CN111346121B - 牛膝活性提取物的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了牛膝活性提取物在制备治疗中枢神经系统感染性炎症性疾病药物中的新用途，所述牛膝活性提取物的制备步骤包括：(1)牛膝活性粗提物的制备将单味药材怀牛膝饮片粉碎，水煮浸提，将浸提液用硫酸铵分级沉淀，将沉淀透析除盐得到牛膝活性肽粗提物；(2)牛膝活性提取物的HPLC分离：使用C18制备柱进行梯度洗脱。本发明牛膝活性提取物能够调节中枢神经系统先天免疫细胞极化表型，减轻神经炎性损伤的药理作用显著，可用于研发治疗中枢神经系统生物性病原体(包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等)侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管等引起的急性或慢性炎症性疾病的药物和保健品。

Description

牛膝活性提取物的新用途
技术领域
本发明属于天然药物领域，具体涉及一种牛膝活性提取物的新用途。
背景技术
中枢神经系统感染性疾病，指各种生物性病原体(包括细菌、病毒、立克次体、螺旋体、寄生虫、真菌、寄生虫等)侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管等所引起的急性或慢性炎症性(或非炎症性)疾病。根据受累部位可分为三类：主要侵犯脑和脊髓实质的脑(脊髓)炎、主要侵犯脑(脊髓)膜的脑(脊)膜炎、脑实质与脑膜合并受累的脑膜脑炎。根据病原体可分为：细菌性、病毒性、真菌性、寄生虫性等。根据发病情况和病程可分为：急性、亚急性、慢性。根据病例特点可分为：包涵体性、出血性、坏死性、脱髓鞘性等。其中细菌引起的脑膜炎是最常见的中枢神经系统感染，与细菌三种成分有关：细菌包膜、细菌的细胞壁、脂多糖物质。革兰氏阳性菌的细胞壁含有大量的多糖肽和壁酸，革兰氏阴性菌的细胞壁含有脂多糖分子，这些物质都引起强烈的脑膜炎性反应。而病毒性脑炎，如单纯疱疹脑炎的脑组织中可见血管周围大量小胶质细胞活化、巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，神经元死亡。中枢神经系统感染性疾病的治疗原则，包括给予抗菌或抗病毒或免疫抑制治疗以控制病情、控制早期并发症、预防迟发性并发症。具体地，主要是采用抗生素或清除病灶等手段消灭或抑制病原体，调节机体的体液及细胞免疫机制以增强防御及修复能力。校正或调节病理生理机制以减轻炎性反应对靶器官的损害，保护脑功能，注意水电解质的平衡等亦是冶疗中极为重要的辅助手段。
小胶质细胞是中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，正常脑组织中，小胶质细胞呈高度分枝状，以大约每小时一次的频率与神经元突触发生直接接触，为大脑提供一个高度动态和高效的监测系统。在大脑发育的早期阶段，小胶质细胞参与对中枢神经系统内神经元数量的调控。当脑内发生炎症、感染、创伤或其他神经系统疾病时，小胶质细胞迅速被激活，介导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应，发挥神经保护或神经毒性作用。激活的小胶质细胞胞体增大、突起变短、细胞形态呈阿米巴样，其活化状态与脑内受损部位的严重程度密切相关，并且呈现不同的功能表型，包括经典激活型(M1型)和替代激活型(M2型)，M1型小胶质细胞具有促炎作用，可释放炎症因子，破坏血脑屏障、抑制神经再生，M2型小胶质细胞具有抗炎作用，可释放保护性的营养因子，营养神经、促进神经修复、促进血管再生。随着对小胶质细胞激活表型的认识越来越深入，干预神经炎症的策略已从完全抑制小胶质细胞活化转为调节其激活表型，在正确的时间提高适当的功能表型，进而减轻炎性损伤、促进神经修复的作用。寻找能调节小胶质细胞极化表型使其向有利于神经损伤修复方向发展的有效药物，是当今医药研究中引人关注的课题。
天然药物应用历史悠久、多靶点作用、疗效良好、毒副作用小，具有从中开发新型药物的潜在价值。近年来越来越多具有神经保护作用的天然药物活性成分也相继被分离出来，但尚未有植物活性肽成分调节小胶质细胞极化表型进而防治神经系统感染性炎症的报道。
牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)为苋科牛膝属植物，常用其根入药，味苦、甘、酸，性平，归肝、肾经，能活血通经、补肝肾、强筋骨、利水通淋、引火下行，可用于腰膝酸痛、筋骨无力、肝阳眩晕等证。牛膝含多糖、皂苷、甾酮、甾醇、香豆素和生物碱等成分，另外还含有少量挥发油、无机盐和氨基酸(多肽或蛋白质)。
专利号201310108655.6公开了一种可用于促进神经生长，防治神经损伤以及防止神经退行性变的牛膝活性提取物及其制备方法与用途，研究表明该多肽活性提取物能够促进小鼠背根神经节神经元突起生长，增加神经元突起延长和分支，促进小鼠神经再生和功能恢复。牛膝活性提取物能减轻施万细胞氧化损伤，增强抗氧化酶活性，抑制PI3K/Akt和ERK1/2信号通路调控的细胞凋亡，从而促进周围神经再生。
发明内容
本发明的目的在于在现有技术的基础上，进一步提供牛膝活性提取物的新用途。
本发明所述的牛膝活性提取物采用专利201310108655.6公开的技术方案获得。
本发明具体技术方案如下：
牛膝活性提取物在制备治疗中枢神经系统感染性病理性神经炎症及其相关疾病的药物中的应用，所述牛膝活性提取物采用专利201310108655.6公开的技术方案获得，具体步骤包括：
(1)牛膝活性粗提物的制备：将单味药材怀牛膝饮片粉碎，水煮浸提，将浸提液使用饱和度为50％和80％的硫酸铵盐溶液进行分级沉淀，将沉淀透析除盐得到牛膝活性肽粗提物；
(2)牛膝活性提取物的HPLC分离：使用C18制备柱，流动相A为含有0.1％TFA的H2O，流动相B为含有0.1％TFA的CH3CN，梯度洗脱条件为：0min：80％流动相A，20％流动相B；30min：47％流动相A，53％流动相B；31min：100％流动B，收集保留时间23.352min的组分。
本发明所述中枢神经系统感染性炎症为生物性病原体侵犯中枢神经系统实质、被膜或血管引起的急性或慢性炎症性疾病。
进一步的，所述生物性病原体选自细菌、病毒、真菌、寄生虫中的一种或几种。
所述细菌选自脑膜炎双球菌、肺炎球菌、嗜血流感杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、各种肠道杆菌、链球菌、炭疽杆菌、产气荚膜杆菌等中的一种或几种。
所述病毒包括单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、EV病毒、巨细胞病毒、腺病毒、流行性感冒病毒、轮状病毒、麻疹病毒、狂犬病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒等中的一种或几种。
本发明以脂多糖(LPS)刺激的BV2小胶质细胞作为细胞模型，研究了本发明所述牛膝活性提取物对小胶质细胞自噬功能、极化表型、炎性小体产生、吞噬功能以及炎症因子释放的影响。LPS是细菌内毒素，用来模拟革兰氏阴性菌感染。结果表明，本发明所述牛膝活性提取物能够激活LPS刺激下小胶质细胞的自噬功能，抑制M1型小胶质细胞的激活，促进并维持M2型小胶质细胞激活，抑制炎性小体的产生，促进小胶质细胞吞噬功能，抑制炎症因子的释放，其安全性高，药理作用显著，可用于研发治疗中枢神经系统感染性疾病的药物和保健品。
附图说明
图1为牛膝活性提取物对小胶质细胞自噬功能的调节(A.泛素结合蛋白SQSTM1和自噬相关蛋白LC3B的Western blot印迹图，B.SQSTM1蛋白印迹灰度分析图，C.LC3BII与LC3BI蛋白印迹灰度比值分析图，D.LC3B的免疫荧光细胞化学染色图)。
图2为牛膝活性提取物对小胶质细胞极化的调节(A.免疫荧光化学染色显示M1型小胶质细胞标志蛋白CD16+32与小胶质细胞标志蛋白Iba-1随着时间变化在BV2细胞中的共定位及荧光强度的变化，B.免疫荧光化学染色显示M2型小胶质细胞标志蛋白CD206与小胶质细胞标志蛋白Iba-1随着时间变化在BV2细胞中的共定位及荧光强度的变化)。
图3为牛膝活性提取物对小胶质细胞炎性小体产生的影响。
图4为牛膝活性提取物对小胶质细胞吞噬功能的影响。
图5为牛膝活性提取物对小胶质细胞炎症因子释放的影响(A.牛膝活性提取物对LPS刺激BV2小胶质细胞后产生TNF-α水平的影响，B.牛膝活性提取物对LPS刺激BV2小胶质细胞后产生IL-6水平的影响)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的应用范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
采用专利201310108655.6公开的技术方案制备得到牛膝活性提取物。
实施例1牛膝活性提取物对小胶质细胞自噬功能的调节
体外采用6孔培养板培养BV2小胶质细胞，接种密度为2×105细胞/ml，24h后加入5μg/ml牛膝活性提取物处理30min，再加入1μg/ml脂多糖(LPS)处理细胞24h，弃去培养液，用PBS漂洗一遍，加入150μl/孔含1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30min，用蛋白刮子收集裂解产物，涡旋3min后4℃、15000rpm离心30min，收集上清。采用BCA蛋白定量法定量后进行Western blot分析。向蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)稀释至1×，涡旋振荡，煮沸10min，取蛋白样品10μg进行10％SDS-PAGE，电泳电压150V，1h；采用湿转法于冰水浴中转至PVDF膜，恒流300mA，2h；转膜结束后，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T中，室温于摇床上包被1h，加一抗：用5％脱脂奶粉稀释一抗SQSTM 1(1:1000)、LC3B(1:1000)，4℃摇床过夜，TBS-T洗三次，每次10min，加二抗：用TBS-T稀释二抗IRDye 800goat-anti-mouse或goat-anti-rabbit IgG(1:5000)，室温下避光孵育2h。TBS-T洗5遍，每遍5min，显色后用全自动化学发光/荧光图像分析系统，加Beyo ECL Star于膜上进行灰度扫描，采用Image J软件分析结果。以β-actin作内参，实验重复3次。体外采用24孔培养板培养BV2小胶质细胞，接种密度为2×105细胞/ml，24h后加入5μg/ml牛膝活性提取物处理30min，再加入1μg/ml脂多糖处理细胞24h后，采用自噬标志蛋白LC3B免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察、拍照，采用图像分析系统分析荧光强度。结果如图1所示(A.泛素结合蛋白SQSTM1和自噬相关蛋白LC3B的Western blot印迹图，B.SQSTM1蛋白印迹灰度分析图，C.LC3BII与LC3BI蛋白印迹灰度比值分析图，D.LC3B的免疫荧光细胞化学染色图)，结果显示，培养不同时间后，牛膝活性提取物能显著促进背根神经节突起的生长。LPS刺激导致BV2细胞泛素结合蛋白SQSTM 1表达上调，自噬流(LC3BII/LC3BI比值)下降，提示LPS抑制了小胶质细胞自噬功能，而牛膝活性提取物组SQSTM 1表达下调，自噬流增高。与Western blot分析结果一致，细胞免疫荧光化学染色图也显示，牛膝活性提取物组LC3B蛋白从胞膜上的I型向胞浆中的II型转化增多，表明牛膝活性提取物激活了小胶质细胞的自噬功能。
实施例2牛膝活性提取物对小胶质细胞极化表型的调节
体外采用24孔培养板培养BV2小胶质细胞，接种密度为2×105细胞/ml，24h后加入5μg/ml牛膝活性提取物处理30min，再加入1μg/ml脂多糖处理细胞2h，6h及24h后，分别采用M1型和M2型小胶质细胞的标志蛋白CD16+32和CD206免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察、拍照，采用图像分析系统分析荧光强度，结果如图2所示(A.免疫荧光化学染色显示M1型小胶质细胞标志蛋白CD16+32与小胶质细胞标志蛋白Iba-1随着时间变化在BV2细胞中的共定位及荧光强度的变化，B.免疫荧光化学染色显示M2型小胶质细胞标志蛋白CD206与小胶质细胞标志蛋白Iba-1随着时间变化在BV2细胞中的共定位及荧光强度的变化)，LPS刺激2h，LPS组与牛膝活性提取物组的M1型(CD16+32+)小胶质细胞均不明显，而与LPS组相比，牛膝活性提取物组M2型(CD206+)小胶质细胞明显增多，且一直维持至24h；LPS刺激6h，LPS组M1型小胶质细胞增多，而牛膝活性提取物组M1型小胶质细胞显著减少，且一直维持至24h。表明牛膝活性提取物能够促进并维持M2型小胶质细胞的表达，抑制M1型小胶质细胞的表达。
实施例3牛膝活性提取物对小胶质细胞炎性小体产生的影响
体外采用6孔培养板培养BV2小胶质细胞，接种密度为2×105细胞/ml，24h后加入5μg/ml牛膝活性提取物处理30min，再加入1μg/ml脂多糖处理细胞24h，弃去培养液，用PBS漂洗一遍，加入150μl/孔含1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30min，用蛋白刮子收集裂解产物，涡旋3min后4℃、15000rpm离心30min，收集上清。采用BCA蛋白定量法定量后进行Western blot分析。向蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)稀释至1×，涡旋振荡，煮沸10min，取蛋白样品10μg进行10％SDS-PAGE，电泳电压150V，1h；采用湿转法于冰水浴中转至PVDF膜，恒流300mA，2h；转膜结束后，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T中，室温于摇床上包被1h，加一抗：用5％脱脂奶粉稀释一抗NLRP3(1:1000)、caspase 1(1:1000)和IL-1β(1:1000)，4℃摇床过夜，TBS-T洗三次，每次10min，加二抗：用TBS-T稀释二抗IRDye800goat-anti-mouse或goat-anti-rabbit IgG(1:5000)，室温下避光孵育2h。TBS-T洗5遍，每遍5min，显色后用全自动化学发光/荧光图像分析系统，加Beyo ECL Star于膜上进行灰度扫描，采用Image J软件分析结果。以β-actin作内参，实验重复3次。结果如图3所示，LPS组NLRP3、caspase 1(p10)和IL-1β表达均升高，而牛膝活性提取物组NLRP3、caspase 1(p10)和IL-1β表达均显著下降。
实施例4牛膝活性提取物对小胶质细胞吞噬功能的影响
体外采用24孔培养板培养BV2小胶质细胞，接种密度为2×105细胞/ml，24h后加入5μg/ml牛膝活性提取物处理30min，再加入10μg/mlβ-淀粉酶(Aβ)处理细胞24h后，分别采用小胶质细胞标志物Iba-1和外源性Aβ免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察、拍照，结果如图4所示，牛膝活性提取物预处理的BV2细胞对Aβ的吞噬明显增多。
实施例5牛膝活性提取物对小胶质细胞炎症因子释放的影响
体外采用6孔培养板培养BV2小胶质细胞，接种密度为2×105细胞/ml，24h后加入5μg/ml牛膝活性提取物处理30min，再加入1μg/ml LPS处理细胞24h后，收集上清，分别采用TNF-α和IL-6ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6的释放量，结果如图5所示(A.牛膝活性提取物对LPS刺激BV2小胶质细胞后产生TNF-α水平的影响，B.牛膝活性提取物对LPS刺激BV2小胶质细胞后产生IL-6水平的影响)，LPS刺激24h会导致BV2小胶质细胞TNF-α和IL-6产生增多，而牛膝活性提取物可显著抑制TNF-α和IL-6的释放。

Claims (4)

1.牛膝活性提取物在制备治疗中枢神经系统感染性炎症性疾病的药物中的应用，所述牛膝活性提取物采用如下方法制备得到，步骤包括 ：
（1）牛膝活性粗提物的制备：将单味药材怀牛膝饮片粉碎，水煮浸提，将浸提液使用饱和度为50%和80%的硫酸铵盐溶液进行分级沉淀，将沉淀透析除盐得到牛膝活性粗提物；
（2）牛膝活性提取物的 HPLC 分离：使用 C18 制备柱，流动相 A 为含有 0.1%TFA 的H2O，流动相 B 为含有 0.1%TFA 的 CH3CN，梯度洗脱条件为：0 min：80%流动相 A，20% 流动相 B；30min：47%流动相 A，53%流动相 B；31min：100%流动 B，收集保留时间 23.352 min的组分，
所述神经炎症为生物性病原体侵犯中枢神经系统实质、被膜或血管引起的急性或慢性炎症性疾病，所述生物性病原体选自细菌、病毒、真菌、寄生虫中的一种或几种。
2.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于所述细菌选自脑膜炎双球菌、肺炎球菌、嗜血流感杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、各种肠道杆菌、链球菌、炭疽杆菌、产气荚膜杆菌的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述病毒选自单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病 毒、EV 病毒、巨细胞病毒、腺病毒、流行性感冒病毒、轮状病毒、麻疹病毒、狂犬病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述牛膝活性提取物通过激活小胶质细胞，产生 M2 型小胶质细胞减轻急慢性神经炎症反应。
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牛膝多肽对多巴胺能神经元的保护作用研究;彭苏;《医药卫生科技辑》;20181030;第36页第2段 *

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