JP2003246740A - 鮫軟骨エキス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は新規の軟骨エキス及びその製造方法
に関する。 【解決手段】 完全軟骨中に存在する実質的な割合の生
物活性水溶性成分を有する液体鮫エキスの獲得方法であ
って、下記の段階：ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生
物活性成分の保全性の保持に適する条件下で、前記軟骨
が約 500μｍ以下のサイズの粒子へと縮小されるまでホ
モジナイズし、粒子と前記生物活性成分を有する粗液体
エキスとの混合物を得；ｂ）前記ホモジネート品を遠心
分離して粒子を前記粗液体エキスから分離し；ｃ）前記
粗液体エキスを更に分離して、約 500キロダルトン(kD
a)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液体エキス
を得；そしてｄ）前記最終液体エキスを濃縮して、少な
くとも100ダルトン未満の分子量を有する分子部分を除
去する；を含んで成る方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 軟骨は無血管組織であり、そして抗脈管形成因子を含む
潜在的な候補として研究されている。これは腫瘍発症に
対して比較的耐性である組織でもある。軟骨に関わる腫
瘍である軟骨肉腫は最低限に脈管形成した固体腫瘍であ
る。脈管形成は腫瘍の発症における重要な要因の一であ
る。独立した固体腫瘍性塊は、腫瘍細胞が隣接し合う脈
管ネットワークを広げてその栄養要求物を供給するよう
になったときに出現する。従って、脈管形成の刺激に関
与する因子が腫瘍の発症におけるその役割について研究
されており、そして抗脈管形成因子及び脈管形成阻害活
性を有する薬剤も腫瘍の増殖をコントロールする又はそ
の退化を及ぼすための手段として調べられている。

【０００２】子牛の肩甲軟骨が固体腫瘍の脈管形成を阻
害する物質を含むことが発見されている（Langerら、19
76）。その抗腫瘍剤としてのすばらしい潜在能力を理由
に、軟骨のより多大な供給源が探されている。

【０００３】鮫はこの種の抗脈管形成性インヒビターの
潜在的な起源であり、その理由はその外骨格が全体的に
軟骨より成るからである（その体重の６％、それらに対
し、子牛では 0.6％）。鮫は腫瘍が発生しにくいという
性質の興味ある特徴も有する。この鮫の腫瘍の低い発症
率を説明する数多くの仮説が立てられている。 Marchal
onisら（1990）は任意の攻撃性因子を容易に攻撃できる
IgM抗体を示した。McKinneyら（1990）は鮫が、新形成
細胞から正常細胞を識別でき且つ前者を破壊できるマク
ロファージを有することを示した。Rosen and Woodhead
(1980) は板鰓類（鮫及びえいを含む群）における腫瘍
の稀少性がその高い体温に匹敵するその組織の高いイオ
ン強度に基づきうることを推定している。このような条
件下で、これらの著者はこの免疫系が 100％に近い免疫
学的監視を発揮するものと信じている。 Mooreら（199
3）は鮫が抗菌及び抗原虫特性を有するアミノステロー
ルを生成することを発見した。最後に、 Lee及びLanger
（1983）並びに Folkman及びKlagsbrum (1987)は鮫が新
生脈管形成を阻害する物質を生成することを示した。Le
e及びLanger（前掲）はこの物質を鮫の軟骨から変性条
件で抽出することにより単離した（グアニジン抽出）。
しかしながら、この抽出工程は非常に長くかかり（41
日）、変性した因子を有するエキスを供し得、そして活
性成分の効率は優れたものからはほど遠いものである。
子牛から単離した活性物質は約16キロダルトン（kd）の
分子量を有するが、同じグループの再研究者は鮫におい
て回収されたものの正確な分子量を得ていない。この物
質は3500Daより大きい分子量を有するとしか定義されて
いない。Oikawaら（1990）は Lee及びLangerにより発表
のものと同じ抽出方法を適用したが、その時間ははるか
に短いものである（41日ではなく、２日）。Oikawaらに
より鮫軟骨から単離された抗脈管形成物質は1000〜10,0
00Daに範囲する分子量を有する分子に限定されている。
Schinitsky(USP 4,473,551号）は粗粉末化鮫軟骨の水エ
キスを発表しており、その 100,000Da以上の画分が単独
で又はグルコサミンと組合さって抗炎症活性を有した。
抗脈管形成又は抗腫瘍活性を有するこのエキスの成分の
示唆はこの特許においてはなされていない。 Kuetnerら
(USP 4,746,729号）は牛軟骨から多形核好中球(PMN) エ
ラスターゼインヒビターを単離した。このインヒビター
は50,000Da未満の分子量の分子の保持された軟骨の水性
エキスより得られる。 Sephacryl S-200の分画は数多く
の画分を供し、そのうちの10〜40kDa がプール後に抗エ
ラスターゼ活性を発揮した。活性成分は 9.5の等電点を
有し、そして約15,000Daの分子量を有し得る。 Kuetner
ら(USP 4,042,457号）は牛軟骨が、内皮細胞増殖に対し
て何ら活性のない細胞増殖阻害活性を有する50,000Da未
満の分子量の成分を有することも示した。 Balassaら(U
SP 4,822,607号）は水性溶液中の軟骨エキスを獲得して
おり、そのエキスは抗腫瘍活性を有する。しかしなが
ら、我々は Balassaの方法の再現により得たエキスにお
いて抗脈管形成活性を見い出せなかった。Spilburgら(U
SP 4,243,582号）は牛軟骨（グアニジン抽出）から 65k
Daの分子量及び 3.8のpIを有する２種類の糖タンパク質
を単離し、それらは抗トリプシン活性及び内皮細胞増殖
阻害活性を示す。

【０００４】子牛及び鮫軟骨は数多くの生物活性、例え
ばプロ炎症活性、抗炎症活性、抗脈管形成活性、リゾチ
ーム活性、細胞増殖促進活性、Ｉ及びIV型コラゲナー
ゼ、エラスターゼ、並びにその他のプロテアーゼ、例え
ばトリプシン、キモトリプシン及びプラスミンに対する
阻害活性を含む。しかしながら、誰もまだ、臨床的に価
値のある活性体のプールを含んで成る軟骨エキスを得て
いない。

【０００５】鮫軟骨はウサギ角膜ポケットアッセイ又は
ヒヨコ漿尿膜(CAM) アッセイにおいて一般的に試験され
る。今日まで、完全粉末化軟骨が in vivoで腫瘍に対し
て直接、ヌードマウスに移植されたヒト黒色腫異種移植
片に対して(USP 5,075,112号）、並びに CAM試験でその
抗脈管形成効果について試験されている。抗腫瘍効果は
軟骨エキスに向けられているが、この効果は腫瘍に対す
る血液供給を枯渇させる抗脈管形成成分にほとんど寄与
するものである。今日まで、鮫軟骨が腫瘍細胞増殖に対
して直接的な効果を有するという証拠がなかった。

【０００６】鮫軟骨エキス及び画分を獲得するためのい
く通りかの方法が既に知られている。そのいくつかは全
抽出することなく粉末化粗軟骨を生成する(USP 5,075,1
12号）。その他はグアニジンの如き変性剤を使用する(U
SP 4,243,582号）。その他は軟骨のまわりの任意の筋
肉、神経又は脈管構造を除去するための酵素消化を介す
る軟骨の前処理を実施しており、その前処理段階に有機
溶媒中での脂肪の除去、それに次ぐ活性成分を水性相の
中での抽出が続く(Balassaら、 USP 3,478,146、4,350,
682、 4,656,137及び 4,822,607号）。かかる前処理の
生物活性軟骨成分の保全性の保持に対する効果はわかっ
ていない。もし強すぎると、酵素消化は活性タンパク質
成分を加水分解しうる。例えば、 Balassaの方法(USP
4,822,607号）は抗脈管形成活性のない液体エキスを供
する。この損失はかかる酵素分解の結果でありうる。 B
alassaの方法はエキスを活性成分において更に濃厚にす
る分画段階を含まない。その他は単に不溶性材料の除去
による軟骨の水性エキス（水中(USP 4,473,551) 又は塩
溶液(USP 4,746,729) を生成する。この中でとりわけ、
特定の分子量の特定の画分が更なる研究及び精製のため
に保持されている。（上記を参照）。

【０００７】上記の方法はいくつかの欠点を有する。そ
れらは一部の価値ある成分を変性しうる。このような場
合でないとき、それらは実用的な目的のためには長すぎ
るという欠点を有する。更に、この長い方法は必ずしも
十分な量の活性成分を供せず、そして回収された成分の
うち、一部は全く回収されないかもしくは検出できるほ
どの活性を示すのには不十分な量で回収され、又は一部
は特定の活性の獲得を焦点とすることにより廃棄されて
いる。

【０００８】脈管形成は癌の発症に関与するのみでな
い。様々な生理系（かっこの中に示す）に影響する数多
くの病気又は症状は脈管形成依存性であり、とりわけ下
記に例示するものである：関節炎及びアテローム硬化性
プラーク（骨及び靱帯）、糖尿病性網膜症、脈管新生緑
内障（目）、乾癬、強皮症、しゅさ、血管腫及び過形成
性瘢痕（皮膚）、脈管接着及び血管線維腫（血液系）。
従って、任意の新規、且つ潜在的な抗脈管形成「因子」
がこのような病気の処置、並びに癌治療及びそのその他
の脈管形成依存性病の治療において有用でありうる。し
かしながら、多くの上記の病気及び症状は抗炎症成分も
伴うため、任意の新規且つ潜在的な抗炎症「因子」もこ
のような病気及び症状、並びに任意のその他の炎症性疾
患又は病状に有用でありうる。更に、コラゲナーゼの如
きプロテアーゼは癌及び早発性老化の如き様々な病気及
び症状に関与するため、新規且つ潜在的な抗コラーゲン
分解性「因子」がコラーゲン分解性成分を有する病気又
は症状の処置において有用でありうる。脈管形成、炎症
及びタンパク質分解は単独で、又は多種多様な病気又は
症状を共に遭遇しうるため、正常な身体機能に悪影響を
及ぼすことなく少なくともこれら全ての活性と対抗でき
る製品が偉大な治療価値を有するであろう。 発明の記述 本発明は、治療的に価値のある複数の活性を含む利点を
有する軟骨エキスを生成する新規な方法を提供する。と
りわけ、抗脈管形成、抗炎症、抗コラーゲン溶解、 in
vivo抗腫瘍増殖及び直接的in vitro抗腫瘍増殖活性が鮫
軟骨エキスの中に満足たる濃度で存在することが確認さ
れた。その他の活性は同定又は確認が待たれる。活性は
全て鮫軟骨の液体エキスにおいて得られ、そしてその一
部はその固体エキスにおいて獲得又は確認された。

【０００９】本発明は完全軟骨の中に存在する生物学的
に活性な水溶性成分の実体部分を有する軟骨の液体エキ
スの獲得のための新規の方法に関連し、この方法は下記
の段階を含んで成る。

【００１０】ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性
成分の保全性の保持に適合する条件下で、前記軟骨が約
500μｍ以下のサイズの粒子にまで縮小され、粒子と前
記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物が得ら
れるまでホモジナイズする； ｂ）前記ホモジネート物を遠心分離して粒子を粗液体エ
キスから分離する；そして ｃ）約500kDa以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終
液体エキスが得られるように前記粗液体エキスを更に分
離する。

【００１１】この新規の方法は実施し易い及び効率的で
あるという利点を有する。高収率の軟骨エキスが得ら
れ、このエキスは特に鮫軟骨から得られたものであり、
少なくとも上記の生物活性は全て含む。好ましくはこれ
は低温で（約０〜20℃）、非変性条件下で（好ましくは
純水の中で）、中性付近のpHで（約５〜８）、未知の生
理化学的特徴の化合物が回収できる可能性を最大限とす
るようにして実施する。本方法に従えば、軟骨成分は少
容量の溶液（１kgの軟骨当り１Ｌ）で、短時間（10〜20
分ほどの短さ）のホモジナイゼーションの後に得られ
る。固体エキスの回収のために同じ方法が利用される
が、ただしペレットを回収及び凍結乾燥し、上清液は捨
てる。

【００１２】本発明は軟骨エキス、特に板鰓類の種、よ
り詳しくは鮫に由来するエキスに関する。固体エキスは
活性を示す。それはコラーゲン及び非水溶性成分を含み
うる。これは全液体エキスの中に抽出されるものの残留
活性も含みうる。この全液体エキスは活性に非常に富
む。これはそのまま、又は濃縮して使用できうる。生物
活性の維持を優先する濃縮工程が特によい。加熱エバポ
レーションの如き活性成分を劣化しうることを頼りとす
る方法は慎重に回避する。約１kDaの分子量カットオフ
値を有する膜上での限外濾過が本発明の液体エキスの濃
縮に利用される。約 100Daの分子量カットオフ値を有す
る膜上でのナノ濾過は液体エキスの生物活性（抗脈管形
成性、抗コラーゲン溶解性）を濃縮するのに更によい。
その結果、約 0.1〜約500kDaより成る分子量の分子を含
む濃縮エキスを試験した。

【００１３】液体エキス（０〜500kDa）を更に分画して
その活性成分を特性決定した。数多くの活性画分が様々
な方法により得られた。腫瘍細胞系に対するその抗腫瘍
活性について試験したその一部をその分子量及び等電点
で大まかに特性決定した。その他は活性、特に抗コラー
ゲン分解性又は抗脈管形成性で割りふった。これらの画
分は完璧な特性決定及び同定が待たれる。従って、価値
ある活性は全液体エキス及びその画分において回収さ
れ、それは好適に利用されうる。多量の粉末型軟骨を投
与する代わりに、より許容され且つ濃厚なエキスがこれ
により投与できうる。

【００１４】本発明は更に上記の軟骨エキスのいづれか
を有効な量で活性成分として含んで成る任意の治療用又
は化粧用組成物に関する。最も関心あるのは皮膚学又は
化粧学において有用な製剤にある。この関心は軟骨エキ
スの観察された活性に由来する。この観点において、観
察された抗脈管形成、抗コラーゲン溶解及び抗炎症活
性、並びにケラチノサイト中のタンパク質キナーゼＣの
如きシグナル生成経路により媒介される細胞分化の対抗
作用は、炎症又は刺激の低下、しわ又は皮膚萎縮の制
御、早発性老化の遅延化、座瘡の軽減、皮膚バリヤー機
能の向上、目のまわりの暗色輪の軽減、くも状静脈及び
静脈瘤の削減、いぼの退縮、並びに皮膚円滑効果のため
の組成物及び方法における鮫軟骨エキスの利用の途を開
くものと考えられる。かかる方法は本発明の範囲に属す
る。更に、鮫軟骨液体エキスは癌、関節炎、乾癬及び座
瘡症例において有効に試験されているため、腫瘍増殖、
脈管形成、炎症及びコラーゲン溶解より成る群から選ば
れる１又は複数種成分の伴う病気又は症状を処置するた
めの組成物及び方法が本発明の範囲に属する。 発明の説明 本発明は添付図面に示す特定の態様を介して一層良く理
解されるであろう。この態様は例示であり、本発明を限
定するものではない。

【００１５】特定の態様において、軟骨はブラック・ス
パイニー・ドッグ・フィッシュ（Black Spiny Dog Fis
h）及びコモン・スパイニー・ドッグ・フィッシュ(Comm
on Spiny Dog Fish) の健康な鮫より得た。筋肉及び接
続組織を全てエタノール処理したスパチラ及びハサミで
かき取ることによって除去した。次いで軟骨をプラスチ
ックバッグの中は真空充填し、そして更なる使用まで−
20℃で凍結した。本方法の態様において、任意の軟骨起
源が使用できうる。我々は背景の章に記載の理由により
鮫軟骨を選定した。板鰓類軟骨（これはこの群の動物種
として鮫及びえいを含む）から出発すると、ほぼ同等の
製品が得られるであろうと信じている。これらの製品は
おそらくは、哺乳動物軟骨起源を使用したとき、活性主
成分の種類及び濃度の双方において異なるであろう。

【００１６】抽出前の軟骨の調製における任意のバリエ
ーションはそれが注目の製品（全液体エキス又はその特
定の画分等）の活性に実質的な影響を及ぼさない限り、
利用してよい。いくつかの活性成分は軟骨の任意の周囲
組織を除去するための Balassaら(USP 4,822,607号）に
教示の如きタンパク質分解消化に耐えることができ、一
方その他はかかる処理に耐えないことがある。かかる前
処理に耐えないようである活性の一つは抗脈管形成活性
である（図21）。従って、別々の活性であると認定され
た水溶性活性成分の可能な限り全てを含む液体エキスを
作ることを所望するなら、抽出手順の際の消化段階は過
剰な加水分解又はタンパク質分解を阻止するために回避
又は慎重にモニターすべきである。 軟骨エキスの調製 新鮮、４℃に融解又は凍結した清浄な軟骨を使用した。
軟骨をエタノール殺菌したミートチョッパーの孔に適当
な容量の水（当量（重量／容積）がほぼ最少容量である
が、価値ある成分の回収率に対して何ら影響を及ぼすこ
となく増やすことができる）と共に数回も（より詳しく
は３回）通す。少容量が好ましく、なぜなら実用的な観
点から、不必要な大容量よりも操作により好都合だから
である。実際には、水は逆浸透及び 0.1μｍフィルター
に至る多重濾過により精製した。数多くの水性溶液（例
えば塩を含む）が水の代わりに使用できる。複数の水溶
性活性体の回収が完了したとき、中性pH付近及び非変性
条件での作業が一部の軟骨活性成分の溶解又は変性のた
めに好ましい。水性溶液中の未知のタンパク質の挙動は
推定できない；一部は酸性pHの中で、そして一部は塩基
性pHでより「快的」である。更に、一部のタンパク質は
かかる変性が水性溶液中のこれらのタンパク質の再生に
不可逆的な影響を及ぼさない限り、温和な変性条件下で
抽出可能である。わかり易くは、生物活性水溶性軟骨成
分の保持に適する任意の抽出条件が本発明の範囲に属す
る。従って、これらの要因の全てを考慮して、純水の中
での軟骨活性成分の抽出工程は、構造及び挙動のまだ規
定されていない成分を非常に良好な収率をもって回収す
るのに賢明な選択であることが示された。

【００１７】次に配合した軟骨／水をキッチンブレンダ
ーで最大スピードで約４℃、20分かけて撹拌することに
よりホモジナイズした。ホモジナイゼーション中、ホモ
ジナイゼーション温度はほぼ20℃まで高まる。むろん、
撹拌スピード及び水性溶液の容量は抽出の時間及び収率
の双方に影響しうる。従って、合理的な範囲のホモジナ
イゼーション時間(500μｍ未満の粒子に規定）は短くて
約10分から長くて24時間であってよく、好ましくは約10
〜60分である。この温度は酵素インヒビターを使用しな
いとき、内因性酵素による活性成分の任意の分解を回避
するために約10℃未満に維持すべきである。理想的に
は、０℃に近い温度が所望されうる。通常かかる実験は
温度が４〜10℃に維持された低温室で行われるため、こ
の温度範囲は本方法において許容されるものとみなされ
る。わかり易くするため、「約４℃」なる語は以降この
許容される温度範囲を示すために用いられている。

【００１８】このホモジネート品の液化は、ブレンダー
が粒子サイズを十分に小さくしないなら、それをPolytr
on分解器に10分約４℃でかけることにより更に得られう
る。他方、ブレンド品は単により機能的なブレンダー分
解器の中でホモジナイズしてよく、我々はこれで液化工
程を10分節約した。完了ホモジナイゼーション工程の終
了時には、残留粒子サイズは約 500μｍ未満となる。む
ろん、最初に粉砕した軟骨の獲得のために論じたのと同
じ許容範囲の時間及び温度が同等に適用される。ホモジ
ナイゼーション後の粒子のサイズは超微小である必要は
ない。従って、抽出前に軟骨を粉状化する必要性が回避
できる。事実、それに反して、水性抽出前の粉末形態に
おける軟骨の粉状化は、特にかかる粉状化を凍結乾燥状
態及び／又は熱乾燥状態で実施するとき、価値ある活性
を変性してしまいうる。

【００１９】ホモジネート品は13,600ｇで15分、約４℃
で遠心分離し、その工程は上清液をペレットからす早
く、且つ効率的に分離する一の手段である。これらのパ
ラメーターのバリエーション及び調整は当業者の知識の
範囲内であり、単にホモジネート品の容量及び使用する
装置に依存する。

【００２０】得られるペレットを24〜48時間凍結乾燥し
た。この最初の画分は以下で凍結乾燥品又は固体エキス
と定義する。

【００２１】この上清液は必要なら、24μｍ Whatmanフ
ィルターで濾過し、限外濾過カラムの性能に影響され易
い粒子を除いてよい。次いで濾過した材料を約500kDaの
孔を有するタンゲンシャルフロー濾過カラムで約４℃に
て限外濾過した。これは０〜約500kDaより成る分子量の
水溶性成分を含んで成る第一粗浸透物の獲得を可能にす
る。この粗浸透エキスを0.22μｍのフィルターで濾過
し、そして更なる使用のために無菌ボトルに小分けし
た。この画分を粗浸透物又は液体エキスと更に呼ぶ。

【００２２】他の高性能遠心分離手順がペレット及び上
清液の獲得のために開発されている。 13600×ｇで15分
の遠心分離工程、それに次ぐ Whatmanフィルターでの大
まかな濾過を１μｍの孔のナイロンポケットの備ったCE
PA遠心機での3000〜4000×ｇでの遠心分離に置き換え
た。25kg／25ｌの調製品がこれにより30分以内に遠心分
離でき、そして約29リットルの上清液が供される。得ら
れる水性容量は出発水容量より多く、軟骨自体の水含有
量の一部が回収されたことを示唆する。凍結乾燥品及び
全液体エキスは下記のおよその組成を有し得、それはバ
ッチ間で観察される、及び異なる材料を用いたときに観
察されるバリエーションを大まかに考慮している： 固体エキス： 脂 質 7.35％¹ タンパク質 46.2％² 水 分 20.4％ ナトリウム 4.16mg／ｇ³ カリウム 2.64mg／ｇ カルシウム 114mg／ｇ マグネシウム 1.49mg／ｇ 亜鉛及び鉄 微 量 液体エキス： 脂 質 0.10−0.20％¹ タンパク質 8−25mg／ml² 乾燥重量 8−25mg／ml 水 分 97−99％ ナトリウム 30−200 mg／ 100ｇ³ カリウム 30−40mg／ 100ｇ カルシウム 2.0mg／ 100ｇ マグネシウム 1.1mg／ 100ｇ 亜鉛及び鉄 微 量^1,2 AOAC Official (1984)章16.219−220 及び2.055 の
それぞれに公開の方法に従って測定。

【００２３】³ SAA 手順に従って測定。

【００２４】タンパク質含有量はケルダール法により評
価した。それは事実上有機窒素（Ｎ）を測定する。有機
窒素は下記の式を利用して当量のタンパク質に変換す
る。

【００２５】 タンパク質含有量（mg／ml）＝（％Ｎ×6.25）÷100 炭水化物は検出されず、それらがその他のエキスの中に
存在し、プロテオグリカン及び／又はムコ多糖類の形態
にあることを推定せしめうる。これらの化合物は測定さ
れたレベルの水分の中に含まれる可能性がある。凍結乾
燥品は予期できないレベルの水分を含み、それはOH基に
より測定される。20％の水分含量は軟骨において通常回
収される炭水化物の％に近く、しかも凍結乾燥品の水分
は０％に近いべきであるため、この仮説は確認する必要
がある。

【００２６】液体軟骨エキスをそのアミノ酸含有量につ
いて分析した。全アミノ酸の平均量は約 1.1mg／mlであ
り、遊離アミノ酸は0.67mg（61％）を占め、そしてタン
パク質起源のアミノ酸は0.44mg（39％）を占めた。各ア
ミノ酸の分布を図１に示す。有意な量のタウリンも検出
された（図示せず）。

【００２７】液体エキス中に存在する主要アミノ酸は軟
骨由来のタンパク質及びペプチドの代表である。例え
ば、リジン、グリシン、アスパラギン酸及びグルタミン
酸は液体エキスのアミノ酸含有量の大部分を示し、そし
てコラーゲン中のＮ−テロペプチド分子内架橋の主成分
である（Hansonら（1992）J.Bone & Min.Res. 7 : 1251
-1258)。

【００２８】液体エキスの微生物限界値をUSP XXIII ＜
61＞基準を適用して管理した。 活性アッセイ 固体エキス： in vitroアッセイ：これらのアッセイはホルモン依存性
癌細胞系 MCF-7及びZR75-1（ATCC (R)番号22-HTB及び15
00-CRL、それぞれ）で行った。ZR75-1細胞： ａ．基礎RPMI培地：フェノールレッドの入っていない52
ｇのRPMI 1640 (Sigma R8755) 、17.875ｇのHepes(遊離
酸；Sigma H0763)、0.55ｇのピルビン酸ナトリウム(Sig
ma P5280) 及び10ｇのNaHCO₃を５ｌの純水の中で混合
し、そしてNaOHでpH7.40にした。

【００２９】直ちに使用しないなら、この溶液を光不安
定性物質を保存するために光から保護されなければなら
ない。この溶液を濾過し、 500mlの無菌ボトルに分注
し、そして最長３ケ月間４℃で保存した。 ｂ．細胞培養維持培地：基礎RPMI培地に10％（ｖ／ｖ）
のFBS(胎児牛血清）、 100ＵのペニシリンＧ／50μｇの
硫酸ストレプトマイシン(Sigma P0906) ／ml培地、２mM
のＬ−グルタミン(Sigma G1517)及び１nMのＥ₂(β−エ
ストラジオール)(Sigma E8875)を添加した。 ｃ．実験用培地：基礎RPMI培地に５％のFBSA（デキスト
ラン−チャーコールに吸着させた胎児牛血清）、２mMの
Ｌ−グルタミン、 100ＵのペニシリンＧ／50μｇの硫酸
ストレプトマイシン／ml培地及び50ng／mlのインスリン
(Sigma）を添加した。この培地に様々な濃度の上記の凍
結乾燥品及び様々な濃度のＥ₂(10^-12 〜10 ^-5ｍ）を添加
した。MCF-7細胞： ａ．基礎 DME-F12培地： DME-F12培地（炭酸水素塩な
し、且つフェノールレッドなし：Sigma)を製造者の仕様
書に従って純水で再構築した。１リットル当り 1.2ｇの
炭酸水素ナトリウムを加え、そしてpHをNaOH／HCl で7.
40にした。この溶液を濾過し、 500mlの無菌ボトルに分
注し、そして４℃で最長３ケ月保存した。 ｂ．細胞培養維持培地：基礎 DME-F12培地に10％（ｖ／
ｖ）のFBS(胎児牛血清）、 100ＵのペニシリンＧ／50μ
ｇの硫酸ストレプトマイシン／ml培地、２mMのＬ−グル
タミン(Sigma）及び１nMのＥ₂ を添加した。 ｃ．実験用培地：基礎 DME-F12培地に５％のFBSA（デキ
ストラン−チャーコールに吸着させた胎児牛血清）、２
mMのＬ−グルタミン、 100ＵのペニシリンＧ／50μｇの
硫酸ストレプトマイシン／ml培地及び50ng／mlのインス
リン(Sigma）を添加した。ZR75-1細胞について前述した
通り、凍結乾燥品及びＥ₂ を同じ濃度で添加した。 ｄ．FBSAの調製：胎児牛血清を１％（ｗ／ｖ）のチャー
コール（炭素脱色用アルカリ）と混合した。デキストラ
ンＴ70の溶液をチャーコール血清溶液に加えて 0.1％
（ｗ／ｖ）の濃度にした。この混合物を４℃で一夜撹拌
した。４℃で30分10,000×ｇで遠心分離後、血清をデカ
ントし、再び同じ割合のチャーコール及びデキストラン
と混合し、室温で３時間撹拌し、そして再遠心分離し
た。次いでその血清を56℃で20分熱不活性化し、滅菌濾
過し、そして無菌コニカルファルコンチューブに小分け
した。実験用培養アッセイ及び結果： ZR75-1及び MCF-7細胞を
24穴プラーク上で 20000細胞／ウェルの集団密度又は６
穴プラーク上で150000細胞／ウェルの集団密度に達する
まで増殖させ、そして上記で調製した様々な濃度の凍結
乾燥品の存在下又は非存在下で処理した。その後、固体
軟骨エキスを培養培地に再懸濁し、そして滅菌濾過し、
その水溶性成分を回収し、そして試験した。実験は全て
三重測定で行った。２日毎に培養培地を抜き取り、そし
て新鮮培地と交換した。細胞を５％の CO₂を含む恒湿雰
囲気下で37℃にて17, ７，３又は３日間、第一、第二、
第三又は第４実験に対応させて増殖させた。細胞増殖阻
害は細胞の直接計測により、又はウェルの全 DNA含量の
測定により測定した。

【００３０】

【表１】

【００３１】上記の細胞増殖阻害率は固体軟骨エキスが
用量依存式にこれら２種類の細胞系の細胞の増殖を阻害
できることを示す。

【００３２】図２は50及び 100mg／mlの固体エキスが処
理の３日後にこれらの細胞系に対して形成不全を明確に
誘導することを示す。

【００３３】図３は、10^-12 〜10^-9Ｍのエストラジオー
ルの存在下で、処理細胞はこのようなホルモン用量率に
より刺激されていないことにより、コントロール細胞と
同様に応答したことを示す。しかしながら、１nM以上で
は、コントロール細胞は強力に刺激され、そして DNAの
濃度は10^-7Ｍのエストラジオールの存在下で3.75μｇに
達した（それに対し、エストラジオール抜きでは0.69μ
ｇ）。30及び50mg／mlの凍結乾燥品により処理した細胞
では、最大刺激で測定した DNAはそれぞれ 1.9及び 1.8
μｇであった。図３はエストラジオールに関して処理し
た細胞の親和定数（Km）が、30及び50mg／mlの存在下で
それぞれ、コントロール細胞のKm値（11.7nM）よりも３
及び16倍高い（31.3nM及び 174.0nM）ことを示す。この
ことは、より高い濃度のエストラジオールが、固体軟骨
エキスが存在しているときに同じ細胞増殖を達成するの
に必要であることを意味する。従って、このエキスは最
大応答（その90％の阻害）を小さくし、そしてエストラ
ジオールに対する処理細胞の親和定数を高める。 in vivoアッセイ：DMBA誘導化ラット乳癌モデル ａ．試験方式の説明： 400匹の生後40日の雌Sprague-Da
wleyラット（Charles River Co., St-Constant, Quebec
より購入）をその環境に12日間かけて馴らした。その時
点で、20mgのDMBA／１mlのコーン油（９，10−ジメチル
−１，２−ベンズアントラセン；Sigma Chemical Co.よ
り購入）をギャベージにより投与した。この処理の３ケ
月後、乳癌の発症した 240匹のラットを選び、そして２
つのグループに分配した。第一グループは５匹のサブグ
ループのラットより成る。処理グループのラットには８
週間にわたって毎日３mlの水中の上昇していく濃度の凍
結乾燥エキスを投与し、一方コントロールグループには
同容量の水を与えた。第二グループは４匹のサブグルー
プのラットより成る。処理グループのラットには10週間
にわたり液体エキスと組合せた又は組合せていない３ml
の水の中の凍結乾燥品を毎日投与し、一方コントロール
グループには同容量の水を与えた。第二グループのラッ
トのうちの一のサブグループのみに3000mg／kg／日の濃
度の凍結乾燥品で処理し、そして３mlの液体エキスもよ
り少ない用量の液体エキス（１mlの水中約８mgのタンパ
ク質）の腹腔内（i.p.）注射で与えた。

【００３４】ラットは２回の実験の始めには 151〜175
ｇの体重であり、そして食事及び水を適量与えた。第一
グループのラットは平均直径 0.9cmの腫瘍を有し、一方
第二グループのラットは平均直径 0.6cmの腫瘍を有し
た。 ｂ．抗腫瘍活性：その結果を以下にまとめる：

【００３５】

【表２】

【００３６】これらの結果は凍結乾燥品が胃腸管の中で
吸収され、そして腫瘍の進行を遅める活性成分を含むこ
とを示す。この阻害は腫瘍細胞に対する直接効果である
か、又は腫瘍増殖を妨げる抗脈管形成媒介効果でありう
る。

【００３７】液体エキスは阻害活性も含み得、なぜなら
その投与は約６％の腫瘍サイズの更なる縮小を及ぼすか
らである。

【００３８】これらの結果は凍結乾燥品が水溶性でない
活性成分を含みうる及び／又はそれが残留水溶性活性成
分を含みうることも示唆する。従って、究極的には、収
率をまだ改善したいない、水溶性成分を最大限に回収す
るようにペレットを水性溶液の中で再抽出してよい。 ｃ．組織病理学：固体軟骨エキスの無毒性を評価するた
め、上記の in vivo実験で用いた動物を断頭により殺
し、そして下記の組織を分析のために採取した：肝臓、
肺、腎臓、心臓、脳、筋肉及び乳腺。これらの組織から
脂肪を除去し、その後それらを Bouin流体の中に２日間
固定した。エタノールで脱水後、固定化組織をパラフィ
ンに包埋した。その切片を獲得し、そしてガラススライ
ドの上に載せ、ヘマトキシリンで染色し、そして顕微鏡
で見た。

【００３９】組織学的検査は大用量の固体エキスのみを
用いたとき又は液体エキスと組合せた固体エキスを用い
たとき、有害な効果がないことを示した（データーは示
さず）。

【００４０】このことは、凍結乾燥品及び液体エキスが
選択的な腫瘍サイズ退縮活性を有することを示唆する。

【００４１】乳腺腫瘍において（図４ａ及びｂを参
照）、血管の面積の重要な縮小（55％）が固体及び液体
軟骨エキスを受容したラットのグループにおいて観察さ
れた（図５）。

【００４２】腫瘍サイズの縮小はその脈管形成の重要な
低下、腫瘍細胞に対する直接的な効果、又は双方の現象
の組合せに基づきうる。in vitroホルモン依存性細胞に
おいて直接的な形成不全効果が観察され、それは in vi
voで確認する必要がある。

【００４３】上記の結果は液体エキスがZR75-1細胞に対
する固体軟骨の効果を上わまわる上昇効果を有すること
を実証するため、その成分を更に調べた。 液体エキス in vitroアッセイ：腫瘍細胞系： いくつかの腫瘍細胞系を液体軟骨エキスの
存在下で増殖させて固体エキスにより観察される形成不
全（上記章）があるかを調べた。

【００４４】簡単には、細胞を96穴プレートの中でプレ
ート培養し、そして培養培地（各細胞タイプに特異的：
例えば、 MCF-7細胞を上記の章に記載の通りに増殖させ
た）の中で様々な液体エキスの存在下又は非存在下で増
殖させた。細胞増殖は培養の３〜５日後に MTTアッセイ
を利用して測定した。腫瘍細胞系は下記の通りとした： CHANG ：腫瘍肝細胞 Hep-G₂：腫瘍肝細胞 A2780 ：卵巣アデノ癌腫細胞 MCF-7 ：乳アデノ癌腫細胞（エストロゲン依存性） MCF-7-ADR ：乳アデノ癌腫細胞アドリアマイシン耐性 液体軟骨エキスは全ての腫瘍細胞系に対して抗増殖活性
を示した。最後の阻害50％及び80％が MCF-7及び A2780
細胞のそれぞれに対して 8.5mg／ml（乾燥重量液体エキ
ス／培養培地１ml）の濃度で得られた。

【００４５】非凍結乾燥及び凍結乾燥液体軟骨エキスは
腫瘍細胞増殖を阻害するその能力において同等であっ
た。このことは、阻害因子がこの濃縮手順で変性しない
ことを示唆する。一次培養細胞： ａ．脈管新生緑内障：腫瘍細胞に対する活性の特異性を
評価するため、限外濾過を経て得られる透過物を正常線
維芽細胞である間葉起源細胞、ヒト TENON線維芽細胞(H
TF) に対して試験した。２人の患者（一方は脈管新生緑
内障 NVGを有し、他方は一次開放角緑内障POAGを有す
る）由来の HTFのみを利用した。

【００４６】HTFの継代培養及び維持：各集密培養物を
0.5mlの0.05％のトリプシン／ 0.5mMのEDTA (Gibco 610
-5300 AG)での37℃で５〜10分の洗浄及び脱離により継
代した。15％の胎児牛血清(FBS) を含む 1.5mlの DME／
F-12培地をトリプシン／EDTAを中和するために添加し
た。

【００４７】細胞の会合は、粉砕そして25cm² Ｔ−フラ
スコに移し入れ、それに10％(FBS)を含む更なる培地を
添加することにより行った。集密に達したら、 HTFを 7
5cm²のＴ−フラスコに移し、そして最後に180cm²のＴ−
フラスコに移した。十分な細胞が得られたら、一部の細
胞を下記の実験のために利用し、そして残りは更なる実
験のための同一の継代を保存するために同時に凍結し
た。 実験プロトコール：集密に達したら、２又は３本の同一
の180cm²のＴ−フラスコの中に増殖する一人の患者由来
の細胞を上記の手順により解離させた。短時間の低速遠
心分離の後、それらを 256チャネライザーの備った ZMI
カルターカウンター216013で計測した。

【００４８】その後の全てのin vitro実験において、約
50万個の細胞に１％の FBSを含む１mlの DME／F-12培地
でそれぞれ16mmの皿及び12穴プレートの中で接種した。
接種の17時間後、１％の FBSの付加された１mlの新鮮な
同じ培地を加えた。実験のデザインに応じて（上記及び
下記参照）、１％の FBS培地にGF（成長因子）を添加す
るもしくはせず、及び液体軟骨エキスを添加し、そして
滅菌濾過した。この日に（０日）、一部の細胞サンプル
を計算してプレート効率を決定した（それは95％以上で
あるべきである）。

【００４９】実験の開始から48時間後、細胞をすすぎ、
解離し、そして再び計測した。細胞の数は「絶対」コン
トロールで得られるものの％として表示した。

【００５０】１％又は５％の FBSをそれぞれ含む各「絶
対」コントロール、並びに１％の FBS及び個別にGF又は
液体軟骨エキスを含む各実験グループは三重サンプルよ
り成る。

【００５１】各実験は同時に１又は２人の患者の細胞に
対して実施し、そして少なくとも２回繰り返した。

【００５２】これらの実験において、GF、ブタ血小板由
来成長因子(pPDGF) 及びヒト組換塩基性線維芽細胞成長
因子（hr bFGF)(Farmitalia Carlo Erba, Milan, Italy
よりDr.P.Brazeauに贈呈）を１％の FBS中で10〜100 ng
／mlの濃度でそれぞれ加えた。実験の開始から48時間
後、細胞をトリプシン−EDTAにより分散させ、そしてカ
ルターカウンターで計測した。以下に示す三重測定値
（第１，２及び３行）は全てウェル当りのカウント数の
20分の１に相当する。 結果：これらの結果を図６にまとめる。 HIFは53才の男
性の緑内障より獲得した。PDGF及びbFGFの如き成長因子
は HTFに対する刺激活性を示したが（ ^*ｐ＜0.02，^**ｐ
＜0.01；Student-Fisher検定により決定）、効果なし、
陽性又は陰性がこれらの細胞を軟骨液体エキス（１kg／
２ｌ）の存在下で増殖させたときに得られた。このこと
は、腫瘍細胞に対する液体軟骨エキスの形成不全活性が
万能でなく、そして線維芽細胞の増殖に影響しないこと
を示す。この軟骨エキスはその他のタイプの線維芽細
胞、HSF(ヒト皮膚線維芽細胞；データーは示さず）に対
しても効果がなかった。たとえ試験していなくても、固
体エキスも正常細胞に対して効果を及ぼさないと推定さ
れる。 ｂ．ヒト臍帯静脈(HUVEC) 由来の内皮細胞： HUVECを J
affeら (1973) に記載の通りにしてコラゲナーゼ調節消
化により抽出した。14回の継代（各継代においてトリプ
シン−EDTA）前に純粋な内皮細胞を利用した。細胞の品
質をジ−アセチルLDLを組込む能力及び第VIII因子でラ
ベルされる能力について分析した。

【００５３】内皮細胞を2500細胞／cm² の密度でゼラチ
ン被覆無菌皿でプレート培養した。細胞を完全培地(Med
199＋ヘパリン（90μｇ／ml）＋Ｌ−グルタミン（２m
M）＋炭酸水素塩＋FBS(10％）＋ECGS(120μｇ／ml）で2
4ｈ培養し、細胞接着を確保する。次いで細胞を PBSで
３回洗い、そして培養培地を実験条件に従って添加し
た。最後の PBS洗浄を０時間目とした。

【００５４】各実験を三重測定で実施し、そして統計学
的分析を比較のために行った。培養培地を24ｈ後、そし
て１日置きに交換した。培養の 168ｈ後、BrdU（最後10
mM）を各培養培地に加え、そして37℃で２ｈインキュベ
ーションした。次に細胞を短いトリプシン−EDTA消化に
より遊離し、そして96穴プレートに移してBrdUの ELISA
検出を可能にした。 ELISAは Boehringer Mannheim Kit
及び方法で実施した。コントロールは細胞抜きで行い、
バックグランドの基底レベルを決定した。別のコントロ
ールは、液体軟骨エキスが細胞接着に影響するかどうか
を排除するため、インキュベーション期間の終了時に培
養培地中の DNA含有量を測定することにより実施した。

【００５５】細胞増殖はペトリ皿の中に存在する DNAの
量でも評価した。各実験を三重測定で実施し、そして統
計学的分析を比較のために実施した。培養培地は毎日交
換した。培養の 168ｈ後、細胞をNa−クエン酸− SDS溶
液で溶解し、そして Hoescht33358とインキュベーショ
ンした。サンプルをスペクトロフルオロメーターで 365
nmで読んだ。

【００５６】最後に、ペトリ皿の中に存在する細胞の量
を酸性ホスファターゼ活性を測定することにより評価し
た。各実験を三重測定で実施し、そして統計学的分析を
比較のために行った。この酵素の活性はペトリ皿中の内
皮細胞の数との強い相関を示した（BrdU組込及び Hoesc
htラベリング；データーは示さず）。酸性ホスファター
ゼ活性はSigma Chemical Company由来のキットで測定し
た（若干の改良を伴い、製造者の手順に従う）。

【００５７】結果は液体軟骨エキスによる内皮細胞増殖
の用量依存式阻害を示した（図７）。得られるED₅₀は約
90μｌの液体エキスである（液体エキス中に存在する約
1.5mgの乾燥重量に相当）。 ｃ．ケラチノサイト：液体軟骨エキスを、ケラチノサイ
トにおいて試験し、その細胞性形質導入経路の既知の作
動因子であるトリホルボールアセテート(TPA) によりプ
ロテインキナーゼＣ(PKC) は活性化しておいた。正常な
ヒト内皮ケラチノサイトは一次培養により樹立した（Ma
tsuiら (1992) J.Invest.Dermatol. 99 :565-571)。培
養は改良MCDB 153製剤中の内皮成長因子（10ng／ml）、
インスリン（５μｇ／ml）、ヒドロコルチゾン(0.5μｇ
／ml）及び牛下垂体エキス（70μｇ／ｍ）を含む無血清
規定培地(KGM) の中で増殖させた。

【００５８】ケラチノサイトを70％の集密度まで増殖さ
せ、そして新鮮培地を再供給してから48ｈ後、 200ng／
mlの TPA又は２μｌ／mlのDMSOにより、更なる追加の再
供給抜きで処理した。様々な濃度の液体軟骨エキスを培
養培地に加える又は加えなかった。これらの結果はケラ
チノサイト増殖に対する液体エキスの効果を示さなかっ
た。それは増殖の TPA誘導阻害に対しても影響を及ぼさ
なかった。しかしながら、液体軟骨エキスは TPA誘導ケ
ラチノサイト分化を阻害することができた（図８）。ケ
ラチノサイトの分化レベルは TPAにより５倍上昇した。
液体軟骨エキスそれ自体は角化封入形成に対して効果が
なかった。しかしながら、その存在は TPA誘導角化封入
形成を約60％以上阻害した。

【００５９】近年の公開物は PKC活性化が正常なケラチ
ノサイトを、増量したインターロイキン−８（IL-8）を
生成させるようにすることを示した。インターロイキン
−８は炎症の媒介因子である(Chabot-Flechterら (199
4) J.Invest.Dermatol. 103：509-515)。更に、乾癬ケ
ラチノサイトは非常に大量のIL-8を生成し、それは乾癬
プラークにおける新生脈管形成を更に促進する(Nickolo
ffら (1994) Am.J.Pathol. 144：820-828)。その他の成
長因子及びインテグリンも関与し、そして関与しうる標
的分子種を広げることが重要でありうる(IL-1, TNF、
等）。我々は TPA誘導が乾癬ケラチノサイトを擬態する
ことはわからない。もしそうなら、これらの結果は軟骨
が in vivoで正常ケラチノサイトに対して効果がなく、
一方それは乾癬（又は活性化）ケラチノサイトに対して
は効果がありうることを示しうる。 TPA活性化ケラチノ
サイト及び乾癬プラーク又はケラチノサイトにおける液
体軟骨エキスによるIL-8の生成の阻害は確認する必要が
ある。IL-8及び／又はその他の成長因子のレベル低下は
このエキスの抗炎症性及び抗脈管形成効果を説明する興
味深い可能性をもつ。コラゲナーゼアッセイ： ａ．アッセイ１：このアッセイはKnightら(1992) FEBS
Let. 296-266に記載されている。この方法は金属プロテ
ィナーゼの活性部位を擬態する蛍光原性ペプチド基質(M
ca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂) を利用する。こ
の基質は一端に蛍光基を、そして他端に蛍光クエンチン
グ基(Dpa) を有する。完全基質において、クエンチング
基は蛍光を効率的にマスクする。基質の分解により、試
験管内の蛍光は高まる。

【００６０】コラゲナーゼ活性化はWeingartenら(1985)
Biochemistry 24, 6730に記載されている。１μｇを50
mMのトリス−HCl 、10mMのCaCl₂ pH 7.5で 100μｌに希
釈し、１μｌの10mg／mlのトリプシン溶液（１mMの HCl
中）を加え、そして20℃で15分インキュベーションし
た。活性化は10μｌのダイズトリプシンインヒビター(S
BTI ５mg／ml）を加えることにより停止させた。各マイ
クロキュベットに以下を添加した： 25又は50μｌのインヒビター^* （水で50μｌにする）； 40μｌの50mMのトリス−HCl 、 200mMのNaCl、10mMのCa
Cl₂ 、pH 7.5； ８μｌの活性化コラゲナーゼ^**（最終67ng）；及び ２μｌの基質（DMSO中で１mMのストック溶液；最終20μ
Ｍ）。

【００６１】蛍光はλ_ex＝328nm 、λ_em＝393nm で記録
した。

【００６２】^* ：インヒビターはコントロール物質（ED
TA、オルト−フェナントロレン等）又は液体軟骨エキス
と定義する。

【００６３】^**：コラゲナーゼはヒトＩ型、IV型及び両
生類オタマジャクシコラゲナーゼと定義する；ゼラチナ
ーゼも使用した。 ｂ．アッセイ２：このアッセイはWelgusら (1979) JBC
256, 9511-9516に記載されている。この方法はＩ型コラ
ゲナーゼ（MMP1）による切断を調べるためにSDS-PAGEを
利用する。Ｉ型コラゲナーゼは天然コラゲナーゼ分子を
一回切ってもとのコラーゲンのサイズの75％及び25％の
２本のフラグメントにする。数時間かけて切断後、反応
はSDS-PAGEにより基質由来の生成物を分離することによ
りモニターする。切断、対、未切断コラーゲンの比をク
マジーブルーによるゲルの染色（又は銀染色）の後に目
視評価する。

【００６４】21ngの活性化コラゲナーゼ（アッセイ１参
照）を５μｇの牛皮コラーゲン(Worthington) ±インヒ
ビターに加え、最終容量は20μｌとした。反応を35℃で
16ｈインキュベーションし、次いで40mMのEDTAを含むSD
S-PAGEサンプルの添加により反応を停止させ、煮沸し、
そして８％のアクリルアミドゲル上に泳動させた。 ｃ．用量−応答性阻害：液体軟骨エキスより得られる結
果は双方のアッセイによるコラゲナーゼ活性用量−応答
性阻害を示した。図９はアッセイで得られた結果を示
す。ED₅₀は30μｌの液体エキス（又は30μｌの液体エキ
ス中に存在する0.51mgの乾燥重量）で得る。 in vivoアッセイ：胎芽脈管形成試験(EVT) ： ａ．試験系の定義：ヒヨコ胎芽の正常発育は、発育中の
胎芽に卵黄（卵の卵黄）由来の栄養素を運ぶ卵黄膜中に
存在する外部血管系の形成を包含する。卵黄膜に載る
と、抗脈管形成物質は卵黄膜中で起こる血管発達を阻害
しうる。卵黄膜へのアクセスを促進するため、ヒヨコの
胎芽を無菌培養箱（ペトリ皿）に移し、そして湿度及び
温度制御インキュベーターに入れる。胎芽は数日にわた
り ex vivo条件でこの中で発育できる。

【００６５】液体軟骨エキスのアリコートをメチルセル
ロース溶液と混合し、そして薄ディスクにおいて風乾さ
せる。この手順の間、液体軟骨エキス濃縮物の中には内
性NaClが存在しており、そしてディスク当りのその量が
25μｇを超えると EVTを妨害する。従って、液体エキス
の脱塩が必要でありうる。 100Da以下の膜カットオフに
よる透析又は電気透析が許容の方法であることが見い出
された。

【００６６】メチルセルロースは液体エキスがそれから
ゆっくりと拡散しうる内部マトリックスを形成する。液
体エキスを含むメチルセルロースディスクを、脈管形成
過程が未だ活性である卵黄膜の脈管外周の外部境界に載
せる。

【００６７】近位膜脈発育に対する液体軟骨エキス含有
ディスクの効果は常に水及び当モル量のNaClを含むディ
スクのそれと比較しておく。ディスクを ex vivo成長過
程の０日又は１日目に胎芽卵黄膜の上に載せる。この時
点で、主要血管の基端のみが卵黄に侵入している。胎芽
を、脈管形成を評価するまで培養条件下で置く（約24
ｈ）。水及び液体エキス含有ディスクは常に同一の胎芽
の卵黄膜上に同時に加える。双方のディスクは、鮫軟骨
エキスをコントロールと比較するとき、個体間変差を最
少限にするため、胎芽の頭尾方向軸を中心に対称となる
ように配置する。 ｂ．抗脈管形成活性： EVTは陽性コントロール又は液体
軟骨エキスとして様々な濃度のプロタミン（37, 75及び
150μｇ）を利用することにより実施した。１日の培養
後、ディスクに覆われた領域における脈管形成レベルを
通常の目かくし方式において一組の科学者により等級分
けする。ディスクを配置し易くするため、それを卵黄膜
の上に載せたらすぐに黒色Ｏリングをそのまわりに配置
する。 EVT試験の評価スケールは１−２−３点に基づ
く：（３点）コントロール胎芽の対立する水平四分円又
は対合四分円に比較したときの正常脈管形成；（２点）
血管はディスクにより覆われた領域に侵入しているが、
中間軌道においては消失している。主要血管はディスク
により覆われた領域を横断するが、その軌道は明らかに
影響を及ぼされているか、又は側方枝分れ密度の減少が
見られる；（１点）ディスクにより覆われた領域に血管
は認められず、又はその経路はディスクにより覆われた
領域から逃げるようにして直ちに偏向している。血管は
ディスクを迂回し、そしてそれを通り過ぎている場合を
除き、ディスクにより覆われた領域を通り過ぎない。

【００６８】用量−応答性阻害はプロタミン（データー
は示さず）及び液体軟骨エキス（図10）により得られ
た。ED₅₀は約 170μｇの乾燥液体エキス（液体エキス中
に存在する乾燥重量）により得られた。Wilcoxonサイン
式等級統計学的検査を同一の卵の上に載せた２枚のディ
スク（水及び軟骨エキス）との間の差の有意性を比較す
るために用いた。マウス乳アデノ癌腫モデル： ａ．試験系の説明：液体軟骨エキスの抗腫瘍性潜在能力
をマウス乳アデノ癌腫モデル（同種移植片）で試験し
た。この試験系は１×10⁶ 個のDA３細胞によるBALB／Ｃ
マウスの皮下接種より成る。これらの細胞は７，12−ジ
メチルベンズアントラセン（DMBA）により誘導されたマ
ウス乳アデノ癌腫に由来する。このモデルはDaniel Med
inaにより樹立された（J.Natl.Cancer Inst.(1969) 4
2：303-310 ；前掲 (1976) 57：1185-1189)。接種した
細胞は in vivoでゆっくりと成長し、そして低い代謝予
後をもって固体腫瘍を形成した。

【００６９】DA３細胞を１mMのメルカプトエタノール、
１Ｍの Hepesバッファー溶液、 100mMのピルビン酸Na、
200mMのＬ−グルタミン、10mMの非必須アミノ酸、１Ｍ
のビタミン、10％の胎児牛血清、１％のペニシリン−ス
トレプトマイシンの添加された RPMI 1640培地の中で37
℃で５％の CO₂において維持した。腫瘍誘導化のため、
細胞を完全培地の中で70％の集密度に至るまで増殖さ
せ、次いでトリプシン−EDTA溶液を利用して回収した。
細胞を遠心分離し、そしてリン酸バッファー溶液で３回
洗い、そして１×10⁶ 細胞／0.1ml の希釈率で再懸濁し
た。

【００７０】DA３細胞接種マウス（ｎ＝15）に毎日鮫軟
骨液体エキス又は偽薬（生理食塩水）の投与を与えた。
処理はDA３細胞の接種の７日後に始めた。様々な濃度の
液体エキスを試験した。投与する液体エキスの量は液体
エキスの中に存在する乾燥重量で表示する。試験製品は
ここに記載の通りに調製した：液体エキスを凍結乾燥
し、そして水の中に様々な濃度で再懸濁した（0.2, 1.
5, ３, 10及び20mg／ 200μｌ）。毎日投与する最終容
量は体重１kg当り10, 75, 150, 500及び1000mgとした。 ｂ．抗腫瘍活性：結果は、約75mg／kgの液体エキスの投
与により最大の腫瘍進行阻害が得られることを示した
（図11）。興味深いことに、より多い用量では効能が下
った。このことは、液体エキスが腫瘍進行を阻害しうる
物質及び腫瘍阻害の作用を阻害しうるその他の物質を含
むことを示唆する。この現象は生物薬について既に報告
されている。

【００７１】最後に、液体エキスの腹腔内投与は腫瘍増
殖の阻害についての最大効能用量を劇的に（75分の１）
に下げた（図12）。 ｃ．毒性：全ての処理により、体重の減少又は液体エキ
ス関連死はなかった。処理期間中マウスの毎日の検査で
徴候又は挙動変化は認められなかった。処理の終了時
に、マウスを殺し、そして全ての器官の大まかな形態を
鑑定病理学者により分析させた。異常は認められなかっ
た。血液分析は異常の徴候を全く示さなかった。 ｄ．組織病理学：腫瘍組織病理学は偽薬又は液体エキス
処理マウス由来の任意の大まかな変化を示さなかった。
腫瘍活性の程度は全グループにおいてかなり高かった。
様々な器官（肺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、小腸、卵巣、
胸部、脳及び心臓）の分析は液体エキスに関連しうる任
意の特定の変化を示さなかった。マウス超過敏性モデル(CHS) ａ．試験系の説明：ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）
はBALB／Ｃマウスにおいて強力な炎症反応を誘導できう
る強力な皮膚刺激因子である。０日目に、10匹のマウス
を、その腹部にDNFBを塗布することにより感作せしめ
た。マウスの右耳にこの感作の５日後に10μｌのDNFBを
塗布することで負荷した。耳の膨大化を組織刺激指数と
していくつかの後曝露時間にわたり測定した。

【００７２】液体軟骨エキスをそれがマウスにおいてDN
FBに対する炎症反応を抑制できるか否かを調べるために
試験した。ビヒクルのみ(0.2mlの食塩水溶液：５匹）又
は液体エキス（20mg／mlの乾燥重量を含む 0.2mlの液体
エキス：５匹）を感作前３日連続及び感作後４日連続で
経口投与した。 ｂ．超過敏性活性：耳負荷の１日後、ビヒクルのみで処
理したマウスは厚さ 8.2mmの耳膨大化を示した。興味深
いことに、軟骨液体エキスで処理したマウスはわずか
2.8mmの耳膨大化を示した。これらのデーターの統計学
的有意差はｐ値＜0.001 を有す。この結果は、液体軟骨
エキスが強力な炎症インヒビターであることを示す。 活性分子を含む液体画分の獲得 in vitroアッセイ：腫瘍細胞系： ａ．試験系の調製：鮫軟骨を回収し、そして前記と同じ
ように処理した。遠心分離後、ペレットを捨て、そして
その上清液を上記の通りに限外濾過し、0.22μｍのフィ
ルターで滅菌濾過した。このようにして得られた液体エ
キスを様々な方法により更に分画した。腫瘍細胞系を上
記の章に記載の通りに増殖させた。 ｂ．FPLC条件：カラム： Hiload 26mm×60cm Sephacryl
S-300。FPLC系： Pharmacia由来。サンプルは全てカラ
ムに装填する前に0.22μｍのフィルターで濾過した。溶
出バッファーは、濾過し、そして15分間脱気したリン酸
バッファー食塩水(PBS) とした。装填するサンプルの容
量は通常 3.2mlとした（13mlにまですることができ
る）。流速は１ml／分とした。10mlの画分を集めた。溶
出化合物はそのU.V.(280nm) 吸収により検定した。較正
チャートは Sigma由来のMW-GF-1000較正キットを用いる
ことにより得られ、この較正サンプルは分析する装填サ
ンプルと同じ容量を有する(3.2ml) 。サンプルの溶出容
量は較正キットの化合物の分子量を、カラムのボイド容
量を差し引いたその溶出容量に対してプロッティングす
ることにより推定した。ボイド容量はデキストランブル
ー（M.W.＝2,000,000)を注入することにより得た。

【００７３】画分をその活性についてZR75-1細胞に対し
て試験した。注目の画分を同定し、そして特性を更なる
研究（以下）により確証した。

【００７４】透過物の活性成分の更なる特性決定はRoto
for (Biorad 170-2950；下記の等電点電気泳動参照）並
びに10〜30kDa, 30〜100kDa及び100kDaより大きい分子
量の画分を得るために様々なカットオフ値のAmiconフィ
ルターで行った。 ｃ．等電点電気泳動条件：鮫軟骨エキスの調製品（１kg
／ｌの透過物46ml）をSpectro pore #7 MWCO 3500kDa膜
(Spectrum 132110) を用いて４℃にて５％のグリセリン
を含む純水４リットルに対して一夜透析した。透析した
溶液を2.75mlの両電解質（Pharmacia #80-1125-87) pH
3.5〜10.0及び 0.5ｇのCHAPS (Sigma C3023；３−
〔（３−クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ〕
−１−プロパン−スルホネート）と混合した。この容量
を純水で55mlにした。この溶液を Rotoforに載せた。等
電点電気泳動は４℃にて、12ワットの定常電力（3000xi
電源 Biorad 165-0554）で、恒温を確実にするために水
を循環させながら行った。分離の開始時に、電圧は 380
ボルト及び31mAのアンペアとした。等電点電気泳動を止
め、そして20本の画分を集めた。

【００７５】

【表３】

【００７６】これらのタンパク質の同定は電気泳動ゲル
上でのその分子量の見積りにより行った（Laemmli, U.
K.(1970) Nature (Lond.) 227 : 680）。

【００７７】これらの画分を装填バッファー(Laemmli参
照）で４倍に希釈し、そして８μｌのアリコートを非還
元条件下で電気泳動にかけた。図13は各画分及び等電点
電気泳動前の材料の電気泳動プロフィールを示す。

【００７８】画分は全て層流フードのもとでそれらを0.
22μｍの孔を有する滅菌Millipack-60フィルターに通す
ことにより無菌ボトル詰めした。 ｄ．腫瘍細胞に対する阻害活性：画分のタンパク質をロ
ーリー用量法により評価した。１kg／２ｌの溶液（透過
物１リットル当りの担軟骨重量で表示）を培養培地中の
様々な濃度でZR75-1細胞に対して試験した。その結果を
下記にまとめる。 第１試験： Rotofor画分に対して実施した試験。（透過
物はエバポレーションにより濃縮）。タンパク質同定：

【００７９】

【表４】

【００８０】第２試験はFPLC画分で実施した（透過物は
エバポレーションにより濃縮した）：

【００８１】

【表５】

【００８２】第３試験はAmicon分フィルターで得た 100
μｌの画分で実施した：

【００８３】

【表６】

【００８４】FPLC画分６及び７は非常に小さい分子量の
活性成分を含む： 0.1〜2.5kDa。

【００８５】画分の形成不全効果は凍結乾燥で観察され
るものの 33000倍まででありうる。 ｅ．溶出物の活性成分の更なる同定：活性画分を上記の
FPLC及び rotofor手順を利用して直径10mm×長さ30cmの
Superose-12カラムでのこの透過物で出発する別のタイ
プの精製により決定した下記の範囲の分子量で、回収し
た（ZR75-1細胞で試験）。１ml／分の流速を選定した。
１mlの画分45本を回収した。

【００８６】

【表７】

【００８７】コラゲナーゼアッセイ： ａ．HPLCクロマトグラフィー：液体エキス(DUP) のサン
プル 980mlをタンゲンシャルフロー限外濾過ユニット
（PELICON, Millipore）で 10kDaのカットオフ膜で濾過
した。このユニットをまず１ｌの水ですすいだ。最終収
量は＞10kDa 画分が480ml、そして＜10kDa 画分が 1.8
ｌであった。＜10kDa をコールドフィンガーエバポレー
ションにより 180mlにまで濃縮（＜10−10×）。＜10−
10×の８本の100μｌのアリコートを CDC-S Hexyl、５
μｍのHPLCカラム（25×0.94cm）に載せ、そしてまず 1
00％の H₂Oで４ml／min で、次いで 100％のMeOHで 8.5
ml／min で溶出させた。 OD₂₁₄ピークに対応する画分を
集めた。

【００８８】５本の画分を集めた（図14）：Fr１，Fr
２，Fr３，Fr４及びFr５。最初の３本の画分は少なくと
も主要ピークを含んだ。ｂ．抗−コラーゲン溶解活性：
この結果はFr１がコラゲナーゼを阻害する最も活性な画
分であることを示す；低レベルの活性が全てのその他の
画分の中に存在する：アッセイ１は図14参照；アッセイ
２は下記の表参照。

【００８９】

【表８】

【００９０】EDTA 40mMはコラゲナーゼを阻害した。生
液体エキス DUPは低い抗−コラーゲン溶解活性を示し
た。画分１〜５は活性であった。最大の活性は画分１で
あった。 10kDaより大きい分子量の画分は有意な阻害活
性を示さなかった。 ｃ．抗−コラーゲン溶解因子の更なる定義：液体軟骨エ
キスをタンゲンシャルフロー濾過装置及び 10kDaのフィ
ルター(Pellicon, Millipore) を用いて分画した。濾液
（＜10kDa の画分）は全抗コラーゲナーゼ活性を含むこ
とが見い出され、そして下記の通りに更に特性決定され
た。＜10kDa 画分は 100Daの見かけ分子量カットオフ膜
(Spectra／ Por CE（セルロースエステル）MWCO：100D
a, Cat # 131015)を用いて更に透析した。抗コラーゲン
溶解活性が濾液の中で回収された（＜10kDa の画分）。
＜10kDa の画分をＣ８逆相カラム（EM Science Lichrop
repRP-8, Cat # 9242）に載せ、そして H₂O、次いで60
％のメタノール、そして最後に 100％のメタノールで溶
出させた。抗コラーゲン溶解活性の大多数（98％）がH₂
O溶出液において回収され、そして２％の活性が60％の
メタノールで溶出した。

【００９１】まとめると、このエキス中の抗コラーゲン
溶解活性は、透析されうる又は Spectra／Por CE（セル
ロースエステル）MWCO：100 膜を通り、そして H₂Oを適
用したときにＣ８逆相カラムマトリックス（Lichropre
p）に吸着されない（１又は複数種の）低分子量化合物
に基づく。 in vivoアッセイ：胎芽脈管形成試験(EVT) ： 液体軟骨エキスをタンゲンシ
ャルフロー濾過装置及び 10kDaのフィルター(Pellicon,
Millipore) を用いて分画した。 10kDaより小さい及び
大きい液体軟骨エキスの画分を同じ条件下で試験した。
それらは新生脈管形成を阻害するうえで同等の効能を示
した（図15）。これは 10kDaを超える画分の中に存在し
ない抗コラーゲン溶解活性と対称的である。 ａ．画分＜10kDa ：本画分中の抗脈管形成因子は上記の
精製工程の際に抗コラーゲン溶解因子として挙動した。 ｂ．画分＞10kDa ：この画分はゲル浸透クロマトグラフ
ィーカラム（SephacrylS-300, Pharmacia）でクロマト
グラフィーにかけた。抗脈管形成活性を有する画分（S3
00-4）をSDS-PAGEで特性決定した。活性画分（S300-4）
は約８〜18kDa の分子量を有する数本のバンドを有した
(BioRad SDS-PAGEマーカータンパク質で比較）。この画
分を陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono-Q, Pharmac
ia) を用い、25mmのトリス−HCl 、pH 8.0及び０〜1.0
ＭのNaCl勾配により更に分画した。0.8〜1.0 ＭのNaCl
で溶出する画分は高い抗脈管形成活性を有した。 0.3〜
0.6ＭのNaCl及び0.08〜0.2 ＭのNaClで溶出する画分は
弱い抗脈管形成活性を有した。 従来技術の製品との比較 従来技術の定義 我々は軟骨エキスに多大な関心を寄せた最初の者ではな
いため、我々は本方法により調製した鮫軟骨液体エキス
の固有の特徴を従来技術に記載されている又はそれより
推定される２種類の製品、即ち、Balassa (USP 4,822,6
07）及びOikawaら（前掲）の方法により調製された製品
との横並び比較により確認した。

【００９２】Oikawaらは２種類の主要画分であって、一
方が１〜10kDa の分子量の分子を有し、そして第二が 1
0kDaより重い分子量の分子を有するものが得られる方法
を発表している。彼らは第一画分のみに抗脈管形成特性
を認めており、他方は CAM試験において抗脈管形成活性
が全くないと言っている。Oikawaらの製品の適当な比較
のため、我々は我々の全液体エキスを２つの対応の画分
に分画し、そして０〜10kDa を有するものを保持した。

【００９３】Balassaは全液体エキスを抽出するための
方法を発表しているため、我々は出発材料として子牛軟
骨を鮫軟骨に置き換えて Balassaの方法を再現すること
により調製した製品と我々の液体軟骨エキス（０〜500k
Da）を比較した。

【００９４】もし Balassa及びOikawaが我々と均等の方
法を発表しているなら、FPLC, HPLC及び CZEで得られる
パターンが実質的に重なり合い、そして同じ抗脈管形成
活性が EVTに対して発揮されうると仮定した。全てのサ
ンプルを12μｇ／μｌの最終濃度（乾燥重量／容量溶
液）にFPLC及びHPLCクロマトグラフィーの前にした。Oi
kawaの製品はそれが不溶性材料を含むため遠心分離し、
そして濾過してからクロマトグラフィーにかけた。 サンプルの調製 ３通りの方法により抽出した鮫軟骨サンプルを下記の通
りにラベル化した（溶液の容量当りの推定乾燥重量
で）： １） DUPは０〜500kDaの分子を含むように分画した本発
明の調製品である（12μｇ／μｌ）； ２） BALは Balassaらの方法に従う調製品である（12μ
ｇ／μｌ）； ３） OIKはOikawaらに従う画分らの調製品である。サン
プルは全て任意の分析前に12μｇ／ml（乾燥重量／容
量）の最終濃度にしてある。 OIKサンプルは多量の不溶
性材料を含み、それは 13,200rpmでの遠心分離により容
易にペレット化する、又は 0.2μｍの膜で濾過してよ
い。不溶性材料の濾過による除去はFPLC, HPLC及び CZE
の前に必須である（図16, 17, 18）。 FPLC比較 条 件：Superose 12 (Pharmacia) ；ゲル浸透カラム。
サンプルをSuperose 12(10／30）ゲル浸透カラムに溶出
液としてリン酸緩衝食塩水(P BS) で 0.5ml／min の流
速において流した（チャートスピード＝0.25cm／min)。
濃縮調整サンプルの 100μｌのアリコートを注入の前に
0.2μｍの膜で濾過した。 OD₂₈₀をモニターした。

【００９５】このカラムを下記の標準品（MWはDaで表
示）で検量した：カタラーゼ(232,000) 、アルドラーゼ
(158,000) 、アルブミン（56,000）、オバルブミン（4
4,000）、キモトリブシン（25,700）、リボヌクレアー
ゼ（13,700）、インスリン(5,700) 、インスリンＢ鎖
（3500）、インスリンＡ鎖（2500）、バシトラシン（14
50）、ビタミンB-12（1355）。主要ピークの分子量は下
記の式により計算した：Log_{1 0} MW＝7.52− 0.212×RT
（ここでRT＝ml表示の溶出容量、Ｒ² ＝0.976 であ
る）。全カラム容量（Vt）はシチジン(246Da) を用いる
決定により 21.93mlであった。ボイド容積（Vo）はブル
ーデキストラン（２×10⁶Da)で8.38mlと決定された。結
果のまとめ：図16ａ）において、我々のサンプル DUPは
約3500Daの分子量である 18.76mlで溶出する第一主要ピ
ーク（１）を有した。その後の22.7（２）及び27.3ml
（３）でのピークは全カラム容量（シチジンによる決定
に従い、 21.93ml）を超えていた。これらのピークはカ
ラムマトリックスに対して若干の親和力を有していた。

【００９６】図16ｂ）において、 Balassaのサンプル B
ALはカラムのVo付近で溶出する小さなピーク（１)(8.4m
l)、18.5ml（4000Da）で溶出するピーク（２）、並びに
22.6min(３）及び28.2ml（４）のVtの後に溶出する２本
のピークを有した。

【００９７】図16ｃ）において、Oikawaのサンプル OIK
はVoでの小さなピーク（１）、18.9ml（3300Da）でのピ
ーク（２）、21.5ml（1000Da）でのピーク（３）及び2
7.3mlでの小さなピーク（４）を有した。

【００９８】サンプルの比較において、3500Daのピーク
とは別に、 DUPサンプルの主要バンドがその他のサンプ
ルにおいて同じ強度で観察されないことに注目すべきで
ある。 OIKサンプルは少量の27.3mlのピークを有するこ
とが認められた。 BALサンプルは28.2mlで泳動するピー
クを有し、それは DUPサンプル中のささいなピークの一
つと相関しうる。 HPLC比較 条 件： CS-S−ヘキシルカラム５μｍ、25×0.94cm、CSC # 059-
085 ；逆相カラム。 結果のまとめ：ヘキシル逆相カラムでのHPLCに関し、 O
D₂₁₀及び OD₂₈₀を同時にモニターした。遠心分離したサ
ンプルの50μｌのアリコート（全て12μｇ／μｌ）を装
填し、そして 100％の H₂Oで溶出させた。 OD₂₁₀に従っ
てラベルした各クロマトグラフィーについてのピーク
（eg.1）及び対応の OD₂₈₀ピークは（eg.1）で表示す
る。このカラムのVoは5.5ml (1.4min)であった。

【００９９】図17ａ）において、 DUPは３本の主要ピー
クを有し、それらはOD₂₁₀(１，２，３）及び２本のささ
いなピーク（４，５）を通じて観察された。２本の副次
的なピークがピーク１の外れに観察され、ピーク１ａ及
び１ｂとラベルした。有意なOD₂₈₀吸収がピーク１，１
ａ，１ｂ及び３にまとまっていた。対して、ピーク２に
ついての対応の OD₂₈₀吸収は OD₂₁₀と比べてはるかに小
さかった。

【０１００】図17ｂ）において、 BALはより多くの OD
₂₁₀ピークを示したが、その強度は DUPピークと比べて
低かった。ピークの重なりが同じ分子の表示である限
り、 Balassaサンプルのピーク３及び７のみが DUPサン
プル中のピークの保持時間と相関しているようであった
（ピーク１ａ又は１ｂ及びピーク４のそれぞれ）。

【０１０１】図17ｃ）において、 OIKエキスの中には３
本の主要ピークしか認められなかった（１，２，３）。
ピーク１及び３は DUPサンプルのピーク１及び３に相関
するが、１の副次的なピークが OIKクロマトグラフィー
に観察された。 OIKサンプル中のピークの高さは DUPよ
りも低かった。従って、FPLC及びHPLCパターンは異なる
製品の特徴を有した。 CZE比較： 条 件： 装置：goalソフトウェア（バージョン7.11Ｕ）の付いた
Beckman系(place系2050）；キャピラリー：Silice (TS
PO 50375）、50μｍ×95cm；バッファー：２Ｍのギ酸；
コート溶液、５％ｐ／ｖのヘキサジメトレンブロミド及
び２％ｖ／ｖのエチレングルコール水溶液；検出器：UV
(200nm) ；電流：−30kV；注入：0.5psi、20秒；温度22
℃。

【０１０２】キャピラリーを１ＭのNaOH（20psi, 20mi
n）、水（20psi, 10min）、コート溶液（20psi, 20mi
n）及びバッファー（20psi, 10min）でコンディショニ
ングした。次にこの条件を泳動用に設定した：バッファ
ー(20psi, ２min)、サンプル注入（0.5psi, 20sec.）、
泳動（−30kV, 45min)、１ＭのNaOH（20psi, 3.5min)、
水（20psi, 3.5min)、コート溶液(20psi, ４min)及びバ
ッファー(20psi, ４min)。

【０１０３】各サンプル(BAL, DUP, OIK画分３）を16.5
mg／mlに再懸濁した。各溶液のpHをBAL, DUP及び OIKの
それぞれの中で7.1, 6.8及び 8.2にした。各溶液のNaCl
濃度をBAL, DUP及び OIKのそれぞれの中で2.08, 4.37及
び0.71mg／mlにした。 結果のまとめ：各サンプルの分子量プロフィール（BAL,
DUP及び OIK-3）を図18〜20に示す。DUP及び BALサン
プルの比較は BALサンプルが＜１の％面積を有する大き
めの比率のピークを含むことを示した。 BAL及び DUPは
MT／EOF ＝1.06, 1.54, 1.59,1.66及び3.22においてピ
ークを共有する。1.06, 1.54及び3.22の比を有するピー
クは BAL及び DUPにおいて類似の％面積を有し、ここで
比1.59のピークは BALのよりも８倍強く、そして比1.66
ではその反対が認められた。

【０１０４】DUP及び OIKサンプルは非常に異なる電気
クロマトグラフィーを示す。 OIKは数本のささいなピー
クを有する１本の主要ピークを有する。これらのどのピ
ークも DUPサンプルの１つと関連することができなかっ
た。 EVT比較 サンプルDUP, BAL及び OIKの抗脈管形成能力を EVTに対
して分析した（図21）。有意な抗脈管形成活性は Balas
saのエキスでは回収されなかった。 DUP粗エキスをOika
waの OIKの画分３と比較した。 DUK及び OIKは共にほぼ
同等であった。Oikawaは本発明を何ら開示しておらず、
なぜなら彼らは 10kDaより大きい分子量画分において活
性は何ら検出できないと述べており、これが図15の我々
の結果と矛盾しているからである。

【０１０５】従って、 Balassaと我々の方法との間での
類似にかかわらず、両方法により得られる製品は明らか
に同じでない。 アミノ酸比較 BAL, DUP及び OIKサンプル（全て16.5mg／mlの乾燥重
量）のタンパク質含有量をローリー法により測定した；
結果はBAL, DUP及び OIKサンプルのそれぞれについて3.
31, 0.27及び4.15mg／mlの値を示した。タンパク質／乾
燥重量の比は DUPサンプルを BAL及び OIKと比較すると
きに非常に重要である。

【０１０６】分析は各液体軟骨調製品のアミノ酸含有量
を更に分析するために実施した。図22〜24はBAL, DUP及
び OIKサンプル中の各アミノ酸の比率を示す。遊離アミ
ノ酸の比率は各軟骨調製品間で異なる：BAL, DUP及び O
IKサンプルのそれぞれにつき23％、73％及び４％。タン
パク質起源由来のアミノ酸の比率は各軟骨調製品間でも
異なる：BAL, DUP及び OIKサンプルにおいてそれぞれ77
％、27％及び86％生データーについては下記の表を参照
のこと：

【０１０７】

【表９】

【０１０８】結 論 我々の製品(DUP) と比較した２の先行技術の製品（BAL,
OIK）は、軟骨エキスを調製するための古典的な方法と
してなお考慮される。上述の結果は、本方法(DUP) は、
抗脈管形成、抗腫瘍、抗炎症及び抗膠原溶解活性が考慮
される限り、予想されない優れた活性の製品を供する。
我々は、本方法が、１つの単一エキス中の多数の水溶性
の阻害因子を回収することに実際成功している。

【０１０９】BAL, DUP及び OIK分子プロフィール並びに
タンパク質成分の直接の比較は、各々の軟骨調製物が特
定の特徴を有することを証明した。それらは特定の構成
物を共有するようであるが、それらの互いの比率は異な
る。これは DUPが、約75mg／kg未満の投与範囲で経口的
に投与した場合に抗腫瘍性であり、より高い投与量では
この効果を次第に失うと考えることにおいて特に重要で
ある。この結果は、単一因子を超える量が DUP液体軟骨
エキス中で重大であることを示唆する。それゆえ、BAL,
DUP及び OIKのような異なる軟骨調製物は、各々の個々
の構成物の割合がそれらの間で種々であるので、極めて
異なる生物特性を示し得る。 臨床試験 臨床試験のための液体エキスの調製 本発明の鮫軟骨液体エキスで予備的臨床試験を行った。
限外ろ過の後に得られた液体エキスを0.22μｍの多孔度
のミリポアフィルターでろ過した。その液体エキスの微
生物制限はUSP XXIII ＜61＞標準に従って制御した。そ
の液体エキスを無菌フラスコ内の７mlのアリコート（約
85mgのタンパク質）中に分配し、−60℃で一晩、凍結
し、そして利用するまで−20℃で更に保存した。 抗脈管形成効果 新脈管形成依存病を治療するために液体軟骨エキスを用
いた。３つの異なるタイプの新脈管形成依存病の代表を
ヒトで実際にテストした；その第１のタイプは癌（前立
腺癌）であり、第２のタイプは皮膚科学的疾患（乾癬）
であり、そして第３のタイプは関節炎（慢性関節リウマ
チ及び変形性関節症）である。以下の例は少くとも本液
体エキスの抗脈管形成活性を示す。

【０１１０】以下に示す結果は、特にテストしたものば
かりでなく全ての新脈管形成依存性の病気の治療におけ
る粗透過物及びその画分の有用性を極めて奨励し、そし
てそれを予想させる。病気が脈管形成性の構成物を有す
る限り、本発明の軟骨エキスは、それがその有効量を含
む組成物に入れられ、そしてこの組成物が正確な投与に
適した形態であるならこの点において有効であろう。そ
れゆえ、本発明は脈管形成の病気の治療に用いるための
以下の特定の組成物に限られない。なぜなら、当業者
は、その投与の態様及び標的の病気の組織によって選択
することにより多数の組成物を誘導することができるで
あろうからである。組成物は、異なる経路、例えば局所
的、経口的、舌下、直腸、静脈内、筋肉、眼内、腹腔
内、拡散等により投与することができる。

【０１１１】軟骨エキスの魚のような味及びにおいのた
め、芳香剤もしくは香料を加えてもよく、又は他のガレ
ニック組成物（リポソーム、被包、パッチ等）を患者の
コンプライアンシーを勧めるようにデザインすることが
できる。用語“患者”とは、ヒト又は動物の患者を意味
する。 癌：前立腺癌を患う１人の患者に液体軟骨エキスを加え
た食事を与えると、以来大きな健康状態の改善を示す。
1986年に腺癌を診断した。同時に放射線療法を行った。
1991年に、PSA(前立腺血清抗原）レベルは 138μｇ／ｌ
であった。その通常の許容される上限は４μｇ／ｌであ
る。次に患者に、抗アンドロゲン療法（EUFLEx）と組み
合わせて去勢により、完全に異なる治療を行った。この
治療は３年間有効であった。その後 PSAレベルは再び上
昇し始めた。1994年から、この患者にその食事に本液体
軟骨エキスを加えて与えた（１日当り体重１kg当り約１
〜1.5mg に等しい７mgのエキス当り約75mgの乾燥重量の
毎日の経口投与）。その PSAレベルは12から 4.0μｇ／
ml（通常の限界）未満に次第に減少した。最終的な結果
を1996年４月に得た。この投与管理は、投与の経路、活
性成分の生物有効性及び病因が制御されるべき要求され
る攻撃性に従って、随意に変えなければならないであろ
う。この場合、本液体エキスはおそらく実質的な割合で
胃腸管に吸収される。DMBA処置したラット及びDMBA接種
したマウスで得られた結果によることもできる（上
述）。同時に、ラット、マウス（先の例）、及びサル
（データーは示さない）において、非毒性であることが
確認された。

【０１１２】DMBA処理ラット及びDA３移植マウスにおけ
る液体エキスの経口投与は、体重１kg当り１〜300 mg／
kgの投与比がおそらく動物モデルにおける腫瘍の進展及
び腫瘍の血管新生の阻害に大きく寄与することを示唆す
る。マウスにおける液体エキスの腹腔内投与（DA３−モ
デル）は、腫瘍の進行を阻害することにおいて有効な投
与量を得るために、投与の経路が重要であることを証明
した。これは、前立腺癌の場合において有効な１mg／kg
の投与比率が、非経口投与経路が選択されるなら約0.01
mg／kgに減らすことができることを示唆する。それゆ
え、１日当り体重１kg当り約0.01〜約200mg の投与量
が、少くとも部分的に新脈管形成を減らし又は完全にな
くすことにより、癌を治療するための半投与量（ED₅₀）
のほぼ合理的な範囲であると仮定される。

【０１１３】より古典的な療法（手術、化学療法、抗ホ
ルモン療法等）と組み合わせて、いく人かの他の患者に
液体軟骨エキスを加えた食事を与えた（１日当り体重１
kg当り約１〜1.5mg に等しいエキス７ml当り約75mgの乾
燥重量の毎日の経口投与）。いくつかの医療の場合の概
要を以下の表に示す。その結果は、液体軟骨エキスとの
組合せ治療が固体の腫瘍を患う患者の生存率及び生活の
質を増加させることができることを示唆する。

【０１１４】

【表１０】

【０１１５】乾 癬 以下の皮膚科学的組成物を作り、乾癬を患う患者への効
能の確認を試みた： −EMULGADE CLB 29％（ｗ／ｗ） −20×粗透過物 69.5％（ｗ／ｗ） −GERMABENII １％（ｗ／ｗ）、及び −ラバンデュラ・アングスチホリア（Lavandula Angust
ifolia） 0.5％（ｗ／ｗ）。

【０１１６】EMULGADE CLB、ステアリン酸エステル類の
混合物、脂肪アルコール及び非イオン性乳化剤(Henkel
Canada Ltdから購入）を撹拌下で65〜70℃に加熱した。
その混合物を撹拌したまま加熱をやめた。その混合物が
45℃の温度に達した時、精油ラバンデュラ・アウグスチ
ホリア及び防腐剤GERMABENII（ジアゾニジル尿素30％、
メチルパラベン11％、プロピルパラベン３％及びプロピ
レングリコール56％；Sutton Laboratories, NJ, U.S.A
から購入）を加えた。その混合物の温度が30℃に達した
時に、液体軟骨エキスを加えた。得られた組成物はなめ
らかな非脂肪性のクリームであり；EMULGADEの割合を変
えることにより、製造元の指示に従って、他の形態の種
々の粘度の皮膚科学的組成物を得ることができる（ミル
ク、ローション、軟膏）。ペースト、ゲル及び他の形態
の経皮調製物を得るために他のビヒクル又は賦形剤を用
いることができよう。

【０１１７】慣用的な療法には応答したがしばらくして
それらに応じなくなった乾癬を患う９人の患者のパネル
に、12週間、毎日２回上述の製剤を供した。この研究の
ために、両側のメンバーに同様かつ対称的な程度の乾癬
について患者を選択した。感染した方を軟膏エキスを含
む組成物で治療し、そして一方を対照組成物で治療し、
そのことを皮膚科医も患者も知らない二重ブラインド方
式でこれらの試みを行った。その乾癬が過角化症を併わ
ない５人の患者において著しい改善が観察され；過角化
症を有する患者についてもその結果は適度に良好であっ
た。２人の患者の体の一部の写真を図25〜26に示す。図
25ａ及びｂにおいては、過角化症を併う乾癬を患う患者
は、たった１ケ月の治療の後で、そう痒もなく極めて大
きな紅斑の減少を示した。しかしながら過角化症はまだ
重大であった。過角化症を伴わない乾癬を患う第２の患
者の写真（図26ｃ及びｄ）は、３ケ月後に極めて優れた
改善を示した。乾癬は多因子性の病気であるようなの
で、患者の応答は、樹立過程における新脈管形成及び炎
症のような構成物の関与並びにこの病状の永続性の重大
性によると仮定される。その抗脈管形成活性は、DMBA処
理ラット（図５）、内皮細胞増殖（図７）及びEVT(図1
0）に示されるように我々のエキスにおいて実際、存在
する。抗炎症活性も確認されている（マウスの CHSモデ
ル）。この種の製剤に関連する他の因子に対する他の治
療剤（角質溶解剤、付加的抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、
免疫抑制剤等）が補われるなら、より優れた結果が得ら
れることが予想される。

【０１１８】この補足は、例えば製剤を有効量の角質溶
解剤を含むようにする形態をとり得る。それは、このよ
うな補足治療剤の別個の投与、同時の投与、又は本局所
製剤の適用との交互の投与によっても行うことができ
る。更に、補足薬物は同じ経路で投与する必要はない。

【０１１９】上述の製剤は、液体軟骨エキスの高い割合
にもかかわらず、全身的な効果を示さず（その効果は治
療される領域に限定される）、そして二次的効果も示さ
なかった。 関節炎：関節炎を患う患者に、有志に基づいて、数ケ月
間、全７mlの液体エキスの１〜２単位を投与した。これ
らの患者は、関節機能の回復、痛み及び炎症の軽減によ
り次第に改善した病状を示した（約60％まで）。関節炎
は脈管形成性かつ炎症性の構成物を有するので、上述の
効果は軟骨エキスの抗脈管形成及び抗炎症活性により得
る。

【０１２０】次にリウマチ学の専門家のグループによっ
て、パイロット臨床研究を行った。年齢39〜60歳の慢性
関節リウマチを患う７人の有志の教示した患者を本研究
に登録した。 American Rheumatism Association'sの改
訂版（Arnett, F.C.ら、 1988, Arthritis & Rheumatis
m, vol.31, 315-325）における分類基準に基づいて診断
を確立した。

【０１２１】治療を30日続け、それは、21mlの液体鮫軟
骨エキス（乾燥重量12mg／ml）の毎日の投与量を摂取す
ることからなる。その治療の効能を、関節圧痛の評価の
ための関節インデックス（Ritchie, D.Mら、1968, Quat
erly J.Med, New Series XXXVII , vol.147, 393〜406)
で決定した。そのインデックスは、関節の縁にわたっ
て、又は特定の場合、関節を動かすことに基づいて加え
られる圧力を関節にかけた時の患者の痛みのいくつかの
定量的評価の合計に基づく。その結果は、液体軟骨エキ
スで治療した時に７人のうち４人が改善され（以下の
表）、このことはその製品が慢性関節リウマチ又は慢性
的炎症を併う他の病状の治療において有用であり得るこ
とを示唆する。

【０１２２】

【表１１】

【０１２３】クモ状静脈 全部で16人のパネリストを本研究のために補充した。そ
のパネリストは顔に目で見えるが過剰でない毛細血管拡
張症を有している。そのパネルを各々８人の２つのグル
ープに分けた。グループＡには５％の液体軟骨エキスを
含むコレステロールリポソームベースを供し、他方第２
のグループ（Ｂ）には、コレステロールリポソームベー
スのみを供した。その製品を３ケ月間、１日２回、顔全
体に用いた。クモ状静脈を示す顔の最少で４つの部位の
像を得るためにファイバー光学表面顕微鏡を用いた。 Z
eiss Ibas Image Analyzerによりグレー値について像を
分析した。面積光学密度(IOD) を各々のパネリストにつ
いて各々の部位について計算した。各々のパネリスト上
の４つの部位を各々の時点で平均化した。

【０１２４】結果は、４週間後に IODの35％の減少があ
り、本研究の過程においてこの効果が維持されたことを
示す（図27）。空のコレステロールリポソームベースは
８及び12週間後に、各々５％及び８％のバックグラウン
ド改善を示した。 眼窩周辺の暗色輪(dark circle) 皮膚の有色化は全てメラニンの存在又は欠如のためでな
く、血液供給及び血漿成分のためでもある。血流が鈍く
より多量の酸素が代謝から除かれる場合、皮膚は色が青
っぽくなる。これらの色の差は、皮膚の厚さのため眼の
領域において顕著である(Oresajoら (1987) Cosmetics
& Toiletries 102：29-34)。眼の下に存在する中隔にお
ける脈管の変化は、暗色輪の外観を悪化させる。眼の周
囲の暗色輪は脂肪沈着、眼瞼下の水腫及び眼の領域の周
囲の血管の漏出のため出現することもある。眼の領域周
囲の新脈管形成を制御し、それにより眼窩周囲の暗色輪
の出現を削減することへの鮫軟骨液体エキスの効果を評
価するよう臨床的研究をデザインした。

【０１２５】18〜65の年齢の合計で18人の女性の有志者
で研究を行った。パネリストは、眼の周囲に明らかな暗
色輪を示していた。全てのパネリストは皮膚科学的又は
眼科学的問題を含む急性又は慢性の病気の証拠のない通
常の健康状態であった。

【０１２６】テスト結果の評価をじゃまし得る日焼け、
発疹、かき傷、やけどのあと等を示す患者は本研究から
排除した。妊娠し又は授乳中の女性も排除した。テスト
部位は、観察に基づいて見られるいぼ、ほくろ、日焼
け、斑痕、及び活性皮膚障害を避けた。

【０１２７】パネルをグループＡに10人及びグループＢ
に８人に２つのグループに分けた。その各々は、５％液
体軟骨エキスを含むビヒクル又はビヒクル単独に相当す
る。パネリストに12週間、１日少くとも２回、眼の領域
周辺に適用するのに十分な産物を供した。ベースライン
において、並びに４，８、及び12週間後に測定結果を得
た。各々の写真を得て像分析により分析した。

【０１２８】皮膚の暗さ／明るさを示すグレー値につい
て写真を分析した。液体軟骨エキスで治療したグループ
はグレー値の優れた増加を示したことが明らかである
（それは暗色化を明るくしたことを示す）。４，８、及
び12週間後、液体軟骨エキスで治療したグループの眼の
領域下の皮膚の明るさは11％、21％及び14％であった。
ビヒクルのみで処理したグループはいずれの変化も示さ
なかった（図28）。 静脈瘤の静脈 全部で20のパネリストで研究を行った。そのパネリスト
は脚に目で見えるが過剰ではない毛細血管拡張症を有し
ている。そのパネルを２つのグループに分け、グループ
Ａ（ｎ＝９）にはクリームを含む液体軟骨エキスを供
し、グループＢ（ｎ＝11）にはビヒクルクリームのみを
供し、それらを３ケ月間、１日２回、脚全体に用いた。
ファイバー光学顕微鏡を用いて静脈瘤の静脈を示す脚の
２〜４部位の像を得た。その像をZeiss Ibasアナライザ
ーによりグレー値について分析した。面積光学密度(IO
D) を、各々のパネリストについて各々の部位について
計算した。各々のパネリスト上の全ての部位を各々の時
点で平均化した。

【０１２９】結果を図29に示す。使用の４，８及び12週
間後に各々 IODの21％、17％及び26％の減少があった。
対照ビヒクルは使用の４，８及び12週間後に各々５％、
０％及び０％のバックグラウンド改善を示した。 他の臨床的及び獣医学的適用の可能性眼科学 ：視覚の減少及び盲目は、異常な血管増殖又は新
生血管形成を特徴とするいくつかの病状によって引きお
こされ得る。これらは、（化学的又は物理的刺激によっ
て引きおこされる）角膜の新生血管形成、角膜の感染、
角膜の移植片拒絶、血管新生緑内障、斑の退化、ヘルペ
スウィルス角膜炎、及び糖尿病網膜症を含む。液体軟骨
エキスは、新しい血管の形成を阻害することにより、及
び毛細血管拡張症及び炎症を削減することによりこれら
の臨床状態に作用することができた。

【０１３０】創傷修復：創傷修復後は細胞、生化学的媒
介物、細胞外マトリックス分子、及び細胞の微小環境の
間の複合体相互作用に関連する。厚み全体の創傷形成の
後、肉芽組織（線維芽細胞、毛細管、及び炎症細胞）が
特徴的な配列で創傷の端から最初に成長する。線維芽細
胞は、24時間以内に創傷端において結合組織から創傷空
間に移動し始める。それらが動く時、線維芽細胞は、細
胞外マトリックスを形成するマトリックス分子（コラー
ゲン及びグリコサミノグリカン）を形成する。創傷形成
後18時間程度の早さでその創傷端における灌注した微小
循環において毛細管発芽が見られる。これらの発芽物は
創傷空間内に成長し、創傷結合組織のための新しい毛細
管ネットワークを供する。線維芽細胞増殖及び移動並び
に毛細管成長は、創傷空間が新しい組織で完全に満たさ
れるまで一単位として続く。肥大性斑痕形成のような肉
芽因子の過剰発現を併う特定の創傷修復条件及びひどく
火傷したヒトの治癒は、脈管形成過程を減らすことは創
傷治癒の過程を遅くするであろうので、（経口的又は局
所的）液体軟骨エキスの投与の利点であり得る。

【０１３１】丘疹鱗屑性皮膚病：乾癬障害への液体軟骨
エキスの有益な効果は、一般的特徴を有する他の病気が
液体エキスの局所的又は全身的投与を利用することもで
きることを示唆する。丘疹鱗屑性皮膚病は表皮の厚層化
及び／又は下の皮膚の炎症から生ずる赤ないし紫の丘疹
及び斑を特徴とし、乾癬、ライター症候群、バラ色ひこ
う疹、扁平苔癬、毛孔性紅色ひこう疹、二期梅毒、菌状
息肉腫、及び魚鱗癬型発疹を含む。

【０１３２】脱毛症：血流を頭皮に導く小さな外側動脈
の結紮は、アンドロゲン過剰露出により引きおこされる
髪の損失を防ぐことに成功している。液体軟骨エキスの
頭皮の特定領域への局所的適用は、脈管ネットワークを
減少させ、結果としてホルモンへの露出を減らすことに
より髪の損失を防ぐことができた。

【０１３３】獣医学的適用：ヒトについて記載されてい
るのと同じ治療的及び美容的適用のために固体及び／又
は液体軟骨エキスを動物に投与することができる。 非抗脈管形成効果 座瘡：座瘡が脈管形成構成物を有する病気又は疾患とし
て分類されるかは本発明者らの知るところでないが、本
液体エキスが抗炎症性であることに基づいて、それを患
う患者において液体軟骨エキスをテストした。座瘡を患
う患者に軟骨エキスを与えるために、次のゲル製剤： CARBOPOL 1.2％ 精製水 77.2％ NaOH 0.3％ PHENOXETOL 0.3％ TWEEN 80 0.3％ 液体軟骨エキス 20.0％ 40×アロエエキス 0.5％ を作った。

【０１３４】液体軟骨エキスは９〜12mg／mlの乾燥重量
を含んでいる。この製剤は、多少激しい形態の座瘡（炎
症性座瘡及びカイスティック（kystic）座瘡）を患う患
者の皮膚に関して著しい改善を示す。図30は、12週間、
局所用液体エキス含有ビヒクルで処理した時の、座瘡を
患う患者の病状の大きな改善を示す。

【０１３５】これらの結果は、抗脈管形成効果のためで
あり得（これにより座瘡により脈管形成構成物があるこ
とを示す）、又はそれは抗脈管形成以外の効果を有する
活性成分のためであり得る（例えば抗炎症効果）。先の
臨床試験で得られた全ての結果は、新脈管形成依存の及
び／又は炎症性の病気の治療における本軟骨液体エキス
の優れた能力を示す。軟骨エキス及びその製剤の量は特
定の必要性を満たすように随意的に種々であり得る。

【０１３６】タンパク質の(proteic) 成分に基づいて、
局所的及び全ての他の組成物は広範囲の本軟骨エキスの
投与量を含み得る。テストしたケースの３つの特定のカ
テゴリーの中で、極めて異なる投与量及び／又は製剤を
用いた。 皮膚刺激性：新脈管形成はしばしば多数の病気における
炎症に関連するので、本軟骨エキスにおいて各々の活性
を別個に割り当てることが要求されよう。この点におい
て、新脈管形成がおこると予想されない皮膚刺激モデル
を、その抗炎症及び鎮静活性についてエキスをテストす
るために選択した。本研究のためにペルーバルサムに対
する感性の経歴を有する９人の有志者を選択した。テス
ト化合物は次の通り： １． D-MEM媒体中１×鮫軟骨50％ ２． D-MEM媒体中１×鮫軟骨20％ ３． D-MEM媒体中１×鮫軟骨10％ ４．コラ・ニチダ(Cola nitida)(Indena) 10％ヒドロア
ルコールに１ である。

【０１３７】この４つのテスト化合物をパネリストの前
腕腹側部に適用した。その材料を20分、吸収させ、次に
ペルーバルサムの刺激をテスト部位に適用した。皮膚刺
激を皮膚の赤みの増加に関して測定した。赤みの程度は
Minolta Chromometerで測定し、それを陽性及び陰性対
照と比較した。陽性対照はペルーバルサムで処理しただ
けの皮膚の色であり、陰性対照はコラ溶液で処理してテ
スト産物のように攻撃した皮膚部位であった。統計的な
有意差を両側プロバビリティーテストで計算した。図31
は、10％のコラが70％活性であったことを示す。鮫軟骨
は20％及び10％濃度で抗刺激剤として各々58％及び60％
であった。投与量に応じた効果はなかった。これらの効
果は、本軟骨エキスが抗脈管形成効果とは別の抗炎症及
び鎮静活性を含むことを示唆する。 癌：53歳の女性患者を、Ｂ型の巨細胞非ホジキンリンパ
腫と診断した。 CATスキャン分析は、頸動脈及び頸静脈
周囲のアデノパシー（直径 2.5cm）並びに右の腎臓の門
上の大きなアデノパシーを示した。患者は化学療法を拒
み、その食事に本液体軟膏エキスを加えた（1993年10
月)(１日当り体重１kg当り約１〜1.5mg に等しい７mlの
エキス当り約75mgの乾燥重量の毎日の経口投与）。３ケ
月後（1994年１月）、 CATスキャン分析は、完全に再吸
収された頸部におけるアデノパシーを示した。1994年11
月までに、腹のアデノパシーは75％だけその体積が減少
した。以来その病気は安定し、患者は良好な健康状態で
ある。

【０１３８】この結果は、特定の固体でない癌も本液体
軟膏エキスの抗腫瘍活性に応じ得ることを示唆する。 皮膚のバリアー保護 ６人の健康な有志者パネルを本研究に参加させた。その
パネリストに、４週間、１日２回、本液体軟膏エキスを
含むクリームを右上腕に適用し、ビヒクルのみを左上腕
に適用した。

【０１３９】パネリストは、皮膚科学的又は眼科学的問
題を含む急性又は慢性の病気の証拠がない年齢21〜45歳
の女性であった。テスト結果の評価をじゃまし得る日焼
け、発疹、やけどのあと等を示す患者を本研究から排除
した。テスト部位はいぼ、母斑、日焼け、斑痕及び実験
で観察される活性な皮膚障害の部位を避けた。テストの
日に、パネリストに、いずれのローション、クリーム又
は他の製品も顔に用いることをやめるように伝えた。測
定の間、パネリストは、20〜22℃の温度及び40％の相対
湿度の制御環境でテストする前少くとも30分間、安静に
した。

【０１４０】テスト部位は右及び左手掌上腕部であっ
た。各々の腕上に小さな領域(3.5cm×７cm）をマーク
し、基底経皮水損失（TEWL）測定値をこの領域内の３つ
の部位から得た(Pinnagodaら. (1990) Contact Dermati
tis 22：164-178 ；Grove (1994)in The effects of ag
ing in oral mucosa and skin, Ed. Squier & Hill, CR
CPress, pp124-125)。

【０１４１】粘着（Tuck）テープを用いてそのテスト領
域を覆い、両方向にフィルムをなでた後、そのテープを
はがした（Elias (1993) J.Invest.Dermatol. 80：O44s
-O49s)。全部で５つのストリッピングを得た。TEWLを再
び記録した。５のグループにおいてストリッピングの後
のTEWL測定を続けた。TEWLが18Ｇ／Ｍ² ／Hrに達した時
にストリッピングをやめた。最後のストリッピングの終
りに再びTEWLを測定した。皮膚バリアーを傷つけるのに
必要とされるストリッピングの数を、18Ｇ／Ｍ ² ／Hr又
はそれ超のTEWLを示す各々の時点について最大のストリ
ッピングの数を記録することによって計算した。片側ラ
ンク係数Ｚテストを用いて、種々の時点での処置対ベー
スラインの間の統計的有意性について結果を分析した。

【０１４２】ビヒクル処理した腕は、２週間及び４週間
の処置の後各々26％及び21％だけ多くのストリッピング
が皮膚を傷つけるために要求されたので、大きな改善を
示さないようであった。２週間及び４週間の液体軟骨エ
キス産物での処置後のパネリストの各々のバリアー状態
において、皮膚バリアーを破壊するのに各々60％及び55
％多くのストリッピングが要求され、有意改善（ｐ＜0.
05）があった（図32）。

【０１４３】それゆえ、液体軟骨エキスは物理的損傷に
対する皮膚バリアーを強化するのに役立つことが判明し
た。 湿 疹：本液体軟骨エキスを、湿疹によって引きおこさ
れる炎症疾患を減少させる能力に基づいて、ビューティ
ーサロンにおいてテストした。本液体エキス含有クリー
ムを適用する美容師は長年にわたり手に慢性の湿疹を患
っている。興味あることに、本軟骨含有クリームは手の
湿疹の発現をかなり減少させた。彼女は現在、湿疹の発
現を防ぐために上手く軟骨含有クリームを用いている。 い ぼ：足底いぼの経歴を有する36歳の女性に、いぼの
進行及び関連する痛みを抑制するためにほぼ３年間、皮
膚科学者により治療した。その治療は、液体窒素、サリ
チル酸（40％）、嫌気性菌、硝酸、及び硫酸であった。
これらの治療は３ケ月間、ほぼ毎週であり、その結果は
ほとんどゼロであった。1996年３月に、彼女にそのいぼ
上に直接、毎日（５分）鮮軟骨液体エキスを適用した；
２週間後にいぼの周囲に新しい表皮のピンクのゾーンが
形成され；次の週にいぼはとれた。それゆえ、この結果
は本液体軟骨エキスがいぼの治療に役立ち得ることを示
唆する。 他の臨床的及び獣医学的適用の可能性：移植片拒絶 ：炎症は移植した細胞の死亡に関連する主な
要因の１つである。それゆえ、移植片は我々の鮫軟骨液
体エキス中に存在する抗炎症構成物から利益を得る。

【０１４４】多発性硬化症：多発性硬化症の原因は知ら
れていない。その組織応答は、静脈周囲単核細胞浸潤を
併い、感染のいずれの明白な組織病理学的証拠もない免
疫病理学的過程の特徴を有する。マトリックスメタロプ
ロティナーゼは炎症応答に関連する重要な因子である。
液体軟骨エキスはマトリックスプロティナーゼの強力な
インヒビターであるので、それは多発性硬化症の治療に
役立ち得る。

【０１４５】線維症：現在の考えは、線維症は通常の創
傷治癒に似るが、それを終了せず、通常組織の斑痕での
置換を導く。ほとんどの線維症の反応は外傷、感染、炎
症に２次的に現れるか、又は理由は知らないが遺伝構成
物を有し得る。典型的にはTGF-βが過剰産生されて線維
芽細胞の増殖及びコラーゲンの過剰生産を導く。コラー
ゲンの過剰な析出は線維症の証明であるので、我々は、
肉芽組織の形成を遅らせることができる液体軟骨エキス
が線維症反応において長期間、利益を有し得ることを示
唆する。

【０１４６】炎症性腸疾患：炎症性腸疾患の原因は未知
であるが、胃腸免疫性がクローン病及び潰瘍性大腸炎の
病因に関連する。粘膜単核細胞は、抗体生産、増殖、細
胞毒性及びサイトカイン合成(FGF, PDGF, EGF, TNF) の
変化を示す。液体軟骨エキスは抗炎症活性を示すので、
その経口投与は、炎症性腸疾患の治療に役立つことが判
明し得る。

【０１４７】心臓病：冠状脈耐性脈管の内皮細胞機能不
全は、冠状脈微小脈管構造並びにおそらく心筋虚血及び
胸の痛みの異常を説明することができる。細胞レベルに
おいて、内皮細胞機能不全は内皮細胞由来弛緩因子であ
る酸化窒素の発現の減少に関連する。NO合成は、脈管シ
ステムが血管拡張の状態を維持し、それにより動脈圧を
制御するのを許容する。NOの内在的合成の欠損は、動脈
の高血圧、肺の高血圧及び心臓病のような病状を引きお
こす。我々は、培養した内皮細胞から、本液体軟骨エキ
スがNO生産量を増加させるという予備的結果を有する。
それゆえ本液体エキスは、NOにより、特定の心臓病にお
いて、及び肺動脈高血圧を併う先天的心臓病を有する小
児において役立つことが判明し得よう。

【０１４８】更に、液体軟骨エキスはアテローム性動脈
硬化症における炎症関連の合併症を減らすことに役立ち
得る。

【０１４９】強皮症：強皮症（硬い皮膚）は皮膚及び内
臓の器官の線維状結合組織の増加を特徴とする。それは
しばしば局所的な皮膚のパッチ過角化症として現れる。
過角化症は皮膚のケラチノサイトが完全に分化して剛性
のケラチン線維を蓄積する細胞の過程である。この皮膚
の状態は、関節周囲の領域の皮膚が感染したなら関節の
動きを限定し得るであろう。ケラチノサイト分化が促進
されている実験システムに加えた場合、本液体軟骨エキ
スは分化又は角化過程を部分的に防止する。それゆえ、
本液体エキスは完全に分化したケラチノサイトの過剰蓄
積を防止することによってこのような皮膚の状態のため
に有益であり得よう。

【０１５０】獣医学的適用：固体及び／又は液体軟骨エ
キスはヒトについて記載されるのと同じ治療及び美容的
適用のために動物に投与することができる。 美容的適用及び組成物：上述のテスト及び試験は、本発
明の軟骨エキスが多数の医療的適用を見い出し得ること
を示した。このエキスで回収された別個の活性の中で、
抗脈管形成、抗コラーゲン溶解、抗炎症及び PKC誘導性
分化への阻害効果が美容的適用に特に要求される。本発
明の軟骨エキスは PKCが媒介する現象のアンタゴニスト
効果を示したので、及びこのようなアンタゴニスト効果
は皮膚バリアー機能を改善するものとして当該技術で示
唆されているので、本軟骨エキス及び医薬として許容さ
れる担体を含む組成物を皮膚に適用するステップを含む
哺乳動物のバリアー機能を改善するための方法を供す
る。他の又は同様の組成物も皮膚を静めるため又は哺乳
動物の炎症を削減するための方法に用いられると予想す
ることができる。炎症は、種々の因子、例えば化学的刺
激剤、物理的な擦過症及び紫外線への露出によって引き
おこされ得る。皮膚においてコラゲナーゼを阻害するた
めの組成物及び方法も考慮される。コラゲナーゼ及び炎
症は早発の老化（コラーゲンのデグラテンション）に関
連し、それゆえ本軟骨エキスで回収されたアンタゴニス
ト活性は、早発性の老化を遅らせるため、及び哺乳動物
におけるしわ又は萎縮を抑制するための組成物及び方法
にも寄与し得よう。しわ又は萎縮の原因を列記すれば、
例えば年をとること、紫外線又は環境汚染物への露出で
ある。局所用組成物は、各々の特定の適用について決定
される有効量の鮫軟骨を含み得る。一般に、これらの組
成物は、約 0.1〜約75重量％の液体鮫軟骨エキスと、約
25〜99.9重量％の医薬として許容されるビヒクルと、を
含み得る。これらの組成物は酸化防止剤、例えば皮膚中
の脂肪ペルオキシドの形成を防ぐ剤を含み得る。このよ
うな酸化防止剤の例は、トコフェロール、トコフェロー
ル誘導体、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体及び
BHTである。本組成物には、ホスホリパーゼＡ２インヒ
ビター又は植物由来の抗刺激剤コラ及び緑茶エキスのよ
うな抗炎症剤を補足することができる。局所用組成物
は、溶液、懸濁液、ローション、チンキ、ゲル、クリー
ム、スプレー、エマルション、スティック、軟膏又はリ
ポソーム（本液体軟骨エキスの少くとも一部がリポソー
ム内に存在するもの）のような別個の形態をとることが
できる。他の美容的な適用は、眼のまわりの暗色輪及び
皮膚バリアー機能を含む。 結 論 本発明の方法は、優れた臨床的評価を有する軟骨エキス
の生産のための方法を提供するものとして証明された。
この新規方法によって製造された鮫軟骨エキスは、優れ
た収率で回収される多重の活性を含む。本軟骨エキス、
特に液体エキス及びその画分は、多くの種類の病気又は
病状に有効でありながら、通常の細胞に非毒性であるの
で、優れた能力を有する。

【０１５１】全ての予想される適用（眼薬から皮膚及び
癌製剤まで）のために、全液体エキスの最少の最終的タ
ンパク質濃度は極めて低く（約0.01mg／mlから）であり
得た。この低範囲の投与量はアクセシビリティー及び活
性成分の作用の部位への浸透に、並びにこれらの成分の
有効な捕獲及び脈管形成インヒビターに対する組織のセ
ンシティビティー又は応答に依存する。

【０１５２】特定の適用についての製剤中の最終タンパ
ク質濃度の上限はまだわかっていない。試みた最も高い
最終濃度は乾癬の場合の製剤中約９mg／mlのタンパク質
の局所的投与、並びに癌の場合７ml及び関節炎の場合21
mlの毎日の投与の投与単位中約12mg／mlの経口投与であ
った。

【０１５３】本鮫軟骨液体エキスは凍結乾燥した場合、
その活性のいくつかを失い得る。しかしながら、凍結乾
燥前に当該技術で周知であるような安定剤又は保護剤の
添加がセンシティブな活性を保護し、乾燥状態での軟骨
エキスのより高い投与量での投与を可能にし得る。 必要な材料： −クーラー −手術道具 −ミートチョッパー −プラスチックバッグ −工業用ブレンダー(Fisher Scientificから購入したWa
ring 3-speed blender) −水の精製のシステム（逆浸透及び 0.1Emろ過；Fische
r Scientific, Montreal, Quebecから購入したContinen
tal Water System,model PRE 2202, Serial number 910
89, Modulab Bioscience RQ／Polishing System) 。こ
のシステムは高品質の非発熱性水を供する。

【０１５４】− Fisher Scientificから購入したprecis
ion balance Mettler − DuPont Canadaから購入したCentrifuge Sorval, RC-
285 −Centrifuge CEPA −１μＭの多孔度の Nylonポケット −オートクレーブ（自動蒸発滅菌器Sanyo, model MAC 3
50P) −10分間 132℃で滅菌し、35分、乾燥した Nalgene 500
ml容器 −24μｍ多孔度のコンカルフィルター（Whatman Reeve
Angel) −超遠心カラム（分子量カットオフ：500kDa及び１kDa
適用可；面積：25平方フィート；流速： 130ｌ／分；入
力圧：30psi ；出力圧：５psi ；Koch Membrane System
Inc., Wilmington, MA, USAから購入） − 130ｌ／分流量を供するためのサニタリー遠心ポンプ
（Monarch Industries, model ACE-S100, Type A) −滅菌室(Ingram & Bellから購入した層状流ハットNuAi
re） −Millipack-60 0.22μｍ滅菌フィルター −滅菌透明又はアンバーガラスボトル −Concentrator DC-10 Amicon −Rotofor Biorad 170-2950 −各々10, 30及び100kDaのカットオフ値のAmiconフィル
ターSIOY10, SIOY30及びSIOY100 −FPLC Pharmacia 216007(コンピューターPharmacia 21
6014) −Hilstand S-300 26mm／60cm (Pharmacia) −Superose S-12 10mm／30cm (Pharmacia) −Lyophilizer Labconco 10273 A 本発明は本明細書に先に記載されており、本開示の教授
から離れることなく、当業者の能力及び知識内で、同じ
目的を達成するであろう等価物で行われるように本発明
の特定の要素を置換することにより改良することができ
ることが十分に認められるはずである。これらの明らか
なバリエーションは本願に含まれると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】液体エキスの特定のアミノ酸組成を示す。

【図２】ZR75-1及び MCF-7細胞系に対する鮫軟骨（固体
エキス）の用量−応答性阻害活性を示す。

【図３】２通りの濃度の固体軟骨エキスを有して又は有
さないでの上昇していく濃度のエストラジオールの存在
下での MCF-7細胞の量の用量−応答性曲線を示す。

【図４】ａ）及びｂ）はギャベージ水（Ａ）又は固体と
液体軟骨エキスの組合せ（Ｂ）の投与されたラットの乳
腺腫瘍切片の比較を示す。

【図５】腫瘍において脈管形成面積が50％縮小した軟骨
処理ラットを示すヒストグラムである。

【図６】液体軟骨エキスが線維芽細胞増殖に対して何ら
効果をもたないことを示す。

【図７】HUVEC増殖に対する液体軟骨エキスの用量−応
答性曲線阻害を示す。

【図８】液体軟骨エキスが TPA−誘導化ケラチノサイト
分化を阻害することを示す。

【図９】コラゲナーゼ活性に対する液体軟骨エキスの用
量−応答性曲線阻害を示す。

【図１０】胎芽脈管形成試験(ex vivo) に対する液体軟
骨エキスの用量−応答性曲線阻害を示す。

【図１１】マウスにおける腫瘍増殖阻害に対する液体軟
骨エキスの様々な用量での効果を示す。

【図１２】液体軟骨エキスの腹腔内投与が当該製品の腫
瘍増殖を阻害する効能を有意に高めることができること
を示す。

【図１３】Rotoforで分離した液体画分の非変性条件下
での電気泳動プロフィールを示す；分子量マーカーは左
にあり、それに単離画分の比較のための分画前の液体エ
キスサンプルが続く。

【図１４】10,000Da未満の分子量を有する本発明の全液
体エキスの画分のHPLC移動パターンを示し、その画分は
濃縮され、そして５つのサブ画分に分けられている。

【図１５】我々の発明の鮫軟骨の液体エキスの２つの画
分で得られた EVT結果を示し(DUP) 、一方は10,000Da未
満の分子量を有するものであり、他方は10,000Daより大
きい分子量を有するものである。

【図１６】３種類の鮫軟骨のエキスのFPLC移動パターン
を示す。パネルＡにおいて、 DUPは本発明に係る鮫液体
エキスである。パネルＢ及びＣにおいて、 BAL及びOIK
はそれぞれ Balassaら及びOikawaら従来技術のエキスで
ある。

【図１７】図17の中に定義と同一のエキスのHPLC移動パ
ターンを示す。

【図１８】本発明の液体エキス(DUP) の CZEを示す。

【図１９】従来技術の液体エキス(BAL) の CZEを示す。

【図２０】従来技術の液体エキス(OIK) の CZEを示す。

【図２１】本発明と従来技術の液体エキスの EVT比較を
示す。

【図２２】従来技術(BAL）のアミノ酸含量を示す。

【図２３】本発明(DUP）のアミノ酸含量を示す。

【図２４】従来技術(OIK）のアミノ酸含量を示す。

【図２５】図25及び26は有効量の濃縮液体軟骨エキスを
含む局所組成物で処置したときの（下部写真）、初期症
状（上部写真）と対比しての、一方は角質増殖症を伴う
（25ａ）及びｂ))、そして他方は角質増殖症を伴わない
（26ｃ）及びｄ))乾癬に苦しむ２人の患者の症状の有意
な改善を示す。

【図２６】図25及び26は有効量の濃縮液体軟骨エキスを
含む局所組成物で処置したときの（下部写真）、初期症
状（上部写真）と対比しての、一方は角質増殖症を伴う
（25ａ）及びｂ))、そして他方は角質増殖症を伴わない
（26ｃ）及びｄ))乾癬に苦しむ２人の患者の症状の有意
な改善を示す。

【図２７】液体軟骨エキスで処置したヒトの顔における
くも状静脈の外観の改善を示す。

【図２８】液体軟骨エキスで処置したヒトの目のまわり
の暗色輪の外観の改善を示す。

【図２９】液体軟骨エキスで処置したヒトの足の静脈瘤
の外観の改善を示す。

【図３０】有効量の液体軟骨エキスを含む局所組成物で
処置したときの（下部写真）、患者の初期症状（上部写
真）と対比しての、座瘡に苦しむ彼女の症状の有意な改
善を示す。

【図３１】ヒト皮膚に対する液体軟骨エキスの抗炎症性
効能を示す。

【図３２】液体軟骨エキスで処置したヒトの皮膚のバリ
ヤー機能の改善を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 17/00 17/00 17/14 17/14 19/02 19/02 27/02 27/02 29/00 29/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｄ 15/08 61/14 ５００ 61/14 ５００ (72)発明者 ブラゾ，ポール カナダ国，ケベック アシュ２エル ３エ ム８，モントリオール，パルク ラフォン テンヌ アブニュ 4054 (72)発明者 ジュノー，クリスティーナ カナダ国，ケベック ジェ１イクス ３テ ５，サント−フォワ，ジングラ ストリー ト 787，アパルトマン 203 (72)発明者 マエス，ダニエル アシュ. アメリカ合衆国，ニューヨーク 11743, ハンティントン，ナサ ロード 273エー (72)発明者 メアナス，ケネス アメリカ合衆国，ニューヨーク 11746, ディクスヒルズ，マククローチ ドライブ 62 Ｆターム(参考） 4C076 AA31 BB01 BB02 BB15 BB16 BB21 BB24 BB29 BB31 CC04 CC11 CC27 GG06 4C083 AA071 EE12 FF01 4C087 BB29 BB46 CA23 DA04 MA44 MA52 MA56 MA58 MA60 MA63 MA66 NA20 ZA33 ZA36 ZA96 ZB11 ZB26 4D006 GA06 KA01 KA71 KB20 KB30 MB05 PA01 PB70 PC41 4D017 AA20 BA03 CA17 DA03 DB10

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 完全軟骨中に存在する実質的な割合の生
   物活性水溶性成分を有する液体鮫エキスの獲得方法であ
   って、下記の段階： ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性
   の保持に適する条件下で、前記軟骨が約 500μｍ以下の
   サイズの粒子へと縮小されるまでホモジナイズし、粒子
   と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物を
   得； ｂ）前記ホモジネート品を遠心分離して粒子を前記粗液
   体エキスから分離し； ｃ）前記粗液体エキスを更に分離して、約 500キロダル
   トン(kDa)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液
   体エキスを得；そして ｄ）前記最終液体エキスを濃縮して、少なくとも100ダ
   ルトン未満の分子量を有する分子部分を除去する； を含んで成る方法。
2. 【請求項２】 前記条件が約０〜20℃の作業温度を含ん
   で成る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記条件が前記水性溶液に関して約６〜
   約８に範囲する作業pHを含んで成る、請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】 段階ａ）を15分〜24時間で行う、請求項
   １記載の方法。
5. 【請求項５】 段階ａ）を15分〜１時間で行う、請求項
   ４記載の方法。
6. 【請求項６】 前記軟骨及び水性溶液が少なくとも約１
   リットルにつき１キログラムの割合である、請求項１記
   載の方法。
7. 【請求項７】 前記濃縮段階ｄ）が約0.1kDaの分子量カ
   ットオフ値を有する膜上で前記最終液体エキスを濾過す
   ることにより行い、これによりこのカットオフ値より小
   さい分子量を有する分子を除去する、請求項１記載の方
   法。
8. 【請求項８】 前記濃縮段階ｄ）が前記最終液体エキス
   の凍結乾燥を含んで成る、請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 前記凍結乾燥が、前記生物活性成分の保
   全性の保持を高めるのに十分な量で前記液体エキスに添
   加された安定化剤又は保護剤の存在下で行う、請求項８
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記軟骨が鮫から回収されたものであ
    る、請求項８又は９記載の方法。
11. 【請求項１１】 完全軟骨中に存在する抗コラーゲン溶
    解性及び抗脈管形成性水溶性成分を有する液体鮫エキス
    の獲得方法であって、下記の段階： ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性
    の保持に適する条件下で、前記軟骨が約 500μｍ以下の
    サイズの粒子へと縮小されるまでホモジナイズし、粒子
    と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物を
    得； ｂ）前記ホモジネート品を遠心分離して粒子を前記粗液
    体エキスから分離し； ｃ）前記粗液体エキスを更に分離して、約 500キロダル
    トン(kDa)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液
    体エキスを得； ｄ）前記最終液体エキスを約 100ダルトンの分子量カッ
    トオフ値を有する膜上で濾過し；そして ｅ）0.1kDa未満の分子量を有する分子を含んで成る画分
    を回収する； を含んで成る方法。
12. 【請求項１２】 完全軟骨中に存在する抗脈管形成水溶
    性成分を有する液体鮫エキスの獲得方法であって、下記
    の段階： ａ）軟骨を水性溶液の中で、前記生物活性成分の保全性
    の保持に適する条件下で、前記軟骨が約 500μｍ以下の
    サイズの粒子へと縮小されるまでホモジナイズし、粒子
    と前記生物活性成分を有する粗液体エキスとの混合物を
    得； ｂ）前記ホモジネート品を遠心分離して粒子を前記粗液
    体エキスから分離し； ｃ）前記粗液体エキスを更に分離して、約 500キロダル
    トン(kDa)以下の分子量を有する軟骨分子を含む最終液
    体エキスを得； ｄ）前記最終液体エキスを約 10kDaの分子量カットオフ
    値を有する膜上で濾過し； ｅ）約 10kDaより大きい分子量を有する分子を含んで成
    る画分を回収し； ｆ）この画分をアニオン交換クロマトグラフィーで分画
    し；そして ｇ）約 0.8〜1.0 ＭのNaClで溶出する画分を回収する； を含んで成る方法。
13. 【請求項１３】 鮫より得られ、且つ請求項１〜６のい
    ずれか１項記載の方法により製造した軟骨エキス。
14. 【請求項１４】 鮫より得られ、且つ請求項７記載の方
    法により製造した軟骨エキス。
15. 【請求項１５】 請求項10記載の方法により製造した軟
    骨エキス。
16. 【請求項１６】 請求項11記載の方法により製造した抗
    コラーゲン溶解及び抗脈管形成軟骨エキス。
17. 【請求項１７】 請求項12の方法により製造した抗脈管
    形成軟骨エキス。
18. 【請求項１８】 腫瘍増殖、脈管形成、炎症及びコラー
    ゲン溶解から成る群から選ばれる１又は複数種の病因学
    的成分を有する病気又は症状を処置するための組成物で
    あって、請求項13、14及び15のいずれか１項記載の有効
    量の軟骨エキス並びに薬理学的に許容されるビヒクルを
    含んで成る組成物。
19. 【請求項１９】 コラーゲン溶解成分を有する病気又は
    症状を処置するための組成物であって、有効量の請求項
    16記載の軟骨エキスを含んで成る組成物。
20. 【請求項２０】 脈管形成成分を有する病気又は症状を
    処置するための組成物であって、有効量の請求項16又は
    17記載の軟骨エキス、又は請求項16及び17記載の軟骨エ
    キスの組合せを含んで成る組成物。
21. 【請求項２１】 腹腔内、皮下、経眼、経鼻、経口、経
    直腸、舌下、筋肉内、皮内又は経皮用途のための請求項
    18記載の組成物。
22. 【請求項２２】 局所組成物である請求項18記載の組成
    物。
23. 【請求項２３】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚バリアーを改善し、その結果表皮透過性水損失に対
    して一層耐性にする、請求項22記載の組成物。
24. 【請求項２４】 前記病気又は症状の処置が刺激された
    哺乳動物の皮膚を滑らかにする、請求項22記載の組成
    物。
25. 【請求項２５】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚の炎症を抑制する、請求項22記載の組成物。
26. 【請求項２６】 前記炎症が物理的摩滅によるものであ
    る、請求項25記載の組成物。
27. 【請求項２７】 前記炎症が化学的刺激によるものであ
    る、請求項25記載の組成物。
28. 【請求項２８】 前記炎症が紫外線によるものである、
    請求項25記載の組成物。
29. 【請求項２９】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚のしわ又は萎縮を抑制する、請求項22記載の組成
    物。
30. 【請求項３０】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚の挫創を抑制する、請求項22記載の組成物。
31. 【請求項３１】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚の乾癬を抑制する、請求項22記載の組成物。
32. 【請求項３２】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚の早発性老化を遅らせる、請求項22記載の組成物。
33. 【請求項３３】 前記病気又は症状の処置が哺乳動物の
    皮膚の湿疹を軽減する、請求項22記載の組成物。
34. 【請求項３４】 哺乳動物の皮膚におけるコラゲナーゼ
    活性を阻害するための組成物であって、請求項13〜16の
    いずれか1項記載の治療的に有効な量の鮫軟骨エキス及
    び薬理学的に許容されるビヒクルを含んで成る組成物。
35. 【請求項３５】 哺乳動物の皮膚における内皮細胞増殖
    を阻害するための組成物であって、請求項13〜17のいず
    れか1項記載の治療的に有効な量の鮫軟骨エキス及び薬
    理学的に許容されるビヒクルを含んで成る組成物。
36. 【請求項３６】 哺乳動物の皮膚における活性化ケラチ
    ノサイト分化を阻害するための組成物であって、請求項
    13〜15のいずれか1項記載の治療的に有効な量の鮫軟骨
    エキス及び薬理学的に許容されるビヒクルを含んで成る
    組成物。
37. 【請求項３７】 前記病気又は症状が、癌、丘疹鱗屑性
    皮膚病、関節炎、座瘡、くも状静脈、静脈瘤性静脈、眼
    窩周囲暗色輪、肥大性瘢痕、脱毛症、湿疹、いぼ、多発
    性硬化症、線維症、炎症性腸疾患、強皮症、血管収縮性
    病、角膜新生脈管形成症、角膜感染症、脈管新生緑内
    障、ヘルペスウィルス角膜炎、糖尿病網膜症及び移植片
    拒絶から成る群から選ばれる、請求項18記載の組成物。