнеална проба или в проба на пилешка хориоалантоисна (САМ) мембрана. Към настоящия момент пълен разпратен хрущял е тестуван директно върху тумори in vivo, върху човешки меланомни ксенотрансплантанти, имплантирани в голи мишки (USP 5 075 112), а така също и в САМ тестове за техния антиангиогенен ефект. Макар на хрущялния екстракт да се приписва противотуморен ефект, този ефект по-често се приписва на антиангиогенния компонент, който лишава тумора от крьвоснабдяване. Към настоящия момент няма доказателство, че акуловият хрущял има пряко въздействие върху туморната клетъчна пролиферация.

Вече са известни някои методи за получаване на екстракти от акулови хрущяли и техни фракции. По някои от тях се получава разпратен суров хрущял без каквато и да е екстракция (USP 5 075 112). Други използват денатуриращи средства като 1уанидин (USP 4 243 582). Трети представят предварителна обработка на хрущял чрез ензимно разграждане за освобождаване от каквито и да са мускулни, нервни или васкуларни структури, заобикалящи хрущяла, чийто етап на предварителна обработка е последван от елиминиране на мазнини в органични разтворители, и след това активните компоненти се екстрахират във водна фаза. (Balassa et al. USPs 3 478 146,4 350 682, 4 656 137 и 4 822 607). Ефектът от подобна предварителна обработка за съхраняване интегритета на биологично активните хрущялни компоненти не е известен. Ако е твърде интензивно, ензимното разграждане може да хидролизира активни протеинови компоненти. Например, по метода на Balassa (USP 4 822 607), се продуцира течен екстракт без антиангиогенна активност; тази загуба може да бъде резултат от подобно ензимно разграждане. Методът на Balassa не включва етап на фракциониране, който по-нататък води до екстракт с активни компоненти. Друга просто продуцират водни екстракти (във вода (USP 4 473 551) или разтвори на соли (USP 4 746 729)) на хрущял чрез отстраняване на неразтворения материал. Сред последните са получени специфични фракции със специфични молекулни тегла за понататъшно изследване и пречистване (виж описаното по-горе).

Посочените методи имат някои недостатъци. Например, те може да са твърде продължителни за определени цели. Нещо повече, продължителните методи незадължително водят до задоволителни количества от активните компоненти и сред възстановените компоненти, някои не се възстановяват изобщо или в недостатъчен добив, за да покажат значима активност или някои са отстранени чрез фокусиране вниманието върху получаване на специфични активности.

Ангиогенезата се свързва не само с развитието на рака. Много заболявалия или състояния, повлияващи върху различни физиологични системи, са ангиогеннозависими, сред които следните: артрит и атеросклеротични плаки (кости и лигаменти), диабетна ретинопатия, невроваскуларна глаукома, макуларна дегенерация, очни херпеси, трахома и корнеална трансплантантна невроваскуларизация (очите), псориазис, склеродерма, розацеа, хемангиома и хипертрофично вроговяване (на кожата), васкуларни адхезии, васкуларни адхезии и ангиофиброма (кръвнасистема). Поради това, всеки нов и потенциален антиангиогенен “фактор” може да бъде установен и използван при лечение на тези заболявания, както и при лечението на рак и други ангиогеннозависими заболявания. Нещо повече, доколкото много от посочените по-горе заболявания и състояния също имат възпалителна компонента, всеки нов и противовъзпалителен “фактор” би могъл да намери приложение за лечение на тези заболявания и състояния, както и всяко друго заразно заболяване или състояние. Нещо повече, доколкото протеази като колагенази са включени в разнообразието от заболявания и състояния като рак и преждевременно състаряване, поради тяхната колагенолитична актив ност, нов и потенциален антиколагенолитичен “фактор” може да намери приложение при лечението на заболявания и състояния, имащи колагенолитична компонента. Поради ангиогенезата, възпаление и протеолиза могат да бъдат отчетени самостоятелно или в комбинация с голямо разнообразие от заболявания или състояния, и затова продукт, способен да действа антагонистично на всички тези активности, без да повлиява на нормалните телесни функции, би бил с огромна терапевтична стойност.

Техническа същност на изобретението

Съгласно изобретението е създаден метод за получаване на хрущялни екстракти, които имат предимството да съдържат множество терапевтично ценни активности. Потвърдено е, че сред тях в акуловия хрущялен екстракт има в достатъчни концентрации антиангиогенни, противовъзпалителни, антиколагенолитични, in vivo антитумор пралифериращи и директни in vitro пролифериращи активности. Други активности очакват идентифициране или потвърждение. Всички активности са получени в течен екстракт на акулов хрущял, а някои от тях са получени или потвърдени в твърд екстракт от него.

Настоящото изобретение се отнася до нов метод за получаване на течен екстракт от хрущял, имащ съществена част от биологично активните водноразтворими компоненти, намиращи се в интактен хрущял, който включва следните етапи:

a) хомогенизиране на хрущяла във воден разтвор в състояния, конкурентни със съхраняването на интегритета на посочените биологично активни компоненти, докато хрущялът се редуцира до частички, чийто размер е по-нисък от или равен на около 500 pm, което води до получаване на смес от частици и суров течен екстракт, имащ посочените биологично активни компоненти;

b) центрофугиране на посочения хомогенат за разделяне на частички от суровия течен екстракт; и

c) по-нататъшно разделяне на суровия течен екстракт, така че да се получи краен течен екстракт, съдържащ хрущялни молекули с молекулно тегло по-ниско от или приблизително равно на 500 kDa.

Този нов метод има предимството, че е лесен за осъществяване и е ефективен. Получен е висок добив от хрущялен екстракт, който (когато е от акула) съдържа поне всички посочени по-го ре биологични активности. За предпочитане той се провежда при ниска температура (около 0 до 20°С), в неденатуриращи условия (за предпочитане в чиста вода), при приблизително неутрално pH (около 5 до 8) за максимализиране вероятността за извличане на веществата с неизвестни физико-химични характеристики. Съгласно този метод хрущялните компоненти могат да бъдат екстрахирани в малък обем от разтвора (например малък обем, възлизащ на 11 за 1 kg от хрущяла), и след кратък период на хомогенизация (приблизително 10 до 20 min). За извличане на твърд екстракт се използва същият метод, с изключение на това, че утайката се извлича и лиофилизира след отстраняване на супернатантата.

Изобретението се отнася до хрущялни екстракти, по-специално екстракти от видовете на елазмобранхиата, по-специално от акула. Твърдият екстракт показва активност. Той може да съдържа колаген и неразтворими компоненти. Той може също да съдържа остатъчна активност от това, което е екстрахирано в тоталния течен екстракт. Тоталният течен екстракт е много богат на активност. Той може да бъде използван като такъв или може да бъде концентриран. Етапът на концентриране, който обслужва съхраняването на биологичните активности, е предпочитан. Методи, които биха влошили качествата на активните компоненти като изпаряване нагорещо, внимателно се избягват. Ултрафилтрация върху мембрана с пропускателна способност за молекули с молекулно тегло приблизително 1 kDa се използва за концентриране на течния екстракт съгласно изобретението. Нанофилтрация върху мембрана със стойности на молекулното тегло около 100 Da е дори по-добра за концентриране на биологичните активности на течния екстракт (антиантиангиогенен, антиколагенолитичен). Като резултат се изпитва концентриран екстракт, съдържащ молекули с молекулно тегло приблизително от 0,1 и 500 kDa.

Течният екстракт (0 до 500 kDa) се фракционира по-нататък за охарактеризиране на неговите активни компоненти. Получени са различни активни фракции по различни методи. Някои от тях, тестувани за тяхната антитуморна активност върху туморни клетъчни линии, се характеризират с тяхното молекулно тегло и изоелектрична точка. Други определят дадена активност, по-специално антиколагенолитична или антиангиогенна. Тези фракции очакват пълното си охарактеризиране и идентифициране. Поради това, ценни активности се извличат в тотален течен екстракт и негови фракции, които могат да бъдат използвани с предимство. Вместо въвеждането на големи количества разпратен хрущял, понастоящем може да се въведе по-подходящ и обогатен екстракт.

Изобретението също се отнася до всеки терапевтичен или козметичен състав, включващ като активна компонента ефективно количество от един от описаните по-горе хрущялни екстракти. По-голямо внимание се отделя на форми за приложение в дерматологията и козметиката. Този интерес идва от наблюдаваните активности на хрущялните екстракти. В този аспект наблюдаваните антиангиогенни, антиколагенолитични и противовъзпалителни активности и антагонистичният ефект на клетъчната диференциация, медиирана от сигналните обмени, като протеин киназа С в кератиноцити, се считат като перспективни възможности за приложение на акулови хрущялни екстракти в състави и методи за редуцирането на възпаления или дразнене, регулирането появата на бръчки или кожна атрофия, забавяне на преждевременното сьстаряване, редуцирането на ахне, подобряването на кожната бариерна функция, редуцирането на тъмните кръгове около очите, редуцирането на паяжиноподобните вени и варикози, регресия на брадавици и кожно успокояващ ефект. Такива методи са в обхвата на настоящото изобретение. Нещо повече, доколкото течният екстракт от акулов хрущял е успешно тестуван за случаи на рак, артрит, псориазис и акне, състави и методи за лечение на заболявания или състояния с един или повече компоненти, подбрани от групата, състояща се от туморна пролиферация, ангиогенеза, възпаление и колагенолиза, са в обхвата на настоящото изобретение.

Описание на фигурите

Изобретението се пояснява чрез специфичните варианти на изпълнение, които не го ограничават, показани на приложените фигури, от които:

фигура 1 показва специфичния аминокиселинен състав на течния екстракт;

фигура 2 показва инхибиторната активност на акулов хрущял (твърд екстракт) в отговор на определена доза върху ZR75-1 и MCF-7 клетъчни линии;

фигура 3 показва кривата на доза - отговор на количество от MCF-7 клетки в присъствието на повишаващи се концентрации естрадиол със или без две концентрации от твърд хрущялен екстракт, фигура 4 а) и Ь) показва сравнение на сектори от туморна млечна жлеза на плъхове, които са третирани чрез даване на вода (А) или комбинация от твърд и течен хрущялен екстракт (В);

фигура 5 е хистограма, която показва, че третирани с хрущял плъхове имат 50% редуциране на областта на васкуларизация на техните тумори;

фигура 6 показва, че течният екстракт няма въздействие върху пролиферацията на фибробластни клетки;

фигура 7 показва кривата на доза - отговор за инхибиране на течен хрущялен екстракт върху HUVECs пролиферацията;

фигура 8 показва, че течен хрущялен екстракт инхибира ТРА-индуцираната кератиноцитна диференциация;

фигура 9 показва кривата на доза - отговор за инхибиране на течния хрущялен екстракт върху колагеназната активност;

фигура 10 показва кривата на доза - отговор за инхибиране на течен хрущялен екстракт в теста за ембрионална васкуларизация (ex ovo);

фигура 11 показва влиянието на различни дози от течен хрущялен екстракт върху инхибиране на туморното развитие у мишки;

фигура 12 показва, че интраперитонеалното въвеждане на течния хрущялен екстракт може да повиши значително ефективността на продукта за инхибиране на туморното развитие;

фигура 13 представя електрофоретичния профил в неденатуриращи условия в течни фракции, разделени на Rotofor, маркерите на молекулното тегло се виждат отляво, последвано от проба на течен екстракт преди фракционирането, в сравнение с изолираните фракции;

фигура 147 показва образци на HPLC миграция върху фракция от тоталния течен екстракт съгласно изобретението, имаща молекулно тегло, по-ниско от 10 000 Da, която фракция е била концентрирана и разделена на пет субфракции;

фигура 15 показва EVT резултатите, получени с две фракции на течен екстракт от акулов хрущял съгласно изобретението (DUP), едната с молекулно тегло, пО-ниско от 10 000 Da, другата имаща молекули, по-галеми от 10 000 Da;

фигура 16 показва образци на FPLC миграция на три различни екстракта от акулов хрущял. В сектор A, DUP се отнася за течен хрущялен екстракт съгласно изобретението. В сектор В и С,

BAL и OIK се отнасят за екстракти от нивото на техниката, Balassa et al., and Oikawa et al., съответно;

фигура 17 показва образци на HPLC миграция на екстрактите от фиг. 17;

фигура 18 показва CZE сравнение на течния екстракт от изобретението с нивото на техниката, A-DUP; B-BAL; C-OIK;

фигура 19 показва EVT сравнение на течния екстракт от изобретението с нивото на техниката;

фигура 20 показва сравнение на аминокиселинното съдържимо съгласно изобретението с нивото на техниката;

фигура 21 показва значителното подобрение състоянието на двама пациенти, страдащи от псориазис, един с хиперкератоза 22 а) и в), а другия - без хиперкератоза 22 с) и d), при локално приложение на състав, съдържащ ефективно количество от концентриран течен хрущялен екстракт (снимките по-долу), сравнени с техните изходни състояния (снимкитепо-горе);

фигура 22 показва подобрението на появилата се мрежичка от кръвоносни съдове на лицето на хора, третирани с течен хрущялен екстракт;

фигура 23 показва подобрение в появилите се тъмни кръгове около очите на хора, третирани с течен хрущялен екстракт;

фигура 24 показва подобрение в появилите се варикозни вени на краката на хора, третирани с течен екстракт;

фигура 25 показва значително подобрение в състоянието на пациенти, страдащи от ахне, при локално третиране със състав, съдържащ ефективно количество течен хрущялен екстракт (снимките по-долу), сравнени с тяхното изходно състояние (снимките по-горе);

фигура 26 показва противовъзпалителния потенциал на течен хрущялен екстракт върху човешка кожа;

фигура 27 показва подобрението на кожната бариерна функция на хора, третирани с течен хрущялен екстракт.

Примери за изпълнение

В един вариант на изпълнение съгласно изобретението хрущялът е получен от здрави кучешки акули - черна и бяла, от видовете Black Spiny Dog Fish и Common Spiny Dog Fish. Отстранена e мускулната и съединителна тъкан с предварително обработени с етанол скалпели и ножички. Хру щялът след това се пакетира под вакуум в пластмасови торбички и се замразява до -20°С за понататъшна употреба. В настоящия вариант на метода може да се използва всеки източник на хрущял. Избран е акулов хрущял, както е посочено по-горе. Счита се, че изхождайки от хрущял на Elasmobranchiata (който включва акули и скатове като животински видове от тази група), биха се получили приблизително еквивалентни продукти. Продуктите ще са най-вероятно различни както по природа, така и по концентрация от активните субстанции, ако се използва животински източник.

Могат да се използват различни варианти на получаване на хрущял преди екстрахирането му, доколкото не въздействат по същество на активността на желания продукт (тотален течен екстракт или определени техни фракции, например) . Някои активни компоненти могат да устоят на протеолитично разграждане според Balassa et al. (USP 4 822 607), за да освободят хрущяла от каквато и да е заобикаляща го тъкан, докато други могат да не устоят на подобно третиране. Една от активностите, която не е устойчива на подобно предварително третиране, е антиангиогенната активност (фиг. 19). Поради това, ако се желае продуцирането на течен екстракт, съдържащ колкото се може повече от водноразтворимите активни вещества, към които са определени отделни активности, подобен етап на разграждане по време на процедурата на екстрахиране следва да бъде заобиколен или внимателно наблюдаван, за да се предотвратят хидролизата или протеолизата.

Изготвяне на хрущялни екстракти

Чист хрущял се използва пресен, размразен до 4°С или замразен. След това хрущялът се пасира многократно (по-специално три пъти) през порите на обработена с етанол месомелачка заедно със съответен обем вода (равно количество (тегло/вода) е около минималния обем, но може да бъде повишен без какъвто и да е страничен ефект върху добива на извлечени ценни компоненти). Нисък обем се предпочита, тъй като е по-удобно да се обработва, в сравнение с ненужно големи обеми - от практическа гледна точка. В практиката водата се пречиства чрез обратна осмоза и многократна филтрация през 0,1 рш филтър. Много водни разтвори (съдържащи соли, например) могат да бъдат използвани вместо вода. Когато възстановяването на множеството водноразтворими активности завърши, се предпочита да се работи при приблизително неутрално pH (5,0 до

8,0) и неденатурационни условия се предпочитат, за да се избегне лизисът или денатурацията на някои от активните компоненти на хрущяла. Поведението на неизвестни протеини във водни разтворители не може да се предскаже; някои могат да са повече “удобни” в кисело pH, някои - при алкално. Нещо повече, някои протеини е възможно да бъдат екстрахирани при меки денатурационни условия, ако подобна денатурация не влияе обратимо на ренатурацията на тези протеини във водни разтвори. Заради чистотата всяко условие за екстрахиране, което е конкурентно със съхраняване биологично активните хрущялни компоненти, е в обхвата на настоящото изобретение. Поради това, като се имат предвид всички тези фактори, осъществявайки метод за екстрахиране на хрущялни активни компоненти в чиста вода, се оказва разумен избор за възстановяване с много добър добив на компоненти с все още неопределена структура и поведение.

Сместа хрущял/вода след това се хомогенизира чрез разбъркване при максимална скорост в кухненски миксер при около 4°С в продължение на 20 min. По време на хомогенизирането, температурата на хомогената се повишава приблизително до 20°С. Разбира се скоростта на разбъркване, както и обемът на водния разтвор, може да повлияе както на времето, така и на добива от екстракцията. Поради това, разумният интервал от време за хомогенизация (определено като по-малко от 500 gm частици) може да бъде приблизително от 10 min до 24 h, за предпочитане приблизително от 10 до около 60 min. Температурата следва да се поддържа под около 10°С, за да се избегне разграждането на активните компоненти от ендогенни ензими, когато не се използват ензимни инхибитори. Следва да се търси температура, близка до 0°С. Доколкото обикновено подобно експериментиране следва да се поддържа между 4 и 10°С, този интервал от температура е разумно приемлива за настоящия метод. За яснота и краткост, изразът “около 4°С” се използва за обозначаване приемливия интервал от температури.

Разреждане на този хомогенат по-нататък може да се постигне чрез поставянето му в Polytron дезинтегратор в продължение на 10 min при около 4*С, ако миксерът не е редуцирал достатъчно размера на частичките. Обратно, сместа може да бъде хомогенизирана в по-удачен смесител-дезинтегратор, който, от друга страна, спестява 10 min от етапа на разреждане. В края на етапа на хомогенизиране остатъчният размер на частичките е не по-малък приблизително от около 500 pm. Разбира се, прилагат се същите приемливи интервали от време и температура, обсъждани за получаване на първия раздробен хрущял. Размерът на частиците след хомогенизиране не бива да е много малък. Поради това, необходимостта от разпрашаване на хрущяла преди екстракцията може да бъде избегната. Наистина разпрашаването на хрущяла до прах преди водната екстракция може в противоположност на това да денатурира ценни активности, по-специално когато подобно пулверизиране се осъществява чрез замразяване в сухо състояние и/или чрез нагряване в сухо състояние.

Хомогенатът се центрофугира при 13600 х g в продължение на 15 min при около 4°С, който етап е един начин за бързо и ефективно разделяне на супернатантата от утайката. Вариации и регулиране на тези параметри са в рамките на познанията на специалиста от областта, зависейки предимно от обема на хомогенизата и използваното оборудване.

Получената утайка се лиофилизира за 24 до 48 h. Тази първа фракция ще бъде охарактеризирана по-долу като лиофилизат или твърд екстракт.

Супернатантата може да бъде филтрувана върху 24 gm филтър на Whatman, ако е необходимо, за освобождаване от частиците, за които се счита че влияят на пречистване през ултрафилтрационна колона. Филтрираният материал след това се подлага на ултрафилтрация при около 4°С върху филтрационна колона с тангенциален поток, с порьозност около 500 kDa, което позволява получаване на първия суров пермеат, включващ водноразтворими молекули с молекулно тегло от около 0 до 500 kDa. Този суров пермеиращ екстракт се филтрува върху 0,22 gm филтър и се разпределя в асептични бутилки за по-нататъшна употреба. Тази фракция по-нататък ще се приема като суров пермеат или течен екстракт.

Обратно, провежда се центрофугиране при високи скорости за получаване на утайката и супернатантата. Етапът на центрофугиране при 13600 х g за 15 min, последван от груба филтрация върху Whatman филтър, се замества с центрофугиране в СЕРА центрофуга, снабдена с найлонов джоб с порьозност 1 gm, при 3000-4000 х g. Продукт 25 kg/25 L може да бъде центрофугиран по този начин в рамките на 30 min и дава около 291 супернатанта. Полученият воден обем е по-голям от изходния обем вода, като се предполага, че част

7,35%· 46%²20,4% 4,16 mg/g³

2,64 mg/g 114mg/g

1,49 mg/g

0,10-0,20%' 8-25 mg/ml²8-25 mg/ml 97-99% 30-220 mg/100 g³30-40 mg/100 g 2,0 mg/100 g 1,1 mg/100 g от водното съдържимо на хрущяла само по себе си е било събрано. Лиофилизата и тоталният воден екстракт може да има следният приблизителен състав, който грубо има предвид вариантите, наблюдавани от една серия към друга, при използване на различен материал:

Твърд екстракт: Липиди Протеини Влажност Натрий Калий Калций Магнезий Цинк и желязо в с Течен екстракт: Липиди Протеини Сухо вещество Влажност Натрий Калий Калций Магнезий Цинк и желязо - в *·² Измерено, следвайки инструкциите, публикувани в АОАС Official (1984), сектори 16.219D 220 и 2.055, съответно.

³ Измерено, следвайки SAA методиката.

Протеиновото съдържимо се измерва по метода на Kjeldahl, който в действителност измерва органичния азот (N). Органичният азот се превръща в еквипотенциален протеин по следното уравнение:

Протеиново съдържимо (mg/ml) - (% N х 6,25) върху 100

Може да се предположи, че въглехидратите, които не могат да бъдат установени, се намират в един или друг екстракт, но под формата на полинуклеотиди и/или мукополизахариди. Възможно е тези съединения да бъдат включени в измереното ниво на влажност. Лиофилизатът съдържа едно неочаквано ниво на влажност, което може да бъде измерено чрез ОН-групите. Тъй като съдържанието на 20% вода е близко до процента на въглехидратите, обикновено възстановявани в хрущяла, докато влажността на лиофилизата следва да бъде близко до 0%, то тази хипотеза остава да бъде доказана.

Течният хрущялен екстракт се анализира за съдържанието му на аминокиселини. Средното количество на тотални аминокиселини е, приблизително 1,1 mg за ml, със свободни аминокиселини, възлизащи на 0,67 mg (61 %), и аминокиселини с протеинов произход, възлизащи на 0,44 mg 5 (39 %). Разпределението на всяка аминокиселина е показано на фиг. 1. Установено е и значително количество на таурин (не е показано).

Големият процент на аминокиселини, намиращ се в течния екстракт, са представителни 10 за протеини и пептиди от хрущял. Например, лизин, глицин, аспарагинова киселина и глутаминова киселина представляват голяма част от аминокиселинното съдържимо на течния екстракт и са основният компонент на N-телопептидното ин15 термолекулярно кръстосано свързване в колаген (Hanson et al., (1992), J. Bone & Min. Res. 7:12511258).

Микробното съдържимо на течния екстракт се контролира, прилагайки USP ΧΧΠΙ <61> стан20 дартите.

Изпитвания за активност

Твърд екстракт In vitro изпитвания

Тези изпитвания се провеждат в хормоно25 зависими ракови клетъчни линии MCF-7 ZR75-1 (АТСС членове 22-НТВ и 1500-CRL, съответно).

Клетки ZR75-1:

a) Основна RPMI среда: 52 g RPMI1640 без фенол, ред (Sigma R8755), 17,875 g Hepes (свободна киселина; Sigma НО763), 0,55 g натриев пируват (Sigma Р5280) 10 g NaHCO, се смесват в 5 1 чиста вода и pH се довежда до 7,40 с NaOH.

Ако не се използва незабавно, този разтвор следва да бъде защитен от светлината за съхраняване на фоточувствителните вещества. Този разтвор се филтрува, разпределя се в 500 ml стерилни колби и се съхранява при 4°С за максимален период от три месеца.

b) Среда за съхраняване на клетъчната култура: Основна RPMI среда се замества с 10% (v/v) FBS (фетален телешки серум), 100 U пеницилин G/50 pg стрептомицин сулфат (Sigma PO906)/ml среда, 2 mM L-глутамин (Sigma G1517) и 1 пМ Е₂ (β-естрадиол Sigma Е8875).

c) Експериментална среда: Основна RPMI среда се замества с 5% FBSA (фетален телешки серум, адсорбиран върху декстран-дървени въглища), 2 шМ L-глутамин, 100 U пеницилин G/50 pg стрептомицин сулфат/ml среда и 50 ng/ml инсулин (Sigma). Към тази среда се добавят повиша8 ващи се концентрации от описания по-горе лиофилизат, а така също и различни концентрации на Е₂ (ΙΟ¹²'»⁰⁵ М).

Клетки MCF-7

a) Основна DME-F12 среда: DME-F12 сре- 5 да (без бикарбонат и без фенол, ред; Sigma) се възстановява следвайки насоките на производителя в чиста вода. За един литър се добавят 1,2 g натриев бикарбонат и pH се довежда до 7,40 с NaOH/HCl. Този разтвор се филтрува, разпре- 10 деля се в 500 ml стерилни колби и се съхранява на 4°С за максимален период от време три месеца.

b) Среда за съхраняване на клетъчната култура: Основна DME-F12 среда се замества с 10% FBS (фетален телешки серум), 100 U пеницилин 15 G/50 pg стрептомицин сулфат (Sigma РО906)/ш1 среда, 2 тМ L-глутамин (Sigma) и 1 пМ Е₂.

c) Експериментална среда: Основна DMEF12 среда се замества с 5% FBSA (фетален телешки серум, адсорбиран върху декстран - дървени 20 въглища), 2 тМ L-глутамин, 100 U пеницилин G/ pg стрептомицин сулфат/ml среда и 50 ng/ml инсулин (Sigma). Както е описано за ZR75-1 клетки, лиофилизат и Е, се добавят в същите концентрации. 25

d) Изготвяне на FBSA: Зародишен телешки серум се смесва с 1 % (т/о) въглен (въглерод обезцветяващ алкални). Разтвор на декстран Т70 се добавя към въглерод - серумния разтвор за достигане на концентрация от 0,1 % (т/о). Сместа се 30 разбърква в продължение на една нощ при 4°С. След центрофугиране при 4°С в продължение на min при 10 000 х g, серумът се декантира, смесва се отново със същите пропорции от въглища и декстран, разбърква се на стайна температура за 35 3 h и отново се центрофугира. След това серумът се инактивира нагорещо при 56°С за 20 min, филтрува се стерилно и се разпределя в стерилни конични епруветки на Falcon.

Експериментални изпитвания на култури- 40 те и резултати:

ZR75-1 и MCF-7 се култивират за достигане плътност на популацията от 20 000 клетки/ кладенче върху 24-ямкови плаки или 150 000 клетки/ямка върху 6-ямкови плаки, и се обработ- 45 ват в присъствие или липса на различни концентрации от лиофилизата, който е получен по-горе. Твърдият хрущялен екстракт се ресуспендира в културална среда и се филтрува на стерилно, така че водноразтворимите му компоненти да се възс- 50 тановят и да се тестуват. Всички експерименти се провеждат трикратно. Културалната среда се изтегля и се замества с прасна среда на всеки два дни. Клетките се култивират в инкубатор при постоянни условия на влажност в атмосферата, съдържаща 5% СО₂, при 37°С, за 17, 7, 3 или 3 дни, съответстващо на първия, втория, третия и четвъртия експеримент, съответно. Инхибирането на клетъчния растеж се измерва чрез директно изброяване на клетките или чрез измерване на тоталното ДНК съдържимо в ямката.

Клетъчно инхибиране (%)
MCF-7	ZR75-1

Концентрация на лиофилизата

Експеримент 1.17 дни 1 mg/ml	1,5	2,0
5 mg/ml	14,33	33,6
10 mg/ml	62,66	90,8
Експеримент 2. 7 дни
1 mg/ml	3,73	0,97
5 mg/ml	15,7	29,0
10 mg/ml	68,37	66,0
Експеримент 3. 3 дни
50 mg/ml	95,8	95,0
100 mg/ml	94,6	98,0
Експеримент 4.3 дни
10 mg/ml	34,4	51,5
20 mg/ml	62,5	70,5
50 mg/ml	95,8	95
100 mg/ml	94,6	98

Посоченият по-горе процент на инхибиране на клетъчния растеж показва, че твърдият хрущялен екстракт може да инхибира в зависим от дозата начин растежа на клетките от тези две клетъчни линии.

Фигура 2 показва, че дози от 50 и 100 mg/ml от твърдия екстракт ясно провокират хипоплазията на тези клетъчни линии, три дни след обработ ването.

Фигура 3 показва, че в присъствието на 10¹²до 10’ М естрадиол клетъчният отговор съответства на този на контролните клетки, които не са стимулирани в тези хормонални граници. Но над 1 пМ контролните клетки са силно стимулирани и концентрацията на ДНК достига до 3,75 pg в присъствие на 10·’ М естрадиол (срещу 0,69 pg в контролата без естрадиол). В клетки, обработени с 30 и 50 mg/ml от лиофилизата, ДНК, измерена при максимално стимулиране е 1,9 и 1,8 pg, съответно. Фигура 3 показва, че афинитетната константа (Km) на третираните клетки за естрадиол е 3 и 16 пъти по-висока (31,3 пМ и 174,0 пМ) в сравнение със стойността на Km от контролните клетки (11,7 пМ), в присъствието на 30 и 50 mg/ml, съответно. Това означава, че по-високи концентрации на естрадиол са необходими за достигане на същия ръст на клетките в присъствие на твърд хрущялен екстракт. Поради това, този екстракт понижава максималния отговор (90% инхибиция) и повишава афинитетната константа на третираните клетки спрямо естрадиол.

Изпитвания in vivo:

Индуциран с DMBA модел на рак на млечната жлеза на плъх

a) Описание на тест системата. Четиристотин женски плъхове от породата Sprague-Dawley на възраст 40 дни (закупени от Charles River Co., St-Constant, Quebec) се адаптират към околната среда в продължение на 12 дни. В това време им се дава по 20 mg DMBA/1 ml царевично масло (9,

10-диметил-1,2-бензантрацен; закупено от Sigma Chemical Co). Три месеца след това третиране се подбират 240 плъха, развили рак на млечната жлеза, и се разпределят в две групи. Първата група се състои от пет подгрупи плъхове. На плъховете от третираните групи се дава дневна доза от повишаващи се концентрации от лиофилизирания екстракт в 3 ml вода за осем седмици, докато контролните групи получават същия обем вода. Втората група се състои от четири подгрупи плъхове. На плъховете от третираните групи се дава дневна доза от лиофилизата в 3 ml вода, комбиниран със или без течния екстракт, за десет седмици, докато контролната трупа получава същия обем вода. Само на една подгрупа от втората група плъхове, третирана с концентрация 3000 mg/kg/дневно от лиофилизата и 3 ml от течния екстракт се прави и интраперитонеална инжекция от по-малка доза от течния екстракт (около 8 mg протеин в 1 ml вода).

Плъховете тежат 151-175 g в началото на двата експеримента и получават храна и вода ad libitum. Първата група от плъхове има тумори със среден диаметър 0,9 cm, докато втората - тумори със среден диаметър 0,6 cm.

b) Антитуморна активност. Резултатите са обобщени, както следва:

Дневни дози на хрущялен екстракт, въвеждани с храната	% инхибиране на туморния растеж (понижение диаметъра на тумора спрямо контролата)
Експеримент 1. Продължителност 8 седмици Плацебо 0 500 mg/kg/дневно 2 1000 mg/kg/дневно 4

3000 mg/kg/дневно	14
5000 mg/kg/дневно	15
Експеримент 2. Продължителност 10 седмици
Плацебо	0
3000 mg/kg/дневно	12
3000 mg/kg/дневно + 3 ml течен екстракт
	18
3000 mg/kg/дневно + 3 ml течен екстракт +1 ml
инжекция	20

Тези резултати показват, че лиофилизатът съдържа активна съставка, която се абсорбира в гастро-интестиналния тракт и понижава туморното развитие. Тази инхибиция би могла директно да повлияе върху туморните клетки или върху медиирания от ангиогенезата ефект, влияещ върху туморното развитие.

Течният екстракт също съдържа инхибиторна активност, доколкото неговото въвеждане причинява допълнително редуциране на размера на тумора около 6%.

Тези резултати предполагат също, че лиофилизатът може да съдържа активни компоненти, които не са водноразтворими и/или, че може да съдържа остатъчни водноразтворими компоненти. Поради това в краен случай може да се предположи, че утайката може да бъде реекстрахирана във воден разтвор за максимално възстановяване водноразтворимите компоненти, ако добивът им все още може да бъде подобрен.

с) Хистопатология. За преценка на нетоксичността на твърдия хрущялен екстракт използваните животни в горните in vivo експерименти се убиват чрез декапитация и за анализ се взимат следните тъкани: черен дроб, бял дроб, бъбреци, сърце, мозък, мускули, млечна жлеза. Мастите се отделят от тези тъкани, след което те се фиксират за два дни в течност на Bouin. След дехидратация в етанол фиксираните тъкани се включват в парафин. Получават се сектори и се монтират върху стъклени слайдове, оцветени с хематоксилин, и се визуализират под микроскоп.

Хистологичното изследване показва, че вредни ефекти се наблюдават при използване на големи дози твърд екстракт самостоятелно или при използване на твърдия екстракт в комбинация с течен екстракт (данни не са показани).

Това предполага, че лиофилизатът и течният екстракт имат селективна активност за размера на тумора.

В тумори на млечната жлеза (виж фигури 4а и в), се наблюдава значително намаляване (55%) на областта на кръвоносните съдове в групата на плъховете, получавали твърд и течен хрущялен екстракт (фигура 5).

Понижаването размера на тумора може да се дължи на значимо понижение на неговата васкуларизация, на директен ефект върху туморните клетки или на комбинация от двата феномена. Антиангиогенният ефект на тези екстракти е описан по-горе. Директният хипоплазичен ефект е наблюдаван in vitro върху хормонозависими клетки, което остава да бъде потвърдено in vivo.

Поради посочените по-горе резултати, показващи, че течният екстракт има понижаващ ефект над и повече от влиянието на твърдия хрущялен екстракт спрямо R75-1 клетки, техните компоненти са изследвани по-нататък.

Течен екстракт

In vitro изпитвания:

Туморни клетъчни линии:

Няколко туморни клетъчни линии се култивират в присъствието на течен хрущялен екстракт за изпитване наличието на хипоплазната активност, наблюдавана с твърдия екстракт (горния раздел).

Накратко, клетките се култивират в плаки с 96 броя ямки и се отглеждат в културална среда (специфична за всеки клетъчен тип; например, клетките MCF-7 се култивират, както е описано по-горе) в присъствие или без присъствие на различни концентрации от течния екстракт. Клетъчната пролиференция се измерва с помощта на МТТ изпитване след 3 до 5-дневно култивиране. Туморните клетъчни линии са:

CHAHG: туморни хепатоцити

Hep-G2: Туморни хепатоцити

А2780: Овариални аденокарциномни клетки

MCF-7: Аденокарциномни клетки от млеч на жлеза (естрогензависими)

MCF-7-ADR: Аденокарциномни клетки на млечната жлеза, устойчиви на Адриамицин

Течният хрущялен екстракт показва антипролиферативна активност върху всички туморни клетъчни линии. По-силно инхибиране, 50 и 80%, се получава при концентрация от 8.5 mg/ml (сухо вещество в течен екстракт/ ml от културалната среда) върху MCF-7 и А2780 клетки, съответно.

Нелиофилизиран и лиофилизиран течен хрущялен екстракт са еквипотенциални в тяхната способност да инхибират туморната клетъчна пролиферация. Това предполага, че фактора (ите) за инхибиране не се денатурира при тази концентрация.

Първично култивирани клетки:

А. Фибробласти от невроваскуларна глаукома: За оценка спецификата на активността на туморните клетки полученият след ултрафилтрация пермеат се тества върху клетки с мезенхимен произход, човешки TENON фибробласти (HTFs), които са нормални фибробласти. Използват се само HTFs от двама пациенти (единият с невроваскуларна глаукома, NVG, а другият с глаукома с първично отворен ъгъл, POAG).

Субкултивиране и поддържане на HTFs: Всяка слята култура се пасира чрез промиване с 0.5 ml от 0.05% трипсин/0. 5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) за 10 min при 37°С. 1.5 ml от среда DMF/F-12, съдържаща 15% фетален телешки серум, (FBS) след това се добавя за неутрализиране на трипсин/EDTA.

Асоциирането на клетките се осъществява чрез разпрашаване и прехвърляне в 25 cm² Т-колби, в които се добавя допълнително среда, съдържаща 10% FBS. След това HTFs се прехвърлят в 75 cm² и евентуално, в 180 cm² Т-колби. Когато бвдат получени достатъчно клетки, някои от тях се използват за експериментите, както са описани по-долу, а други същевременно се замразяват за съхраняване идентични пасажи за по-нататъшни експерименти.

Експериментални методики: Когато бъде постигнато сливане, клетките от един пациент, развиващи се в две или три идентични 180 cm² Тколби, се разтварят чрез методиката, описана погоре. След краткотрайно центрофугиране на помалко ускорение, те се преброяват с ZMI Coulter Counter 216013, оборудвани с 256-Channelyzer.

За всички следващи in vitro експерименти, на 1 ml DME/F-12 среда, съдържаща 1 % FBS, се инокулират приблизително петдесет хиляди клетки за всяка от 16 nun панички и 12-ямкова плака. Седемнадесет часа (hrs) след посявката се добавя 1 ml прясна идентична среда, заместена с 1 % FBS (“абсолютни” контроли). В зависимост от експерименталния дизайн (виж по-горе и по-долу), 1 % FBS средата е заместена или не с GFs растежни фактори) или с течния хрущялен екстракт, и се филтрира стерилно. На този ден (ден 0) се изброяват и някои проби от клетки за определяне ефективността на покриване (което следва да бъде еднакво или по-голямо от 95%).

След 48 h от поставянето на експериментите клетките се промиват, разтварят се и се из11 брояват отново. Броят клетки се изразява като процент от тези, получени в “абсолютните” контроли.

Всяка “абсолютна” контрола, съдържаща 1% или 5% FBS, съответно, и всяка експериментална група, заместена с 1 % FBS и с индивидуален GF или течен хрущялен екстракт, се състои от тройни проби.

Всеки експеримент се провежда върху клетки на един или друг пациент едновременно, и се повтарят поне два пъти.

В тези експерименти, GFs, свински тромбоцитен растежен фактор (pPDGF) и човешки рекомбинантен базален фибробластен растежен фактор (hr bFGF) (подарък от Dr.P.Brazeau от Farmitalia Carlo Erba, Milan, Italy) се добавя в концентрация от 10 до 100 mg/ml в 1 % FBS, съответно. След 48 h от поставянето на експеримента клетките се диспергират с Trypsin-EDTA и се изброяват с Coulter брояч. Всички тройни стойности (колони 1,2 и 3) възлизат на стойност под една двадесета част от преброеното за ямка.

Резултати. Резултатите са обобщени на фиг.6 HTFs са получени от болен от глаукома 53годишен мъж. Докато фактори като PDGF и bFGF показват стимулираща активност върху HTFs (*Р<0.02, **Р<0.01; определена по теста на Student-Fisher), не е получен ефект, позитивен или негативен при култивиране на тези клетки в присъствие на хрущялен течен екстракт (1 kg/2L). Това предполага, че хипоплазната активност на течния хрущялен екстракт върху туморни клетки не е универсална и не въздейства върху развитието на фибробластите. Същият хрущялен екстракт няма въздействие и върху друг тип фибробластни клетки, HSF (Човешки кожни фибробласти; данните не са показани). Макар и да не са тествани, това предполага, че твърдят екстракт също няма въздействие върху нормални клетки.

Ь) Ендотелни клетки от човешка пъпна вена (HUVECs): HUVECs, се екстрахират с колагеназно-контролирано разграждане, както е описано в Jaffe et al. (1973). Чисти ендотелни клетки се използват преди четвъртия пасаж (трипсин- EDTA при всеки пасаж). Количеството на клетките се анализира за техния капацитет да включват диацетил LDL и да бъдат белязани с фактор VIII.

Ендотелни клетки се покриват при плътност 2500 клетки/cm² стерилни панички, покрити с желатин. Клетките се култивират с пълна среда (Меб199+хепарин (90 G pg/ml) +Ь-глутамин (2mM) + бикарбонат + FBS (10%) + ECGS (120 pg/ml) в продължение на 24 h за обезпечаване клетъчната адхезия. След това клетките се промиват 3 пъти с PBS и културална среда се добавя съобразно условията на експеримента. Последното PBS промиване се приема за време 0.

Всеки експеримент се осъществява трикратно, а статистически анализ се извършва за сравнение. Културалната среда се изменя след 24 h, и всеки друг ден. След 168 h от култивирането към всяка култура се добавя BrdU (10 mM) и се инкубира 2 h при 37°С. След това клетките се освобождават с кратко трипсин- EDTA разграждане и се прехвърлят в 96-ямкови плаки, за да може да бъде проведено установяване на BrdU с ELISA. ELISA се осъществява с кит и по метода на Borhringer- Mannheim. Контролата се провежда без клетки за определяне на основното ниво. Друга контрола се осъществява чрез измерване на ДНК съдържимото в кулутралната среда в края на инкубационния период, за да се определи дали течният хрущялен екстракт влияе на клетъчната адхезия.

Клетъчната пролиферация се оценява още и с количеството на ДНК, намиращо се в петриевите панички. Всеки експеримент се провежда в тройна проба, а за сравнение и статистически анализ. Културалната среда се сменя всеки ден. След 168 h култивиране, клетките се лизират с Naцитратен-SDS разтвор и се инкубират с Hoescht 33358. Пробите се разчитат при 365 шп със спектрофлуорометър.

Накрая, количеството на клетките, намиращи се в петриевите панички, се оценява и чрез измерване активността на киселата фосфатаза. Всеки експеримент се провежда в тройна проба и се анализира статистически. Активността на този ензим показва силна корелация с броя на ендотелните клетки в петриевите панички (BrdU включване в Hoescht маркиране; данни не са показани) . Кисело фосфатазната активност се измерва с кит от Sigma Chemical Company (съгласно методиката на производителя с някои модификации).

Резултатите показват инхибирането на ендотелната клетъчна пролиферация в отговор на течен хрущялен екстракт (фигура 7). Получената стойност за Εϋ_Λ е приблизително 90 μΐ от течния екстракт (равно на приблизително 15 mg сухо вещество, намиращо се в течния екстракт).

С) кератиноцити: течен хрущялен екстракт се изпитва в кератиноцити, чиято протеинкиназа С (РКС) е активирана с трифорбол аце12 тат (TPA), известен конкурент на тази клетъчна трансдукционна обмяна. Нормални човешки епидермални кератиноцити се установят като първични култури (Matsui etal (1992) J.Invest. Dermatol. 99: 565-751). Културите се развиват в свободна от серум дефинирана среда (KGM), съдържаща епидермален растежен фактор (10 ng/ml), инсулин (5 pg/ml), хидрокортизон (0.5 pg/ml) и телешки хипофизен екстракт (70 pg/ml) в модифицирана MCDB 153 форма.

Кератиноцити се култивират до 70% сливане, и 48 h след подхранването с прясна среда се обработват с 200 ng/ml ТРА или 2 pg/ml DMSO, без допълнително подхранване.Различни концентрации на течен хрущялен екстракт се добавят или не към културалната среда. Резултатите не показват въздействие на течния екстракт върху кератиноцитната пролиферация; той няма въздействие върху ТРА-индуцираното инхибиране на пролиферацията. Обаче течният хрущялен екстракт е способен да инхибира ТРА-индуцираната кератиноцитна диференциация (фигура 8). Нивото на диференциация на кератиноцитите се повишава петкратно от ТРА Течният хрущялен екстракт сам по себе си няма влияние върху формирането на вроговената обвивка. Обаче, неговото присъствие инхибира ТРА-индуцираното формиране на вроговена обвивка до повече от 60%.

Публикациите напоследък показват, че РКС активацията води от страна на нормалните кератиноцити до продуциране на повишени количества интерлевкин-8 (IL-8), медиатор на възпаление (Chabot-Fletcher et al. (1994) Llnvest. Dermatol. 103:509-515). Нещо повече, псориазисни кератиноцити продуцират много високи количества IL-8, който по-нататък промотира неоваскуларизация в псориазисни плаки Nickoloff et al. (1994) Am.

J.Pathol. 144:820-828). Други растежни фактори и интегрини са също включени и това може да е важно за разширяване семейството на мишенната молекула (11-1, TNF, и др). Не е известно дали ТРА индукцията маскира псориазисните кератиноцити. Ако случаят е такъв, тези резултати предполагат, че хрущялът може да няма въздействие върху нормални кератиноцити in vivo, докато той може да има ефект върху псориазисните (или активираните) кератиноцити. Инхибирането продуцирането на IL-8 в ТРА-активирани кератиноцити, както и в псориазисните плаки или кератиноцити от течния хрущялен екстракт, остава да бъде доказано. Понижаването на нивата на IL-8 и/ или други растежни фактори е интересна възмож ност за разширяване противовъзпалителния и антиангигогенния ефект на този екстракт.

Колагеназно изпитване:

а) Проба 1. Това изпитване е описано в Knight et al. (1992) FEBS Let. 296, 263-266. Методът използва флуорогенен пептиден субстрат (Mca-pro-leu-glu-Dpa-ala-arg-NH2), маскиращ активното място на металопротеиназите. Този субстарт има флуоресцентна група (Мса) в единия край и флуоресцентна (Dpa) група в другия. При ензимното разграждане на субстрата, флуоресценцията в тест епруветката се повишава.

Колагеназното активиране е описано от Weingarten etal. (1985) Biochemistry 24,6730.1 pg се разрежда до 100 μΐ с 50 mM Tris- НС1,10 шМ СаСЦ. PH 7.5,1 pl при 10 mg/ml разтвор на трипсан (в 1 mMHCl) се добавя и инкубира за 15 min при 20°С. Активирането завършва чрез добавяне на 10 pl соев инхибитор на трипсина (SBTI, 5 mg/ml). Към всяка микрокювета се добавят:

или 50 pl инхибитор* (доведен до 50 pl свода);

μΐ 50 mM Tris- НС1, 200 mM NaCl, 10 шМ СаСЦ, pH 7.5;

μΐ активизирана колагеназа ·♦ (67 ng); и pl субстрат (1 шМ основен разтвор в DMSO, 20 μΜ)

Флуоресценцията се възпроизвежда при λβχ-328 nm,

Xem“393 nm.

*: инхибиторът се определя като контролно вещество (като EDTA, ортофенантролен) или течен хрущялен екстракт.

**: колагеназата се определя като човешки тип I, тип IV, и амфибийна колагеназа от попова лъжичка; гелатиназа също може да бъде използвана.

В. Проба 2. Това изпитване е описано от Welgus et al. (1979) JBC 256, 9511-9516. В метода се използва SDS- PAGE за изпитване разграждането с колагеназа, тип 1 (ММР1). Колагеназата тип 1 осъществява едно отделно срязване в естествената колагенова молекула, при което се получават два фрагмента с размери, възлизащи на 75% и 25% от оригиналния коалген. След разграждане за няколко часа, реакцията се наблюдава чрез разделяне на продуктите от субстрата чрез SDS-PAGE. Съотношението на разградения спрямо неразграден колаген се установява визуално след оцветяване на теловете с Comassie blue (или сребърно оцветяване).

ng активирана колагеназа (виж Проба 1) се добавя към 5 pg колаген от телешка кожа (Worthington) +/-инхибитор в краен обем 20 pl. Реакциите се инкубират за 16 h при 35°С, след това се спират чрез добавяне на SDS-PAGE проба с 40 mM EDTA, варят се и се натоварват върху 8% акриламиден гел.

с) Инхибиране в отговор на дозата: резултатите, получени с течни хрущялни екстракти, показват зависеща от дозата инхибиция на колагеназната активност с двете проби. На фигура 9 са показани резултати, съответно - проба 1. ED50 се получава с 30 μΐ от течния екстракт (или 0л51 mg сухо тегло в 30 pl от течния екстракт).

In vivo изпитвания

Ембрионално васкуларизационен тест (EVT)

а) Определяне на тест- системата. Нормалното развитие на пилешкия ембрион включва формирането на външна васкуларна система, локализирана във вителиновата мембрана, която пренася хранителни вещества от вителуса (яйчен жълтък) към развиващия се ембрион. Поставени върху вителиновата мембрана антиангиогенни вещества могат да инхибират развиването на кръвоносните съдове във вителиновата мембрана. За улесняване достъпа до вителиновата мембрана пилешки ембриони се прехвърлят в съд със стерилна култура (петриева паничка) и се поставят в инкубатор с контролирана влажност и температура. След това ембрионът се развива в тези ex ovo условия за няколко дни.

Еднакви части от течен хрущялен екстракт се смесват с разтвор метилцелулоза и сместа се оставя да се изсуши на въздуха до тънки дискове. По време на тази процедура присъщият за течния хрущялен екстракт NaCl се концентрира и се сблъсква с EVT, когато количеството за един диск надхвърли 25 pg.

Поради това, необходимо е отделянето на солите от течния екстракт. Установено е, че диализата през мембрана, чиито отвори са по-малки от 100 Da, или електродиализата са приемливи методи.

Метилцелулозата формира един инертен матрикс, от който течният екстракт може бавно да дифундира. Метилцелулозните дискове, съдържащи течния екстракт, се поставят върху външната страна на васкуларния периметър от вителиновата мембрана, където ангиогенният процес е все още активен.

Ефектът на дисксьдържащия течен хрущялен екстракт върху проксималното васкуларно раз витие винаги се сравнява с този на дисксвдьржащата вода плюс еквимоларно количество NaCl. Дисковете се поставят върух ембрионалната вителинова мембрана в ден 0 или ден 1 от ex ovo растежния процес. В този момент само зачатъци на големите кръвоносни съдове навлизат във вителуса. Ембрионите след това се поставят в условията на културата до достигане на васкуларизацията (приблизително 24 h). Дисксъдържащите вода и течен екстракт винаги се добавят едновременно върху вителиновата мембрана на същия ембрион. Двата диска се подреждат по симетричен начин спрямо цефалокаудалния край на ембриона с оглед намаляване индивидуалните вътрешни вариации при сравняване на акуловите хрущялни екстракти с контролата.

Ь) Антиангаогенна активност: EVTs се провеждат с помощта на различни концентрации протамин (37,75 и 150 pg) като позитивна контрола или течен хрущялен екстракт. Един ден след началото на култивирането нивото на васкуларизация в областта, покрита от диска, се определя по обичайния сляп метод. За улесняване определянето локализацията на дисковете около тях се поставя черен О-образен пръстен веднага след разполагането им върху вителиновата мембрана. Скалата за отчитане за EVT теста се базира на мащаб 1-2-3: (мащаб -3). Нормална васкуларизация при сравняване с противоположен хоризонтален квадрант или съвпадащия квадрант на контролния ембрион; (мащаб - 2). Кръвоносните съдове навлизат в областта, покрита от диска, но изчезват към средата. Големи кръвоносни съдове пресичат областта, покрита от диска, но тяхната траектория ясно се повлиява или се наблюдава намаляване на плътността в латералното разклонение; (мащаб -1). Не се наблюдават кръвоносни съдове в областта, покрита от диска, или техните хомолози рязко се извиват, за да избегнат областта, покрита от диска. Кръвоносните съдове не прорастват зад областта, покрита от диска освен ако не ги прескочат и не отидат зад тях.

Инхибирането в отговор на дозата се получава с протамин (данни не са показани) и течният хрущялен екстракт (фиг. 10). ED_M се получава с около 170 pg от течен екстракт (сухо вещество в течния екстракт). Статистическият тест на Wilcoxon се използва за сравняване значимостта на разликите между двата диска (вода и хрущялен екстракт), поставени в едно и също яйце.

Модел на миша аденокарцинома на млечната жлеза

а) Описание на тестсистемата. Антитуморният потенциал на течния хрущялен екстракт се тества с миши аденокарциномен модел (алотрансплантант). Тестсистемата се състои от подкожно инокулирана BLB/C мишка с 1 х 10⁶ DA3 клетки. Тези клетки произхождат от миша аденокарцинома на млечната жлеза, индуцирана от 7,12диметилбензантрацен (DMBA). Моделът е установен от Daniel Medina (J.Nstl. Cancer. Inst. (1969 (42:303-310; ibid. (1976) 57: 1185- 1189). Инокулираните клетки се развиват бавно in vivo и формират твърд тумор с ниска метастатична прогноза.

DA3 клетки се поддържат в RPMI1640 среда, заместена с 1 шМ меркаптоетанол, IM Hepes буферен разтвор, 100 mM Na пируват, 200 mM Lглутамин, 10 тМ неесенциални аминокиселини, 1М витамини, 10% фетален телешки серум, 1 % пеницилин- стрептомицин при 37°С с 5% СО₂. За индуциране на тумора клетките се култивират до 70% сливане в пълна хранителна среда и след това се събират с помощта на разтвор на трипсинEDTA. След това клетките се центрофугират и промиват трикратно с фосфатно- буферен разтвор, и ресуспендират при разреждане на 1 х 10⁶ клетки/0.1 ml.

DA3 клетъчно инокулирани мишки (п-15) са получавали дневно орално течен акулов хрущялен екстракт или плацебо (разтвор на соли). Лечението е започнало 7 дни след DA3 клетъчното инокулиране. Изпитвани са различни концентрации на течния екстракт. Количеството на въвеждания течен екстракт се изразява с количеството сухо вещество, намиращо се в течния екстракт. Членовете за тестване се изготвят в следния ред: течният екстракт се лиофилизира и ресуспендира във вода при различни концентрации (0.2, 1.5, 3, 10 и 20 mg за 200 μΐ). Крайните дози, въвеждани дневно, са 10,75,150,500 и 1000 mg/kg телесно тегло.

а) антатуморна активност. Резултатите показват, че максимумът на инхибиране на туморна прогресия се получава с въвеждането на около 75 mg/kg течен екстракт (фиг. 11). Интересното е, че поголеми дози са по-малко потентни. Това предполага, че течният екстракт съдържа вещества, които могат да инхибират туморната прогресия и друга вещества, които могат да инхибират въздействието на туморните инхибитори. Този феномен е вече докладван за биологични лекарствени средства.

Накрая интраперитонеално въвеждане на течния екстракт понижава драстично (75 х) мак сималната ефективна доза за инхибиране на туморния растеж (фиг. 12).

c) Токсичност. При всички третирания няма загуба в телесното тегло или свързана с течния екстракт смърт. Няма и симптоми или изменения в поведението, наблюдавани при ежедневно изпитване на мишки по време на периода на изпитване. В края на третирането мишките се умъртвяват и морфологията на всички органи се анализира от патологоанатом. Не се наблюдават абнормални явления. Кръвните анализи не показват признаци на абнормалност.

d) Хистопатологая. Туморната хистопатологая не показва никакви големи изменения между тумор от третирани с плацебо или течен хрущялен екстракт мишки. Туморната вариабилност е твърде висока във всички групи. Анализи на различни органи (бял дроб, черен дроб, бъбреци, панкреас, стомах, тънки черва, яйчници, млечна жлеза, мозък и сърце) не показват специфично изменение, което може да бъде свързано с течния екстракт.

Миши модел за хипертензивност (CHS):

a) Описание на тест системата. Динитрофлуоробензен (DNFB) е силен кожен дразнител, който може да индуцира силна възпалителна реакция в BALB/C мишка. В ден 0, мишките (10 от тях) се правят чувствителни чрез намазване на коремчето им с DNFB. Мишките се провокират върху дясното ухо чрез намазване на 10 μΐ DNFB 5 дни след намазване на коремчето им. Резорбция на ухото се измерва неколкократно като индекс на тъканно възпаление.

Течният хрущялен екстракт се тества за изпитване дали той би могъл да редуцира възпалителния отговор спрямо DNFB в мишка. Вехикулума самостоятелно (0.2 μΐ разтвор на соли; 5 мишки) или течния екстракт (0.2 μΐ течен екстракт, съдържащ 20 mg/ml сухо вещество; 5 мишки) се дават орално в продължение на 3 дни преди провокиране на чувствителността им и 4 дни след това.

b) Антихиперзентивна активност. Един ден след провокирането на ухото мишка, третирана с вехикулума самостоятелно, показва резорбция до

8.2 mm дебелина. Интересното е, че мишка, третирана с течен хрущялен екстракт, показва резорбция на ухото само 2.8 mm. Статистическата обработка на тези данни показва, че стойността на р <0.001. Тези резултати показват, че течният хрущялен екстракт е силен инхибитор на възпаления.

Получаване на течни фракции, съдържащи активни молекули

In vitro изпитване

Туморни клетъчни линии

а) Изготвяне на тестсистема. Акулов хрущял се събира и обработва, както е описано погоре. След центрофугиране утайката се отстранява и супернатантата се ултрафилтрира, както е описано, до стерилното филтриране върху 0,22 pm филтър. Така полученият течен екстракт по-нататък се фракционира по различни начини. Туморните клетъчни линии се култивират, както е описано по-горе.

b. FPLC условия. Колона. Hiload 26 mm х 60 cm Sephacryl S-300. FPLC система, от Pharmacia. Всички проби се филтруват върху 0.22 pm филтър преди натоварване върху колоната. Елуационният буфер е фосфатно буферна сол (PBS), филтрувана и дегазирана в продължение на 15 min. Обемът на натоварената проба е обикновено 3.2 ml (може да бвде до 13 ml) .Скоростта на потока е 1 ml/min. Събират се фракции от 10 ml. Елуираните вещества се откриват по тяхната UV абсорбция (280 nm). Калибрационната крива се получава с помощта на MW-GF-1000 калибрационен кит от Sigma, като тази калибрацион- 25 на проба има същия обем, както натоварената проба за анализ (3.2 ml). Елуационният обем на пробата се извежда от съпоставяне на молекулното тегло на веществата от калибрационния кит с техния елуационен обем, от който се изважда празният обем на ко- 30 лигата. Празният обем се получава чрез инжектиране на декстрин блу (M.W.-2.000, 000).

Активността на фракциите се тества върху ZR75-1 клетки. Желаните фракции се идентифицират и техните характеристики се потвърждават 5 чрез по-нататъшно изследване (описано по-долу).

Допълнително охарактеризиране на активните компоненти на пермеата се провежда върху Rotofor (Biorad 170-2950) и върху филтри на Amicon с различни степени на пропускливост за 10 получаване на фракции с молекулно тегло между 10-30 kDa и над 100 kDa.

О Условия за изоелектрофокализация. Препарат на течен екстракт от акулов хрущял (46 ml от пермеат 1 kg/Ι) се подлага на диализа в про15 дължение на една нощ срещу 41 чиста вода, съдържаща 5% глицерин, при 4**С с помощта на мембрана Spectra pore # 7 MWCO 3500 kDa (Spectrum 132110). Диализираният разтвор се смесва с 2.75 ml амфолити (Pharmacia # 80-1125-87) pH 3.520 10.0 и 0.5 g CHAPS (Sigma С 3023; 3- [(3-холамидопропил) -диметиламино] -1 -пропан-сулфонат). Обемът се довежда до 55 ml с чиста вада- Разтворът се натоварва върху Rotofor. Изоелектрофокализацията се провежда при 4°С, при постоянно напрежение 12 W (300 xi напрежение Biorad 1650554) ,при постоянна водна циркулация за осигуряване постоянност на температурата. В началото на разделянето, волтажът е 380 V, а амперажът е 31 mA. Когато амперажът се стабилизира (при 14 mA), волтажът достига 870 V. Изоелектрофокализацията се прекъсва и се събират 20 фракции.

ФРАКЦИЯ	ОБЕМ (ml)	рн
1	3.7	3.56
2	2.1	4.01
3	2.2	4.18
4	2.3	4.31
5	2.2	4.63
6	2.1	5.03
7	2.5	5.30
8	2.1	5.5-
9	2.4	5.81
10	2.5	6.26
11	2.3	7.00
12	2.4	7.29
1	2.4	7.64
14	2.5	7.94
15	2.3	8.32
16	2.5	8.62

17	2.4	8.94
18	2.9	9.30
19	3.1	9.88
20	3.6	10.71

Идентифицирането на тези протеини се извършва чрез изпитване на тяхното молекулно тегло върху гел за електрофореза (Laemli, U.K. (1970) Nature (Lond.) 227:680).

Тези фракции се разреждат четирикратно с буфер (виж Laemmli) и 8 pL равни части се подлагат на електрофореза в нередуциращи условия. Фигура 13 показва елжгрофорешчния профил на всяка фракция и на материала преди изоелектрофокализация.

Всички фракции се бутилират стерилно в ламаринен поток чрез прекарването им през стерилен Millipack-60 филтър с порьозност 0.22 ш.

d) Инхибиторна активност върху туморни клетки.

Протеиновото съдържание на фракциите се преценява по метода на Lowry. Разтвори от 1 kg/ 21 (изразено като тегло на суровия хрущял за литър пермеат) се тестват върху ZR75-1 клетки при различни концентрации в културална среда. Резултатите са обобщени, както следва:

Тест 1. Тестове, проведени на Rotofor фракции, (пермеатът е концентриран чрез изпаряване). Идентификация на протеина.

Идентифицирани фракции	Изоелектрична точка	Средна стойност	Молекулно тегло
7-8-9-10	5.30 до 6.26	5.78	29 +/-1 kDa
7-8-9	5.30 до 6.26	5.68	60 +/-1 kDa
12- 13- 14	7.29 до 7.94	7.62	48 +/-1 kDa
13-14	7.64 до 7.94	7.79	35 +/-1 kDa

Тест 2. Проведен върху FPLC фракции (пермеатът е концентриран чрез изпаряване).

фракции 6u7

Молекулно тегло 0. l-2.5kDa

Тест 3. Проведен върху 100 μΐ фракции, получени върху молекулни филтри Amicon.

Изпитвани концетрации	Молекулно тегло	Инхнбиране на ZR75-1 клетъчни култури
100pg/ml	MW > 100 kDa	64%
100 gg/ml	30 kDa < MW < 100 kDa	114%
100 pg/ml	10kDa<MW<30 kDa	127%
100 gg/ml	MW <10 kDa	149%

FPLC фракции 6 и 7 съдържат активни компоненти с много малко молекулно тегло: 0.1 до 25 kDa.

Хипоплазният ефект на фракциите може да бъде до 33 000 пъти по-висок от наблюдавания с лиофилизата.

Е) Друга идентификации на активните ком- 50 поненти на елуата. Активните фракции (тествани върху ZR75-1 клетки) се възстановяват в след ния интервал от молекулни тегла, определени чрез друг тип на пречистване, започвайки със същия пермеат (1 kg/Ι) върху 10 mm диаметър х 30 cm дълга Superose-12 колона с помощта на FPLC и Rotofor процедури, описани по-горе. Избира се скорост на потока от 1 ml/min. Събират се 45 фракции от 1 ml.

Фракции 20 - 21	активност	Във	фракции.
	съответстващи ш молекулно	тегло от
	70 до 120 kDa
фракция 22	активност	Във	фракции,
	съответстващи яа молекулмо тегло от
	60 до 70 kDa
фракция 29- 32	активност	Във	Are* Imine
	съответстващи на молекулно	тегло от
	35 до 46 kDa
Фракция 34-35	активност	Във	фракции,
	съответстващи на молекулно	тегло от
	29 kDa
Фракция 38- 39	активност	ВъВ	фракции,

съответстващи ма молекулно тегло cm 0 go 2.5 kDa

Колагеназно изпитване

A) HPLC хроматография. Проба, съдържаща 980 ml течен екстракт (DUP), се филтрира през мембрана с пропускливост 10 kDa в ултрафилтрационна единица с тангенциален поток (PELLICON, Millipore). Единицата най-напред се промива с 1 L вода. Крайният добив е 480 ml > 10 kDa фракция и

1.8 L с < 10 kDa фракция. Фракцията < 10 kDa е концентрирана чрез студено изпаряване до 180 ml (< 10- 10х). Осем пъти 100 μΐ , равни части от <10- 10х се натоварват върху CDC-S Hexyl, 5 pm HPLC колона (25 х 0.94 cm) и се елуира най напред със 100% HjO при 4 ml/min; след това при 8.5 ml/min със 100% МеОН. Фракциите се събират съответно на Οϋ_ϊ|4 пикове.

Събират се пет фракции (фигура 14): Frl, Fr2, Fr3, Fr4 и Fr5. Първите три фракции включват най-малко големия пик.

Ь) Аитиколагенолитична активност. Резултатите показват, че Frl е най-активната фракция за инхибиране на колагеназата. По-ниско ниво на активност има във всички други фракции: проба 1, виж. Фиг. 14; проба 2, виж следващата таблица.

ПРОБА

ΚΟΛΑΓΕΗΟΒΟ ОЦВЕТЯВАНЕ

Само колаген (С)	++++
С + Enz	+
С + Enz + EDTA	++++
С + Enz + DUP	+
С + Enz + Frl	++++
C + Enz + Fr2	+++
C + Enz + Fr3	+ + +
C + Enz + Fr4	++ +
C + Enz + Fr5	+++
C + Enz + >10 kDa	+

ОЦВЕТЯВАНЕ НА

ΚΟΛΑΓΕΗΟΒ ФРАГМЕНТ + + + + +

EDTA 40 mM инхибира колагеназа. Тоталният течен екстракт показва ниска антиколагенолитична активност. Фракции 1 до 5 са активни. Най-активна е фракция 1. Фракцията на молекулно тегло, по-високо от 10 kDa, не показва значима инхибиторна активност.

с) По-нататъшно определяне на антиколагенолитичния фактор. Течният хрущялен екстракт се фракционира с помощта на филтрационен апа45 рат в тангенциален поток и 10 kDa филтър (Pellicon, Millipore). Установено е, че филтратът (<10 kDa фракция) съдържа цялата антиколагеназна активност и е охарактеризирана по-нататък, както следва. Фракцията <10 kDa по-нататък се диализира с помощта на мембрана с пропускателна способност 100 Da номинално молекулно тегло (Spectra/Por _ СЕ (целулозен естер) MWCO: 100 Da, Cat# 131015). Антиколагено18 литичната активност се възстановява във филтрата (<100 Da фракция). Фракцията < 100 се прилага към С8 обратнофазова колона (EM Science Lichroprep_RP-8, Cat# 9242) и се елуира с HjO, след това с 60% метанол и накрая - със 100% метанол. По-голямата част от антиколагенолитичната активност (98%) се възстановява в Н^О елуата с 2% от активността, елуирана с 60% метанол.

Най-общо антиколагенолитична активност в екстракта се дължи на ниско молекулно съединение/я, които могат да диализират или да преминат през Spectra/Por_CE (целулозен естер MWCO:100 мембрана и не адсорбира към матрицата на С8 обратнофазова колона (Licoprep_), когато се прилага към Н₂О.

In vivo изпитване

Ембрионално васкуларизационен тест (EVT):

Течният хрущялен екстракт се фракционира с помощта на апарат в тангенциален поток и 10 kDa филтър (Pellicon, Millipore). фракциите от течния хрущялен екстракт с по-малко и повече от 10 xDa се тестват при същите условия. Те показват еднакви възможности (Фиг. 15) при инхибиране на неовасукларизацията. Това контрастира с антиколагенолитичната активност във фракцията с над 10 kDa.

a) Фракция <10 kDa. Антиангиогенният фактор в тази фракция се отнася като антиколагенолитичен фактор по време на етапа на пречистване, описан по-горе.

b) Фракция >10 kDa. Фракцията се хроматографира върху хроматографска колона с пермеатен гел (Sephacril S-300, Pharmacia). Фракция (S300-4) с антиангиогенна активност се охарактеризира върху SDS-PAGE. Активната фракция (S300-4) има няколко протеинови ивици с молекулни тегла от приблизително 8 до 18 kDa (в сравнение с BioRad SDS-PAGE маркерни протеини) .Тази фракция по-нататък се фракционира с помощта на анионообменна хроматография (МопоQ, Parmacia) с помощта на 25 mm Tris- HCL pH 8.0 и 0 до 1.0 M NaCl градиент. Елуиращата се между 0.8 - 1.0 М NaCl фракция има висока антиашиогенна активност. Фракции, елуиращи се между О.З-О.б М NaCl и 0.08 □ 0,2 М NaCl, имат помалка антиангиогенна активност.

Сравнение с продукти от нивото на техниката

Установен е уникалният характер на течния екстракт от акулов хрущял, изготвен по настоящия метод, в сравнителни тестове с два про дукта, описани и изведени от нивото на техниката, наречени продукти, получени по метода на Balassa (USP 4 822 607) и Oikawa et al. (op. cit.).

Oikawa et al. описват метод, по който са получени две главни фракции: едната, имаща молекули с молекулни тегла от 1 до 10 kDa; втората, имаща компоненти, по-тежки от 10 kDa. Те приписват антиангиогенни свойства само на първата фракция, а за другата се казва, че не проявява каквато и да е антиангиогенна активност в САМ тест. За адекватно сравнение с продуктите на Oikawa, ние сме фракционирали нашия тотален течен екстракт в две кореспондиращи си фракции, и получихме една с 0 до 10 kDa.

Доколкото Balassa описва метод за екстрахирам на тотален течен екстракт ние сравнихме нашия тотален течен хрущялен екстракт (0 до 500 kDa) с продукта, изготвен чрез възпроизвеждане на метода на Balassa, където телешкият хрущял е заместен с акулов хрущял като изходен материал.

Предполага се, че ако Balassa и Oikawa описват метод, еквивалентен на този съгласно изобретението, образците, получени на FPLC, HPLC и CZE, следва да се препокриват съществено, и същата антиангиогенна активност следва да се изяви на EVT. Всички проби са направени до крайна концентрация 12 pg/μΙ (сухо тегло/обем разтвор) преди FPLC и HPLC хроматографиране. Продуктите на Oikawa се центрофугират и филтурват преди хроматографиране, тъй като съдържат неразтворим материал.

Изготвяне на пробите

Пробите от акулов хрущял, екстрахирани по три метода, се бележат (с определено сухо тегло за обем от разтвора), както следва:

1) DUP е продукт от настоящото изобретение, фракциониран да съдържа молекули между 0 до 500 kDa (12 pg/ml);

2) BAL е продукт съгласно рецептата на Balassa et al. (12 pg/ml);

3) OIK е продуктът на фракция 3 съгласно Oikawa et al. Всички проби са изготвени до крайна концентрация от 12 pg/ml (сухо вещество/обем) преди всеки анализ OIK пробата има високо съдържание на неразтворим материал, който може да се утаи чрез центрофугиране при 13 200 RPM или чрез филтруване през 0.2 pm мембрана. Отстраняването чрез филтруване на неразтворимия материал е важно преди FPLC, HPLC и CZE (фигури 16, 17, 18).

FPLC Сравняване

Условия

Супероза 12 (Pharmacia); гел пермеатна колона. Пробите се пропускат върху Супероза 12 (10/30) гел пермеатна колона с фосфатно буфериран разтвор (PBS) като елуент при скорост на потока от 0.5 ml/min (скорост-0.25 cm/min). 100 μΐ равни части от пробата се филтрират през 0.2 pm мембрана преди инжектиране. Наблюдава се OD^.

Колоната се калибрира със следните стандарти (MW в Das): каталаза (232 000), алдолаза (158 000), албумин (56 000), овалбумин (44 000), химотрипсин (25 700), рибонуклеаза (13 700), инсулин (5 700), инсулин В верига (3 500), инсулин А верига (2500), базитрацин (1450), витамин В-12 (1355) . Молекулните тегла на големите пикове се изчисляват по средното уравнение: Log_|0MW- 7.52 - 0.212 х RT, където RT е елуационният обем в ml. R² е 0.976. Общият обем на колоната (V_t) е 21.93 ml, както е определено с помощта на цитидин (246 Da). Празният обем (V_o) е определен като 8.38 ml с декстраново синьо (2 x1ο⁶ Da).

Сумарни резулати

На фигура 16. а) пробата съгласно изобретението DUP има първи голям пик (1), който е елиуран при 18. 76 ml, давайки молекулно тегло от около 3500 Da. Последващите пикове при 22.7 (2) и 27.3 ml (3) са извън общия обем на колоната (21.93 ml, както е определено с цитидин). Очевидно тези пикове имат известен афинитет към матрикса на колоната.

На фигура 16. Ь) пробата BAL на Balassa има малък пик (1), елуиран близо до V_o на колоната (8.4 ml), пик (2) при 183 ml (4000 Da) и два пика на елуиране след V, (3) 22.6 min и (4) 28.2 ml.

На фигура 16. с) пробата OIK на Oikawa има малък пик (1) при V_o, пик (2) при 18.9 ml (3300 Da), пик (3) при 213 ml (1000 Da) и малък пик (4) при 27.3 ml.

При сравняване на пробите се забелязва, че извън пика 3500 Da голямата ивица от DUP пробата не се наблюдава със същата интензивност в другите проби. OIK пробата очевидно няма малко количество от 27.3 ml пик. Пробата BAL проявява миграция на пика при 28.2 ml, която може да корелира с един от големите пикове в пробата DUP.

HPLC Сравняване

Условия

CS-S-хексил колона 5 pm, 25 х 0.94 cm, CSC# 059-085; обратнофазова колона.

Обобщени резултати

За HPLC върху хексил- обратнофазова колона, OD_2I0 и ODj^ce наблюдават едновременно. Равни части по 50 μΐ от центрофугирани проби (всички при 12 pg/pl) се натоварват и елуират със 100% ЩО. Пиковете за всяка хроматограма, белязани съгласно OD_2i0 и съответните се отбелязват с (eq.l). V_oor тази колона е 53 ml (1.4 min).

На фигура 17. a) DUP има 3 големи пика, които се изследват чрез OD_2I0 (1,2,3), и два малки пика (4,5). Два странични пика се наблюдават извън пик 1, означени като 1а и lb. Значително абсорбиране се свързва с пикове 1, la, lb и

3. За сравнение съответстващата стойност на OD^ за пик 2 е по-малко сродна на OD_2I0.

На фигура 17. В) BAL показва повече OD_2Wпикове, но интензивността е по-малко сродна на DUP пиковете. Доколкото препокриване на пикове би могло да даде индикация за идентичност на молекули, само пикове 3 и 7 в пробата на Balassa показват взаимовръзка с времето на запазване на пикове в пробата DUP (пик 1а и пик

4, съответно).

На фигура 17. с) се наблюдават само три големи пика (1,2,3) в OIK екстракт. Пиковете 1 и 3 могат да корелират с пикове 1 и 3 на пробата DUP, но в OIK хроматограмата на пик 1 не са наблюдавани странични пикове. Височината на пиковете в ОК пробата е по-ниска от тази в DUP. Поради това образците на FPLC и HPLC са характерни за различните продукти.

CZE Сравнение

Условия

Апарати. Beckman система (р/асе система 2050) с goal software (версия 7.11 U); Капилярност Silice (TSPO 50375), 50 pm х 97 cm; буфер 2 М мравчена киселина; Coated Разтвор, 5% p/v хексадиметрен бромид и 2% v/v етилен гликол във вода; Детектор UV (200 nm); Ток - 30 kV; Инжекция 0.5 psi, 20 s; Температура 22*С.

Капилярността се осигурява с 1 μ NaOH (20 psi, 20min), вода (20 psi, 10 min), Coated разтвор (20 psi, 20 min), и буфер (20 psi, 10 mm). След това се установяват условията за началото на процеса: Буфер (20 psi, 2 min), инжектиране на пробата (0.5 psi, 20 sec.), run (- 30 kV, 45 min), 1 M NaOH (20psi, 3,5min), вода (20psi, 3.5min), coated разтвор (20 psi, 4 min) и буфер (20 psi, 4 min).

Всяка проба (BAL, DUP, OIK фракция 3) се ресуспендира при 16.5 mg/ml. PH на всеки разтвор е 7.1, 6.8 и 8.2 в BAL, DUP и OIK, съответно. Концентрацията на NaCl във всеки разтвор е 2.08,4.37 и 0.71 mg/ml в BAL, DUP и ОК, съответно.

Обобщени резултати

Молекулният профил на всяка проба (BAL,

DUP и OIK-3) е показан на фиг.18. Сравнението на DUP и BAL пробите показва, че пробата BAL съдържа по-голямо съотношение на пикове с % област < 1. BAL и DUP споделят пиковете при MT/EOF- 1.06, 1.54, 1.59, 1.66 и 3.22. Пиковете със съотношение на 1.06,1.54 и 3.22 имат сходна % област в BAL и DUP, докато пиковете при съотношение 1.59 са 8 пъти по-интензивни в сравнение с тези в BAL и противоположният се вижда при съотношение 1.66.

DUP и ΟΙΚ пробите представят много различни електрохроматограми. ΟΙΚ има един голям пик с няколко малки пика. Нито един от тези пикове не може да бъде свързан с някои от DUP пробата.

EVT Сравнение

Антиангиогенният потенциал на пробите DUP, BAL и ΟΙΚ се анализира върху EVT (фигура 19). Няма възстановяване на значителна антиангиогенна активност в екстракта на Balassa. Суровият DUP екстракт е сравнен с фракция 3 в Oikawa OIK. DUP и OIK са почти еквивалентни. Oikawa et al, независимо че са виждали далече напред от настоящото изобретение, доколкото са забелязали, че не се установява активност във фракцията с молекулно тегло, по-високо от 10 kDa, която е в контрадикция с нашите резултати от фиг. 15.

Поради това, въпреки сходствата между процеса на Balassa и този съгласно изобретението, продуктите, получени по тези два процеса, са отчетливо различни.

Сравнение на аминокиселинното съдържание

Протеиновото съдържимо на BAL, DUP и OIK (всички със сухо тегло 16.5 mg/ml) се измерва по метода на Lowry. Резултатите показват стойности от 3.31, 0.27 и 4.15 mg/ml за пробите BAL, DUP и OIK, съответно. Съотношението протеин/ сухо тегло е много различно, когато DUP пробата е сравнена с BAL и OIK.

Анализите се провеждат за по-нататъшно изследване аминокиселинното съдържимо на всеки течен хрущялен препарат. Фигура 20 илюстрира съотношението на вяска аминокиселина в BAL, DUP и OIK пробите. Съотношението на свободни аминокиселини варира между всеки хрущялен екстракт: 23%, 73% и 4% в BAL, DUP и OIK проби, съответно. Задължително съотношението на аминокиселини с протеинов произход също варира между всеки от хрущялните препарати: 77%, 27 и 86% в BAL, DUP и OIK проби, съответно. Виж следващата по-долу таблица за сурови данни:

Хрущялен препарат	Свободно а. а. съдържание (pg/ml)	а. а. с протеинов произход (gg/ml)
BAL	675	2314
DUP	604	223
OIK	181	3910

Заключения

Двата продукта от нивото на техниката (BAL и OIK), които са сравнявани с нашия (DUP), все още се считат като класически методи за получаване на хрущялни екстракти. Резултатите показват, че настоящият метод (DUP) предоставя продукт с неочаквано добра активност, отнасяща са както за антиангиогенната, така и за противотуморна и антиколагенолитичната активност. Може да се предложи, че настоящият метод в действителност е успешен за възстановяване мултиплеността на водно разтворимите инхибиторни фактори в един отделен екстракт.

Директно сравняване на BAL, DUP и OIK молекулни профили и протеиново съдържимо показва, че всеки хрущялен препарат има специфични характеристики. Макар те да споделят ня40 кои конституенти, ясно е, че тяхното съотношение един спрямо друг е различно. Особено важно е предположението, че DUP е антитуморен при орално въвеждане в доза под около 75 mg/kg и загубва постепенно този ефект при по-високи дози. Този резултат предполага, че количеството от повече от един фактор е критично в DUP течен хрущялен екстракт. Поради това, различни хрущялни препарати като BAL, DUP и OIK могат да показват много различни биологични свойства, тъй като съотношението на всеки от компонентите в тях варира.

Клинични изпитвания

Получаване на течни екстракти за клинични изпитания

Предварителни клинични изпитвания са проведени с акулов екстракт от изобретението.

Течният екстракт, получен след ултрафилтрация, се филтрува върху милипоров филтър с порьозност 0.22 рш. Микробният лимит на настоящия течен екстракт е контролиран съгласно USP XXIII <61> стандарт. Течният екстракт се разпределя в 7 ml равни части (около 85 mg протеини) в асептични колби, замразява се при 60°С за една нощ и по-нататък се съхранява при -20°С до момента на използването му.

Антиангиогенен ефект

Течният хрущялен екстракт се използва за лечение на ангиогенезисзависими заболявания. Изпитани са три различни типа представители на ангиогенезисзависими заболявания в практиката на лечение на хора; първият тип е рак (рак на простата жлеза), вторият тип е дерматологично неразположение (псориазис), и третият е артрит (ревматоиден артрит и остеоартрит). Примерите подолу ще илюстрират и индикират поне антиангиогенната активност на течния екстракт.

Резултатите, показани по-долу, са много окуражителни и изглеждат предсказуеми за приложимостта на суровия пермеат и неговите фракции за лечението на всички ангиогенезисзависими заболявания и не само за специално тестуваните. Доколкото дадено заболяване има ангиогенезисен компонент, изглежда че хрущялният екстракт от изобретението ще бъде ефективен в това отношение, осигурявайки навлизането на състава, който съдържа ефективно количество, и че този състав е в подходяща форма за приложение. Поради това, следва да се оцени фактът, че настоящото изобретение не се ограничава до следващите специфични състави за приложение при лечение на ангиогенезисни заболявания, доколкото би било възможно да се получат много състави, като изборът се води от начина на приложение и болната тъкан, към която са насочени. Съставите могат да бъдат въвеждани по много различни начини, например локално, орално, сублингвално, ректално, интравенозно, интрамускулно, интраокуларно, интраперитонеално, чрез дифузия и други. Тъй като хрущялният екстракт има вкус и мирис на риба, могат да бъдат добавяни ароматизиращи и оцветяващи агенти или други галенични състави (липозоми, капсулиране и други, за да се намалят нежеланите реакции от пациентите. Препаратите могат да се прилагат в хуманната и ветеринарната медицина.

Рак

Пациент, страдащ от рак на простатата жлеза, приема течен хрущялен екстракт с диетата си и показва значително подобрение. Аденокарциномът е диагностициран през 1986. По това време не е предприемана радиотерапия. През 1991 нивото на простатния серумен антиген (PSA) е 138 gg/l, докато нормално приемливият по-висок лимит е 4 gg/l. Пациентът след това е подложен на напълно различна терапия чрез кастриране, комбинирано с антиандрогенна терапия (EUFLEX). Това лечение е ефективно в продължение на три години, след което нивото на PSA отново започва да се повишава. От юни 1994 този пациент приема течен хрущялен екстракт с храната си (дневна орална доза от около 75 mg сухо тегло/7 ml от екстракта, равно на около 1-1.5 mg/kg телесно тегло). Нивата на PSI се понижават постепенно от 12 до под 4.0 pg/ml (нормални стойности), като последният резултат е получен през април, 1996. Този режим би могъл да бъде променян по желание в съответствие с начина на приложение, биологичната стойност на активните ингредиенти и желаната агресивност, с която следва да бъде контролирана патологията. В този случай течният екстракт вероятно се абсорбира в гастроинтестиналния тракт в съществени количества. Един може да зависи от резултатите, получени с третирани с DMBA плъхове и инокулирани мишки (виж по-горе). По това време не е доказана токсичност в плъхове, мишки (виж по-горе), и маймуни (данни не са показани).

Орално приложение на течния екстракт в третирани с DMBA плъхове и DA3 имплантирани мишки предполага дози от между 1 до 300 mg/kg телесно тегло, което вероятно има голямо значение за инхибиране на туморната прогресия и тумориата васкуларизация в модели животни. Интраперитонеалното въвеждане на течен екстракт в мишка фАЗ-модел) показва, че начинът на приложение е важен за получаване на ефективна доза за инхибиране на туморната прогресия. Това предполага, че дозата от 1 mg/kg, ефективна за случая на рак на простатата, би могла да е по-ниска - до приблизително 0.01 mg/kg, ако се избере паренталното приложение. Ето защо се счита ,че дозата от около 1.01 до около 200 mg/ kg телесно тегло на ден е един приемлив интервал от средна доза (ED_W) за лечение на рак, поне частично чрез редуциране или понижаване на ангиогенезиса.

Няколко друга пациенти са получавали течен хрущялен екстракт (дневна доза от около 75 mg сухо тегло/7 ml екстракт, равно на около 1-13 mg/kg телесно тегло/ден) в комбинация с по-традици онни терапии (хирургична намеса, хемотерапия, антихормонотерапия и други). Обобщение на някои медицински случаи са предложени в изложената по-долу таблица. Резултатите предполагат, че комбинираната терапия с течен хрущялен екстракт може да повиши степента на преживяемост и качеството на живота на пациенти, страдащи от твърди тумори.

Тип на рака

История на заболяването

Пикочен мехур Овариална аденокарцинома Рабдомиосаркома Панкреатична саркома с метастази в черния дроб Аденокарцином на млечната жлеза

Пикочен мехур на 50-годишен мъж; подложен на ампутация на няколко лезии (2 сш и 1,5 cm) и добавяне на течен хрущялен екстракт към храната; няма остатъчен рак до 09/94. 47-годишнажена; лезииот 15cm (отдясно), 11 cm (отляво) и няколко 2 cm лезии; подложена на операция и хемотерапия през 1991; рецидив, лекуван с хемотерапия през 1992; втори рецидив, лекуван с хемотерапия през 1993; добавяне на течен хрущялен екстракт към храната през 1994; оттогава малигнена неоплазма в редуцирана маса. 63-годишен мъж; инфилтриращ тумор с диаметър 11 сп (450 g); подложен на операция и хемотерапия; рецидив, третиран с радиотерапия и добавяне на течен хрущялен екстракт към храната; до сега тумор, показващ некрозирала тъкан и стабилност 45-годишна жена; панкреатична лезия (9 cm) + метастази в черния дроб; хемотерапия и добавяне на течен хрущялен екстракт към храната; туморна регресия до 80% в 1994; тумор, изчезнал през 1995. 67-годишна жена; операция през 1978; рецидив и метастази в белия дроб (1994); добавяне на течен хрущя лен екстракт към храната; оттогава, частична регресш на туморите по размер (1,5 cm -> 1 cm) и брой (12 -> б)

Псориазис

Създаден е следният дерматологичен състав, който е изпитан за потвърждаване ефективността му у пациенти, страдащи от псориазис:

- Emulgade CLB 29% (W/W)

- 20 X суров пермеат 69,5% (W/W)

- Germaben II1% (w/w)

- Lavandula Angustifolia 0,5% (W/W)

Emulgade CLB, смес от стеаратни естери, мастни алкохоли и нейонни емулгатори (закупени от Henkel Canada Ltd.) се нагрява при 65-70°С, при разбъркване. Нагряването се прекъсва, докато сместа продължава да се разбърква. Когато сместа достигне температура 45°С, се добавят есенциалното масло Lavandula Angustifolia и консервантите Germaben II (диазонидил уреа 30%, метилпарабен 11%, пропилпарабен 3% и пропилен гликал 56%; закупени от Sutton Laboratories, NJ, USA). Когато температурата на сместа достигне 30°С, се добавя течният хрущялен екстракт. Така полученият състав е хомогенен, немазен крем; чрез вариране процента на Emulgade.MoraT да бъдат получени други форми на дерматологични състави с различен вискозитет съгласно инструкциите на производителя (мляко, лосион, мехлем) . Могат да бъдат използвани и други вехикулуми за получаване на пасти, галове и каквато и да е друга форма на трансдермални препарати.

Посочената по-горе форма се дава два пъти дневно за период от дванадесет седмици на група от 9 пациенти (локалноприложение), страдащи от псориазис, които са били повлияни от обичайни терапии, но са се оказали твърде упорити за тях. За това изследване пациентите са подбрани за сходен или симетричен обхват на псориазиса. Тези изпитвания се провеждат в двойносляпа проба, когато нито дерматологът, нито пациентът знаят коя от страните се третира със състава, съдържащ хрущялния екстракт, и която се третира с контролния състав. Значимо подобрение е наблюдавано в 5%, чийто псориазис не е усложнен от хиперкератоза; а за болните с хиперкератоза ре зултатите са сравнително добри. Снимки на частите на телата на двама пациенти са показани на фиг. 21. На фиг. 21. а) и Ь) е показано, че пациент, страдащ от псориазис с хиперкератоза, е показал много значима редукция на еритема, свързана с отсъствие на сърбеж, един месец след третирането. Хиперкератозата обаче остава значима. Снимки на втория пациент, страдащ от псориазис, неусложнен с хиперкератоза (фиг. 21. с) и d), показват по-голямо подобрение три месеца след третирането. Докато псориазисът очевидно е многофакторно заболяване, предполага се, че отговорът на пациентите зависи от значимостта на включените компоненти, като ангиогенезис и възпаление за установяването и постоянността на това състояние. Антиангиогенната активност наистина е налице в екстракта, съгласно изобретението, както е показано в третирани с DMBA плъхове (фиг. 5), ендотелна клетъчна пролиферация (фиг. 7) и EVT (фиг. 10). Противовъзпалителната активност също е потвърдена (CHS модел на мишка). Вероятно е по-добри резултати да са получени, ако този вид форма включва друг вид терапевтични агенти, адресиращи към друг фактор, включени в кератинолизата (кератинолитични агенти, допълнителни противовъзпалителни агенти, антихистамини, имуносупресори и други).

Това може да доведе до изменение на формата, така че да включва ефективно количество кератинолитичен агент, например. Това може да бъде постигнато чрез разделно въвеждане на такъв комплементарен терапевтичен агент, конкурентно или в редуване с приложението на настоящата форма на локално приложение. Нещо повече, комплементарната медикация не се нуждае от въвеждане по същия начин.

Посочената по-горе форма не показва системен ефект (ефектът е лимитиран до третираните области) и няма вторичен ефект независимо от високите съотношения в течния хрущялен екстракт.

Артрит

Пациенти, страдащи от артрит, са опитали на доброволни начала една до две единици от 7 ml тотален течен екстракт на ден за няколко ме5 сеца. Тези пациенти виждат постепенно подобрение на своето състояние чрез възстановяване на ставните функции, понижение на болката и възпалението (до около 60%). Докато артритът има автогенни и възпалителни компоненти, посоче10 ният по-горе ефект може да бъде приписан на антиангиогенните и противовъзпалителни активности на хрущялния екстракт.

След това е проведено пилотно клинично изследване от група специалисти в ревматалогия15 та. Седем доброволци и просветени субекти на възраст между 39 и 60 години и страдащи от ревматоиден артрит са се записали за това изследване. Диатозата е установена на базата на класификационните критерии в ревизираното издание на American Rheumatism Association's (Arnett, F. C. etal., 1988, Artritis & Rheumatism, vol.l, 315-325).

Третирането продължава 30 дни и се състои в инжектиране на дневна доза от 21 ml течен акулов хрущялен екстракт (12 mg/ml сухо вещество) . Ефективността на третирането се определя с един артикуларен индекс за преценка на ставна нечувствителност (Ritchie, D.M. et al., 1968, Quateriy J. Med. New Series XXXVII, vol 147,393-406). Индексът се основава на сумирането на множество количествени оценки на изпитваната от пациента болка, когато ставите са подложени на постоянно налягане, оказвано върху артикуларните ръбове или в някои случаи при движение на ставата. Резултатите показват, че 4 пациенти от 7 имат подобрение, когато са третирани с течен хрущялен екстракт (таблицата по-долу), предполагайки, че продуктът може да е приложим при лечение на ревматоиден артрит или други състояния, комплицирани от хронично възпаление.

Пациент (No)	Възраст (аодшга)	Индекс do	Ritchie	Подобрете
Де··	ДшЗ·
1	60	30	22	Да
2	43	8	8	Не
3	52	12	12	Не
4	41	15	19	Не
5	46	5	3	Да
6	39	6	2	Да
7	55	14	7	Да

Паяжинообразна мрежичка от кръвоносни съдове

Набират се общо 16 доброволци за изследване. Те имат видима, но не и ексцезивна теленгестазия на лицето. Групата се разделя на две от по 8 члена всяка. Група А се снабдява с холестерол липозомна база, съдържаща 5% течен хрущялен екстракт, докато втората група (В) е снабдена само с холестерол липозомна база. Продуктите се прилагат на цялото лице два пъти дневно в продължение на три месеца. Използва се оптичен микроскоп за получаване образите на минимум 4 места от лицето, показващи паяжинообразните капиляри. Образите се анализират за сиви стойности чрез Анализатор Zeiss Ibas Image. Интегрираната оптична плътност (IOD) се изчислява за всяко място на всеки член от групата. За четири места на всеки от пациентите се изчислява средна стойност за всеки момент.

Резултатите показват, че е налице 35% понижение на IOD след 4 седмици и този ефект се съхранява за курса на изследване (фиг. 22). Празната холестерол липозомна база показва основно подобрение от 5% и 8 % след 8 и 12 седмици употреба, съответно.

Околоочни (периорбитални) кръгове:

Кожно оцветяване не се дължи изцяло на наличието или липсата на меланин, но също и на кръвоснабдяване и плазмено съдържимо. Когато кръвният поток е ленив и по-големи количества на кислород се отделят за метаболизма, кожата става синкава на цвят. Тези различия в оцветяването се увеличават в областта около окото, поради тънкостта на кожата (Oresajo et al. (1987) Cosmetics & Toiletries 102:: 20-34).

Васкуларните изменения в ивицата под окото могат също да засилят появяването на тъмни кръгове. Тъмни кръгове около окото, могат също да се появят благодарение на отлагане на мазнини, едема под веждите и крьвоток от съдовете около окото. Клиничното изследване е така поставено, че да оцени ефекта на акулов течен екстракт за контролиране ангиогенезиса в околоочната област, като по този начин редуцира появата на периорбитални тъмни кръгове.

В изследването участват общо 18 жени доброволки на възраст от 18 до 65 години. Участничките показват отчетливи тъмни кръгове около очите. Всички те са в нормално състояние на здравето, без проява на остри или хронични заболявания, включващи дерматологични или офталмологични проблеми.

Субектите, показващи слънчево обгаряне, обриви, сърбеж, следи от обгаряния и други, които могат да се насложат с резултатите от теста, са изключени от изследването. Бременни или кърмещи жени също са изключени. Избягва се изследването на места, където има брадавици, бенки, слънчево обгаряне, белези и активни кожни лезии, видени при наблюдението.

Групата се разделя на две, 10 в група А и 8 в група В, всяка съответстваща на вехикулум, съдържащ 5% течен хрущялен екстракт, или вехикулум - самостоятелно, съответно. Участничките в експеримента се снабдяват с продукт, достатъчен да бъде приложен в областта около окото поне два пъти на ден в продължение на 12 седмици. Измерванията се получават в началото, и след 4, 8 и 12 седмици. При всяка визита се правят снимки и се анализират чрез Анализатор на образа.

Снимките се анализират за сиви степени, които включват потъмняване/осветляване на кожата. Ясно е, че групата, третирана с течен хрущялен екстракт, проявява подобрение в сивите степени (които включват осветляване на тъмното оцветяване) . След 4,8 и 12 седмици има 11 %, 21 % и 14% осветляване на кожата под областта на окото от групата, третирана с течен хрущялен екстракт. Групата, третирана само с вехикулум, не показва никакви изменения (фиг. 23).

Варикозни вени

В изследването взимат участие общо 20 участници, които видимо нямат ексцесивна таланиестазия на краката. Групата е разделена на две групи, Група А (п-9) е снадена с течен хрущялен екстракт, съдържащ крем, докато Група В (п-11) е снабдена само с крем за приложение изцяло на краката, два пъти дневно за 3 месеца. Използва се оптичен микроскоп за получаване на образи от 2-4 места от краката, показващи варикозни вени. Образите се анализират за сиви степени чрез анализатор на Zeiss Ibas. Интегрираната оптична плътност (IOD) се изчислява за всеки участник в експеримента. Изчислява се средната стойност от всички места от всеки даден момент.

Резултатите са показани на фиг. 24. Има понижение в стойностите на IOD на 21 %, 17% и 26% след 4, 8 и 12 седмица на прилагане, съответно. Контролният вехикулум показва ниво на подобрение от 5%, 0% и 0% след 4, 8 и 12 седмици на приложение, съответно.

Други потенциални клинични приложения и приложения във ветеринарната медицина

Офгалмологая

Влошаване на зрението или слепота може да бъде причинено от множество състояния, характеризиращи се с абнормен растеж на кръвоносни съдове или неоваскуларизация. Те включват неоваскуларизация (причинено от химични или физични дразнители), корнеална инфекция, корнеално отхвърляне на трансплантанти, неоваскуларна глаукома, макуларна дегенерация, кератит от херпес вирус и диабетна ретинопатия. Течният хрущялен екстракт може да действа при тези клинични състояния чрез инхибиране формирането на нови кръвоносни съдове и чрез редуциране на телангиестазиса и възпалението.

Възстановяване на рани

Възстановяването включва комплекс от взаимодействия между клетки, биохимични модератори, молекули от екстрацелуларния матрикс и клетъчна микросреда. След дълбоко нараняване, гранулационна тъкан (фибробласти, капиляри и възпалителни клетки) най-напред растат от ръба на раната в характерен порядък. Фибробласти започват да мигрират в пространството на раната от съединителна тъкан към ръба на раната в рамките на 24 h. След придвижването им фибробластите продуцират матрични молекули (колаген и гликозаминогликани), които формират един ексграцелуларен матрикс. Първите капилярни луковици могат да бъдат забелязани в перфузата микроциркулация при ръба на раната най-рано на 18 h след нараняването. Луковицата нараства в пространството на раната и дава новата капилярна мрежа за съединителната тъкан на раната. Фибробластната пролиферация и миграция и растежът на капилярите продължава, докато пространството на раната се запълни с нова тъкан. Някои условия за възстановяване на раната, усложнени от свръхекспресия на факторите на гранулация, като хипертрофично зарастване и заздравяване на кожата на лошо обгорени хора, може да бъде подпомогнато от течен хрущялен екстракт (орално или локално), докато понижаването на автогенния проц ес би забавило процеса на заздравяване на раната.

Папулосквамозно кожно заболяване Благотворният ефект на течния хрущялен екстракт върху псориазисни лезии предполага, че други заболявания, имащи общи характеристики, също би могло да бъдат положително повлияни от локално или системно прилагане на течния екстракт. Папулосквамозното кожно заболяване се характеризира с червени до виолетови пъпки и плаки, което е резултат от надебеляване на епидермиса и/или подчертано кожно възпаление и включ ва псориазис, синдром на Райдер, питириазис на Жибер (pityriasis rosea), плосък лишей (lichen planus), питириазис рубра пиларис, вторичен сифилис, микоза и ихтиозен обрив.

Алопеция

Лигатура на малки латерални артерии, водещи кръвния поток към кожната покривка на главата, се е оказала благоприятна за предотвратяване загубата на косата, причинено от свръх мерно подлагане на въздействието на андрогени. Локално приложение на течен хрущялен екстракт върху някои участъци от кожната покривка на главата, би могло да предотврати загубата на коса чрез намаляване на кръвоносната мрежа и последващо подлагане на хормони.

Ветеринарни приложения

Твърди и/или течни хрущялни екстракти могат да бъдат приложени за животни за същите терапевтични и козметични приложения, които са описани за хора.

Неантиангиогенен ефект

Акне

Макар акнето да не е класифицирано като заболяване или неразположение с анпюгенна компонента, независимо от това то е подложено на тесгуване на течния хрущялен екстракт при пациенти на базата на това, че течният хрущялен екстракт е също и противовъзпалителен. За експериментиране на хрущялния екстракт при пациенти с акне е създадена следната гелиа форма, съдържаща в %:

Carbopol1,2

Пречистена вода77,2

NaOH0,3

Phenoxetol0,3

Tween 800,3

Течен хрущялен екстракт20,0 х екстракт от алое0,5

Течният хрущялен екстракт съдържа 9 12 mg/ml сухо вещество. Тази форма показва значително подобрение на аспекта от кожата на пациенти, засегнати от повече или по-малко проявени форми на акне (възпалително акне и кистозно акне). На фиг. 25 е показано значителното подобрение на състоянието на пациент, страдащ от акне, при локално третиране с тъмен екстракт, съдържащ вехикулум, в продължение на 12 седмици.

Тези резултати могат да се дължат на антиангиогенен ефект (като по този начин се изявява ангиогенната компонента на акнето), или мо гат да се дължат на активните ингредиенти, които имат въздействие, различно от антиангиогенното (противовъзпалителен ефект, например). Всички резултати, получени в описаното по-горе клинично изпитване, показват големия потенциал на хрущялния течен екстракт при лечение на ангиогеннозависими и/или възпалителни заболявания. Количеството на хрущялния екстракт, както и неговите лекарствени форми, могат да варират по желание и с оглед на специфични нужди.

Може да се отбележи, на базата на протеиновото съдържимо, че съставите за локално или други приложения, могат да съдържат широк интервал дози от хрущялния екстракт. Сред трите специфични категории от изпитани случаи са използвани много различни дози и/или лекарствени форми.

Кожна дразнимост

Докато анпюгенезата често се свързва с възпаление при различни заболявания, за предпочитане е да се определи всяка активност поотделно в хрущялния екстракт. В този смисъл модел на кожната дразнимост, при който не се предполага поява на аигиогенезис, е избрана за тестуване на противовъзпалителната и успокояващата активност на екстракта. За изследването са избрани девет доброволци с история на кожна чувствителност спрямо Балсам на Перу. Тестовите съединения са следните:

1. IX акулов хрущял 50%, в среда D-MEM

2. IX IX акулов хрущял 20%, в среда D-MEM

3. IXIX акулов хрущял 10%, в среда D-MEM

4. Cola nitida (Indena) 10%, Вода-алкохол 1:1.

Четирите тестови съединения се прилагат на вентралните предмишници на доброволците. Материалът е оставен да абсорбира за 20 min и след това се прилага балсам на Перу, един дразнител, върху тестуваното място. Кожното дразнене се измерва чрез увеличаване на кожното зачервяване. Степента на зачервяване се измерва с хромометър на Minolta и се сравнява с позитивни и негативни контроли. Позитивната контрола е цвят на кожата, третирана с балсам на Перу самостоятелно, а негативна контрола е място от кожата, третирано с разтвор на кола и провокирано като тестовите продукти. Статистическата значимост се изчислява чрез вероятностния Т-тест.

На фиг. 26 е показано, че кола в 10% е 70% активна. Акуловият хрущял е на 58% и 60% антидразнител при концентрации, съответно 20% и 10%. Тези резултати предполагат, че хрущялният екстракт съдържа противовъзпалителна и ус покояваща активност, отделно от антиангаогенния ефект.

Рак

На 53-годишни пациентки е поставена диагноза клетъчна не-Ходжкинова лимфома от тип В. CAT сканиращ анализ показа аденопатии около каротидната и югуларната вена (2,5 cm в диаметър) и обемна аденопатия върху десния бъбречен хилус. Пациентът е отказал хемотерапия и е приемал течен хрущялен екстракт към храната си (октомври, 1993) (дневна орална доза) от около 75 mg сухо тегло/ 7 ml от екстракта, равно на около 1-1,5 mg/kg телесно тегло/ден). Три месеца по-късно (януари, 1994 CAT анализът показва пълна резорбция на аденопатиите в шийката. През ноември 1994 абдоминалната аденопатия намалява по обем до 75%. Заболяването оттогава е стабилно и пациентът се чувства в добър здравен статус.

Кожна бариерна защита

В изследването участва група от шест здрави доброволци. Участниците получават крем, съдържащ течния хрущялен екстракт, за приложение на дясната предмишница и само вехикулум за приложение на лявата предмишница, два пъти дневно в продължение на четири седмици.

Участниците са жени на възраст от 21 до 45 години, с проява на акутно или хронично заболяване, включващо дерматолопгчни или офталмологични проблеми. Обектите постоянно проявяват еритема, обриви, петна от обгаряния и други. Избягва се на тестуваното място да има брадавици, бенки, еритема, слънчево обгаряне, белези и активни дермални лезии, наблюдавани при изследване. В деня на теста участниците са инструктирани да не използват лосиони, кремове или други продукти за лице. По време на курса на измерване участниците се адаптират поне 30 min преди тестуването в контролирана околна среда с температура 20-22°С и 40 % относителна влажност.

Тестувано място са дясната и лявата предмишница. Малък участък (3,5 cm х 7 cm) се маркира върху всяка ръка и измерването за основна трансепидермална загуба (TEWL) се получава от три места в рамките на тази област (Pinnagoda et al. (1990) Contact Dermatitis 22: 164-178; Grove (1994) in The effects of aging in oral mucosa and scin, Ed, Squier & Hill, CRS Press, pp 124-125).

За покриване на тестувания участък се използва лейкопласт и след постоянно разтриване в две посоки пластирът се отлепва (Elias (1993) J.Invest. Dermatol. 80:044s-049s). TEWL се пов таря отново. Набраздяванията, последвали TEWL измерванията, продължават в група 5. Набраздяването прекъсва, когато TEWL достигне 18 G/M²/ Hr. TEWL се измерва отново в края на последната ивичеста последователност. Броят на набраздяванията, необходими да нарушат кожната бариера, се изчислява чрез отбелязване броя на максимума набраздявания за всяка ръка по всяко време, което сочи TEWL 18 G/M²/Hr или повече. Получените резултати се анализират за статистическа стойност между третирането при различно време спрямо базата с помощта на един коефициент Z.

Обработената с вехикулум ръка не показва подобрение, докато само 26% и 21 % и повече набраздяване се изисква за увреждане на кожата след 2 седмици и 4 седмици обработка, съответно. Налице е значително подобрение (р<0,05) в бариерното състояние за всеки от участниците след обработка с течен хрущялен екстракт за 2 и 4 седмици, когато 60% и 55% и повече се изисква за разрушаване на кожната бариера (фиг. 27).

Поради това, течен хрущялен екстракт е доказано приложим за засилване на кожната бариерна функция.

Екзема

Течен хрущялен екстракт се използва в козметичен салон на основата на способността му да понижава възпалителни лезии, причинени от екзема. Козметиците използват течния хрущялен екстракт в кремове на пациенти, страдащи от много години от хронична екзема на ръцете. Интересно е, че приложенията на хрущялсьдържащ крем понижава значително проявлението на екземата по ръцете. Понастоящем хрущялсъдържащите кремове успешно предотвратяват проявлението на екземата.

Брадавици

36-годишна жена с история на заболяване от плантарни брадавици се лекува от дерматолог в продължение на приблизително три години за контролиране прогресията на брадавици и свързаната с тях болка. Сред използваните средства са течен азот, салицилова киселина (40%), анаеробна, азотна киселина и сярна киселина. Тези средства са прилагани всяка седмица в продължение на три месеца и резултатите са почти нулеви. През март 1996 г. тя е започнала за прилага акулов хрущялен екстракт директно на брадавиците. Две седмици по-късно се формира розова зона от нов епидермис около брадавиците, а следващите седмици брадавиците изчезват. Поради това, този резултат предполага, че течният хрущялен екстракт може да подпомогне лечението от брадавици.

Друга потенциални клинични приложения и приложения във ветеринарната медицина

Отхвърляне на трансплантанти

Инфекцията е един от важните фактори, включени в загиването на трансплантирани клетки. Поради това, тъканното трансплантиране може да бъде подпомогнато от противовъзпалителните компоненти, намиращи се в акулов хрущялен екстракт съгласно изобретението.

Мултиплена склероза

Причината за мултиплената склероза е неизвестна. Тъканният отговор има характеристики на имунопатологичен процес с перивенуларна мононуклеарна клетъчна инфилтрация и липса на каквото и да е открито хистопатологично проявление на инфекция. Матричните металопротеинази са важни фактори, включени в инфекциозния отговор. Доколкото течният хрущялен екстракт е силен инхибитор на матрични металопротеинази, той може да бъде използван при лечение на мултиплена склероза.

Фиброза

Настоящите концепции предполагат, че фиброзата опосредства нормалното заздравяване на раните, но не успява да го завърши, водейки до заместване на нормалната тъкан с цикатрикс. Повечето фибротични реакции се явяват вторични за травми, инфекция, възпаление или за неизвестни причини, може да има генетична компонента. Обикновено TGF-β са свръхпродуцирани и индуцират пролиферацията на фибробластни клетки и свръхпродуциране на колаген. Доколкото екстензивното отлагане на колаген е белег на фиброзата, ние предполагаме, че течен хрущялен екстракт, който може да отсрочи формирането на гранулационна тъкан, може да има продължително благоприятно въздействие в потискането на фибротичните реакции.

Възпаление на червата

Етиологията на възпалителните заболявания на червата е неизвестна, но абнорменият интестинален имунитет е включен в патогенезата на болестта на Crohn и улцерозен колит. Мукозни мононуклеарни клетки показват изменение на антитяло продукцията, пролиферация, цитотоксичност и синтез на цитокини (FGF, PDGF, TNF). Течен хрущялен екстракт показва противовъзпалителна активност и след това орално приложение може доказано да бъде полезен за терапевтично приложение на възпаление на червата.

Сърдечно заболяване

Ендотелната дисфункция на коронарно резистентни кръвоносни съдове може да се причисли към абнормалностите на микроваскулатура и вероятна миокардиална исхемия и болка в гръдния кош. На клетъчно ниво ендотелната дисфункция се свързва с понижена експресия на азотен окис (N0), един ендотелен успокояващ фактор. Синтезата на N0 позволява на васкуларната система да поддържа състоянието на вазодилатация, като по този начин регулира артериалното налягане. Недостиг в ендогенната синтеза на N0 подтиква към подобни състояния като артериална хипертензия, белодробна хипертензия и сърдечно заболяване. Ние имаме предварителни резултати от култивирани евдотелни клетки, според които течният хрущялен екстракт повишава продукцията на N0. Течният екстракт поради това, чрез N0, доказано да бъде приложим в някои състояния на заболяване на сърцето, а така също и при пациенти деца с вродено сърдечно заболяване, усложнено от белодробна артериална хипертензия.

Нещо повече, течен хрущялен екстракт може да помогне за понижаване свързаните с възпаление усложнения при атеросклероза.

Склеродермия

Склеродермията (твърда кожа) е заболяване, белязано с увеличение на фиброзната съединителна тъкан на кожата и често на висцералните органи. Тя често се проявява като хиперкератинизация на локализирани кожни плаки. Хиперкератинизацията е клетъчен процес, в който кератиноцитите на кожата напълно диференцират и акумулират ригидни кератинови фибри. Кожното състояние може да води до лимитирана ставна подвижност, ако е поразена кожата в периартикуларната област. Добавен към експериментална система, в която кератиноцитната диференциация е напреднала, течен хрущялен екстракт частично предотвратява процеса на диференциация или кератинизация. Поради това, течният екстракт може да бъде благоприятен за подобни състояния на кожата чрез предотвратяване свръхакумулирането на напълно диференцирани кератиноцити.

Приложения във ветеринарната практика

Твърд и/или течен хрущялен екстракт могат да бъдат прилагани на животни за същите терапевтични и козметични цели, описани по-горе за хора.

Козметични приложения и състави

Описаните по-горе тестове и опити показват, че хрущялният екстракт по това изобретение може да намери множество медицински приложе ния. Сред различните активности, установени в този екстракт, особено желани за приложение в козметиката са анти- ангиогенният, противовъзпалителен и инхибиторен ефект върху РКС-индуцираната диференциация. Доколкото хрущялният екстракт от настоящото изобретение показва антагонистичен ефект върху РКС-медиирани клетъчни събития, и доколкото такъв антагонистичен ефект е предположен в нивото на техниката като подобряващ кожната бариерна функция, в обхвата на настоящото изобретение се включва както метод за подобряване бариерната функция в кожа на бозайници, който включва етапа на приложение върху кожата на състав, съдържащ хрущялен екстракт и фармацевтично приемлив носител, така и същия този състав. Други или сходни състави също могат да бъдат използвани в метода за успокояване на кожата или за редуциране възпалението на кожата на бозайници. Възпалението може да бъде причинено от различни агенти, като химични дразнители, физични абразии и подлагане на ултравиолетова радиация. Състави и методи за инхибиране колагеназата в кожата също са предвидени. Колагеназата и възпалението са свързани с преждевременно състаряване (деградация на колагена) и поради това антагонистичните активности, възстановени в хрущялния екстракт, също могат да бъдат включени за съдействие в състави и методи за отстраняване на преждевременното състаряване, и за регулиране набръчкването или атрофията на кожата на бозайниците. Причините за набръчкването или атрофията са например възрастта, подлагането на ултравиолетова радиация или на замърсяване от околната среда. Съставите за локално приложение могат да включват ефективно количество от акулов хрущял, което да бъде определено за всяко специфично приложение. Най-общо, тези състави могат да бъдат приблизително от 0,1 до 75% тегл. от течния хрущялен екстракт и приблизително от 25 до 99,9% тегл. приемлив във фармацевтично отношение вехикулум. Тези състави могат да съдържат антиоксидант като агент за предотвратяване формирането на липидни пероксиди в кожата. Примери за такъв антиоксидант са токоферол, токоферолни производни, аскорбинова киселина, производни на аскорбиновата киселина и ВНТ. Съставите могат да бъдат допълнени с противовъзпалителни агенти като инхибитор на фосфолипаза А2 или получени от растенията екстракти на кола и зелен чай. Формите за локално приложение могат да бъдат различни, например разт вори, суспензии, лосиони, тинктури, галове, кремове, спрейове, емулсии, пластири, мехлеми или липозоми (поне част от течния хрущялен екстракт е включен в липозоми). Другите козметични приложения включват лечение на тъмни кръгове около очите и кожна бариерна функция.

Заключения

Методът от настоящото изобретение е показан като осигуряващ получаването на хрущялни екстракти с висока клинична стойност. Акуловите хрущялни екстракти, получени по този метод, включват множество активности, получени в задоволителни добиви. Хрущялните екстракти, поспециално течният екстракт и неговите фракции, имат голям потенциал, доколкото те са нетоксични за нормалните клетки, докато те са ефективни в широко разнообразие от заболявания или състояния.

За всички предсказани приложения (от офталмични капки до дерматологични форми и противоракови лекарствени средства), предполага се, ме минималната крайна концентрация на протеин на тоталния течен екстракт може да бъде много ниска (от около 0,01 mg/ml). Този нисък интервал на дозите зависи от достъпа и пермеабилността на активните ингредиенти в мястото на действие, както и от ефикасното улавяне на тези ингредиенти и чувствителността или отговора на тъканта спрямо антиогенни инхибитори. По-високата граница на крайната протеинова концентрация във формите за същите приложения понастоящем не са известни. Опитите с по-високи крайни концентрации са за локално приложение от около 9 mg/ml протеини във формата за случаите на псориазис и орално приложение от около 12 mg/ml в дозата от 7 ml, прилагана дневно в случаите на рак и 21 ml в терапията на артрит.

Акуловият хрущялен екстракт може да загуби някои от своите активности при лиофилизиране. Обаче, добавянето на стабилизатори или защитни агенти е известно в нивото на техниката, преди лиофилизация за съхраняване активностите за чувствителност, и прави възможно въвеждането на по-високи дози от хрущялния екстракт в сухо състояние.

Необходим материал: хладилници; хирургични инструменти; месомелачка; пластмасови торбички; промишлен смесител (3-скоростен смесител на Waring, закупен от Fisher Scientific); система за пречистване на вода (обратна осмоза и 0,1 Em филтрация; Континентална водна система, модел PRE 2202, сериен номер 91089, Modulab

Bioscience RQ/ Polishing System, закупен от Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Тази система предоставя апирогенна вода с високо качество; точен баланс на Metier, серия АЕ, закупен от Fisher Scientific; Центрофуга на Sorvall RC-285, закупена от DuPont Canada; Центрофуга СЕРА; Найлонов джоб с порьозност 1 тМ; Автоклав (автоматичен стерилизатор Sanyo, модел MAC 350Р); контейнери Nalgene 500 ml, стерилизирани при 132°С за 10 min и изсушени 35 min; Конични филтри с 24 mm порьозност Whatman Reeve Angel; Ултрафилтрационна колона (пропускателна способност молекулно тегло: 500 kDa и 1 kDa; повърхност: 25 квадратни фута; поток: 130 L/min; налягане на входа: 30 psi; налягане при изхода: 5 psi; закупен от Koch Membrane Systems Inc., Wilmington, MA, USA; санитарна цеитрофужна помпа (Monarch Industries, model ACE-S100, type А) за осигуряване поток от 130 L/min; стерилна кутия (laminar flow hut NuAire, закупена от Ingram & Bell); стерилни филтри Millipack - 60 0,22 gm, стерилни чисти или янтарни стъклени колби; концентратор DC - 10 Amicon; Rotofor Biorad 1702950; Филтри Amicon SIOYIO, SIOY30 и SIOYIOO c пропускателни стойности 10,30 и 100 kDa, съответно; FPLC Pharmacia 216007 (Computer Pharmacia 216014); Hilstand D-300 26 mm/60 cm (Pharmacia); Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia); Лиофилизатор Labconco 10273 A.

Съгласно изобретението е възможно да се създадат модификации чрез заместване на някои елементи от настоящото изобретение, с които да се постигне същата цел. Счита се, че тези вариации са покрити от настоящото описание.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на течен екстракт от хрущял, имащ част от биологично активните водноразтворими компоненти, намиращи се в интактен хрущял, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

а) хомогенизиране на хрущяла във воден разтвор при условия, съвместими със съхраняването на интегритета на посочените биологично активни компоненти, докато хрущялът се редуцира до частици, чийто размер е по-малък от или равен на 500 gm, като се получава смес от частици и суров течен екстракт със същите биологично активни компоненти;

в) центрофугиране на посочения хомогенат за разделяне на частиците от суровия течен екстракт;

c) по-нататъшно разделяне на суровия течен екстракт за получаване на краен течен екстракт, съдържащ хрущялни молекули с молекулно тегло, по-ниско от или равно на 500 kDa; и

d) концентриране на посочения краен течен екстракт, като се отстраняват молекулите с молекулно тегло, по-ниско от 100 Da.
2. Метод съгласно претенция 1, в който посочените условия включват работна температура от 0 до 20°С.
3. Метод съгласно претенция 1, в който посочените условия включват работно pH в интервала от 6 до 8 за посочения воден разтвор.
4. Метод съгласно претенция 1, в който етап

а) се провежда в рамките на 15 min до 24 h.
5. Метод съгласно претенция 4, в който етап

а) се провежда в рамките на 15 min до 1 h.
6. Метод съгласно претенция 1, в който посоченият хрущял и воден разтвор са в съотношение от 1 kg за поне около 11.
7. Метод съгласно претенция 1, в който етапът на концентриране d) се провежда чрез филтруване на посочения краен течен екстракт върху мембрана със стойност на пропускателната способност за молекулно тегло от около 0,1 kDa, а молекулите с по-ниско молекулно тегло се отстраняват.
8. Метод съгласно претенция 1, в който посоченият етап на концентриране d) включва лиофилизация на посочения краен течен екстракт.
9. Метод съгласно претенция 8, в който посочената лиофилизация се провежда в присъствието на стабилизатори или защитни агенти, добавени към посочения течен екстракт в количество, достатъчно за подобряване съхраняването на интегритета на посочените биологично активни компоненти.
10. Метод съгласно претенция 8 или 9, в който посоченият хрущял е добит от акула.
11. Метод за получаване на течен екстракт от акулов хрущял с антиколагенолитични и антианпюгенни водноразтворими компоненти, намиращи се в интактния хрущял, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

а) хомогенизиране на хрущяла във воден разтвор в условия, съвместими със съхраняването интегритета на посочените биологично активни компоненти, за редуциране на хрущяла до частички с размер, по-малък от или равен на 500 pm, като се получава смес от частици и суров течен екстракт със същите биологично активни компо ненти;

b) центрофугиране на посочения хомогенат за разделяне на частиците от суровия течен екстракт;

c) по-нататъшно разделяне на суровия течен екстракт, за да се получи краен течен екстракт, съдържащ хрущялни молекули с молекулно тегло, по-ниско от или равно на 500 kDa;

d) филтруване на посочения краен течен екстракт върху мембрана със стойност на пропускателната способност за молекулно тегло от 100 Da; и

e) възстановяване на фракцията, съдържаща молекули с молекулно тегло до 0,1 kDa.
12. Метод за получаване на течен екстракт от акулов хрущял с антиангиогенни водноразтворими компоненти, намиращи се в интактен хрущял, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

a) хомогенизиране на хрущяла във воден разтвор в условия, съвместими със съхраняването на интегритета на посочените биологично активни компоненти за редуциране на хрущяла до частички с размер, по-малък от или равен на 500 рш, като се получава смес от частици и суров течен екстракт с посочените биологично активни компоненти;

b) центрофугиране на посочения хомогенат за разделяне на частиците от суровия течен екстракт;

c) по-нататъшно разделяне на суровия течен екстракт, за да се получи краен течен екстракт, съдържащ хрущялни молекули с молекулно тегло, по-ниско от или равно на 500 kDa;

d) филтруване на посочения краен течен екстракт върху мембрана със стойност на пропускателната способност за молекулно тегло от 10 kDa;

e) възстановяване на фракцията, съдържаща молекули с молекулно тегло, по-високо от 10 kDa;

f) разделяне на тази фракция върху анионнообменна хроматографска колона; и

g) възстановяване на фракция, която се елуира при 0,8 до 1,0 М NaCl.
13. Хрущялен екстракт, добит от акула, характеризиращ се с това, че е получен по метода съгласно претенциите от 1 до 6.
14. Хрущялен екстракт, добит от акула, характеризиращ се с това, че е получен по метода съгласно претенция 7.
15. Хрущялен екстракт, добит от акула, характеризиращ се с това, че е получен по метода съгласно претенция 10.
16. Антиколагенолитичен и антиангиогенен хрущялен екстракт, характеризиращ се с това, че е получен по метода съгласно претенция 11.
17. Антианпиогенен хрущялен екстракт, характеризиращ се с това, че е получен по метода съгласно претенция 12.
18. Състав за лечение на заболявания или състояния с един или повече биологични компоненти, подбрани от групата, състояща се от туморна пролиферация, ангиогенеза, възпаление и колагенолиза, който включва ефективно количество хрущялен екстракт съгласно която и да е от претенциите 13,14 и 15 и фармацевтично приемлив носител.
19. Състав за лечение на заболявания или състояния с колагенолитична етиологична компонента, който включва ефективно количество хрущялен екстракт съгласно претенция 16.
20. Състав за лечение на заболявания или състояния с ангиогенна етиологична компонента, който включва ефективно количество хрущялен екстракт съгласно претенция 16 или 17, или комбинация от хрущялните екстракти съгласно претенциите 16 и 17.
21. Състав съгласно претенция 18 за интраперитонеално, субкутанно, окуларно, назално, орално, ректално₍сублингвално, инстрамускулно, интрадермално или трансдермално приложение.
22. Състав съгласно претенция 18 за локално приложение.
23. Състав съгласно претенция 22, като посоченият хрущялен екстракт се добавя за достигане на крайно сухо тегло от 1 до 50 mg/ml от състава.
24. Състав за локално приложение при лечение на ахне, съдържащ 2 mg от твърдото тегловно съдържимо на хрущялния екстракт съгласно която и да е от претенциите 13,14 и 15 за ml от състава, в качеството му на терапевтично ефективен ингредиент в съчетание с подходящ фармацевтичен носител.
25. Състав за локално приложение при лечение на псориазис, съдържащ 30-50 mg от твърдото тегловно съдържимо на хрущялния екстракт съгласно която и да е от претенциите 13,14 и 15 за ml от състава в качеството му на терапевтично ефективен ингредиент в съчетание с подходящ фармацевтичен носител.
26. Състав за лечение на рак, съдържащ терапевтично ефективно количество от хрущялен екстракт съгласно която и да е от претенциите 13, 14 и 15 в съчетание с подходящ фармацевтичен носител.
27. Състав съгласно претенция 26, където посоченият хрущялен екстракт се дозира така, че да достигне 0,01 до 200 mg от общото сухо тегло на посочения екстракт за 1 kg телесно тегло на пациента.
28. Състав съгласно претенция 27 за орално или сублингвално приложение на пациент, нуждаещ се от такова лечение.
29. Приложение на хрущялен екстракт съгласно която и да е от претенциите 13,14 и 15 за производство на медикамент за лечение на възпаление.
30. Приложение на хрущялен екстракт съгласно която и да е от претенциите 13,14 и 15 за производство на медикамент за инхибиране на ангиогенеза.
31. Приложение на състав съгласно претенция 22 за производство на медикамент за подобряване на кожната бариерна функция на кожата на бозайници.
32. Приложение на състав съгласно претенция 22 за производство на медикамент за успокояване на кожата на бозайници.
33. Приложение на състав съгласно претенция 22 за производство на медикамент за редуциране възпалението на кожата на бозайници.
34. Приложение на медикамент съгласно претенция 33, като посоченото възпаление е причинено от физична абразия.
35. Приложение на медикамент съгласно претенция 33, като посоченото възпаление е причинено от химичен дразнител.
36. Приложение на състав съгласно претенция 22 за производство на медикамент за инхибиране колагеназната активност в кожата на бозайници.
37. Приложение на състав съгласно претенция 22 за производство на медикамент за регулиране на набръчкването или атрофията на кожата на бозайници.
38. Приложение на състав съгласно претенция 24 за производство на медикамент за редуциране на акне в кожата на бозайници.
39. Приложение на състав съгласно претенция 25 за производство на медикамент за лечение на псориазис на кожата на бозайници.
40. Приложение на състав съгласно претенция 22 за производство на медикамент за забавяне преждевременното сьстаряване на кожата на бозайници.
41. Приложение на състав съгласно претенция 18 за производство на медикамент за ле чение на заболявания или състояния с един или повече компоненти, подбрани от групата, състояща се от туморна пролиферация, ангиогенеза, възпаление и колагенолиза.
42. Приложение на медикамент съгласно претенция 41, като посочените заболявания или състояния са подбрани от групата, състояща се от рак, папулосквамозно заболяване на кожата, артрит, акне, паяжинообразна мрежичка от кръвоносни съдове, верикозни вени, околоочни тъмни кръгове, хипертрофични белези, алопеция, екзема, брадавици, мултиплена склероза, фиброза, възпалителни заболявания на вътрешните органи, склеродермия, вазоконстриктивни заболявания, корнеална неоваскуларизация, корнеална инфекция, неоваскуларна глаукома, херпес вирус кератитис, диабетна ретинопатия и отхвърляне на трансплантати.
43. Приложение на състав, съдържащ екстракт от хрущял съгласно която и да е от претенциите 13,14 и 15, за производството на меди камент за инхибиране на ендотелна клетъчна пролиферация.
44. Приложение на състав, съдържащ екстракт от хрущял съгласно която и да е от пре5 тенциите 13,14 и 15, за производството на медикамент за инхибиране на ТРА активирана кератиноцитна диференциация.