ES2604559T3 - Producto de cartílago - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende las siguientes etapas: a) picar el cartílago; b) mezclar el cartílago picado y agua; c) calentar la mezcla de la etapa b) a una temperatura entre 45 ºC y 55 ºC; d) añadir una solución acuosa de H3PO4 para ajustar el pH de la mezcla de la etapa c) a un valor comprendido entre 3,0 y 3,5; e) tratar la mezcla ácida de la etapa d) con una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) comprendida entre 0,6% y 1,0%, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, de modo que se obtiene una solución; f) neutralizar la solución de la etapa e) con Ca(OH)2, y g) filtrar la solución de la etapa f) que contiene sales insolubles, de modo que se obtiene una solución acuosa del producto de cartílago, en el que el producto de cartílago comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento.
Description
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Control Positivo (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en medio 10% FCS, en ausencia del producto de cartílago y en presencia de bromodeoxiuridina) y el Control Basal (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago).
En la Figura 2 se representa a tres concentraciones (250 µg/ml, 500 µg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de migración de fibroblastos dérmicos humanos a las 48 horas. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago) y dos Controles Positivos (un cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en medio de cultivo al 10% FCS y en ausencia del producto de cartílago y un cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de EGF).
En la Figura 3 se representa a tres concentraciones (250 µg/ml, 500 µg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de síntesis de elastina en un cultivo de fibroblastos dérmicos humanos a las 72 horas de exposición. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago) y el Control Positivo (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de TGF-β).
En la Figura 4 se representa a tres concentraciones (250 µg/ml, 500 µg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre la actividad de la metaloproteasa 1 (MMP-1) en un cultivo de fibroblastos dérmicos humanos estimulados con IL-1β. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago y de IL-1β), el Control estimulado con IL-1β y el Control Positivo de inhibición (cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de IL-1β y de dexametasona).
En la Figura 5 se representa el efecto de dos composiciones a base de producto de cartílago, hidroxiapatita y vitamina D3, a dosis baja (Composición 1 D.B.) y a dosis alta (Composición 2 D.A.) sobre la degradación del cartílago, utilizando la escala de puntuación OARSI. También se incluyen el Blanco (grupo de ratas sin inducción de osteoporosis ni de artrosis), Control 1 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento del compuesto de Referencia), Control 2 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento con las composiciones a base del producto de cartílago) y el Compuesto OHC (producto de Referencia).
En la Figura 6 se representa el efecto de dos composiciones a base de producto de cartílago, hidroxiapatita y vitamina D3, a dosis baja (Composición 1 D.B.) y a dosis alta (Composición 2 D.A.) sobre el volumen de hueso (BV/TV %). También se incluyen el Blanco (grupo de ratas sin inducción de osteoporosis ni de artrosis), Control 1 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento del compuesto de Referencia), Control 2 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento con las composiciones a base del producto de cartílago) y el Compuesto OHC (producto de Referencia).
En la Figura 7 se representa el efecto de dos composiciones a base de producto de cartílago, hidroxiapatita y vitamina D3, a dosis baja (Composición 1 D.B.) y a dosis alta (Composición 2 D.A.) sobre la densidad de la superficie del hueso (BS/TV (mm-1)). También se incluyen el Blanco (grupo de ratas sin inducción de osteoporosis ni de artrosis), Control 1 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento del compuesto de Referencia), Control 2 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento con las composiciones a base del producto de cartílago) y el Compuesto OHC (producto de Referencia).
En la Figura 8 se representa el efecto de dos composiciones a base de producto de cartílago, hidroxiapatita y vitamina D3, a dosis baja (Composición 1 D.B.) y a dosis alta (Composición 2 D.A.) sobre el número trabecular (TbxN (mm-1)). También se incluyen el Blanco (grupo de ratas sin inducción de osteoporosis ni de artrosis), Control 1 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento del compuesto de Referencia), Control 2 (Grupo de ratas con inducción de osteoporosis y artrosis. Este fue el grupo Control para el tratamiento con las composiciones a base del producto de cartílago) y el Compuesto OHC (producto de Referencia).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no representan una limitación del alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Preparación de un producto de cartílago de tráquea porcina de la invención
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Piezas de tráquea porcina se sometieron a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos y a continuación se picaron. En un reactor se introdujeron 3.100 ml de agua desionizada. Se añadieron 1.575 g de cartílago de tráquea porcina picado. La mezcla se calentó a 50 ºC y se ajustó el pH entre 3,0 y 3,5 con H3PO4. Una vez ajustado el pH, se añadieron 5,9 g de pepsina (Biocatalysts, 1:3000 MDP) y se mantuvo la temperatura a 50 ºC. Se comprobó el pH cada 30 minutos, las tres horas siguientes, y se ajustó en caso que fuese necesario. A las diez horas del inicio de la digestión se volvieron a añadir 5,9 g de pepsina (Biocatalysts, 1:3000 MDP) y se comprobó el pH cada 30 minutos, durante las tres horas siguientes. En total, la digestión se llevó a cabo durante 24 horas, empleándose en total una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de tráquea porcina del 0,75%. Transcurridas las 24 horas, se calentó a 80 ºC durante una hora. A continuación, se filtró para clarificar el producto. Una vez filtrado, se añadieron 7,9 g de carbón activo y se calentó a 50 ºC durante 30 minutos. Se neutralizó con hidróxido de calcio. A continuación, se filtró, obteniéndose una solución acuosa de producto de cartílago. El producto final en forma sólida (polvo color crema) se obtuvo atomizando la solución acuosa de producto de cartílago.
Características analíticas del producto de cartílago sólido obtenido:
Hidrolizado de proteína: 77% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Hidrolizado de colágeno: 54,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Aminoácidos totales: 70,7% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Aminoácidos libres: 1,2% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Hidroxiprolina total: 6,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Grado de hidrólisis de la proteína: 1,7%; Grado de hidrólisis del hidrolizado de colágeno: 0,1%; Sulfato de condroitina: 19,7% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Acido hialurónico: 0,3% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento TGF-β1: 53,0 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento TGF-β3: 31,3 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Cenizas: 8,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Calcio: 0,4% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro, Fosfatos: 0,3% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro.
En el 77% del hidrolizado de proteína se incluye el hidrolizado de colágeno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%.
Las características analíticas del producto de cartílago pueden variar ligeramente dependiendo del lote del producto de cartílago obtenido.
Determinación de los grados de hidrólisis:
El grado de hidrólisis de la proteína se determinó mediante un método estándar. Se expresó como el porcentaje de aminoácidos libres con relación a los aminoácidos totales.
El grado de hidrólisis del hidrolizado de colágeno se determinó mediante un método estándar. Se expresó como el porcentaje de hidroxiprolina libre con relación con la hidroxiprolina total.
Determinación de los factores de crecimiento:
Para la determinación de los factores de crecimiento se utilizaron los siguientes kits de ELISA (R&D Systems), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante:
Quantikine porcine TGF-β1 (catálogo: MB100B); DuoSet Human TGF-β3 (catálogo: DY243).
Ejemplo 2: Comprimidos de producto de cartílago de tráquea porcina, sal de calcio y vitamina D3
Los comprimidos se prepararon siguiendo procedimientos convencionales. Por comprimido:
Producto de cartílago de tráquea porcina………………………………300 mg Hidroxiapatita………………………………………………………………400 mg Vitamina D3…………………………………………………………………100 UI
Ejemplo 3: Comprimidos de producto de cartílago de tráquea porcina, sal de calcio, vitamina D3 y vitamina K2
Por comprimido:
Producto de cartílago de tráquea porcina…………………………….300 mg 12
Como Control Basal se utilizó medio de cultivo y como Controles Positivos se incluyeron medio de cultivo al 10% en FCS (Fetal Calf Serum) y también medio de cultivo con EGF 5 ng (Epidermal Growth Factor).
5 Resultados
Como se puede observar en la Figura 2, el producto de cartílago produjo un importante efecto inductor de la migración celular a las 48 h de exposición para las concentraciones de 500 µg/ml y 2 mg/ml (42% y 75% de inducción, respectivamente). Además debe destacarse que el efecto de dicho producto superó al mostrado por los
10 controles positivos (medio al 10% FCS y EGF a 5 ng/ml).
Ejemplo 6: Valoración de la acción hidratante
El ácido hialurónico es un componente esencial de las pieles sanas y está involucrado en la hemostasis, la
15 hidratación y los procesos de reparación. Gracias a su capacidad de retener el agua en un porcentaje equivalente a miles de veces, desarrolla una función primordial en la piel. La piel joven es rica en ácido hialurónico, sin embargo a medida que envejecemos, la distribución y función del ácido hialurónico en la piel van cambiando y aparecen los signos característicos del envejecimiento como arrugas y líneas de expresión.
20 Materiales y métodos
Para evaluar la eficacia inductora de la hidratación de la piel por un producto de cartílago de la presente invención, en concreto por el producto de cartílago del Ejemplo 1, se llevó a cabo un estudio para la cuantificación de glicosaminoglicanos, principalmente ácido hialurónico sintetizado por los fibroblastos dérmicos humanos tras la
25 incubación con el producto de cartílago (2mg/ml, 500 µg/ml y 250 µg/ml) durante 24 horas. Para ello se utilizó el método de incorporación de 3H-glucosamina en los glicosaminoglicanos de nueva síntesis.
La radioactividad unida se analizó en un contador de centelleo líquido. Los valores de CPMs (cuentas por minuto) obtenidos son proporcionales a la cantidad de ácido hialurónico sintetizado en un 90%.
30 Como Control Positivo los fibroblastos se expusieron a TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1), conocido como inductor de la producción de proteína de la matriz extracelular. El Control Basal consistió únicamente en fibroblastos en medio de cultivo.
35 Resultados
El producto de cartílago mostró un leve efecto hidratante a las 24 horas de exposición a la concentración de 500 µg/ml. Concretamente, estimuló la síntesis de ácido hialurónico en un 12% si se compara con el Control Basal.
40 Ejemplo 7: Valoración de la capacidad inductora de la producción de elastina
En la piel humana, el envejecimiento intrínseco está caracterizado por atrofia de la dermis debida a la pérdida de colágeno, a la degeneración de la malla de fibras de elastina y a la pérdida de hidratación. La elastina es la proteína que confiere las propiedades elásticas a la piel.
45 Materiales y métodos La capacidad inductora de la elasticidad de la piel por parte de un producto de cartílago de la presente invención, concretamente del producto de cartílago del Ejemplo 1, fue evaluada a partir de la cuantificación de la producción de elastina en los fibroblastos.
50 Los fibroblastos dérmicos humanos fueron sembrados en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en crecimiento hasta llegar a confluencia. Seguidamente, se expusieron durante 72 horas a las concentraciones de 2 mg/ml, 500 µg/ml y 250 µg/ml. Finalizado este período de tratamiento, las células fueron lavadas y fijadas para su procesamiento ELISA. En este proceso se utilizó un anticuerpo primario contra la elastina (Monoclonal Anti-Elastin
55 antibody produced in mouse, Sigma), seguido de anticuerpo secundario conjugado a la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y revelado con o-fenilendiamina (sustrato de la HRP) y urea-H2O2. La lectura de la absorbancia se realizó en lector de ELISA a 492 nm.
El valor de elastina producida fue ponderado con el de proteína total en cada condición experimental, resultando en 60 los valores del índice de producción de elastina/proteína total.
Como Control Positivo los fibroblastos fueron expuestos a TGF-β1 (Transforming Growth Factor Beta 1). Como Control Basal los fibroblastos se cultivaron en medio de cultivo.
65 Resultados
14
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