CZ129398A3 - Způsob výroby kapalného extraktu žraločí chrupavky a farmaceutický prostředek, obsahující tento extrakt - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsob výroby kapalného extraktu ze žraloci chrupavky, majícího antikolagenolytické, protizánětlivé, antiangiogenické a protinádorové aktivity. Dále se tento vynález týká farmaceutických prostředků, obsahujících tento extrakt a způsobů výroby a použití těchto farmaceutických prostředků.

Dosavadní stav techniky

Chrupavka je avaskularizovaná tkáň, jež byla studována jako potenciální kandidát, obsahující antiangiogenické faktory. Je rovněž tkání, jež je poměrně resistentní k vývoji nádorů. Nádor spojený s chrupavkou, chondrosarkom, je nejméně vaskularizován ze všech solidních nádorů. Angiognese je jedním z důležitých faktorů vývoje nádoru. Diskrétní, solidní tumorové hmoty se objeví tehdy, když nádorové buňky mohou vyprovokovat expanzi přilehlé vaskulární sítě k dodávání potřebné výživy. Faktory zapojené do stimulace angiogenese byly proto studovány co do role ve vývoji nádorů, a antiangiogenické faktory jakož i léky mající angiogenicky inhibiční aktivitu byly rovněž zkoumány jako prostředky ke kontrole růstu nebo k ovlivnění regrese nádorů.

Bylo objeveno, že chrupavka plece telat obsahuje látky, jež inhibují vaskularizaci solidních nádorů (Langer et al., 1976). Díky povzbuzujícímu potenciálu jako protinádorového činidla byly vyhledávány zdroje většího přísuny chrupavek.

Žraloci jsou zvířata, jež mohou být potenciálním zdrojem tohoto druhu inhibitorů anigiogenesy, protože jejich endoskeleton je složen výhradně z chrupavky (6 % tělesné hmotnosti proti 0,6 % u telat). Žraloci mají také jako zajímavou charakteristiku nízkou přirozenou náchylnost k vývoji nádorů. K vysvětlení této

nízké pravděpodobnosti vývoje nádorů u žraloků bylo vypracováno^·mnoho hypotéz. Marchalonis et al. (1990) prokázali IgM protilátky schopné přímo atakovat jakékoli škodící agens. McKiney et al.-iaý, (1990) ukázali, že žraloci mají makrofágy schopné difere^iciovat normální buňky z neoplastických buněk a ničit neoplastické buňky. Rosen a Woodhead (1980) postulovali, že vzácnost nádorů u elasmobranchů (skupiny, k níž patří žraloci a rejnoci) může být způsobována vysokou iontovou silou jejich tkání, jež je ekvivalentní vysoké tělesné teplotě. Tito autoři věří, že za těchto podmínek vykazuje imunitní systém skoro stoprocentní imunologickou ochranu. Moore et al (1993) objevili, že žraloci produkují aminosterol mající antibakteriální a antiprotozoální vlastnosti. Konečně: Lee a Langer (1983) a Folkman a Klagsbrun (1987) ukázali, že žraloci produkují látku, jež inhibuje neovaskularizaci. Lee a Langer (cit. dílo) izolovali tuto látku tak, že ji extrahovali ze žraločí chrupavky za denaturujících podmínek (guanidinová extrakce). Tento způsob extrakce je však velmi zdlouhavý (41 dnů), může poskytovat extrakty, jež mají denaturované faktory, a výtěžek aktivních složek má daleko do výborného. Zatímco aktivní látka izolovaná z telat má molekulovou hmotnost kolem 16 kilodaltonů (kDa), stejná skupina výzkumníků neudává přesnou molekulovou hmotnost aktivní látky získané ze žraloků. Tato látka je definována pouze jako mající molekulovou hmotnost vyšší než 3500 Da. Oikawa et al. (1990) použili stejný způsob extrakce, jaký je popsán Leem a Langerem, ale o mnohem kratším trvání (2 dny místo 41 dnů). Antiangiogenická látka izolovaná ze žraločí chrupavky Oikawou et al. je omezena na molekulu o molekulové hmotnosti v rozmezí 1000 až 10 000 Da. Schinitzky (USP 4 473 551) popisuje vodný extrakt surové, na prášek upravené žraločí chrupavky, jehož frakce o více než 100 000 Da má protizánětlivou aktivitu samotná nebo ve spojení s glukosaminem. Žádná zmínka o složce tohoto extraktu, jež by měla antiangiogenickou nebo protinádorovu aktivitu, v tomto patentu není. Kuetner et al. (USP 4 746 729) izolovali inhibitor elastasy polymorfonukleárních neutrofilů (PMN) z bovinní chrupavky. Tento inhibitor byl získán z vodného extraktu chrupavky, z něhož byly ponechány molekuly o molekulové hmotnosti • · • ·

nižší než 50 000 Da. Frakcionace na Sephacrylu S-200 poskytla,^./.' četné frakce, z nichž byly spojeny ty s 10 - 40 kDa poté, co u nich byla prokázána antielastasová aktivita. Aktivní složka má isolelektrický bod 9,5 a může mít molekulovou hmotnost kolem 15 000 kDa. Kuetner et al. (USP 4 042 457) rovněž ukázali, že bovinní chrupavka má složku o molekulové hmotnosti nižší než 50 000, jež má inhibiční aktivitu na buněčnou proliferaci bez jakékoli aktivity na růst endothelových buněk. Balassa et al. (USP 4 822 607) získali extrakt chrupavky ve vodném roztoku, přičemž tento extrakt měl protinádorovou aktivitu. My jsme však nepozorovali žádnou antiangiogenickou aktivitu v extraktu získaném reprodukováním Balassovy metody. Spilburg et al. (USP 4 243 582) izolovali z bovinní chrupavky (guanidinovou extrakcí) dva glykoproteiny o molekulové hmotnosti 65 kDa a o pí 3,8, jež vykazovaly anti-trypsinovou aktivitu a inhibiční aktivitu na řůst endothelových buněk.

V telecích a žralocích chrupavkách je obsaženo mnoho biologických aktivit, jako jsou prozánětlivá aktivita, protizánětlivá aktivita, antiangiogenická aktivita, lysozymová aktivita, aktivita podporující buněčný růst, inhibiční aktivita proti kolagenase typů I a IV, elastase a jiným proteasám, jako je trypsin, chymotrypsin a plasmin. Nikdo však zatím nezískal extrakt chrupavky, jenž by obsahoval společně klinicky cenné aktivity.

Antiangiogenická složka(y) žraločí chrupavky byly obecně testovány v testech na králičím rohovkovém váčku nebo kuřecí chorioalantoické membráně (CAM). Celková, na prášek upravená chrupavka byla dosud testována přímo na nádorech in vivo, na lidském melanomovém xenoštěpu, implantovaném na nahé myši (USP 5 075 112), jakož i na antiangiogenický účinek v CAM testech. I když byl chrupávkovým extraktům přiřazen protinádorový účinek, tento účinek byl nejčastěji připsán antiangiogenické složce, jež připraví nádor o dodávku krve. Dosud neexistuje žádný důkaz, že by žraločí chrupavka měla nádorových buněk.

Dosud je známo málo způsobů chrupavky. Některé z nich poskytují přímý účinek na proliferaci získávání extraktů žraločí práškovou surovou chrupavku • · bez jakékoli extrakce (USP 5 075 112). Jiní používají denaturační činidla jako guanidin (USP 4 243 582). Jiní provádějí předběžné zpracování chrupavky cestou enzymatické digesce, aby se/^ ,_s.

zbavili jakýchkoli svalových, nervových a cévních struktur obklopujících chrupavku, přičemž tento krok předběžného zpracování je následován eliminací rozpouštědlech, a pak se aktivní složky tuků v organických extrahují do vodné fáze (Balassa et al. USP 3 478 146,

350 682, 4 656 147 a 4 822 607).

Účinek takovéhoto předběžného zpracování na zachování integrity biologicky aktivních složek chrupavky není znám. Pokud je příliš intenzivní, enzymatická digesce může hydrolyzovat aktivní bílkovinné složky. Například: Balassova metoda (USP 4 822 607) produkuje kapalný extrakt bez antiangiogenické aktivity a tato ztráta může být důsledkem takovéto enzymatické degradace. Balassova metoda nezahrnuje frakcionační krok, jenž by mohl obohacovat extrakt aktivními složkami. Jiní jednoduše vyrábějí vodné extrakty chrupavky (ve vodě, USP 4 473 551, nebo v solných roztocích, USP 4 746 729) eliminací nesolubilizovaného materiálu. U dříve jmenovaných způsobů se specifické frakce o specifické molekulové hmotnosti konkrétně ponechaly pro další studie a purifikaci (viz diskusi shora).

Shora citované způsoby mají několikeré nedostatky. Mohou denaturovat cenné složky. Když nemůže jít o tento případ, mají nevýhodu v tom, že jsou příliš zdlouhavé pro praktický účel. Navíc zdlouhavé způsoby nutně neposkytují dostatečná množství aktivních složek, a ze získávaných složek některé nejsou získány vůbec nebo jen v nedostatečném výtěžku na to, aby vykazovaly detegovatelnou aktivitu, nebo jsou některé přehlédnuty při soustřeďování se na získání konkrétních aktivit.

Angiogenese je zapojena nejen do vývoje nádorů. Mnohé choroby nebo stavy, ovlivňující různé fyziologické systémy (uváděné v závorce), jsou závislé na angiogenese, mezi nimi následující příklady: Arthritida a atherosklerotické plaky (kost a šlacha), diabetická retinopatie, neovaskulární glaukomy, makulární degenerace, oční herpes, trachomy a neovaskularizace rohovkových štěpů (oko), psoriasa, skleroderma, rosacae, • · · · hemangiomy a hypertrofické jizvy (kůže), vaskulární adheze λ.a angiofibromy (krevní systém). Každý nový a účinný antiangiogenický faktor proto může nalézt použití v léčbě.?’.* těchto chorob jakož i v terapii nádorů a jiných na angiggenese J; závislých chorob. Navíc: Protože mnohé ze shora zmiňovaných chorob a stavů mají také zánětlivou složku, každý nový a účinný protizánětlivý faktor může nalézt použití v léčbě těchto chorob a stavů jakož i jakýchkoli jiných zánětlivých onemocnění nebo stavů. Dále: Protože proteasy, jako kolagenasy, jsou zapojeny v řadě onemocnění a stavů, jako je rakovina a předčasné stárnutí, prostřednictvím své aktivity v degradaci kolagenu, nový a účinný antikolagenolytický faktor by mohl nalézt použití v léčbě onemocnění a stavů, majících kolagenolytickou složku. Protože s angiogenesou, zánětem a proteolýzou se lze u velké řady onemocnění a stavů setkat jednotlivě nebo v kombinacích, prodíikt, schopný antagonizovat přinejmenším všechny tyto aktivity bez ovlivnění normálních tělesných funkcí, by měl mít velkou terapeutickou hodnotu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nový způsob výroby extraktů chrupavky, majících výhodu v obsahu četných terapeuticky cenných aktivit. Z nich antiangiogenické, protizánětlivé, antikolagenolytické aktivity a aktivity proti proliferaci nádorů in vivo a přímé aktivity proti proliferaci nádorů in vitro byly potvrzeny jako přítomné v dostatečných koncentracích v extraktu žraloci chrupavky. U dalších aktivit se očekává identifikace nebo potvrzení. Všechny aktivity byly získány nebo verifikovány v kapalném extraktu žraloci chrupavky, a některé z nich byly získány nebo verifikovány v tuhém extraktu téhož.

Předkládaný vynález se týká nového způsobu získání kapalného extraktu chrupavky, majícího podstatnou součást biologicky aktivních ve vodě rozpustných složek, přítomných v nativní chrupavce, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

i.

za podmínek í*-;.· biologicky na částice,.'^,;

což yede ke ve vodném roztoku integrity řečených nezredukuje

a) homogenizaci chrupavky kompatibilních se zachováním aktivních složek, dokud se chrupavka jejichž velikost je menší nebo rovná asi 500 směsi částic a surového kapalného extraktu, biologicky aktivní složky,

b) centrifugaci řečeného a surového kapalného extraktu, a

c) další separace surového získal konečný kapalný extrakt mající molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou asi 500 kDa.

Tento nový postup má výhodu v tom, že je snadno proveditelný pm, majícího řečené í homogenátu k oddělení částic kapalného extraktu tak, aby se obsahující chrupavkové molekuly a účinný. Byly získány vysoké výtěžky extraktu chrupavky, přičemž extrakt, získaný obzvláště ze žraločí chrupavky, obsahuje přinejmenším všechny shora zmiňované biologické aktivity. Postup se s výhodou provádí za nižší teploty (kolem 0 až 20°C), v nedenaturujících podmínkách (s výhodou v čisté vodě) a blízko neutrálního pH (kolem 5 až 8), k maximalizaci pravděpodobnosti získání sloučenin o neznámých fyzikálně chemických charakteristikách. Podle tohoto postupu může být chrupavka extrahována v malém objemu roztoku (až tak malém, jako je 1 1 na 1 kg chrupavky), a po krátké době homogenizace (až tak krátké, jako je 10 až 20 minut). Pro získávání tuhého extraktu se používá stejný postup, až na to, že se získá a lyofilizuje peleta, s odstraněním supernatantu.

Tento vynález se týká extraktů chrupavky, obzvláště z biologických druhů elasmobranchů, konkrétněji ze žraloka. Tuhý extrakt vykazoval aktivitu. Tuhý extrakt může obsahovat kolagen a složky nerozpustné ve vodě. Může rovněž obsahovat zbytkovou aktivitu toho, co bylo extrahováno do celkového kapalného extraktu. Celkový kapalný extrakt je velice bohatý na aktivitu. Může být používán jako takový nebo může být koncentrován. Přednost se dává koncentračnímu kroku, jenž podporuje zachování biologických aktivit. Pečlivě jsme se vyhnuli návratu ke způsobům,jež mohou poškozovat aktivní složky, jako je odpařování za tepla. Ke koncentrování kapalného extraktu podle vynálezu se použila ultrafiltrace na membráně, mající hraniční hodnotu molekulové hmotnosti asi 1 kDa. Nanofiltrace na membráně majícím hraniční hodnotu molekulové hmotnosti kolem 100 Da byla pro zkoncentrování biologických aktivit kapalného extraktu. , (antiangiogenické, protizánětlivé) ještě lepší. V důsledku toho se testoval koncentrovaný extrakt obsahující molekuly -r o molekulové hmotnosti obsažené mezi asi 0,1 a 500 kDa.

Kapalný extrakt (0 až 500 kDa) byl dál frakcionován k charakterizaci svých komponent. Různými způsoby byly získány četné aktivní frakce. Některé z nich, testované na protinádorovu aktivitu na nádorových buněčných liniích, byly zhruba charakterizovány svou molekulovou hmotností a isolelektrickým bodem. Jiným byla připsána aktivita, obzvlášť antikolagenolytická nebo antiangiogenické. U těchto frakcí se očekává úplná charakterizace a identifikace. V úplném tekutém extraktu a jeho frakcích, jež lze s výhodou použít, byly tedy získány denné aktivity. Namísto podávání vysokých množství práškové chrupavky může být nyní podáván přijatelnější a obohacený extrakt.

Předkládaný vynález se rovněž týká terapeutických nebo kosmetických prostředků, obsahujících jako aktivní složku účinné množství jednoho ze shora uváděných extraktů. Nejvíce zájmu bylo věnováno přípravkům pro použití v dermatologii a kosmetologii. Tento zájem pochází z pozorovaných aktivit extraktů chrupavky. V tomto ohledu byly pozorované antiangiogenické, antikolagenolytické a protizánětlivé aktivity a antagonistický účinek buněčné diferenciace, zprostředkovaný signalizační dráhou, jako je proteinkinasa C v keratinocytech, uvažovány jako výchozí body k otevření cest pro použití žraločího chrupavkového extraktu v prostředcích a způsobech ke snižování zánětu nebo podráždění, regulaci vrásek nebo atrofie kůže, zpomalování předčasného stárnutí, redukci akné, zlepšování barierní funkce kůže, redukce tmavých kruhů kolem očí, redukce pavoučích cév a uzlin, regrese bradavic a k vyhlazovacímu účinku na kůži. Takovéto způsoby jsou v rozsahu tohoto vynálezu. Navíc: Protože kapalné extrakty žraločí chrupavky byly úspěšně testovány u případů rakoviny, arthritidy, psoriasis a akné, prostředky a způsoby pro léčbu ···· .··· · * · · _o * ······ ····· * · · · O“ ······ ·· onemocnění nebo stavů, majících jednu nebo více složek vybraných ze skupiny sestávající z proliferace nádoru, angiogenese, zánětu a kolagenolysy jsou v rozsahu tohoto vynálezu.

ř

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález bude snadněji pochopen na konkrétních provedeních, ukázaných v připojených obrázcích, jejichž účelem je osvětlit vynález, spíše než omezovat jeho rozsah.

Stručný popis obrázků:

Obrázek 1 ukazuje konkrétní aminokyselinové složení tekutého extraktu.

Obrázek 2 ukazuje dávkovou závislost inhibiční aktivity žraloci chrupavky (tuhý extrakt) na buněčných liniích ZR75-1 a MCP-7.

Obrázek 3 ilustruje křivky dávkové závislosti množství buněk MCF-7 v přítomnosti rostoucích koncentrací estradiolu s nebo bez dvou koncentrací tuhého chrupavkového extraktu.

Obrázky 4 a) a b) srovnání řezů nádorů prsní žlázy potkanů, jimž byla podávána voda (A) nebo kombinace pevného a tekutého chrupavkového extraktu (B).

Obrázek 5 je histogram ilustrující, že potkani léčení chrupavkou mají 50 % úbytek vaskularizované plochy ve svých nádorech.

Obrázek 6 ukazuje, že kapalný extrakt chrupavky nemá žádný účinek na proliferaci fibroblastových buněk.

Obrázek 7 ukazuje křivku dávkové závislosti inhibice proliferace buněk HUVEC kapalným chrupavkovým extraktem.

Obrázek 8 ukazuje, že kapalný chrupavkový extrakt inhibuje TPA-indukovanou diferenciaci keratinocytů.

Obrázek 9 ukazuje křivku dávkové závislosti inhibice kolagenasové aktivity kapalným chrupavkovým extraktem.

Obrázek 10 ukazuje křivku dávkové závislosti inhibÍQě kapalného chrupavkového extraktu v testu embryonální vaskularizace (ex ovo).

Obrázek 11 ukazuje účinek kapalného chrupavkového extraktu v inhibici nádorového růstu u myší.

Obrázek 12 ukazuje, že intraperitoneálni podávání kapalného chrupavkového extraktu může významně zvýšit účinnost tohoto produktu v inhibici nádorového růstu.

Obrázek 13 představuje elektroforetický profil kapalných frakcí separovaných za nedenaturujících Rotofor; markéry molekulové hmotnosti jsou pro porovnání s izolovanými frakcemi kapalného extraktu před frakcionaci.

Obrázek 14 ukazuje obraz HPLC kapalného extraktu nižší než 10 000 podmínek na zařízení ukázány vlevo a jsou následovány vzorkem ukazuje obraz HPLC migrace frakcí celkového podle vynálezu, majících molekulovou hmothost Da, přičemž tyto frakce byly zkoncentrovány subfrakcí.

a rozděleny na pět

Obrázek 15 frakcemi kapalného (DUP), přičemž jedna měla molekulovou 10 000 Da a druhá měla molekuly větší než 10

Obrázek 16 ukazuje obraz HPLC migrace žraločí chrupavky. V panelu A označuje DUP extrakt podle vynálezu. V panelech extrakty podle předchozích znalostí, et al.

ukazuje výsledky testu EVT získané s dvěma extraktu žraločí chrupavky podle vynálezu hmotnost nižší než

Ba C,

Balassa

000 Da.

tří různých chrupavkový

BAL a OIK extraktů kapalný označují et al. resp. Oikawa

Obrázek def inovaných Obrázek vynálezu a podle C = OIK.

Obrázek 19 vynálezu a podle

Obrázek 20 podle vynálezu a

Obrázek 21 ukazuje obraz HPLC v Obrázku 17.

ukazuje CZE srovnání předchozích znalostí v migrace stejných extraktů, kapalných oboru. A kapalných oboru.

extraktů extraktů podle ; BAL, podle ukazuje EVT srovnání předchozích znalostí v ilustruje srovnání aminokyselinového složení podle předchozích znalostí v oboru, ilustruje významné zlepšení stavu dvou pacientů trpících psoriasou, jednoho s hyperkeratosou 22 a) a b) a druhého • «♦1 · * · f···· • ΐ · · v «4 *· »·· • » »·««· Í ···· · · · ·· ·· ♦ · · *· · · bez hyperkeratosy 22 c) a d) , když byli léčeni místním prostředkem obsahujícím účinné množství koncentrovaného kapalného chrupavkového extraktu (spodní fotografie), ve srovnání s jejich počátečními stavy (horní fotografie). . _f.

Obrázek 22 ukazuje zlepšení ve vzhledu pavoučích žilek na tváři lidských subjektů, léčených kapalným chrupavkovým extraktem.

Obrázek 23 ukazuje zlepšení ve vzhledu tmavých kruhů kolem očí lidských subjektů, léčených kapalným chrupavkovým extraktem.

Obrázek 24 ukazuje zlepšení ve vzhledu varikózních žil na nohách lidských subjektů, léčených kapalným chrupavkovým extraktem.

Obrázek 25 ilustruje významné zlepšení stavu pacientky trpící akné, když byla léčena místním prostředkem obsahujícím účinné množství koncentrovaného kapalného chrupavkového extraktu (spodní fotografie), ve srovnání s jejím počátečním stavem (horní fotografie).

Obrázek 26 ukazuje protizánětlivý potenciál kapalného chrupavkového extraktu na lidské kůži.

Obrázek 27 ukazuje zlepšení bariérové funkce kůže lidského subjektu ošetřovaného kapalným chrupavkovým extraktem.

V jednom konkrétním provedení byla chrupavka získána ze zdravých žraloků druhů Black Spiny Dog Fish a Common Spiny Dog Fish. Veškeré svalové a vazivové tkáně byly odstraněny seškrábáním pomocí skalpelů a nůžek, zpracovaných ethanolem. Chrupavka pak byla vakuově zabalena do plastových sáčků a zmražena na - 20°C pro další použití. V předkládaném provedení postupu lze použít jakýkoli zdroj chrupavky. Žraločí chrupavku jsme vybrali z důvodů oznámených v části Dosavadní stav techniky. Má se za to, že při vycházení z chrupavky elasmobranchů (jež zahrnuje žraloky a rejnoky jako živočišné druhy této skupiny) by se měly získávat téměř rovnocenné produkty. Produkty budou nejpravděpodobněji odlišné jak co do povahy, tak co do koncentrace aktivních principů, když se použije savčí zdroj chrupavky.

« ♦ « «

- 11 Při přípravě chrupavky před její extrakcí lze použít? jakýchkoli variací, pokud podstatné neovlivní aktivitu produktu, jež je předmětem zájmu (například celkového kapalného extraktu nebo jeho konkrétní frakce). Některé aktivní složky _tmohou odolávat proteolytické digesci k odstranění jakýchkoli obklopujících tkání, jak zjistili Balassa et al. (USP 4 822 607), zatímco jiné nemusí vydržet takovéto zpracování. Jednou z aktivit, u níž se ukazuje, že neoddává takovémuto předchozímu zpracování, je antiangiogenická aktivita (Obrázek 19). Proto, když je záměrem vyrobit kapalný extrakt, obsahující tolik, jak je jen možno, ze všech ve vodě rozpustných aktivních složek, jimž jsou přiřazeny oddělené aktivity, musí se extrakční postup takovémuto kroku digesce vyhnout nebo jej pečlivě sledovat, aby se zabránilo rozsáhlé hydrolýze nebo proteolýze.

Preparace chrupavkového extraktu

Chrupavka se používala čerstvá, rozmražená na 4°C, nebo zmražená. Chrupavka pak prošla mnohokrát (konkrétněji třikrát) otvory masového mlýnku, aseptizovaného s přiměřeným objemem vody (stejné množství přibližným minimálním objemem, ale může být ethanolem, spolu (hmotnost/objem) je zvyšováno bez toho, že by mělo vliv na výtěžek získávání cenných složek). Malý objem je výhodný, protože je z praktického hlediska pro manipulaci příjemnější než zbytečně velké objemy. V praxi byla voda čištěna inverzní osmózou a mnohonásobnou filtrací až po 0,1 μκ filtr. Místo vody mohou být použity mnohé vodné roztoky (obsahující, například, soli). Když se předpokládá získání četných, ve vodě rozpustných aktivit, je výhodná práce blízko neutrálního pH (5,0 až 8,0) a za nedenaturujících podmínek, aby se předešlo lyži nebo denaturaci některých z aktivních složek chrupavky. Chování neznámých bílkovin ve vodných roztocích nelze předvídat: Některým bude lépe v kyselém pH, jiným při zásaditém pH. Navíc: Některé bílkoviny mohou být extrahovatelné v mírně denaturujících podmínkách, když takováto denaturace ireverzibilně neovlivní renaturaci těchto bílkovin ve vodných roztocích. Jasně řečeno:

* i

Veškeré podmínky extrakce, jež jsou kompatibilní se zachováním? biologicky aktivních, ve vodě rozpustných složek chrupavky, jsou v rozsahu vynálezu. Proto se, při uvážení všech těchto faktorů,. ,, ukázalo provádění extrakčního postupu aktivních složek chrupavky v čisté vodě správnou volbou pro získání dobrého výtěžku složek, u nichž se ještě jen má definovat struktura a chování.

Směs chrupavka/voda se pak zhomogenizovala mícháním v kuchyňském mixeru při maximálních obrátkách, při asi 4°C po 20 minut; při této homogenizaci se teplota homogenátu zvýšila ke 20°C. Obrátky, jakož i objem vodného roztoku, mohou samozřejmě ovlivnit jak čas, tak výtěžek extrakce. Rozumné rozmezí doby homogenizace (definované k částicím menším než 500 μπι) může proto být od tak krátké doby, jako je 10 minut, po tak dlouhou, jako je 24 hodin, s výhodou mezi 10 až 60 minutami. Teplota se má udržovat pod asi 10°C, aby se zabránilo veškeré degradaci aktivních složek endogenními enzymy, když se nepoužívají žádné inhibitory enzymů. Ideálně se má vyhledávat teplota blízká 0°C. Protože normálně se takovéto experimentování provádí v chladové místnosti, kde teplota může být udržována mezi 4 a 10°C, takovéto rozmezí je považováno za přijatelné v daném postupu. Pro potřeby jasnosti a stručnosti, výraz asi 4°C je zde níže používán k označování tohoto přijatelného rozsahu teplot.

Zkapalnění tohoto homogenátu lze dále dosáhnout tím, že se podrobí dezintegraci v přístroji Polytron po dobu 10 minut při asi 4°C, pokud se mixerem dostatečně nezmenšila velikost částic. Alternativně může směs z mixeru být homogenizována ve výkonnějším mixeru/dezintegrátoru, jenž, v našich rukách, ušetřil 10 minut zkapalňovacího kroku. Na konci dovršeného homogenizačního kroku je reziduální velikost částic menší než asi 500 μιη. Je samozřejmé, že přijatelné rozsahy času a teploty, rozebírané pro získání první mleté chrupavky, jsou přijatelné stejně. Velikost částic po homogenizaci nemusí být extrémně malá. Nutnosti převést chrupavku na prášek před homogenizací se lze tedy vyhnout. Ve skutečnosti může převádění chrupavky do formy prášku před vodnou extrakcí naopak způsobit denaturaci cenných aktivit, zvláště když takovéto převádění probíhá v lyofilizovaném nebo usušeném stavu.

Homogenát byl centrifugován při 13 600 x g po 15 minut při ¹ asi 4°C, kterýžto krok je jedním ze způsobů, jak rychle a účinné oddělit supernatant od pelety. Variace a nastavení těchto^ parametrů spadají jasně do znalostí osoby zběhlé v oboru a^závisí pouze na objemu homogenátu a na použitém zařízení.

Výsledná peleta byla lyofilizována po 24 až 48 hodin. Tato první frakce je dále definována jako lyofilizát nebo tuhá extrakt.

Supernatant může být, pokud je to potřebné, filtrován na filtru 24 pm Whatman, k odstranění částic, jež mohou mít účinek na výkon ultrafiltrační kolony. Filtrovaný materiál je pak ultrafiltrován při asi 4C na koleně s tangenciálním tokem, mající porozitu pro asi 500 kDa, jež umožňuje, aby byl získán první surový permeát obsahující ve vodě rozpustné molekuly o molekulové hmotnosti mezi 0 a asi 500 kDa. Tento šifrový proteklý extrakt byl filtrován na 0,22 μιη filtru a pro další použití alikvotován do aseptických láhví. Na tuto frakci bude dále odkazováno jako na surový permeát kapalného extraktu.

Alternativní, výkonnější procedura byla vyvinuta k získání pelety a supernatantu. Krok centrifugace při 13 600 x g po 15 minut s následnou hrubou filtrací na filtrech Whatman byl nahrazen centrifugací v centrifuze CEPA vybavené nylonovou kapsou s porozitou 1 μιη, při 3000 - 4000 x g. Preparace o 25 kg / 25 1 může být tímto způsobem centrifugována v průběhu 30 minut a může poskytnout asi 29 litrů supernatantu. Získaný vodný objem je vyšší než počáteční objem vody, což napovídá, že se sklízí část vodného obsahu chrupavky samotné. Lyofilizát a celkový kapalný extrakt mohou mít následující přibližné složení, jež zhruba bere do úvahy variace pozorované od šarže k šarži a za použití různého materiálu.

TUHÝ EXTRAKT:

Lipidy 7,35 % ¹

Bílkoviny 46,2 % ²

Vlhkost 20,4 %

Sodík 4,16 mg/g ³

- 14 • ·

Draslík	2,64	mg/g
Vápník	114	mg/g
Hořčík	1,49	mg/g
Zinek a	železo:	stopy

KAPALNÝ EXTRAKT:

Lipidy	0,10 -	0,20 %
Bílkoviny	8-25	mg/ml
Sušina	8-25	mg/ml
Vlhkost	97 - 99	%
Sodík	30 - 220 mg/100
Draslík	30 - 40	mg/100

Vápník 2,0 mg/100 g

Hořčík 1,1 mg/100 g

Zinek a železo: stopy ^1/2 Měřeno podle instrukcí publikovaných v AOAC Official (1984) sekcích 16.219-220 resp. 2.055;

³ Měřeno podle SAA postupu.

Obsah bílkovin byl hodnocen Kjeldahlovou metodou, jež ve skutečnosti měří organický dusík (N). Organický dusík je převeden na ekvivalentní bílkovinu s použitím následující rovnice:

Obsah bílkoviny (mg/ml) - (% N x 6,25) děleno 100

Za situace, kdy cukry nelze detegovat, se dá předpokládat, že v jednom nebo druhém extraktu jsou, ale ve formě proteoglykanů nebo mukopolysacharidů. Je možné, že tyto sloučeniny jsou zahrnuty do měřené hladiny vlhkosti. Lyofilizát obsahuje neočekávanou hladinu vlhkosti, jež byla měřena podle OH- skupin. Protože 20 % obsahu vody má blízko k procentu cukrů normálně získaných z chrupavky, zatímco vlhkost lyofilizátu musí být blízká 0 %, je potřebné verifikovat tuto hypotézu.

Kapalný extrakt chrupavky byl analyzován na obsah aminokyselin. Průměrné množství celkových aminokyselin bylo • · • · • · ·

- 15 přibližně 1,1 mg na ml, přičemž volným aminokyselinám odpovídá? 0,67 mg (61 %) a aminokyselinám bílkovinného původu 0,44 mg (39 %). Distribuce všech aminokyselin je ukázána v Obrázku 1... Byly detegováno též významné množství taurinu (není ukázánqj.

Hlavní aminokyseliny přítomné v kapalném extraktu jsou reprezentativní pro bílkoviny a peptidy z chrupavky. Například: Lysin, glycin, kyselina asparagová a glutamová představují velkou část z aminokyselinového obsahu tekutého extraktu a jsou hlavními složkami N-telopeptidového intermolekulárního provázání v kolagenu (Hanson et al.

1251-1258 ) .

(1992) J. Bone & Min. Res. 7:

Mikrobiální limit kapalného s použitím USP XXIII <61> standardů.

extraktu byl kontrolován

Testy aktivity

Tuhý extrakt

In vitro testy:

Tyto testy se prováděly na nádorových, na hormonech dependentních buněčných liniích MCF-7 a ZR75-1 (ATCC (R) čísla 22-HTB resp. 1500-CRL

Buňky ZR75-1:

a. Základní RPMI médium: 52 g RPMI 1640 bez fenolové červeně (Sigma R8755), 17,875 g Hepes (volná kyselina, Sigma H0763), 0,55 g pyruvátu sodného (Sigma P5280) a 10 g NaHCO₃ bylo smícháno v 5 1 čisté vody a nastaveno NaOH na pH 7,40.

Pokud se nepoužije okamžitě musí být tento roztok chráněn před světlem pro zachování fotolabilních látek. Tento roztok byl zfiltrován, rozdělen do 500 ml sterilních láhví a skladován při 4°C maximálně po dobu tří měsíců.

• ·

b. Médium k udržování buněčné kultury: Základní RPMI médium bylo doplněno 10 % (objem/objem) FBS (fetálního bovinního séra), 100 U penicilinu G / 50 μg streptomycin sulfátu (Sigma P0906) / ml média, 2 mM L-glutaminem (Sigma G1517) a 1 ηΜ E2 (β-estradiol Sigma E8875).

c. Experimentální médium: Základní RPMI médium bylo doplněno 5 % FBSA (fetálního bovinního séra adsorbovaného na dextran-aktivním uhlí), 2 mM L-glutaminem, 100 U penicilinu G / 50 μg streptomycin sulfátu / ml média, 50 ng/ml insulinu (Sigma). K tomuto médiu se přidaly rostoucí koncentrace shora popsaného lyofilizátu jakož i různé koncentrace E₂ (10 až 10 M).

Buňky MCF-7:

a. Základní DME-F12 médium: DME-F12 médium (bez bikarbonátu a bez fenolové červeně, Sigma) bylo rekonstituováno v čisté vodě podle instrukcí výrobce. Na jeden litr se přidalo 1,2 g hydrogenuhličitanu sodného a pH bylo nastaveno NaOH/HCl na 7,40. Tento roztok byl zfiltrován, rozdělen do 500 ml sterilních láhví a skladován při 4°C maximálně po dobu tří měsíců.

b. Médium k udržování buněčné kultury: Základní DME-F12 médium bylo doplněno 10 % (objem/objem) FBS (fetálního bovinního séra), 100 U penicilinu G / 50 pg streptomycin sulfátu / ml média, 2 mM L-glutaminem (Sigma) a 1 ηΜ E₂-

c. Experimentální médium: Základní DME-F12 médium bylo doplněno 5 % FBSA (fetálního bovinního séra adsorbovaného na dextran-aktivním uhlí), 2 mM L-glutaminem, 100 U penicilinu G / 50 μg streptomycin sulfátu / ml média, 50 ng/ml insulinu (Sigma). Jak je popsáno pro ZR75-1 buňky, lyofilizátu E₂ byly přidány ve stejných koncentracích.

d. Příprava FBSA: Fetální bovinní sérum bylo smícháno s 1 % (hmotn./obj.) aktivního uhlí (alkalický odbarvující uhlík). K roztoku uhlí-sérum byl přidán roztok dextranu T70 k dosažení « 4 · · 4 * 4 ΐ 4 · · · • 4 44444 4 4444 444« 4 koncentrace 0,1 % (hmotn./obj.). Směs byla míchána přes noc při’

4“C. Po centrifugaci při 4’C po 30 minut při 10 000 x g bylo sérum dekantováno, smícháno znovu ve stejných poměrech s uhlím, a dextranem, mícháno za pokojové teploty po tři hodiny g, znovu centrifugováno. Sérum pak bylo tepelně inaktivováno při 56”C po 20 minut, sterilně zfiltrováno a alikvotováno do sterilních kónických zkumavek Falcon.

Testy experimentální kultury a výsledky:

Buňky ZR75-1 a MCF-7 byly rozrůstány k dosažení hustoty populace 20 000 buněk/jamku na 24-jamkových destičkách nebo 150 000 buněk/jamku na 6-jamkových destičkách, a zpracovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti různých koncentrací lyofilizátu připraveného jak se uvádí shora. K tomuto působení se tuhý extrakt chrupavky resuspenduje v kultivačním médiu a sterilně zfiltruje, takže se získají a testují jeho ve vodě rozpustné složky. Všechny pokusy se prováděly v triplikátech. Kultivační média byla odstraňována a nahrazována čerstvými médii každé dva dny. Buňky rostly v inkubátoru pod trvale zvlhčovanou atmosférou obsahující 5 % CO₂ , při 37°C, po 17, 7, 3 resp. 3 dny, jak odpovídá prvnímu, druhému, třetímu resp. čtvrtému pokusu. Inhibice růstu buněk byla měřena přímým počítáním buněk nebo měřením obsahu totální DNA v jamce.

Koncentrace lyofilizátu

Inhibice buněk (%)

MCF-7 ZR75-1

1. pokus: 17 dnů mg/ml mg/ml mg/ml

1,5

14,33

62,66

2,0

33,6

90,8

2. pokus: 7 dnů mg/ml mg/ml mg/ml

3,73

15,7

68,37

0,97

29,0

66,0

3. pokus: 3 dny mg/ml

100 mg/ml

95,8

94,6

95,0

98,0

4. pokus: 3 dny mg/ml mg/ml mg/ml

100 mg/ml

34.4

62.5

95,8

94.6

51.5

70.5

Procenta inhibice buněčného růstu uvedená shora ukazují, že tuhý extrakt chrupavky může způsobem závislým na koncentraci inhibovat růst buněk těchto dvou buněčných linií.

Obrázek 2 ukazuje, že dávky tuhého extraktu 50 a 100 mg/ml jasně vyvolávají na těchto buněčných liniích hypoplasii, po třech dnech působení.

··«· ·««· ··«· • · « · * ·· · · »·· • · ···«· · ···· ·· · · · ·· ··· · ··· _ i o v __ Q

Obrázek 3 ukazuje, že v přítomnosti 10 až 10 M estradiolu reagovaly buňky, na něž se působilo, stejně jako kontrolní buňky, t.j. tak, že nebyly stimulovány těmito dávkami hormonu. Avšak: Nad 1 nM byly kontrolní buňky silně stimulovány a koncentrace DNA dosáhla 3,75 μ9 v přítomnosti 10 M estradiolu (proti 0,69 gg v kontrole bez estradiolu). V buňkách, na něž se působilo 30 a 50 mg/ml lyofilizátu, je DNA měřená při nejvyšší stimulaci 1,9 resp. 1,8 μg. Obrázek 3 ukazuje, že afinitní konstanta (Km) pro estradiol je u buněk, na něž se působí, třikrát resp. 16 krát vyšší (31,3 a 174,0 nM) než hodnota Km kontrolních buněk (11,7 nM) , v přítomnosti 30 resp. 50 mg/ml. Toto znamená, že pro dosažení stejného růstu buněk je nutná vyšší koncentrace estradiolu, pokud je přítomný extrakt chrupavky. Tento extrakt tedy snižuje maximální odezvu (s její 90 % inhibicí) a zvyšuje afinitní konstantu k estradiolu u buněk, na něž se extraktem působí.

In vívo testy:

Model DMBA indukovaného potkaního mamárního nádoru

a. Popis testovacího systému: Čtyři sta 40 dnů starých samic potkanů Sprague-Dawley (získaných od Charles River Co., St-Constant, Québec) bylo adaptováno na jejich prostředí po 12 dnů. V tomto čase jim bylo v pití podáno 20 mg DMBA/1 ml kukuřičného oleje (9,10-dimethyl-l,2-benzantracen, získaný od Sigma Chemical Co.). Tři měsíce po tomto působení bylo vybráno 240 potkanů, u nichž se vyvinul mamární nádor, a rozděleno do dvou skupin. První skupina sestávala z pěti podskupin potkanů. Potkani ze skupin, na něž se působilo, dostávali denní dávku rostoucích koncentrací lyofilizovaného extraktu v 3 ml vody po osm týdnů, zatímco kontrolní skupina dostávala stejný objem vody. Druhá skupina sestávala ze čtyř podskupin potkanů. Potkani ze skupin, na něž se působilo, dostávali také denní dávku lyofilizátu v 3 ml vody, bez kapalného extraktu nebo v kombinaci s ním, po deset týdnů, zatímco kontrolní skupina dostávala stejný

objem vody. Jen jedna podskupina druhé skupiny potkanů, u níž se působilo koncentrací 3000 mg/kg/den lyofilizátu a 3 ml kapalného extraktu, dostávala též intraperitoneální (i.p.) injekce menší dávky kapalného extraktu (asi 8 mg bílkoviny v 1 ml vody).

Potkani vážili 151-175 g na začátku daných dvou pokusů a dostávali stravu a vodu ad libidum. První skupina potkanů měla nádory o středním průměru 0,9 cm, zatímco druhá skupina potkanů měla nádory o středním průměru 0,6 cm.

b. Protinádorová aktivita: Výsledky jsou shrnuty jak následuje

Denní dávky chrupavkového extraktu podávané v pití	% inhibice nádorového růstu (snížení průměru nádoru proti kontrole)
1. pokus: Trvání 8 týdnů
Placebo	0
500 mg/kg/den	2
1000 mg/kg/den	4
3000 mg/kg/den	14
5000 mg/kg/den	15
2. pokus: Trvání 10 týdnů
Placebo	0
3000 mg/kg/den	12
3000 mg/kg/den + 3 ml kapalného
extraktu	18
3000 mg/kg/den + 3 ml kapalného extraktu
+ 1 ml inj.	20

* « * * « «· · · « · · « · ····· · · · · · ··*· · ·· ··« · ···

Tyto výsledky ukazují, že lyofilizát obsahuje aktivní složky, jež jsou absorbovány v gastrointestinálním traktu a zpomalují progresi nádorů. Tato inhibice může být přímým, účinkem na nádorové buňky nebo antiangiogenesou zprostředkovaným účinkem, zasahujícím do nádorového růstu.

Kapalný extrakt rovněž obsahuje inhibiční aktivitu, protože jeho podávání způsobovalo další snížení velikosti nádoru o asi 6 %.

Tyto výsledky rovněž napovídají, že lyofilizát může obsahovat aktivní složky, jež nejsou ve vodě rozpustné nebo že může obsahovat zbytkové, ve vodě rozpustné aktivní složky. Proto lze, pro poslední eventualitu, uvažovat o re-extrakci pelety ve vodném roztoku pro maximální zisk ve vodě rozpustných složek, přičemž může být výtěžek ještě zlepšen.

c. Histopatologie: K hodnocení netoxicity tuhého extraktu chrupavky byla zvířata použitá ve shora uvedených in vivo pokusech zabita dekapitací a k analýze byly brány následující tkáně: Játra, plíce, ledviny, srdce, mozek, svaly a mamární žlázy. Z těchto tkání byl odstraněn tuk a potom byly fixovány po dva dny v Bouinově tekutině. Po dehydrataci v ethanolu byly fixované tkáně uloženy do parafinu. Byly získány jejich řezy a upevněny na skleněné podložky, obarveny hernatoxylinem a vizualizovány pod mikroskopem.

Histologická prohlídka ukázala, že nejsou viditelné žádné škodlivé účinky při použití nejvyšších dávek tuhého extraktu samotného nebo při použití tuhého extraktu v kombinaci s kapalným extraktem (data nejsou ukázána).

Toto napovídá, že lyofilizát a kapalný extrakt mají selektivní aktivitu v regresi velikosti nádorů.

U nádorů mamární žlázy (viz Obrázky 4a a b) bylo ve skupině zvířat, jež dostávala tuhý a tekutý extrakt chrupavky, pozorováno důležité zmenšení (55 %) plochy krevních cév (Obrázek 5).

Zmenšení velikosti nádoru může být způsobeno významným snížením jeho vaskularizace, přímým účinkem na nádorové buňky, nebo kombinací obou fenoménů. Antiangiogenický účinek těchto extraktů je dobře vykreslen shora. Přímý hypoplasní účinek byl » · t · t * · « v · * 4 ··«·· · ···· ··* * 4 • · *·· · ·»· pozorován in vitro na hormonálně závislých buňkách, což zbývá potvrdit in vivo.

Protože shora zmiňované výsledky ukázaly, že kapalný extrakt má u ZR75-1 buněk zvýšený účinek přes chrupavkového extraktu, složky kapalného zkoumány.

a nad účinky tuhého extraktu byly dále

Kapalný extrakt

In vitro test:

Nádorové buněčné linie:

Několik nádorových v přítomnosti kapalného je přítomna hypoplasní (oddíl shora).

buněčných linií bylo necháno růst extraktu chrupavky k zjištění, zda aktivita pozorovaná s tuhým extraktem

Ve stručnosti: Buňky byly naneseny na 96-jamkové destičky a rozrůstány v kultivačním médiu (specifickém pro každý typ buněk, například buňky MCF-7 byly rozrůstány jak je popsáno v oddílu shora) v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací kapalného extraktu. Proliferace buněk byla měřena MTT testem po 3 až 5 dnech kultivace. Nádorovými buněčnými liniemi byly:

CHANG:

Hep-G2:

A2780:

MCF-7:

MCF-7-ADR:

Nádorové hepatocyty

Nádorové hepatocyty

Ovariální adenokarcinomové buňky

Mamární adenokarcinomové buňky (závislé na estrogenu)

Mamární adenokarcinomové buňky (resistentní k Adriamicinu)

Kapalný extrakt chrupavky vykazoval protiproliferační aktivitu na všech nádorových buněčných liniích. Nejsilnější φ · » · · » * « «· · φ » »·* · · · ··· · ·«« ·· • · ··· Μ · ·· inhibice, 50 resp. 80 %, byla získána při koncentraci 8,5 mg/ml (sušina kapalného extraktu/ml kultivačního média) na buňkách MCF-7 resp. A2780.

Nelyofilizovaný a lyofilizovaný kapalný chrupavkový ^xtrakt byly stejně potentní v své schopnosti inhibovat proliferaci nádorových buněk. Toto napovídá, že inhibiční faktor(y) nejsou denaturovány tímto postupem zkoncentrování.

Primární kultivované buňky:

a. Fibroblasty z neovaskulárního glaukomu: Po hodnocení specificity aktivity na nádorové buňky byl permeát získaný po ultrafiltraci testován na buňkách mesenchymového původu, lidských TENON fibroblastech (HTF), jež jsou normálními fibroblasty. Byly použity pouze HTF ze dvou pacientů (jednoho s neovaskulářním glaukomem, NVG, a druhého s primárním otevřeným úhlovým glaukomem, POAG).

Subkultivace a udržování HTF: Každá konfluentní kultura byla pasážována promytím a uvolněním s 0,5 ml 0,05 % trypsinu/0,5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) po 5 - 10 minut při 37°C. Pak bylo přidáno 1,5 ml média DME/F-12, obsahujícího 15 % fetálního bovinního séra (FBS) k neutralizaci trypsinu/EDTA.

Asociace buněk byla provedena triturací a přenosem do 25 cm T-lahviček, do nichž bylo přidáno další médium obsahující o 10 % FBS. Po dosažení konfluence byly HTF přeneseny do 75 cm a konečně do 180 cm² T-láhví. Když se získal dostatek buněk, některé z nich se použily k pokusů, jež jsou popsány níže, a jiné byly současně zamraženy k zachování identické pasáže pro příští pokusy.

Experimentální protokoly: Když bylo dosaženo konfluence, buňky od jednoho pacienta rostoucí ve dvou nebo třech 180 cm T-láhvích byly disociovány postupem popsaným shora. Po krátké centrifugaci při nízkých obrátkách byly buňky spočítány pomocí přístroje ZMI Coulter Counter 216013, vybaveného zařízením 256-Chanelyzer.

* ♦ • 4 4 4 4 4 4 » 4 · · · · 4 » 4 · _ O A — «»♦·»· « · » “ 44 4· 44 ·# 4« 44

Pro všechny in vitro pokusy jež následují, se do každé 16 mm misky a 12-jamkové destičky očkovalo přibližně padesát tisíc buněk do 1 ml DME/F-12 média obsahujícího 1 % FBS. Sedmnáct hodin po zaočkování byl přidán 1 ml čerstvého stejného média, doplněného 1 % FBS (absolutní kontroly). V závislosti na rozvrhu pokusu (viz shora a zdola) médium s 1 % FBS bylo nebo nebylo doplněno GF (růstovými faktory) nebo kapalným extraktem chrupavky, a bylo sterilně zfiltrováno. V tento den (den 0) byly některé vzorky buněk také spočítány pro stanovení účinnosti nanášení (jež musí být rovná nebo vyšší než 95 %).

Čtyřicet osm hodin po začátku pokusů byly buňky promyty, disociovány a znovu počítány. Počet buněk byl vyjádřen jako procento buněk získaných v absolutních kontrolách.

Každá absolutní kontrola, obsahující 1 % resp. 5 % FBS, a každá experimentální skupina, doplněná 1 % FBS a jednotlivými GF nebo kapalným extraktem chrupavky, sestávala ze vzorků v triplikátech.

Všechny pokusy se pokaždé prováděly na buňkách jednoho nebo dvou pacientů a byly opakovány přinejmenším dvakrát.

V těchto pokusech se přidávaly GF, růstový faktor odvozený z prasečích krevních destiček (pPDGF) a lidský rekombinantní bazický fibroblastový růstový faktor (hr bFGF) (dar Dr. P. Brazeaua z Farmitalia Carlo Erba, Miláno, Itálie) v koncentracích 10 resp. 100 ng/ml v 1 % FBS). Čtyřicet osm hodin po začátku pokusů byly buňky dispergovány v trypsinu-EDTA a spočítány na přístroji Coulter Counter. Všechny hodnoty v triplikátech (sloupce 1, 2a 3), jež se objevují níže, se rovnají jedné dvanáctině počtu na jamku.

Výsledky: Výsledky jsou shrnuty v Obrázku 6. HTF byly získány z glaukomu muže o stáří 53 let. Zatímco růstové faktory, jako PDGF a bFGF, vykazovaly stimulační aktivitu na HTF (* P < 0,02, P < 0,01, stanoveno Studentovým-Fisherovým testem), nebyl získán žádný účinek, pozitivní ani negativní, když tyto buňky byly rozrůstány v přítomnosti kapalného extraktu chrupavky (1 kg/21). Toto napovídá, že hypoplasní aktivita kapalného extraktu chrupavky na nádorové buňky není univerzální

- 25 ·· ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ··»· · · · · • · * * *··* · ·· • · ··· · · * ··· · ··* « · • · ··· · ta te » ·· ·« ·· ·· ·· ·· a neovlivňuje růst fibroblastů. Stejný kapalný extrakt chrupavky rovněž neměl účinek na jiný typ fibroblastových buněk, HSF (fibroblasty lidské kůže, data nejsou ukázána). I když to nebylo testováno, předpokládá se, že ani tuhý extrakt nevyvolává žádný účinek na normálních buňkách.

b. Endothelové buňky z lidské pupeční

HUVEC byly extrahovány pomocí kontrolované jak je popsáno v Jaffe et al.

byly používány před čtvrtou trypsin-EDTA). Kvalita buněk byla v inkorporaci di-acetyl LDL a faktorem VIII.

Endothelové buňky byly nanášeny s hustotou na sterilní misky pokryté želatinou. Buňky byly kultivovány šňůry (HUVEC): Buňky digesce kolagenasou, (1973). Čisté endothelové buňky pasáží (ve analyzována na na schopnost všech jej ich být i pasážích kapacitu označeny

500 buněk/cm² s úplným médiem (Medl99 + heparin (90 gg/ml) + L-glutamin (2 mM) + bikarbonát + FBS (10 %) + ECGS (120 gg/ml)) v průběhu 24 hodin k zajištění adheze. Pak byly buňky promyty 3 krát s PBS a bylo přidáno kultivační médium podle pokusných podmínek. Poslední mytí PBS bylo považováno za čas 0.

Všechny pokusy byly prováděny v triplikátěch a pro porovnání se prováděla statistická analýza. Kultivační médium bylo měněno po 24 hodinách a každý druhý den. Po 168 hodinách kultivace byl byl do médií všech kultur přidán Brdu (10 mM finálně) a inkubován 2 hodiny při 37°C. Pak byly buňky uvolněny krátkou digescí trypsinem-EDTA a přeneseny na 96-jamkové destičky k umožnění ELISA detekce BrdU. ELISA se prováděla se soupravou a metodou Boehringer Mannheim. Prováděla se kontrola bez buněk ke stanovení bazální hladiny pozadí. Jiná kontrola se prováděla měřením obsahu DNA v kultivačním médiu na konci doby inkubace aby se odděleně zjistilo, zda kapalný extrakt chrupavky ovlivnil buněčnou adhezi.

Buněčná proliferace byla hodnocena rovněž podle množství DNA přítomné v Petriho miskách. Všechny pokusy byly prováděny v triplikátech a pro porovnání se prováděla statistická analýza. Kultivační médium bylo měněno denně. Po 168 hodinách kultivace • · • · byly buňky lyžovány roztokem s barvivém Hoechst spektrofluorometru při

Konečně: Množství

33358.

365 nm.

Na-citrát-SDS a inkubovány byly odečteny na

Vzorky

Petriho miskách bylo fosfatasy. Všechny

Aktivita tohoto enzymu vykazuje přítomných na značení, data měřena pomocí soupravy (podle postupu výrobce silnou buněk přítomných na hodnoceno rovněž měřením aktivity kyselé pokusy byly prováděny v triplikátěch a pro porovnání se prováděla statistická analýza.

korelaci s počtem endothelových buněk miskách (Brdu inkorporace a Hoechst ukázána). Aktivita kyselé fosfatasy byla od Sigma Chemical Company modifikacemi).

Výsledky endothelových Získaná ED50

Petriho nejsou s některými doložily dávkově závislou inhibici buněk kapalným extraktem chrupavky je přibližně 90 μΐ kapalného extraktu k přibližně 1,5 mg sušiny, přítomné v kapalném extraktu).

proliferace (Obrázek 7).

(ekvivalent

c. Keratinocyty: Kapalný chrupavkový extrakt byl testován na keratinocytech, jejichž proteinkinasa C (PKC) byla aktivována triphorbol acetátem (TPA), známým agonistou této buněčné transdukční dráhy. Normální lidské epidermální keratinocyty byly etablovány jako primární kultury (Matsui et al. (1992) J. Invest. Dermatol. 99: 565-571). Kultury byly rozrůstány v bezsérovém definovaném médiu (KGM) obsahujícím epidermální růstový faktor (10 ng/ml), insulin (5 μg/ml), hydrokortison (0,5 μg/ml) a bovinní pituitární extrakt (70 μg/ml) v modifikované MCBD 153 formulaci.

Karatinocyty byly rozrůstány k 70 % konfluence a po 48 hodinách po obměně čerstvého média bylo na ně působeno bud 200 ng/ml TPA nebo 2 μΐ/ml DMSO bez další obměny média. Pak ke kultivačnímu médiu byly nebo nebyly přidávány různé koncentrace kapalného chrupavkového extraktu. Výsledky neukázaly žádný účinek kapalného extraktu na proliferaci keratinocytů a extrakt rovněž neměl žádný účinek na TPA-indukovanou inhibici proliferace. Kapalný chrupavkový extrakt však byl schopen inhibovat TPA-indukovanou diferenciaci keratinocytů (Obrázek 8). Hladina diferenciace keratinocytů byla TPA zvýšena 5 krát. Kapalný • · • · · • · · · • · · · • · · * ·

chrupavkový extrakt neměl sám žádný vliv na tvorbu zrnité obálky. Jeho přítomnost však inhiboval TPA-indukovanou tvorbu zrnité obálky z více než 60 %.

Recentní publikace ukázaly, že PKC aktivacevede u normálních keratinocytů k produkci zvýšených množství interleukinu-8 (IL-8), mediátoru zánětu (Chabot-Fletcher et al. (1994) J. Invest. Dermatol. 103: 509-515). Navíc: Psoriatické keratinocyty vytvářejí velmi vysoká množství IL-8, jenž dále podporuje neovaskularizaci v psoriatických plácích (Nickoloff et al. (1994) Am. J. Pathol. 144: 820-828). Jiné růstové faktory a integriny jsou též zapojeny a může být důležité rozšířit rodinu molekul, jež mohou být zapojeny (IL-1, TNF, atd.). Nevíme, zda indukce TPA mimikuje psoriatické keratinocyty. Pokud se jedná o tento případ, tyto výsledky napovídají, že chrupavka může být bez účinku na normální keratinocyty in vivo, zatímco může mít účinek na psoriatické (nebo aktivované) keratinocyty. Inhibici produkce IL-8 v TPA-aktivovaných keratinocytech jakož i v psoriatických plácích nebo keratinocytech kapalných chrupavkovým extraktem zbývá ověřit. Snížené hladiny IL-8 nebo jiných růstových faktorů jsou zajímavou možností, vysvětlující protizánětlivé a antiangiogenické účinky tohoto extraktu.

Testy kolagenasy:

a. Stanovení 1: Toto stanovení je popsáno v Knight et al. (1992) FEBS Lett. 296, 263-266. Daný způsob používá fluorogenní peptidový substrát (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂) mimikující aktivní místo metaloproteinas. Tento substrát má fluorescenční skupinu (Mca) na jednom konci a skupinu zhášející fluorescenci (Dpa) na druhém. V intaktním substrátu zhášející skupina účinně maskuje fluorescenci. Za enzymatického štěpení substrátu se fluorescence ve zkumavce zvyšuje.

Aktivace kolagenasy je popsána ve Weingarten et al. (1985) Biochemistry 24, 6730. 1 μg byl zředěn na 100 μΐ s 50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH 7,5. Byl přidán 1 μΐ roztoku 10 mg/ml trypsinu (v 1 mM HC1) a směs inkubována po 15 minut při 20°C. Aktivace • · • · byla ukončena přidáním 10 μΐ trypsinového inhibitoru sóji (SBTI, 5 mg/ml). Do každé mikrokyvety bylo přidáno:

nebo 50 μΐ inhibitoru* (upraveného na 50 μΐ vodou), μΐ 50 mM Tris, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,5,

Jc *ic , μΐ aktivované kolagenasy (67 ng finálně) a μΐ substrátu (1 mM zásobní roztok v DMSO, 20 μΜ finálně). Fluorescence byla zaznamenávána při / ex = 328 nm, / em = 393 nm.

*: inhibitor je definován jako kontrolující substance (jako EDTA, orto-fenatrolen) nebo kapalný extrakt chrupavky.

**: kolagenasa je definována jako lidský typ I, typ IV, a kolagenasa pulců obojživelníků; používala se i želatinasa.

Stanovení 2: Toto stanovení je popsáno ve Welgus et al.

9511-9516. Tento způsob používá SDS-PAGE ke kolagenasou typu I (MMP1).

nativního kolagenu velikosti 75 několik hodin od substrátu ]

b.

(1979), JBC 256, zjišťování štěpení provede v itiolekule poskytne kolagenu.

oddělením

Tento způsob používá

Kolagenasa typu I jediné štěpení, jež % a 25 % původního se reakce monitoruje pomocí SDS-PAGE. Poměr určí vizuálně po barvení stříbrem).

(viz Stanovení I) se přidalo (Worthington) +/- inhibitor μΐ. Reakce byly inkubovány po 16 hodin při přidáním SDS-PAGE vzorkového pufru a naneseny na 8 % akrylamidový gel.

dva fragmenty o

Po štěpení po daných produktů rozštěpeného a nerozštěpeného kolagenu se obarvení gelů Coomassie blue (nebo ng aktivované kolagenasy kolagenu telecí kůže k 5 μg v konečném objemu 20 35°C, pak zastaveny EDTA, zahřátý k varu s 40 mM

c. Dávkově závislá inhibice. Výsledky získané s kapalným chrupavkovým extraktem ukázaly na dávkově závislou inhibici kolagenasové aktivity v obou stanoveních. ED50 se získá s 30 μΐ kapalného extraktu (nebo 0,51 mg sušiny přítomné v 30 μΐ kapalného extraktu).

In vivo testy:

Test embryonální vaskularizace (EVT):

ť

a. Definice testovacího systému: Normální vývoj kuřecího embrya zahrnuje tvorbu vnějšího cévního systému ve vitelinové membráně, jenž přináší živiny z vitelu (žloutku vajíčka) k vyvíjejícímu se embryu. Když se umístí na vitelinovou membránu, antiangiogenické látky mohou inhibovat vývoj krevních cév, jenž probíhá ve vitelinové membráně. Pro umožnění přístupu k vitelinové membráně se kuřecí embrya přenášejí do sterilní kultivační nádobky (Petriho misky) a ukládají do inkubátoru s řízenou teplotou a vlhkostí. Embrya se pak vyvíjejí v těchto ex ovo podmínkách po několik dnů.

Alikvot kapalného extraktu chrupavky se smíchá s roztokem methylcelulosy a ponechá uschnout na vzduchu na tenké terčíky. V průběhu tohoto postupu se koncentruje vnitřně obsažený NaCl a interferuje s EVT když je jeho množství na terčík vyšší než 25 μg. Pro může být zapotřebí odsolení kapalného extraktu: Jako přijatelné způsoby byly shledány dialýza s membránou o hraniční hodnotě menší než 100 Da nebo elektrodialýza.

Methylcelulosa vytváří inertní matrici, z níž může kapalný extrakt pomalu difundovat. Methylcelulosové terčíky obsahující kapalný extrakt se umístí na vnější okraj vaskulárního perimetru vitelinové membrány, kde je angiogenní proces ještě aktivní.

Účinek terčíků, obsahujících kapalný extrakt chrupavky, na proximální vaskulární vývoj se vždy přirovnává k vývoji s terčíky, obsahujícími vodu a ekvimolární množství NaCl. Terčíky se umísťují na vitelinovou membránu embrya v den 0 nebo v den 1 ex ovo růstového procesu: V tomto bodě zasahují do vitelu jen začátky hlavních krevních cév. Embrya jsou pak dána do kultivačních podmínek dokud se nezjistí vaskularizace (přibližně 24 hod.). Terčíky obsahující vodu a kapalný extrakt se přidávají vždy současně na vitelinovou membránu téhož embrya. Oba terčíky jsou uspořádány symetrickým způsobem vzhledem k cefalo-kaudální ose embrya, aby se při porovnávání kapalných chrupavkových extraktů s kontrolami minimalizovaly variace v rámci jedince.

• · * ·

b. Antiangiogenická aktivita: EVT se prováděly s použitím různých koncentrací protaminu (37, 75 a 150 μg) jako pozitivními kontrolami nebo s kapalným extraktem chrupavky. Po jednom dni kultivace byl hladině vaskularizace v oblasti pokryté terčíkem přiřazen stupeň dvojicí badatelů běžným způsobem naslepo. Pro umožnění lokalizace terčíku byl hned po jeho depozici na vitelinovu membránu umístěn kolem něj černí O-kroužek. Stupnice hodnocení pro EVT test je založena na hodnotách 1-2-3: (Hodnota = 3) normální vaskularizace při porovnání s opačným horizontálním kvadrantem nebo s odpovídajícím kvadrantem kontrolního embrya, (hodnota = 2) krevní cévy vstupují do oblasti pokryté terčíkem, ale mizí uprostřed dráhy, hlavní krevní cévy křižují oblast pokrytou terčíkem, ale jejich dráha je zřetelně ovlivněna, nebo je pozorován pokles laterálního větvení, (hodnota = 1) nepozorují se žádné krevní cévy v oblasti pokryté terčíkem nebo jejich dráha je prudce odkloněna tak, jako by se měly vyhnout oblasti pokryté terčíkem, krevní cévy nerostou za oblast pokrytou terčíkem s výjimkou, že ji obejdou a vyjdou za ní.

Model myšího mamárního adenokarcinomu:

a. Popis testovacího systému: Protinádorový potenciál kapalného extraktu chrupavky byl testován na modelu myšího mamárního adenokarcinomu (aloštěpu). Testovací systém sestával ze subkutánní inokulace BALB/C myší 1 x 10⁶ buňkami DA3. Tyto buňky pocházejí z murinního mamárního adenokarcinomu indukovaného 7,12-dimethylbenzantracenem (DMBA). Tento model byl etablován Danielem Medinou (J. Nati. Cancer Inst. (1969) 42: 303-310; ibid (1976) 57: 1185-1189). Inokulované buňky pomalu rostou in vivo a vytvářejí solidní tumor s nízkou prognózou metastáz.

Buňky DA3 byly udržovány při 37°C a 5 % CO₂ v médiu RPMI 1649 doplněném 1 mM merkaptoethanolem, 1 M roztokem HEPES pufru, 100 mM pyruvátem sodným, 200 mM L-glutaminem, 10 mM neesenciálními aminokyselinami, 1 M vitaminy, 10 % fetálním bovinním sérem a 1 % pěnicilinem-streptomycinem. Pro indukci • · « · • · nádorů byly buňky narůstány v úplném médiu k 70 % konfluence a pak sklízeny s použitím roztoku trypsin-EDTA. Buňky byly pak centrifugovány, promyty třikrát roztokem fosfátového pufru a resuspendovány při ředění 1 x 10⁶ buněk / 0,1 ml. _f

Myši inokulované buňkami DA3 (n =15) obdržely denní orální podávání tekutého extraktu žraločí chrupavky nebo placeba (solného roztoku). S tímto působením se začínalo 7 dnů po inokulaci buňkami DA3. Testovány byly různé koncentrace kapalného extraktu. Množství podávaného kapalného extraktu se vyjadřuje množstvím sušiny přítomné v kapalném extraktu. Testované položky se připravují, jak se zde popíše: Kapalné extrakty se lyofilizují a resuspendují v různých koncentracích ve vodě (0,2, 1,5, 3, 10 a 20 mg na 200 μΐ). Konečné dávky, jež se denně podávaly, £>yly 10, 75, 150, 500 a 1000 mg/kg tělesné hmotnosti. i

a.

w

b. Protinádorová aktivita: Výsledky ukazují, že nejvyšší inhibice nádorové progrese byla získána při podávání kapalného extraktu asi 75 mg/kg (Obrázek 11). Větší dávky jsou méně účinné, což je zajímavé. Napovídá to, že kapalný extrakt obsahuje látky, jež mohou inhibovat nádorovu progresi, a jiné látky jež mohou inhibovat působení nádorových inhibitorů. Tento fenomén byl již u biologických léčiv uváděn.

Konečně: Intraperitoneální podávání kapalného extraktu drasticky (75 x) snižovalo maximální účinnou dávku pro inhibici nádorového růstu (Obrázek 12).

c. Toxicita: U žádného z působení nedošlo ke ztrátě tělesné hmotnosti nebo k úmrtím v souvislosti s působením kapalného extraktu. V průběhu působení, za denního pozorování, nebyly pozorovány žádné symptomy nebo změny chování. Na konci působení byly myši utraceny a vnější morfologie všech orgánů byla analyzována graduovaným patologem: Nebyla zjištěna žádná abnormalita. Analýzy krve nevykázaly žádné známky abnormality.

d. Histopatologie: Histopatologie nádoru neodhalila žádné vnější změny mezi nádory z myší, na něž se působilo placebem nebo kapalným extraktem. Rozsah viability nádoru byl dosti vysoký ve • ·

všech skupinách. Analýzy různých orgánů (plic, jater, ledvin, pankreatu, žaludku, střeva, vaječníků, mléčných žláz, mozku a srdce) neodhalily žádnou specifickou změnu, jež by mohla být dána do souvislosti s kapalným extraktem.

Model myší hypersensitivity:

a. Popis testovacího systému: Dinitrofluorbenzen (DNFB) je silný kožní iritant, jenž může u BALB/C myší vyvolávat silnou zánětlivou reakci. V den 0 bylo 10 myší sensitizováno natřením jejich břich DNTB. Myši byly 5 dní po sensitizaci vystaveny natření 10 μΐ DNFB na pravé ucho. Otok ucha byl jako ukazatel podráždění měřen v několika časech po tomto vystavení.

Kapalný chrupavkový extrakt byl testován ke zjištění, zda může u myší snížit zánětlivou odezvu k DNFB. Orálně byly podávány po tři po sobě jdoucí dny před sensitizaci a po 4 následující dny buď samotný nosič (0,2 ml solného roztoku, 5 myší) anebo kapalný extrakt (0,2 ml kapalného extraktu obsahujícího 20 mg/ml sušiny, 5 myší).

b. Proti-hypersensitivní aktivita: Jeden den po vystavení ucha vykazovaly myši, na něž se působilo jen samotným nosičem, otok ucha na tloušťku 8,2 mm. Je zajímavé, že myši, na něž se působilo chrupavkovým kapalným extraktem vykazovaly otok ucha jen 2,8 mm. Statistická významnost těchto dat má p hodnotu < 0,001. Tyto výsledky ukazují, že kapalný chrupavkový extrakt je silným inhibitorem zánětu.

• · • · • · • · · i

• · · · • 1 · • · · · • · · · • ·

ZÍSKÁNÍ KAPALNÝCH FRAKCÍ OBSAHUJÍCÍCH AKTIVNÍ MOLEKULY

In vitro testy:

Nádorové buněčné linie:

a. Příprava testovacího systému: Žraločí chrupavky byly shromážděny a zpracovány stejně jak je popsáno shora. Po centrifugaci byla peleta vyhozena a supernatant ultrafiltrován jak je popsáno až po sterilní filtraci na 0,22 μη filtrech. Takto získaný netod.

kapalný

Nádorové extrakt byl dále buněčné linie byly frakcionován pomocí různých rozrůstány jak je popsáno shora.

b.

FPLC: FPLC systém od fy. Pharnacia, Hiload 26 mm x 60 cm kolonu roztok

Podmínky

Sephacryl S-300. Všechny vzorky byly před nanesením na filtrovány na 0,22 μη filtru. Elučním pufrem byl solný pufrovaný fosfátem (PBS), filtrovaný minut. Objem nanášeného vzorku byl obvykle do 13 ml). Rychlost průtoku frakce. Eluované sloučeniny (280 nm). Kalibrační graf od fy. Sigma, ;

vzorek nanášený odvozen z byla byly byl ml/min. detegovány získán s a odplyněný

3,2 ml (může

Byly sbírány absorbancí kalibrační svou UV během být až ml použitím přičemž kalibrační ’ k analýze (3,2 ml). Eluční vynesení molekulové vzorek měl hmotnosti soupravy MW-GF-1000 stejný objem jako objem vzorku byl sloučenin kalibrační soupravy proti jejich elučnímu nějž byl odečten zádržný objem kolony, injikováním dextranové modři (mol. hmotn.

Frakce byly testovány na aktivitu identifikovány frakce, o něž byl zájem, byly zpracovány v dalším studiu (níže).

aktivních obj enu, od byl získán

Zádržný objem = 2 ooo ooo).

na buňkách ZR75-1. Byly charakteristiky a jejich

Další charakterizace prováděna na přístroji isoelektrofokusaci, níže) hraničními hodnotami k získání frakcí o molekulové hmotnosti mezi složek (Biorad a na filtrech

Rotofor permeátu byla

170-2950, viz

Amicon z různými

- 30 kDa, 30 - 100 kDa a nad 100 kDa.

c. Podmínky isoelektrofokusace: Preparát kapalného extraktu žraločí chrupavky (46 ml permeátu 1 kg/1) byl dialyzován přes noc proti 4 litrům čisté vody obsahující 5 % glycerinu při 4°C s použitím membrány Spectra póre #7 MWCO 3500 kDa (Spectrum 132110). Dialyzovaný roztok byl smíchán s 2,75 ml amfolytů (Pharmacia #80-1125-87) pH 3,5-10,0 a 0,5 g CHAPS (Sigma C3023, 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamonio]-l-propan sulfonát). Objem byl doplněn na 55 ml čistou vodou. Tento roztok byl nanesen na Rotofor. Isoelektrofokusace byla provedena při 4°C za konstantního výkonu 12 watů (3000 xi zdroj napětí, Biorad 165-0554), za trvalé vodní cirkulace pro zajištění udržování dané teploty. Na začátku separace bylo napětí 380 voltů a proud 31 mA. Když se proud stabilizoval (při 14 mA), odečet napětí byl 870 voltů. Isoelektrofokusace byla zastavena a sebráno bylo 20 frakcí.

FRAKCE	OBJEM (ml)	PH
1	3,7	3,56
2	2,1	4,01
3	2,2	4,10
4	2,3	4,31
5	2,2	4,63
6	2,1	5,03
7	2,5	5,30
8	2,1	5,50
9	2,4	5,81
10	2,5	6,26
11	2,3	7,00
12	2,4	7,29
13	2,4	7,64
14	2,5	7,94

• ·

15	2,3	8,32
16	2,5	8,62
17	2,4	8,94
		r
18	2,9	9,30
19	3,1	9,88
20	3,6	10,71

Identifikace těchto bílkovin byla provedena stanovením jejich molekulové hmotnosti na elektroforetickém gelu (Laemmli, U. K. (1970) Nátuře (Lond.) 227: 680).

Tyto frakce byly zředěny čtyřikrát nanášecím pufrem (viz Laemmli) a 8 μΐ alikvoty byly podrobeny elektroforéze za neredukujících podmínek. Obrázek 13 ukazuje elektroforetický profil každé frakce a materiálu před isoelektrofokusací.

Všechny frakce byly v boxu s laminárním prouděním dány sterilně do lahviček protlačením přes filtr Milipack-60, mající porozitu 0,22 μιη.

d. Inhibiční aktivita na nádorové buňky: Bílkovinný obsah frakcí byl změřen Lowryho dávkovači metodou. Roztoky 1 kg / 2 1 (vyjádřeno jako hmotnost surové chrupavky na litr permeátu) byly testovány na buňkách ZR75-1 při různých koncentracích v růstovém médiu. Výsledky jsou shrnuty jak následuje:

• ·

1. test: Testy provedené na frakcích z přístroje Rotofor (permeát byl zkoncentrován odpařením). Identifikace bílkovin:

Identifikované frakce	Isoelektrický bod	Hodnota mediánu	Molekulová hmotnost
7-8-9-10	5,30 až 6,26	5,78	29 +/- 1 kDa
7-8-9	5,30 až 6,26	5,68	60 +/- 1 kDa
12-13-14	7,29 až 7,94	7,62	48 +/- 1 kDa
13-14	7,64 až 7,94	7,79	35 +/- 1 kDa

2. test provedený na FPLC frakcích (permeát byl zkoncentrován odpařením):

Frakce	Molekulová hmotnost
6 a 7	0,1 - 2,5 kDa

3. test provedený na 100 μΐ frakcích získaných na molekulárních filtrech Amicon:

Testovaná koncentrace	Molekulová hmotnost (MW)	Inhibice kultur buněk ZR75-1
100 μ9/ΐη1	MW > 100 kDa	64 %
100 μ9/πι1	30 kDa < MW < 100 kDa	114 %
100 μg/ml	10 kDa < MW < 30 kDa	127 %
400 μg/ml	MW < 10 kDa	149 %

FPLC frakce 6 a 7 obsahují aktivní složky o velice malé molekulové hmotnosti, 0,1 až 2,5 kDa.

Hypoplasní účinek frakcí může být až 33 000 krát vyšší než účinek pozorovaný s lyofilizátem. ť

e. Další identifikace aktivních složek eluátu: Aktivní frakce (testované na buňkách ZR75-1) se získají v následujícím rozsahu molekulových hmotností, určených jiným typem purifikace, začínajícím se stejným permeátem (1 kg/1) na koloně o 10 mm průměru a 30 cm délky, plněné Superose-12, za použití FPLC a Rotofor postupů, popsaných shora. Byla vybrána rychlost průtoku 1 ml/min. Sebráno bylo 45 frakcí po 1 ml.

Frakce 20 - 21	aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 70 až 120 kDa
Frakce 22	i aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 60 až 70 kDa
Frakce 29 - 32	aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 35 až 46 kDa
Frakce 34 - 35	aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 29 kDa
Frakce 38 - 39	aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 0 až 2,5 kDa

' · · · • 9 · t · · .Λ.··· • · * ::: g · ♦ · e ·

Testy kolagenasy:

a. HPLC chromatografie: 980 ml vzorek kapalného extraktu (DUP) byl zfiltrován přes membránu s hranicí 10 kDa v ultrafiltrační jednotce s tangenciálním tokem (PELICON, Milipore). Jednotka byla napřed promyta 1 1 vody. Konečné výtěžky byly 490 ml frakce > 10 kDa a 1,9 1 frakce < 10 kDa. Frakce < 10 kDa byla zkoncentrována odpařením s chlazeným prstem na 180 ml (<10-10x). Osm 100 μΐ alikvotů <10-10x bylo naneseno na CDC-S Hexyl, 5 μιη HPLC kolonu (25 x 0,94 cm) a eluováno napřed 100 % H₂O při 4 ml/min. a pak při 8,5 ml/min. 100 % MeOH. Sbírány byly frakce odpovídající vrcholům 0D₂j^.

Bylo sebráno pět frakcí (Obrázek 14): Frl, Fr2, Fr3, Fr4 a Fr5. První tři frakce zahrnují alespoň jeden větší vrchol.

b. Antikolagenolytická aktivita. Výsledky ukazují, že Frl je nejaktivnější frakcí při inhibici kolagenasy. Nižší hladina aktivity je přítomná ve všech ostatních frakcích: Stanovení 1 viz Obrázek 14, stanovení 2 viz následující tabulku.

Vzorek	Barvení kolagenu	Barvení fragmentů kolagenu
Jen kolagen (C)	+ + + +	-
C + Enz	+	+ + +
C + Enz + EDTA	+ + + +	-
C + Enz + DUP	+	+ +
C + Enz + Frl	+ + + +	-
C + Enz + Fr2	+ + +	+
C + Enz + Fr3	+ + +	+
C + Enz + Fr4	+ + +	+
C + Enz + Fr5	+ + +	+
C + Enz + > 10 kDa	+	+ + +

• *

EDTA 40 mM inhibovala kolagenasu. Celkový kapalný extrakt DUP vykazoval nízkou antikolagenolytickou aktivitu. Frakce 1 až 5 byly aktivní: Nejaktivnější byla frakce 1. Frakce o molekulové hmotnosti vyšší než 10 kDa nevykazovala žádnou významnou inhibiční aktivitu.

c. Další definování antikolagenolytického faktoru: Kapalný chrupavkový extrakt byl frakcionován s použitím filtračního přístroje s tangenciálním tokem a 10 kDa filtru (Pelicon, Milipore). U filtrátu (< 10 kDa frakce) byla nalezena antikolagenasová aktivity a byl charakterizován dále, jak následuje: Frakce < 10 kDa byla dále dialyzována s použitím membrány o nominální hranici 100 kDa molekulové hmotnost (Spectra/Por CE (celulosový ester) MWCO: 100 kDa, kat. č. 131015). Antikolagenolytická aktivita byla získána ve filtrátu (< 100 kDa frakce). Frakce < 100 kDa byla nenesena na kolonu s C8 reverzní fází (EM Science Lichroprep RP-8, kat. č. 9242) a eluována H₂0, pak 60 % methanolem a konečně 100 % methanolem. Většina antikolagenolytické aktivity (98 %) byla získána v H₂O eluátu, přičemž 2 % aktivity byla eluována 60 % methanolem.

V souhrnu: Antikolagenolytická aktivita v extraktu je způsobována sloučeninou (nebo sloučeninami) o nízké molekulové hmotnosti, jež může být dialyzována nebo procházet membránou Spectra/Por CE (celulosový ester) MWCO: 100 a jež není, když se nanáší v H₂0, adsorbována na C8 matrici kolony s reverzní fází (Lichroprep).

In vivo test:

Test embryonální vaskularizace (EVT):

Kapalný chrupavkový extrakt byl frakcionován s použitím filtračního přístroje s tangenciálním tokem a 10 kDa filtru (Pelicon, Milipore). Frakce kapalného chrupavkového extraktu nad a pod 10 kDa byly testovány za stejných podmínek. Ukázaly se být

- 40 - :..:

stejně účinné v inhibicí neovaskularizace (Obrázek 15). Toto je v kontrastu s antikolagenolytickou aktivitou, jež není přítomna ve frakci nad 10 kDa.

a. Frakce < 10 kDa: Antiangiogenický faktor v této frakci se v průběhu purifikačních kroků popsaných shora choval jako antikolagenolytický faktor.

b. Frakce > 10 kDa: Tato frakce byla chromátografována na gelové permeační chromátografické koloně (Sephacryl S-300, Pharmacia). Jedna frakce (S300-4), mající antiangiogenickou aktivitu, byla charakterizována na SDS-PAGE. Tato aktivní frakce (S300-4) měla několik pruhů bílkovin majících molekulové hmotnosti mezi přibližně 8a 18 kDa (srovnáváno s markerovými bílkovinami BioRad SDS-PAGE). Tato frakce byla dále frakcionována s použitím anexové chromatografie (Mono-Q, Pharmacia) za použití Tris-HCl pH 8,0 a gradientu 0 až 1,0 M NaCl. Frakce eluovaná mezi 0,8 - 1,0 M NaCl měla vysokou antiangiogenickou aktivitu. Frakce eluované mezi 0,3-0,6 M NaCl a mezi 0,08 - 0,2 M NaCl měly nižší antiangiogenickou aktivitu.

POROVNÁNÍ S DOSAVADNÍMI PRODUKTY Z OBORU

Definice dosavadního stavu

Protože nejsme první, kteří měli velký zájem o chrupavkové extrakty, ověřili jsme si jedinečný charakter kapalného extraktu žraloci chrupavky, připraveného podle předkládaného postupu, v porovnávacích testech vedle dvou produktů popsaných v dosavadním stavu (nebo dedukovatelných z něj), jmenovitě produktů připravených postupem Balassy (USP 4 822 607) a Oikawy et al. (cit. dílo).

Oikawa et al. popisují způsob, jímž se získají dvě hlavní frakce, jedna mající molekuly o molekulových hmotnostech obsažených mezi 1 a 10 kDa, a druhá mající složky o hmotnosti vyšší než 10 kDa. Antiangiogenické vlastnosti připsali pouze • · • · ·· ·· • · · · • · · ♦ • · · · · · · • · • · · · • · jakékoli •· •· •· •· první frakci, přičemž se antiangiogenické aktivity Oikawových produktů jsme extrakt na dvě odpovídající frakce, 0 až 10 kDa.

druhé říká, CAM testu, frakcionovali že prostá je adekvátní porovnání celkový kapalný a získali jsme frakci_řmající

Pro náš

Protože Balassa popisuje postup pro extrakci celkového kapalného extraktu, porovnávali jsme náš celkový kapalný chrupavkový extrakt (0 až 500 kDa s produktem připravovaným za reprodukce Balassova způsobu, přičemž byly telecí chrupavka nahrazena žraločí chrupavkou jako výchozím materiálem.

Předpokládáme, že kdyby Balassa a Oikawa popisovali postup rovnocenný našemu, obrazy z FPLC, HPLC a CZE by se měly podstatně překrývat a v EVT by se měla odhalit stejná antiangiogenická aktivita. Všechny vzorky byly před FPLC a HPLC chromatografií uzpůsobeny na konečnou koncentraci 12 μg/μl (sušina/objem roztoku). Oikawův produkt byl před chromatografií centrifugován a filtrován, protože obsahoval nerozpustný materiál.

Příprava vzorků

Vzorky žraločí chrupavky extrahované danými třemi způsoby byly označeny jak následuje (se stanovenou suchou hmotností na objem roztoku):

1) DUP je preparát podle tohoto vynálezu, frakcionovaný tak, aby obsahoval molekuly mezi 0 až 500 kDa (12 μ9/μ1),

2) BAL je preparát podle předpisu Ballasy et al. (12 μ9/μ1),

3) OIK je preparát frakce 3 podle Oikawy et al.

Všechny vzorky byly při všemi analýzami uzpůsobeny na konečnou koncentraci 12 μg/μl (sušina/objem roztoku). Vzorek OIK měl vysoký obsah nerozpustného materiálu, jenž bylo možno centrifugací při 13 200 ot./min. snadno dostat do pelety nebo odfiltrovat na 0,2 μιη membráně. Odfiltrování nerozpustného materiálu bylo podstatné před FPLC, HPLC a CZE (Obrázky 16, 17 a 18) • · » · • · · » · · • ·» • · · • · (Pharmacia). Vzorky koloně Superose 12 (PBS) jako eluentem • · · ♦ • · · * . _ ······ — 4 Z - · · · • « · ·

Porovnání FPLC

Podmínky:

Kolona pro gelovou permeaci Superose 12 byly chromatografovány na gelovové permeační (10/30) s fosfátem pufrovaným solným roztokem za rychlosti průtoku 0,5 ml/min (rychlost pohybu papíru = 0,25 cm/min). Před nanesením byly 100 μΐ alikvoty koncentračně nastavených vzorků filtrovány přes 0,2 μιη membránu. Monitorvala se OD₂₈₀.

Kolona byla kalibrována následujícími standardy (mol. hmotn. v Da): Katalasa (323 000), aldolasa (158 000), albumin (56 000), ovalbumin (44 000), chymotrypsin (25 700), ribonukleasa (13 700), insulin (5 700), B řetězec insulinu (3 500), A řetězec insulinu (2 500), bacitracin (1 450), vitamin B-12 (1 355). Molekulové hmotnosti hlavních vrcholů byly vypočítávány podle následující rovnice: Log₁₀ MW = 7,52 - 0,212 x RT, kde RT = eluční objem v ml . R² =0,976. Celkový objem kolony (V_t) byl 21,93 ml, jak bylo stanoveno s použitím cytidinu (246 Da). Zádržný objem (V_Q) byl stanoven na 8,38 ml s blue dextranem (2 x 10⁶ Da).

Souhrn výsledků:

V Obrázku 16 a) měl náš vzorek DUP první .hlavní vrchol (1), jenž se eluoval při 18,76 ml, což dává molekulovou hmotnost kolem 3 500 Da. Následující vrcholy při 22,7 (2) a 27,3 ml (3) byly za celkovým objemem kolony (21,93 ml, jak je stanoveno s cytidinem). U těchto vrcholů se projevuje určitá afinita k náplni kolony.

V Obrázku 16 b) měl Balassův vzorek BAL malý vrchol (1) eluující se blízko νθ, vrchol (2) při 18,9 ml (3 300 Da) a dva vrcholy eluující se po V_t, (3) 22,6 ml a (4) 28,2 ml.

V Obrázku 16 c) měl Oikawův vzorek OIK rovněž malý vrchol (1) při V_Q, vrchol (2) při 18,9 ml (3 300 Da), vrchol (3) při

21,5 ml (1 000 Da) a malý vrchol (4) při 27,3 ml.

Při porovnávání daných vzorku je pozoruhodné, že, kromě vrcholu 3 500 Da, hlavní pruhy DUP vzorku nebyly pozorovány ve • ·

stejné intenzitě jako v jiných vzorcích. U vzorku OIK se nezdá, že by měl malé množství vrcholu u 27,3 ml. Vzorek BAL měl vrchol pohybující se u 28,2 ml, jenž by mohl korelovat s jedním z menších vrcholů v DUP vzorku.

Porovnáni HPLC

Podmínky:

Kolona CS-S-hexyl 5 μη, 25 x 0,94 cm, CSC #059-085; kolona s reversní fází.

Souhrn výsledků:

U HPLC na koloně hexyl-reversní fáze byly současně monitorovány OD_21Q a ^OD280‘ Nanášeny a eluovány 100 % H₂O byly μΐ alikvoty centrifugovaných vzorků (vždy 12 μg/μl). Vrcholy každého chromátogramu byly označeny podle OD₂₁₀ (např. 1) a odpovídající vrcholy OD₂₈₀ jsou zaznamenány pomocí např. 1.

Objem Vo této kolony byl 5,5 ml (1,4 min).	vrcholy, jež byly
V Obrázku 17	a)	měl	DUP	3 hlavní
pozorovány v OD21Q	(1,	2,	3) a	2 menší	vrcholy (4, 5). Dva
postranní vrcholy,	označované	la a lb	, byly pozorovány

u vrcholu 1. Významná absorbance OD₂₈₀ byla spojena s vrcholy 1, la, lb a 3. Pro porovnání: Odpovídající absorbance OD₂₁₀ je u vrcholu v poměru k OD₂₈₀ mnohem menší.

V Obrázku 17 b) vykazoval BAL více ^OD210 ^vrcholů, ale intenzity byly nižší v porovnání s DUP vrcholy. Pokud může být překryv vrcholů ukazatelem identity molekul, pouze vrcholy 3 a 7 v Balassově vzorku se zdají korelovat s retenčními časy vrcholů DUP vzorku (vrchol la nebo lb respektive vrchol 4).

V Obrázku 17 c) byly v OIK extraktu pozorovány jen tři hlavní vrcholy (1, 2, 3). Vrcholy 1 a 3 by mohly korelovat s vrcholy 1 a 3 DUP vzorku, ale na OIK chromátogramu nebyly pozorovány žádné postranní vrcholy u 1. Výška vrcholů v OIK

vzorku byla nižší než u DUP. Proto jsou FPLC a HPLC obrazce charakteristické pro rozlišované produkty.

Porovnání CZE

Podmínky:

Přístroj: Systém Beckman (p/ace systém 2050) s cílovým software (verse 7.11 U); kapilára: Silica (TSPO 50375), 50 μιη x 97 cm; pufr: 2 M kyselina mravenčí; potahovací roztok; 5 % (díly/objem) hexadimethren bromid a 2 % (obj./obj.) ethylenglykol ve vodě; detektor: UV (200 nm); proud: - 30 kV; nástřik 0,035 atm., 20 vteřin; teplota: 22°C.

Kapilára byla kondicionována s 1 M NaOH (1,4 atm., 20 min.), vodou (1,4 atm., 10 min.), potahovacím roztokem (1,4 atm., 20 min.) a pufrem (1,4 atm., 10 min.). Podmínky byly upraveny k operaci: (1,4 atm., 20 min.), nástřik vzorku (0,035 atm., 20 vteřin), operaci (-30 kv, 45 min.), 1 M NaOH (1,4 atm.,

3,5 min.), voda (1,4 atm., 3,5 min.), potahovací roztok (1,4 atm., 4 min.) a pufr (1,4 atm., 4 min.).

Všechny vzorky (BAL, DUP, OIK frakce 3) byly resuspendovány na 16,5 mg/ml. Hodnoty pH roztoků byly 7,1, 6,8 resp. 8,2 pro BAL, DUP resp. OIK. Koncentrace NaCl v jednotlivých roztocích byla 2,08, 4,37 resp. 0,71 mg/ml pro BAL, DUP resp. OIK.

Souhrn výsledků:

Molekulární profil každého ukázán v Obrázku 18. Porovnání vzorek BAL obsahuje ve větším vzorku (BAL, DUP a OIK-3) je vzorků DUP a BAL ukázalo, že zastoupení vrcholy o procentní ploše < 1. BAL a DUP sdílejí vrcholy U MT/EOP = 1,06, 1,54, 1,59,

1,66 a 3,22. Vrcholy s poměrem 1,06, 1,54 a 3,22 mají v BAL

DUP podobnou procentní plochu, zatímco vrchol u poměru 1,59 je 8 krát intenzivnější než v BAL a opak je pozorován u poměru

1,66.

	- 45	• · · * · · • · a * · • e · · · • · · · · · · _ · · · · ·· ·· ··	·· · • · · · • · · * • · · * · · • ♦ • * ·	• · · • · · e> « · • · · · • · · • · · v
Vzorky DUP	a OIK	dáváj i	velice	rozdílné
elektrochromatogramy.	OIK má	jeden hlavní	vrchol	a několik
menších vrcholů. Žádný	s těchto	vrcholů nelze	dát do	souvislosti
s některým vrcholem vzorku DUP.			*
Porovnání EVT
Antiangiogenický	potenciál	vzorků DUP,	BAL	a OIK byl

analyzován na EVP (Obrázek 19). V Balassově extraktu nebyla získána žádná významná antiangiogenická aktivita. Hrubý extrakt DUP byl porovnáván s frakcí 3 v Oikawově OIK. DUP a OIK byly téměř ekvivalentní. Oikawa et al. však tvrdí něco jiného než tento vynález, protože se zmiňují, že v dané frakci o molekulové hmotnosti vyšší než 10 kDa nebyla detegovatelná žádná aktivita, což je v rozporu s našimi výsledky v Obrázku 15.

Je proto jasné, že přes podobnosti mezi Balassovými a našimi postupy nejsou produkty získané těmito dvěma postupy stejné.

Porovnání obsahu aminokyselin

Bílkovinný obsah BAL, DUP a OIK vzorků (všechny 16,5 mg/ml sušiny) byl měřen Lowryho metodou: Výsledky ukazují 3,31, 0,27 a 4,15 mg/ml pro BAL, DUP a OIK. Poměr bílkovina/sušina je velice odlišný když se DUP vzorek srovnává s BAL a OIK.

Byly provedeny analýzy k dalšímu analyzování obsahu aminokyselin v každém kapalném chrupavkovém preparátu. Obrázek 20 ilustruje podíl každé aminokyseliny v BAL, DUP a OIK vzorcích. Podíl volných aminokyselin je různý u každého chrupavkového preparátu: 23 %, 73 % resp. 4 % v BAL, DUP resp. OIK vzorcích. Podíl aminokyselin bílkovinného původu rovněž zřetelně kolísá podle chrupavkových preparátů: 77 %, 27 % resp. 86 % v BAL, DUP resp. OIK vzorcích. K surovým datům viz následující tabulku:

• ·

Chrupavkový	Obsah volných	Obsah aminokyselin
preparát	aminokyselin ^g/ml)	bílkovinného původu ^g/ml)
BAL	675	2314
DUP	604	223
OIK	181	3910

Závěry

Dva produkty z dřívějšího stavu v oboru (BAL, OIK), jež byly porovnávány s naším (DUP) byly dosud považovány za klasické postupy preparace chrupavkových extraktů. Výsledky shora ukazují, že nynější postup (DUP) poskytuje produkt s nečekaně dobrou aktivitou, pokud se týče antiangiogenických, protinádorových, protizánětlivých a antikolagenolytických aktivit. Můžeme mít za to, že nynějším postupem bylo skutečně dosaženo získávání mnoha ve vodě rozpustných inhibičních faktorů jednom jediném extraktu.

Přímé srovnání molekulárních profilů a obsahu bílkovin BAL, DUP a OIK prokázalo, že preparáty každého chrupavkového extraktu mají zvláštní charakteristiky. I když se ukazuje, že sdílejí některé složky, je zřejmé, že jejich vzájemný poměr je různý. Toto je obzvláště důležité, když se uváží, že DUP je protinádorový když se podává orálně v dávkovacím rozsahu pod asi 75 mg/kg a že ztrácí postupně tento účinek při vyšším dávkování. Tento výsledek napovídá, že v DUP kapalném chrupavkovém extraktu je kritickým množství více než jednoho faktoru. Různé preparáty chrupavky, jako BAL, DUP a OIK proto mohou vykazovat velice rozdílné biologické vlastnosti, jelikož podíly jednotlivých složek se v nich mohou lišit.

• ·

- 47 KLINICKÉ ZKOUŠKY

Příprava kapalných extraktů pro klinické zkoušky f

Předběžné klinické zkoušky byly prováděny s kapalným extraktem žraloci chrupavky podle vynálezu. Kapalný extrakt získaný po ultrafiltraci byl filtrován na filtru Milipor o porozitě 0,22 μπι. Mikrobiální limit kapalného extraktu byl kontrolován podle standardu USP XXIII <61>. Kapalný extrakt byl rozdělen na 7 ml alikvoty (kolem 85 mg bílkoviny) do aseptických lahviček, zamražen při -60 °C přes noc a do použití dále skladován při -20°C.

Antiangiogenický účinek

Kapalný chrupavkový extrakt byl používán k léčbě onemocnění závislých na angiogenese. V praxi byly na lidských subjektech testovány tři různé typy onemocnění závislých na angiogenese: První typem byla rakovina (rakovina prostaty), druhým typem byly dermatologické poruchy (psoriasa) a třetím typem byla artritida (reumatoidní arthritida a osteoarthritida). Příklady níže budou ilustrovat a ukazovat přinejmenším antiangiogenickou aktivitu kapalného extraktu.

Výsledku ukázané odsud dále jsou velmi povzbudivé a jsou považovány za prediktivní co do užitečnosti surového permeátu a jeho frakcí v léčbě všech onemocnění závislých na angiogenese a nejen těch, jež byly konkrétně testovány. Pokud onemocnění má angiogenický prvek, uvažuje se, že chrupavkový extrakt podle vynálezu bude v tomto ohledu účinný, za podmínky že bude v prostředku obsahujícím jeho účinné množství a že daný prostředek je ve formě vhodné pro patřičné podávání. Bude se proto rozumět, že tento vynález není omezen na následující konkrétní prostředky k použití v léčbě angiogenických onemocnění, jelikož osoba zběhlá v oboru by měla být schopna odvodit početné prostředky, přičemž výběr bude založen na způsobu jejich podávání a na cílové chorobné tkáni. Prostředky mohou být podávány různými cestami, např. místně, orálně, sublinguálně, rektálně, ·· ·· • < · ·· nitrožilně nitrosvalově itraokulárně ·· ·· • · · · • · · ·· ·· • · ·

intraperitoneálně difúzí, atd.

Z důvodu rybí chuti a pachu chrupavkového extraktu lze přidávat příchutě a parfémy, nebo lze pro podporu pacientovy spolupráce navrhovat jiné galenické prostředky (liposomy, enkapsulaci, náplasti, atd.). Výraz pacient je míněn jako označení lidského nebo zvířecího pacienta.

Rakovina:

Jeden pacient, trpící rakovinou prostaty, měl kapalným chrupavkovým extraktem doplněnou stravu a vykazoval od té doby významné zdravotní zlepšení. Adenokarcinom byl diagnostikován v r. 1986. V tomto čase byla nasazena radioterapie. V r. 1991 byla hladina PSA (prostatického sérového antigenu) 138 úg/l, když normální přijatelná horní hranice je 4 ug/l. Pacient pak prošel úplně jinou terapií, kastrací spojenou s antiandrogenovou terapií (EUFLEX). Tato léčba měla účinek po tři roky, po čemž se hladina PSA začala opět zvyšovat. Od června 1994 byla tomuto pacientovi strava doplněna kapalným chrupavkovým extraktem (denní orální dávka asi 75 mg sušiny / 7 ml extraktu, ekvivalent asi 1 -

1,5 mg/kg tělesné hmotnosti/den). Hladiny PSA se postupně snižovaly z 12 k níže než 4,0 μg/ml (normální hranice), přičemž se posledního uvedeného výsledku dosáhlo v dubnu 1996. Tento dávkový režim by se mohl modifikovat podle libosti v souladu s cestami podávání, biodostupností aktivních složek a žádoucí rozhodnosti, s níž se má do patologie zasahovat. V tomto případě je kapalný extrakt pravděpodobně absorbován podstatném podílu v gastrointestinálním traktu. Lze se spoléhat na výsledky získané s potkany podrobenými účinku DMBA a s inokulovanými myšmi (viz shora). V této době je netoxičnost ověřena na potkanech, myších (viz příklady shora) a opicích (data nejsou ukázána).

Orální podávání kapalného extraktu potkanům podrobeným účinku DMBA a DA3-implantovaným myším napovědělo dávkování mezi 1 až 300 mg/kg tělesné hmotnosti, u něhož se předpokládá velký příspěvek k inhibici progrese nádorů a nádorové vaskularizace ve • · • · • · zvířecích modelech. Intraperitoneální podávání kapalného extraktu u myší (DA3 model) prokázalo, že tato cesta podávání je důležitá pro získání dávek účinných v inhibici progrese nádorů. Toto napovídá, že dávkování 1 mg/kg, účinné v daném případě rakoviny prostaty, by mohlo být sníženo k téměř 0,01 mg/kg, kdyby bylo zvoleno podávání parenterální cestou. Proto se předpokládá, že dávka asi 0,01 až asi 200 mg/kg tělesné hmotnosti denně je přibližným rozumným rozsahem mediánových dávek (ED_5Q) pro léčbu rakoviny, přinejmenším zčásti prostřednictvím snížení nebo zabránění angiogenese.

Několika dalším pacientům byl kapalný chrupavkový extrakt přidán do stravy (denní orální dávka asi 75 mg sušiny / 7 ml extraktu, ekvivalent asi 1 - 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti/den) v kombinace se spíše tradičními terapiemi (chirurgie, chemoterapie, antihormonoterapie, atd.). Souhrn některých medicinálních případů poskytuje následující tabulka. Výsledky napovídají, že kombinovaná terapie s kapalným chrupavkovým extraktem může zvyšovat přežívání a kvalitu života pacientů trpících solidními tumory.

Typ rakoviny	Medicinální historie
Močový měchýř	Močový měchýř, 70 let starý muž; podrobil se ablativní chirurgii několika lézí (2 cm a 1,5 cm) a přidal si do stravy kapalný chrupavkový extrakt; bez reziduálních karcinomů od 09/94.
Ovariální adenokarcin om	47-letá žena; léze 15 cm (vpravo), 11 cm (vlevo) a několik 2 cm lézí; podrobena operaci a chemoterapii v r. 1991; návrat léčen chemoterapií v r. 1992; druhý návrat léčen chemoterapií v r. 1993; přidání kapalného chrupavkového extraktu do stravy v r. 1994; od té doby zhoubná neoplasma o snížené hmotnosti.
Rhabdomyosarkom	63-letý muž; infiltrující nádor o průměru 11 cm (450); podroben operaci a chemoterapii; návrat léčen radioterapií a přidáním kapalného chrupavkového extraktu do stravy; nádor vykazuje od té doby nekrotizovanou tkáň a stabilitu.

Pankreatický karcinom s jaterními metastázami	45-letá žena; pankreatická léze (9 cm) + jeterní metastázy; poté chemoterapie a přidání kapalného chrupavkového extraktu do stravy; nádor zmizel v r. 1995.
Mamární adenokarcinom	67-letá žena; operace v r. 1978; návrat a plicní metastázy (1994); Megace a přidání kapalného chrupavkového extraktu do stravy; od té doby částečná regrese nádorů co do velikosti (1,5 cm —> 1 cm) a počtu (12 —> 6).

Psoriasa:

Byl připraven následující dermatologický prostředek a zkoušen pro ověření účinnosti na pacientech trpících psoriasou:

- EMULGADE CLB 29 % (hmotn./hmotn.)

- 20 x surový permeát 69,5 % (hmotn./hmotn.)

- GERMABEN II 1 % (hmotn./hmotn.)

- Levandula Augustinofolia 0,5 % (hmotn./hmotn.)

EMULGADE CLB, směs stearátových esterů, mastných alkoholů a neionických emulgátorů, (zakoupený u Henkel Canada Ltd.) byl zahříván na 65-70°C za míchání. Zahřívání směsi bylo zastaveno, zatímco míchání bylo udržováno. Když směs dosáhla teplotu 45°C, byla přidána olejová esence Levandula Augustinofolia a konzervační činidlo GERMABEN II (diazonidyl močovina 30 %, methylparaben 11 %, propylparaben 3 % a propylenglykol 56 %, zakoupeno u Sutton Laboratories, N.J., USA). Když směs dosáhla teplotu 30 °C, byl přidán kapalných chrupavkový extrakt. Prostředek takto získaný byl hladkým, nemastným krémem; změnami procentního obsahu EMULGADE lze podle návodu výrobce získat jiné formy dermatologických prostředků o různé viskozitě (mléko, roztok, mast). Jiné nosiče nebo excipienty lze použít k získání past, gelů a jiných forem transdermálních přípravků.

Formulace uvedená shora byla dávána dvakrát denně po období dvou týdnů topickou aplikací panelu devíti pacientů trpících psoriasou, u níž byla dříve odezva na zkoušené konvenční terapie, • · • ·

jež se ale stala po čase k nim odolná. Pro tuto studii byli vybráni pacienti s podobným a symetrickým rozsahem psoriasy po obou stranách členů skupiny. Tyto testy byly provedeny dvojitě slepým způsobem: Ani dermatolog, ani pacienti nevěděli,_t která postižená strana je ošetřována prostředkem obsahujícím chrupávkový extrakt a která je ošetřována kontrolním prostředkem. Výrazné zlepšení bylo pozorováno u pěti pacientů, jejichž psoriasa nebyla komplikována hyperkeratosou; u těch pacientů, kteří měli hyperkeratosu, byly výsledky středně dobré. Fotografie částí těl dvou pacientů jsou ukázány v Obrázku 21. V Obrázku 21 a a b se předvádí, že u pacienta postiženého psoriasou s hyperkeratosou se přesto ukázalo velmi významné snížení erythemy, nespojené s žádným svěděním, už po pouhém měsíci léčby. Zůstala však závažná hyperkeratosa. Fotografie druhého pacienta trpícího psoriasou bez komplikace hyperkeratosou (Obrázek 21 c ad) ukazuje mnohem větší zlepšení po tříměsíční léčbě. Protože psoriasa se jeví jako multifaktorové onemocnění, předpokládá se, že odezva pacientů závisí na významu zapojení určitých složek, jako jsou angiogenesa a zánět, při etablování a pokračování tohoto stavu. Antiangiogenická aktivita je skutečně v našem extraktu, jak je ukázáno na potkanech po

5), proliferaci endothelových buněk (Obrázek 10). Protizánětlivá aktivita byla myší model). Je pravděpodobné, že by mohlo výsledků, kdyby se k tomuto typu prostředků činidla, zaměřená na další zapojené faktory

DMBA

7) a (Obrázek

EVT (CHS přítomna působení (Obrázek rovněž ověřena být dosaženo lepších přidával jiná léčivá (keratolytická činidla, další protizánětlivá antihistaminika, imunosupresory, atd.).

Toto přidání může mít formu doplnění prostředku obsahoval účinné množství (například) keratolytického činidla, tak, aby činidla.

Lze jej také dosáhnout odděleným podáváním takovéhoto přídavného léčivého činidla, souběžně nebo alternativně s podáváním daného místního prostředku. Navíc: Přídavná medikace nemusí být podávána stejnou cestou.

Prostředek uváděný shora nevykazoval žádný systémový účinek (účinek byl omezen na ošetřenou oblast) a nevykazoval žádný • · • · sekundární účinek. i přes vysoké zastoupení kapalného chrupavkového extraktu.

Arthritida:

Pacienti trpící arthritidou zkoušeli na dobrovolném základě jednu nebo vě jednotky o 7 ml celkového kapalného extraktu denně po několik měsíců. Těmto pacientů se jejich stav jevil jako postupně se zlepšující, s nápravou funkce kloubů, snižováním bolestí a zánětů (až do asi 60 %). Protože arthritida má angiogenické a zánětlivé složky, shora uvedený účinek může být připsán antiangiogenickým a protizánětlivým aktivitám chrupavkového extraktu.

Skupinou specialistů na revmatologii pak byla provedena pilotní klinická studie. Do studie bylo rekrutováno sedm dobrovolných a poučených subjektů, ve věku mezi 39 a 60 lety, trpících revmatoidní arthritidou. Byla stanovena diagnóza na základě klasifikačních kritérií z revidovaného vydání amerického revmatického sdružení (Američan Rheumatism Association) (Arnett, F. C. et al., 1988, Arthritis & Rheumatism, sv. 31, 315-325).

Léčba trval 30 dní a sestávala z požívání denní dávky 21 ml kapalného extraktu žraločí chrupavky (12 mg/ml sušiny). Účinnost léčby byla stanovována s článkovým ukazatelem pro zjišťování citlivosti kloubů (Ritchie, D. M. et al., 1968, Quarterly J. Med. New Series XXXVII, sv. 147, 393-406). Tento ukazatel je založen na součtu čísel z kvantitativního hodnocení bolesti pociťované pacientem, když jsou klouby podrobovány pevnému tlaku, prováděnému přes okraj článku nebo v některých případech za pohybu kloubu. Výsledky ukazují, že u čtyř pacientů ze sedmi se stav zlepšil, když byli léčeni kapalným chrupavkovým extraktem (tabulka níže), což napovídá že tento produkt může být užitečný při léčbě revmatoidní arthritidy a jiných stavů komplikovaných chronickým zánětem.

• · • ·

Pacient (čís.)	Věk (let)	Ritchieho index	Zlepšení
den 0	den 30
1	60	30	22	ano
2	43	8	8	ne
3	52	12	12	ne
4	41	15	19	ne
5	46	5	3	ano
6	39	6	2	ano
7	55	14	7	ano

Pavouci žilky:

Pro tuto studii bylo získáno celkově 16 účastníků panelu. Účastníci měli viditelné avšak ne excesivní telangiektáze na tváři. Panel byl rozdělen na dvě skupiny po osmi. Skupině A byl poskytnut cholesterolový liposomální základ obsahující 5 % kapalného chrupavkového extraktu, zatímco druhé skupině (B) byl poskytnut jen cholesterolový liposomální základ samotný. Tyto produkty byly používány na celém obličeji, dvakrát denně po tři měsíce. K získání obrázků nejméně 4 míst obličeje vykazujících pavoučí žilky byl použit mikroskop s povrchovou vláknovou optikou. Obrázky byly analyzovány na hodnoty šedi pomocí přístroje Zeiss Ibas Image Analyzer. Integrovaná optická denzita (IOD) byla vypočtena pro všechna místa každého účastníka panelu. Čtyři místa každého účastníka panelu byla zprůměrována v každém časovém bodu.

Výsledku ukazují, že po 4 týdnech došlo k 35 % poklesu v IOD a že tento účinek se udržoval v průběhu studie (Obrázek 22). Prázdný cholesterolový liposomální základ vykazoval zlepšení pozadí o 5 resp. 8 % po 8 resp. 12 týdnech používání.

• ·

Periorbitální tmavé kruhy:

Zabarvení pokožky není plně způsobováno jen přítomností nebo nepřítomností melaninu, ale též dodávkou krve a obsahem plazmy. Když je proudění krve slabé a když se větší množství kyslíku odtahují do metabolismu, kůže se jeví jako namodralá. Tyto změny barvy se zvýrazňují v oblasti očí z důvodu tenčí vrstvy kůže (Oresajo et al. (1987) Cosmetics & Toiletries 102: 29-34). Cévní změny v septech přítomných pod očima mohou rovněž zhoršovat vzhled tmavých kruhů. Tmavé kruhy kolem očí se objevují též z důvodu ukládání tuku, otoku pod očními víčky a úniku krve z cév kolem oční oblasti. Byla navržena klinická studie k hodnocení účinku kapalného extraktu žraločí chrupavky na kontrolu angiogenese kolem oční oblasti a takto snižovaného objevování se periorbitálních tmavých kruhů,

Studie se zúčastnilo 18 dobrovolnic ve věku mezi 18 a 65 roky. Účastnice panelu vykazovaly zřetelné tmavé kruhy kolem očí. Všechny účastnice panelu byly normálního zdraví, bez nálezu akutních nebo chronických onemocnění, včetně dermatologických nebo oftalmologických problémů.

Ze studie byly vyloučeny subjekty vykazující běžné spálení slunečním zářením, vyrážky, škrábance, znaky popálení atd., jež by mohly interferovat s hodnocením testu. Vyloučeny byly též těhotné a kojící ženy. Testované místo se vyhnulo bradavicím, pihám, opálení, bledým místům, jizvám a aktivním dermálním lézím pozorovaným při prozkoumání.

Panel byl rozdělen do dvou skupin, 10 ve skupině A a 8 ve skupině B, přičemž každá odpovídala bud’ nosiči obsahujícímu 5 % kapalného chrupavkového extraktu anebo nosiči samotnému. Účastnice panelu obdržely dostatek produktu k aplikaci kolem oční oblasti přinejmenším dvakrát denně po 12 týdnů. Měření se získávala při základním stavu a po 4, 8 a 12 týdnech. Při každé návštěvě se získaly fotografie a analyzovaly se obrazovou analýzou.

Fotografie byly analyzovány na hodnoty šedi, jež zobrazuje tmavost/světlost kůže. Je zřejmé, že skupina podrobená účinku chrupavkového extraktu vykázala dobré zvýšení hodnot šedi (což • · zobrazuje zesvětlení tmavého zabarvení). Po 4, 8 a 12 týdnech došlo ve skupině podrobené účinku kapalného extraktu chrupavky k 11 %, 21 % a 14 % zesvětlení pokožky pod oblastí očí. Skupina podrobená účinku samotného nosiče nevykázala žádnou? změnu (Obrázek 23).

Křečové žíly:

Do studie bylo zahrnuto 20 účastníku panelu. Účastníci panelu měli viditelné ale ne excesivní telangiektáze na nohách. Panel byl rozdělen do dvou skupin. Skupině A (n -9) byl poskytnut k používání na celých nohách, dvakrát denně; po měsíce, krém obsahující kapalný extrakt chrupavky, zatímco t skupině B (n = 11) byl poskytnut samotný nosičový krém. K získám obrazů 2 - 4 míst nohou vykazujících křečové žíly byl použit mikroskop s vláknovou optikou. Obrazy byly analyzovány na hodnoty šedi pomocí analyzátoru Zeiss Ibas. Integrovaná optická denzita (IOD) byla vypočtena pro všechna místa každého účastníka panelu. Všechna každého účastníka panelu byla zprůměrována v každém časovém bodu.

Výsledky jsou ilustrovány na Obrázku 24. Došlo k 21 %, 17 % a 24 % poklesu IOD po 4,8 a 12 týdnech používání. Kontrolní nosič vykazoval zlepšení základu 5%, 0% a 0 % po 4, 8 resp. 12 týdnech používání.

Další potenciální klinické a veterinární aplikace:

Oftalmologie:

Zhoršení zraku nebo slepota mohou být způsobovány řadou stavů charakterizovaných abnormálním růstem krevních cév nebo neovaskularizaci. Toto zahrnuje korneální neovaskularizaci (způsobovanou chemickým nebo fyzikálním podrážděním), korneální infekci, odmítnutí korneálních štěpů, neovaskulární glaukom, makulární degradaci, herpes virovou keratitidu a diabetickou • · • ·

- 56 retinopatii. Kapalný chrupavkový extrakt by na tyto klinické stavy mohl působit inhibici tvorby nových krevních cév

a snižováním	telangiektáze a	zánětu.
Hojení	ran:
Hojení	ran zahrnuje	komplexní interakce	mezi	buňkami,
biochemickými mediátory,	molekulami extracelulární	matrice
a buněčným	mikroprostředím.	Po poranění plné	hloubky	napřed

z okraje rány vyrůstá v charakteristickém pořadí granulační tkáň (fibroblasty, kapiláry a buňky zánětu). Fibroblasty začnou do 24 hodin migrovat z vazivových tkání na okraji rány do prostoru rány. Jak se pohybují, fibroblasty produkují molekuly matrice (kolagen a glykosaminoglykany), jež vytvářejí extracelulární matrici. První pučení kapilár lze pozorovat v perfundovaných mikrocirkulacích na okraji rány už tak časně, jako je 18 hodin po poranění. Tato pučení se rozrůstají do prostoru rány a poskytují novou kapilární siř pro vazivové tkáně rány. Proliferace a migrace fibroblastů a kapilární růst pokračují v jednotě dokud se prostor rány zcela nezaplní novou tkání. U některých stavů hojení ran, jež jsou komplikovány nadprodukcí granulačních faktorů, jako jsou hypertrofické jizvy a hojení kůže těžce popálených osob, by mohlo být prospěšné podávání kapalného chrupavkového extraktu (orálně nebo místně), protože snížený angiogenický proces by mohl zpomalit proces hojení rány.

Papuloskvamní kožní onemocnění:

Prospěšný účinek kapalného chrupavkového extraktu na psoriatické léze napovídá, že by lokální nebo systémové podávání kapalného extraktu mohlo pomáhat u jiných onemocnění, jež mají společné charakteristiky. Papuloskvamní kožní onemocnění jsou charakterizována červenými až fialovými pupínky a skvrnami, jež vznikají ze zvýšení tloušťky epidermatu nebo z podložního kožního zánětu a zahrnují lupénku (psoriasis), Reiterův syndrom, pytiriasis rosea, lichen planus, pityriasis rubra pilaris, sekundární lues, mycosis fungoides a ichtyosiformní erupce.

- 57 Plešatost:

Ligatura malých laterálních tepen přinášejících proudění krve do vlasy porostlé části hlavy byla úspěšná při prevenci ztráty vlasů, způsobované nadměrným vystavením androgenům. Lokální aplikací kapalného extraktu chrupavky na některé oblasti vlasy porostlé části hlavy by dalo předcházet ztrátě vlasů prostřednictvím zmenšení cévní sítě a následného vystavení hormonům.

Veterinární aplikace:

Tuhé nebo kapalné chrupavkové extrakty lze podávat zvířatům pro tytéž léčebné nebo kosmetické aplikace jaké jsou popsány pro lidi.

NEANGIOGENICKÝ ÚČINEK

Akné:

I když akné nejsou, pokud vynálezci vědí, klasifikovány jako choroba nebo porucha, mající angiogenickou složku, bylo přesto lákavé zkoušet kapalný chrupávkový extrakt na takto postižených pacientech na základě skutečnosti, že kapalný extrakt je též protizánět1ivý. Pro experimentování s chrupavkovým extraktem u pacientů postižených akné byl připraven následující gelový přípravek:

CARBOPOL 1,2 %

Čištěná voda 77,2 %

NaOH 0,3 %

PHENOXETOL 0,3 %

TWEEN 80 0,3 %

Kapalný chrupávkový extrakt 20 %

X extrakt Aloe 0,5 % • ·

- 58 Daný kapalný chrupavkový extrakt obsahuje 9 - 12 mg sušiny/ml. Tento přípravek vykazuje znamenité zlepšení kožního aspektu pacientů postižených silnějšími a mírnějšími formami akné (zánětlivá akné a kystická akné). Obrázek 25 ukazuje významné zlepšení stavu pacienta, trpícího akné, za 12 týdnů místní léčby nosičem obsahujícím kapalný extrakt.

Tyto výsledky mohou být způsobeny antiangiogenickým účinkem (přičemž by odhalovaly angiogenickou složku u akné) nebo mohou být způsobeny aktivními složkami, jež mají účinek jiný než antiangiogenický (například protizánětlivý). Všechny výsledky získané v klinických zkouškách shora ukazují na velký potenciál chrupavkového kapalného extraktu v léčbě onemocnění závislých na angiogenese nebo zánětlivých onemocnění. Množství chrupavkového extraktu jakož i jeho přípravky mohou být pro splnění konkrétních účelů libovolně obměňovány. Stojí za povšimnutí, že (bráno podle bílkovinného obsahu) mohou místní a jiné prostředky obsahovat dávky chrupavkového extraktu v širokém rozsahu. U daných tří konkrétních kategorií zkoušených případů se používaly velice rozdílná dávkování a přípravky.

Podráždění kůže:

Protože angiogenesa je u mnohých onemocnění často spojena se zánětem, bylo by záhodno popsat v chrupavkovém extraktu každou aktivitu zvlášť. V tomto ohledu byl k testování protizánětlivé a zklidňující aktivity vybrán model podráždění kůže, kde není podezření, že by nastávala angiogenesa. Pro studii bylo vybráno devět dobrovolníků s historií citlivosti kůže k peruánskému balzámu. Testované sloučeniny byly jak následuje:

1) IX žraločí chrupavka

2) IX žraločí chrupavka

3) IX žraločí chrupavka

4) Cola nitida (Indena) % v médiu D-NEM % v médiu D-NEM % v médiu D-NEM %, vodný alkohol 1:1

Tyto čtyři testované sloučeniny byly aplikovány na ventrální předloktí účastníků panelu. Materiál byl ponechán absorbovat se po dvacet minut a pak se na testovaná místa aplikoval iritant, • · • · • · « · * • ··· · ··* · • · · · peruánský balzám. Podráždění kůže se měřilo v pojmech zvyšování kožního zarudnutí. Stupeň zarudnutí byl měřen přístrojem Minolta Chromameter a porovnáván s pozitivními a negativními kontrolami. Pozitivní kontrolou byla barva kůže, na níž se působilo samotným peruánským balzámem a negativní kontrolou bylo místo kůže, ne něž se působilo cola roztokem a vystavené působení jako u testovaných produktů. Statistická významnost byla kalkulována dvouokrajovým T-testem pravděpodobnosti. Obrázek 26 ukazuje, že cola při 10 % byla ze 70 % aktivní. Žraločí chrupavka byla 58 % a 60 % anti-iritantem při koncentracích 20 % a 10 %. Účinek nebyl závislý na dávce. Tyto výsledky napovídají, že chrupavkový extrakt obsahuje protizánětlivou a zklidňující aktivitu, jež je vzdálena od antiangiogenického účinku. i

Rakovina:

U pacientky věku 53 let byla diagnostikován ne-Hodgkinův makrocelulární lymfom B typu. Analýza CAT prohlídky odhalila adenopatie kolem karotidy a jugulární žíly (o průměru 2,5 cm) a objemnou adenopatii nad pravým renálním hilem. Pacientka odmítla chemoterapii a zařadila do stravy kapalný chrupavkový extrakt (říjen 1993) (denní orální dávka asi 75 mg sušiny/7 ml extraktu, ekvivalent k asi 1 - 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti/den).

O tři měsíce později (leden 1994) analýza CAT prohlídky odhalila, že adenopatie na krku se úplně resorbovaly. V listopadu 1994 se objem břišní adenopatie snížil o 75 %. Onemocnění je od té doby stabilní a pacientka se cítí zdravá.

Tento výsledek napovídá že některé nádory jiné než solidní mohou mít rovněž odezvu na antitumorální aktivitu kapalného chrupávkového extraktu.

Bariérové bílkoviny kůže:

• · • · • ♦

Studie se zúčastnil panel šesti zdravých dobrovolnic. Účastnice panelu dostávaly krém obsahující kapalný extrakt chrupavky k aplikaci na pravé předloktí a samotný nosič k aplikaci na levé předloktí, dvakrát denně po čtyři týdny.

Účastnicemi panelu byly ženy věku 21 - 45 let, bez nálezu akutních nebo chronických onemocnění, včetně dermatologických nebo oftalmologických problémů. Ze studie byly vyloučeny subjekty vykazující běžné spálení slunečním zářením, vyrážky, škrábance, znaky popálení atd., jež by mohly interferovat s hodnocením testu. Testované opálení, spálení pozorovaným při místo se vyhnulo bradavicím, nevům, pihám, sluncem, jizvám a aktivním dermálním lézím prozkoumání. V den testu byly účastnice instruovány, aby přestaly používat na tváři pleťová mléka, krémy nebo jiné produkty. V průběhu měření byly účastnice dány přinejmenším po 30 minut před testováním do rovnováhy s kontrolovaným prostředím o teplotě 20 - 22°C a 40% relativní vlhkosti.

Testovaným místem bylo pravé a levé předloktí. Na každé paži byla vyznačena malá ploška (3,5 x 7 cm) a ze tří míst v rámci této plošky byla získána měření bazální transepidermální ztráty vody (TEWL) (Pinnagoda et al. (1990) Contact Dermatitis 22: 164-178; Grove (1994) v The effects of aging in oral mucosa and skin, vyd. Squir & Hill, CRC Press, str. 124-125).

Testovaná plocha byla pokryta lepící páskou (Tuck) a po silném přitlačení v obou směrech byla páska stažena (Elias (1993) J. Invest. Dermatol. 80: 044s-049s). Celkově se získalo stáhnutí. Znovu se zaznamenala TEWL. Ve stahováních následujících po měřeních TEWL se pokračovalo ve skupinách po 5. Stahování byla ukončena když se TEWL blížila 18 g/m²/hod. nebo víc. TEWL se opět změřila na konci poslední série stahování. Počet stahování potřebný k poškození kožní bariery se kalkuloval zaznamenáním nejvyššího počtu stahování na každé paži v každém okamžiku, jenž

Výsledky byly vykazoval TEWL s hodnotou 18 g/m²/hod. nebo víc.

analyzovány na statistickou významnost mezi působeními po různý čas proti základním hodnotám s použitím • · • · ·* ·· · * ·· « «· · · · · · ♦ ·· « · · · * * · · · * « · ··· · · · ··· · »·*♦

- 61 - · · · ' jedno-okrajového Z testu s řazenými koeficienty. Paže, na niž se působilo nosičem, se nezdála vykazovat přílišné zlepšení, protože po 2 resp. 4 týdnech působení bylo potřebných k poškození kůže jen o 26 % resp. 21 % více stažení. U bariérového stavu všech účastnic panelu došlo k významnému vylepšení (p < 0,05) bariérového stavu po působení kapalného chrupavkového extraktového produktu po 2 resp. 4 týdny, kdy bylo k narušení kožní bariery potřebných o 60 % resp. 55 % více stažení (Obrázek 27).

U kapalného chrupavkového extraktu tedy bylo prokázáno, že je užitečný pro zesílení kožní bariery proti fyzikálnímu poškození.

Ekzémy:

Kapalný chrupavkový extrakt byl testován v kosmetickém salonu na základě schopnosti snižovat zánětlivé léze, způsobované ekzémy. Kosmetička, která aplikovala krém obsahující kapalný chrupavkový extrakt, trpí po mnoho let chronickým ekzémem na rukou. Je zajímavé, že používání krému obsahujícího chrupavku významně snížilo projevy ekzému na jejích rukách. Nyní úspěšně používá krém obsahující chrupavku k prevenci projevu ekzému.

Bradavice:

36-letá žena s historií plantárních bradavic byla léčena dermatologem po skoro tři roky ke kontrole postupu bradavic a s tím spojených bolestí. Léčba zahrnovala kapalný dusík, kyselinu salicylovou (40 %), anaerobii, kyselinu dusičnou a kyselinu sírovou. Tato léčba probíhala obecně každý týden s trváním tří měsíců a výsledky byly téměř nulové. V březnu 1996 si začala aplikovat denně (5 minut) kapalný extrakt žraloci chrupavky přímo na bradavice: Po dvou týdnech se vytvořila kolem bradavic růžová zóna nové epidermis a následující týden bradavice zmizely. Tyto výsledky proto napovídají, že kapalný chrupavkový «· · extrakt může pomáhat při léčbě bradavic.

Další potenciální klinické a veterinární aplikace:

Odmítání štěpů:

Zánět je jeden z hlavních faktorů zapojených do mortality transplatovaných buněk. Proto může být pro štěpy tkání prospěšná protizánětlivá složka přítomná v našem kapalném extraktu žraloci chrupavky.

Roztroušená skleróza:

Příčiny roztroušené sklerózy jsou neznámé. Tkáňová odezva má rysy imunopatologického procesu, s infiltrací perivenulárních mononukleárních buněk a nepřítomností jakéhokoli přímého histopatologického infekce. Matrixové metaloproteinasy jsou významnými faktory zapojenými do zánětlivé odezvy. Protože kapalný chrupávkový extrakt je účinným inhibitorem matrixových metaloproteinas, může být užitečný při léčbě roztroušené sklerózy.

Fibróza:

Současné koncepce napovídají, že fibróza připomíná normální hojení ran, ale bez ukončení, což vede k náhradě normální tkáně jizvou. Většina fibrotických reakcí se objevuje sekundárně po traumatu, infekci, zánětu, nebo mohou mít, z neznámých důvodů, genetickou složku. Typicky je nadprodukován TGF-β a ten indukuje proliferaci fibroblastových buněk a nadprodukci kolagenu. Protože nadměrné ukládání kolagenu je typickým znakem fibrózy, navrhujeme, že kapalný chrupavkový extrakt, jenž zpomaluje tvorbu granulačních tkání, by mohl být dlouhodobě prospěšný při potlačování fibrotických reakcí.

Zánětlivá střevní onemocnění:

Etiologie zánětlivých střevních onemocnění je neznámá, ale do patogenese Crohnovy choroby a ulcerativní kolitidy je zapojena abnormální intestinální imunita. Mononukleární buňky sliznice vykazují změněnou produkci protilátek, proliferaci, cytotoxicitu a syntézu cytokinů (FGF, PDGF, EGF, TNF). Kapalný chrupávkový extrakt vykazuje protizánětlivou aktivitu a jeho orální podávaní se tedy může ukázat užitečným v terapeutické léčbě zánětlivých střevních onemocněni.

Srdeční choroby:

Endotheliální dysfunkce odolnosti koronárních cév může * zodpovídat za abnormality v koronární mikrovaskulatuře a možná za ischemii myokardu a bolesti v hrudi. Na buněčné úrovni je endotheliální dysfunkce spojena s omezenou expresí kysličníku dusného (NO), relaxačního faktoru spojeného s endothelem. Syntéza NO umožňuje cévnímu systému udržovat vasodilataci a tím regulovat tepenný tlak. Deficit v endogenní syntéze NO přispívá k takovým stavům, jako je tepenná hypertense, pulmonární hypertense a srdeční choroby. Máme předběžné výsledky z kultivovaných endothelových buněk, že kapalný chrupavkový extrakt zvyšuje produkci NO. Kapalný extrakt se tedy může, prostřednictvím NO, ukázat užitečným u některých srdečních chorobných stavů jakož i u pediatrických pacientů s kongenitálními srdečními chorobami komplikovanými tepennou hypertensí.

Navíc: Kapalný chrupavkový extrakt může pomáhat snižovat atherosklerotické komplikace spojené se zánětem.

Skleroderma:

Skleroderma (tvrdá kůže) je nepříliš běžné onemocnění, vyznačující se nárůstem fibrotických vazivových tkání kůže a často i viscerálních orgánů: Často se objevuje jako hyperkeratinizace lokalizovaných oblastí kůže. Hyperkeratinizace je buněčný proces, u něhož se keratinocyty kůže plně diferencují ·· « · ♦ · · · * · · • ····· · ···· · · · · a akumulují rigidní keratinová vlákna. Tento stav kůže může vést k omezené hybnosti kloubu, pokud je zasažena periartikuární oblast. Kapalný chrupávkový extrakt, přidaný do experimentálního systému, v němž je povzbuzena diferenciace keratocytů, -zčásti zabraňuje této diferenciaci, neboli keratinizačnímu procesu. Proto kapalný chrupavkový extrakt může být prospěšný u takovýchto

stavů kůže tím, že zabrání diferencovaných keratocytů.	nadbytečné	akumulaci plně
Veterinární aplikace:
Tuhé nebo kapalné chrupavkové pro tytéž léčebné nebo kosmetické	extrakty lze aplikace jaké	podávat zvířatům jsou popsány pro

lidi.

Kosmetické aplikace a prostředky:

Testy a zkoušky shora ukázaly, že chrupavkový extrakt podle vynálezu může nalézt mnohé medicinální aplikace. Z mnohých různých aktivit získaných v tomto extraktu jsou antiangiogenické, antikolagenolytické, protizánětlivé aktivity a inhibiční účinek na PKC-indukovanou diferenciaci obzvláště žádoucí pro kosmetické aplikace. Protože chrupavkový extrakt podle vynálezu vykázal antagonistický účinek na PKC-zprostředkované buněčné děje, a protože takovýto antagonistický účinek se v oboru navrhuje jako účinek zlepšující bariérovou funkci kůže, spadají pod rozsah tohoto vynálezu způsob ke zlepšení bariérové funkce kůže, jenž zahrnuje krok aplikace prostředku, obsahujícího chrupavkový extrakt, na kůži a tento prostředek. Lze uvažovat i o použití jiných nebo podobných prostředků ve způsobech zklidnění kůže nebo snížení zánětu v savčí kůži. Zánět může být způsobován různými agens, jako jsou chemické podráždění, fyzikální abrase a ultrafialové záření. S prostředky a způsoby inhibice kolagenasy v kůži se rovněž počítá. Kolagenasa a zánět jsou spojeny s předčasným stárnutím (degradací kolagenu), a tudíž antagonistové aktivity získané v chrupavkovém extraktu by se

mohly rovněž uplatňovat svým příspěvkem v prostředcích a způsobech pro zpomalování předčasného stárnutí a pro regulaci vrásek nebo atrofií v savčí kůži. Jako příklady v seznamu příčin vrásek a atrofií se uvádějí věk, vystavení ultrafialovému záření a enviromentální znečištění. Místní prostředky mohou zahrnovat účinné množství žraločí chrupavky, jež je potřebné stanovit pro každou konkrétní aplikaci. Obecné mohou tyto prostředky obsahovat od asi 0,1 do asi 75 hmotnostních procent kapalného extraktu chrupavky a od asi 25 do 99,9 hmotnostních procent farmaceuticky přijatelného nosiče. Tyto prostředky mohou obsahovat antioxidant jako činidlo, zabraňující tvorbě lipidových peroxidů v kůži. Příklady takovýchto antioxidantů jsou tokoferol, tokoferolové deriváty, kyselina askorbová, deriváty kyseliny askorbové a BHT. Prostředek může být doplněn protizánětlivými činidly, jako jsou inhibitor fosfolipasy A2 nebo botanicky odvozené anti-iritantní cola extrakt a extrakt zeleného čaje. Místní prostředky mohou mít různé formy, jako jsou suspenze, pleťová mléka, tinktury, gely, krémy, spreje, emulze, tyčinky, mazání nebo liposomy (přičemž přinejmenším část kapalného chrupávkového extraktu je přítomná v liposomech). Další kosmetické aplikace zahrnují tmavé kruhy kolem očí a bariérovou funkci kůže.

ZÁVĚRY

Postup podle vynálezu byl prokázán jako postup, jenž poskytuje produkci chrupavkového extraktu o velké klinické hodnotě. Extrakty žraločí chrupavky, vyráběné podle tohoto nového postupu, zahrnují řadu aktivit, jež se získávají v dobrých výtěžcích. Extrakty chrupavky, obzvláště kapalný extrakt a jeho frakce, mají velký potenciál, protože jsou netoxické pro normální buňky, zatímco jsou účinné ve velké řadě chorob a stavů.

Pro všechny předpovězené aplikace (od očních kapek po dermatologické přípravky a prostředky léků proti rakovině) se předpokládá, že minimální konečná bílkovinná koncentrace může být velmi nízká (od asi 0,01 mg/ml). Tento nízký rozsah dávek závisí na dostupnosti místa působení a na pronikání aktivních složek k němu, jakož i na účinném zachycení těchto složek a citlivosti nebo odezvě dané tkáně k angiogenickým inhibitorům. Nejvyšší hranice konečné bílkovinné koncentrace v prostředcích pro některé aplikace není v současnosti známa. Nejvyšší zkoušené konečné koncentrace byly místní podávání asi 9 mg/ml bílkovin v prostředku proti případům psoriasy a orální podávání asi 12 mg/ml v dávkových jednotkách o 7 ml podávaných denně v případech rakoviny a o 21 ml v testech arthritidy.

POTŘEBNÝ MATERIÁL

- Chlazení

- Chirurgické nástroje

- Mlýnek na maso

- Plastové sáčky

- Průmyslový mixer (mixer Waring 3-speed, zakoupený od Fisher Scientific)

- Systém k čištění vody (inverzní osmóza a 0,1 μ filtrace; Continental Water Systém, model PRE 2202, sériové číslo 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing Systém zakoupený od Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Tento systém poskytuje apyrogenní vodu o vysoké kvalitě.

- Přesné váhy Mettler, série AE, zakoupené od Fisher Scientific

- Centrifuga Sorvall RC-285 zakoupená od DuPont Canada

- Centrifuga CEPA

- Nylonová kapsa o porozitě 1 μπι

- Autokláv (automatický parní sterilizátor Sanyo, model MAC 350P)

- 500 ml nádobky Nalgene, sterilizované při 132°C po 10 minut a sušené po 35 minut

- Kónické filtry s 24 μπι porozitou Whatman Reeve Angel

- Ultrafiltrační kolona (hranice molekulové hmotnosti 500 kDa a 1 kDa podle použití, povrch 2,3 m², průtok 130 1/min., vstupní tlak 2,1 atm., výstupní tlak 0,35 atm., zakoupená od Koch Membrane Systems lne., Wilmington, MA, USA)

- Sanitární odstředivé čerpadlo (Monarch Industries, model ACE-S100, typ A) k poskytnutí průtoku 130 1/min.

- Sterilní kabinet (kabinet s laminárním prouděním NuAire zakoupený od Ingram & Bell)

- Sterilní filtry Milipack-60 0,22 μιη

- Sterilní láhve z čirého nebo medového skla

- Koncentrátor Amicon DC-10

- Rotofor Biorad 170-2950

- Filtry Amicon SIOYIO, SIOY30 resp. SIOYIOO s hraničními hodnotami 10, 30 resp. 100 kDa

- FPLC Pharmacia 216007 (počítač Pharmacia 216014)

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Lyofilizátor Labconco 10273 A

Tento vynález byl popsán shora a musí se očekávat, v zřejmě v mezích možností a v rozsahu znalostí osoby v oboru (bez odklonu od poznatků tohoto zveřejnění) modifikace náhradou některých prvků tohoto vynálezu používanými ekvivalenty, čímž se dosáhne stejného cíle. Tyto zřejmé variace se považují za pokryté touto přihláškou.

že bude zběhlé vnášet jej ich • · * · · ·· · · ·· • · M> · ···· · * • · ····· · ···· ···· ·· · · · · ··

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby kapalného extraktu chrupavky, majícího podstatnou součást biologicky aktivních ve vodě rozpustných složek, přítomných v intaktni chrupavce, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   a) homogenizaci chrupavky ve vodném roztoku za podmínek kompatibilních se zachováním integrity řečených biologicky aktivních složek, dokud se chrupavka nezredukuje na částice, jejichž velikost je menší nebo rovná asi 500, μπι, což vede ke směsi částic a surového kapalného extraktu, majícího řečené biologicky aktivní složky,

   b) centrifugaci řečeného homogenátu k oddělení částic a surového kapalného extraktu,

   c) další separaci surového kapalného extraktu tak, aby se získal konečný kapalný extrakt obsahující chrupavkové molekuly mající molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou asi 500 kilodaltonů (kDa), a

   d) zkoncentrování řečeného konečného kapalného extraktu bez podstatné ztráty řečených biologicky aktivních ve vodě rozpustných složek nacházejících se v řečeném konečném kapalném extraktu.

   2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že řečené podmínky zahrnují pracovní teplotu zahrnující teplotu mezi 0 až 20°C pro krok a) a mezi 0 až 10°C pro kroky b), c) ad).

   3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že řečené podmínky zahrnují pro řečený vodný roztok pracovní pH v rozsahy mezi 6 až 8.

   Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že krok a) se provádí v průběhu 15 minut až 24 hodin.

   5.

   Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že krok a) se provádí v průběhu 15 minut až 1 hodiny.

   Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že řečená chrupavka a vodný roztok jsou v poměru 1 kilogram na alespoň 1 litr.

   7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že řečený krok zkoncentrování d) se provádí filtrací řečeného konečného kapalného extraktu na membráně s hraniční hodnotou molekulové hmotnosti 0,1 kDa, přičemž se molekuly mající molekulovou hmotnost nižší než hraniční hodnota odstraňuj i.

   8. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že řečený krok zkoncentrování d) zahrnuje lyofilizaci řečeného konečného kapalného extraktu.

   9. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že řečená lyofilizace se provádí v přítomnosti stabilizátorů nebo ochranných činidel přidaných k řečenému kapalnému extraktu v množství dostatečném ke zlepšení ochrany integrity řečených biologicky aktivních složek.

   10. Způsob podle nároku 8 nebo 9,vyznačuj ící se tím, že řečená chrupavka je získána ze žraloka.

   • · • · • ·

   11. Způsob výroby kapalného extraktu žraloci chrupavky, majícího antikolagenolytické a antiangiogenické ve vodě rozpustné složky, přítomné v intaktní chrupavce, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   a) homogenizaci chrupavky ve vodném roztoku za podmínek kompatibilních se zachováním integrity řečených biologicky aktivních složek, dokud se chrupavka nezredukuje na částice, jejichž velikost je menší nebo rovná asi 500 μιη, což vede ke směsi částic a surového kapalného extraktu, majícího řečené biologicky aktivní složky,

   b) centrifugaci řečeného homogenátu k oddělení částic a surového kapalného extraktu,

   c) další separaci surového kapalného extraktu tak, aby se získal konečný kapalný extrakt obsahující chrupavkové molekuly mající molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou asi 500 kilodaltonů (kDa), a

   d) filtraci konečného kapalného extraktu na membráně s hraniční hodnotou molekulové hmotnosti 100 Da, a

   e) získání frakce zahrnující molekuly o molekulové hmotnosti od 0 do 0,1 kDa.

   12. Způsob výroby kapalného extraktu žraločí chrupavky, majícího antiangiogenické ve vodě rozpustné složky, přítomné v intaktní chrupavce, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   a) homogenizaci chrupavky ve vodném roztoku za podmínek kompatibilních se zachováním integrity řečených biologicky aktivních složek, dokud se chrupavka nezredukuje na částice, jejichž velikost je menší nebo rovná asi 500 μιη, což vede ke směsi částic a surového kapalného extraktu, majícího řečené biologicky aktivní složky,

   b) centrifugaci řečeného homogenátu k oddělení částic a surového kapalného extraktu,

   c) další separaci surového kapalného extraktu tak, aby se získal konečný kapalný extrakt obsahující chrupavkové molekuly mající molekulovou hmotnost nižší nebo rovnou asi 500 kilodaltonů (kDa),

   d) filtraci konečného kapalného extraktu na membráně s hraniční hodnotou molekulové hmotnosti 10 kDa,

   e) získání frakce zahrnující molekuly o molekulové hmotnosti vyšší než 10 kDa,

   f) frakcionování této frakce na aniontoměničové .

   14.

   15.

   16.

   17.

   chromatografické koloně, a

   g) získání frakce,

   1,0 M NaCl.

   Chrupavkový extrakt, vyznačující se jež se eluuje mezi 0,8 získaný tím podle kteréhokoli z nároků 1 až 6.

   Chrupavkový extrakt, vyznačující se podle nároku 7.

   Chrupavkový extrakt, vyznačující se podle nároku 10.

   Antikolagenolytický vyznačující se podle nároku 11.

   Antiangiogenický vyznačující se podle nároku 12.

   ze yt žraloka, že je vyroben způsobem

   získaný ze žraloka, způsobem tím, že je vyroben získaný ze žraloka, tím, že je vyroben způsobem chrupavkový tím, že je vyroben extrakt, způsobem chrupavkový tím, že je vyroben extrakt, způsobem

   • · • · • ·

   -

   18. Farmaceutický prostředek k léčbě onemocnění nebo stavů majících jednu nebo více složek vybraných ze skupiny sestávající z nádorové proliferace, angiogenese, zánětu a kolagenolýzy, vyznačuj ící se tím, že obsahuje účinné množství chrupávkového extraktu podle kteréhokoli z nároků 13, 14 a 15, a farmaceuticky přijatelný nosič.

   19. Farmaceutický prostředek k léčbě onemocnění nebo stavů majících kolagenolytickou složku, vyznačuj ící se tím, že obsahuje účinné množství chrupávkového extraktu podle nároku 16.

   20. Farmaceutický prostředek k léčbě onemocnění nebo stavů majících angiogenickou složku, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství chrupavkového extraktu podle nároku 16 nebo 17 nebo kombinaci chrupavkových extraktů podle nároků 16 a 17.

   21. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že je prostředkem pro intraperitoneální, podkožní, oční, nosní, orální, rektální, sublinguální, nitrosvalové, intradermální nebo transdermální použití.

   22. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že je místní prostředek.

   23. Farmaceutický prostředek podle nároku 22, vyznačující se tím, že řečený chrupavkový extrakt se přidává k dosažení konečné hmotnosti sušiny 1 až 50 mg/ml prostředku.

   24. Místní farmaceutický prostředek k léčbě akné vyznačující se tím, že zahrnuje 2 mg chrupavkového extraktu, vyrobitelného podle kteréhokoli z nároků 7, 8 a 9, v obsahu hmotnosti sušiny chrupavkového extraktu na ml prostředku, jako terapeuticky účinnou složku ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   25. Místní farmaceutický prostředek k léčbě psoriasy vyznačující se tím, že zahrnuje 30 - 50 mg chrupavkového extraktu, vyrobitelného podle kteréhokoli z nároků 7, 8 a 9, v obsahu hmotnosti sušiny chrupavkového extraktu na ml prostředku, jako terapeuticky účinnou složku ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   26. Farmaceutický prostředek k léčbě rakoviny vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství chrupavkového extraktu, vyrobitelného podle kteréhokoli z nároků 7,8 a 9, jako terapeuticky účinnou složku ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   27. Farmaceutický prostředek podle nároku 26 vyznačující se tím, že řečený chrupavkový extrakt je dávkován k dosažení 0,01 až 200 mg celkové hmotnosti sušiny řečeného extraktu na kilogram tělesné hmotnosti pacienta.

   28. Farmaceutický prostředek podle nároku 27 vyznačující se tím, že je prostředkem k orálnímu nebo sublinguálnímu podávání pacientovi, u nějž je potřebná takováto léčba.

   29. Způsob léčby zánětu u pacienta, u nějž je potřebná takováto léčba, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podávání účinného protizánětlivého množství chrupavkového extraktu podle nároků 13, 14 a 15 ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   30. Způsob inhibice angiogenesy u pacienta, u nějž je potřebné takovéto působení,vyznačující se tím, že zahrnuje orální podávání účinného antiangiogenického množství chrupavkového extraktu podle nároků 13, 14 a 15 ve

   spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem. 31. Způsob zlepšení kožní bariérové funkce u savčí kůže, v y z n a č u j ící se tím, že zahrnuje krok

   aplikace prostředku podle nároku 22 na kůži.

   32. Způsob ke zklidnění savčí kůže, vyznačující se tím, že zahrnuje krok aplikace prostředku podle nároku 22 na kůži.

   33. Způsob k snížení zánětu v savčí kůži, vyznačuj jící se tím, že zahrnuje krok

   aplikace prostředku podle nároku 22 na kůži.

   34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že řečený zánět je způsoben fyzikální abrazí.

   - 75 35.

   36.

   Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že řečený zánět je způsoben chemickým dráždidlem.

   Způsob inhibice kolagenasové aktivity v savčí kůži, vyznačující se tím, že zahrnuje krok aplikace prostředku podle nároku 22 na kůži.

   37.

   Způsob regulace vrásek nebo atrofie v savčí kůži, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje krok aplikace prostředku podle nároku 22 na kůži.

   .

   39.

   40.

   Způsob redukce akné v savčí kůži,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje krok aplikace prostředku podle nároku 24 na kůži.

   Způsob léčby psoriasy v savčí kůži, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje krok aplikace prostředku podle nároku 25 na kůži.

   Způsob zpomalení předčasného stárnutí v savčí kůži, vyznačující se tím, že zahrnuje krok aplikace prostředku podle nároku 22 na kůži.

   Způsob léčby onemocnění nebo stavů majících jednu nebo více složek vybraných ze skupiny sestávající z nádorové proliferace, angiogenese, zánětu a kolagenolýzy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání prostředku podle nároku 18 pacienta, u nějž je potřebná takováto léčba.

   41.

   • · • ·

   42. Způsob podle nároku 41vyznačující se tím, že řečená onemocnění nebo stavy jsou vybrány ze skupiny sestávající z rakoviny, papuloskvamních kožních onemocnění, arthritidy, akné, pavoučích žilek, křečových žil, periorbitálních tmavých kruhů, hypertrofických jizev, alopecie, ekzémů, bradavic, roztroušené sklerózy, fibrózy, zanětlivých střevních onemocnění, korneální neovaskularizace, korneální infekce, neovaskulárního glaukomu, herpes virus keratitidy, diabetické retinopatie a odmítaní štěpů.

   43. Způsob inhibice proliferace endothelových buněk vyznačující se tím, že zahrnuje krok uvedení řečených endothelových buněk do kontaktu s prostředkem obsahujícím chrupavkový extrakt podle nároků 13, 14 a 15.

   44. Způsob inhibice diferenciace aktivovaných keratinocytů vyznačující se tím, že zahrnuje krok uvedení keratinocytů do kontaktu s prostředkem obsahujícím chrupavkový extrakt podle nároků 13, 14 a 15.

   1/26

   Ύ>\ί ífc ·* ♦