DE2065867B2

DE2065867B2 - Carcinoembryonales Antigen und Verfahren zu seiner Gewinnung

Info

Publication number: DE2065867B2
Application number: DE2065867A
Authority: DE
Inventors: Samuel Orkin Westmount Freedman; Phil Cote St. Luc Gold; John Henry Montreal Krupey
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1970-06-01
Filing date: 1970-06-15
Publication date: 1980-06-04
Also published as: JPS5516267B1; GB1321999A; US3663684A; DE2029499B2; NL7801570A; DK144591C; GB1321997A; JPS5122047B1; DE2065867A1; CA964580A; IL42508A0; GB1322000A; DE2029499C3; CH611629A5; CH615439A5; BE767800A; NL7107501A; IT995014B; GB1321998A; SE400124B

Description

2. Carcinoembryonales Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe b) des Herstellungsverfahrens als Glycoprotein-Lösungsmittel Perchlorsäure mit einer Konzentration von 0,5—2 η verwendet worden ist.

3. Carcinoembryonales Antigen gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Jod radioaktiv markiert ist.

4. Verfahren zur Gewinnung von für menschliches carcinoembryonales Antigen spezifischen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein warmblütiges Tier mit im wesentlichen reinem menschlichem oarcinoembryonalen Antigen gemäß Anspruch 1 immunisiert und dann das bei diesem Tier gebildete Anti-CEA Antiserum sammelt.

a) Zusatz einer abgemessenen Menge von Anti-CEA-Antiserum zu einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum,

b) Inkubieren des Gemisches,

s c) Zufügen einer abgemessenen Menge von radioaktiv markiertem CEA zum inkubierten Gemisch,

d) Inkubieren des Gemisches,

e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zum inkubierten Gemisch, wobei alle CEA-Anti-CEA-Komplexe

ι ο copräzipitiert werden, und

f) Messen der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes,

wobei zur Herstellung des Anti-CEA-Antiserums reines CEA verwendet wird, das ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, das mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum beim Geldiffusionstest eine einzige Präzipitationslinie bildet und das wie folgt erhältlich ist:

g) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes

auf Verdauungssystemepitheltumoren,
h) Behandlung des Homogenisates mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,

i) Abtrennung des Niederschlages und Klären der

erhaltenen Lösung,
j) Dialyse der geklärten Lösung,
k) Konzentrieren des Dialysats,
ι- jo I) Klären der erhaltenen Lösung,
m) Trocknen der geklärten Lösung,
n) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-% Agarose und einer ιί Teilchengröße von 40—190 μ und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel darstellt,

o) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm 4» und einem Molekulargewicht von etwa 200 000,
p) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate durch eine Blockelektrophorese, durchgeführt bei 300—500 V und etwa 20 mA mit Ferritin als Standard, Lösung des Aktivmaterials in einem ν-, Boratpuffer vom pH 8,2—9,2 und einer lonenstärke von 0,0! 25—0,10, und Verwendung eines wasserunlöslichen, hydrophilen, quervernetzten Dextrangels mit einer Ausschlußgrenze von 5000, einer Wasseraufnahmekapazität von 2,5 ± 0,2 g/g Trok- V) kensubstanz und einer Korngröße von 20—80 μ als elektrophoretisches Trägermaterial und
r) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Startzone etwa 10—14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig i crritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer Richtung wandert.

In der deutschen Patentanmeldung P 20 29 499.9 wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut offenbart. Dieses Verfahren ist durch die folgenden Verfahrensstufen gekennzeichnet:

Die vorliegende Erfindung betrifft das carcinoembryonale Antigen (CEA) per se wie auch mit Jod ho radioaktiv markiertes CEA sowie ein Verfahren zur Gewinnung von l'ür CEA spezifischen Antikörpern.

Durch die erfindungsgemäße besondere Aufbereitung wird ein CEA erhalten mit Eigenschaften, die bisher bekanntes CEA nicht besitzt, so daß das neu h^r> erhaltene CEA als neuer Stoff anzusehen ist.

In Nature 215, Seiten 67/68 (1967) wird die Reinigung und Charakterisierung eines CEA beschrieben, wobei jedoch die Autoren offenbar Grund zur Annahme

haben, daß dieses CEA noch weitere schwache Antigene enthält

In J. Exp. Med. 128,387-398 (1968) wird ebenfalls die Herstellung eines CEA beschrieben, wobei die Autoren ebenfalls zu dem Ergebnis kommen, daß das gereinigte CEA neben dem CEA noch andere Komponenten enthält

In Cancer Research 29, 1961-1964 (1969) wird die Isolierung eines CEA beschrieben, welches ähnlich oder identisch sein soll dem in obenerwähnter Literaturstelle Nature Beschriebenen, wobei angegeben wird, daß eine weitere Reinigung des CEA wegen dessen Neigung zur Polymerisation nicht möglich sei.

Im Hinblick auf die erwähnte Neigung zur Polymerisation und in Anbetracht der zahlreichen bisher angestellten Bemühungen um Gewinnung eines reinen CEA ist es überraschend, daß du.-ci. die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte ein für einen Radioimmunassay ausreichend reines CEA erhalten werden konnte.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein carcinoembryonales Antigen erhältlich durch:

(a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes von Tumoren, die im Verdauungssystemepithel entstehen, das sich von einem embryonalen entodermalen Gewebe ableitet,

(b) Behandeln des Homogenisats mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,

(c) Abtrennen des Niederschlags und Klären der erhaltenen Lösung,

(d) Dialysieren der geklärten Lösung gegen Wasser,

(e) Konzentrieren des Dialysats,

(f) Klären der erhaltenen Lösung,

(g) Trocknen der geklärten Lösung und Aufarbeiten durch Chromatographie und Elektrophorese, wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Verfahrensschritte:

(h) Unterwerfen des erhaltenen Materials einer Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-% Agarose und einer Teilchengröße von 40—190 μ und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymerisatgei (Sephadex G-200) darstellt, unter jeweiligem Sammeln und Konzentrieren der Eluate, die ein spektrophotometrisches Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 ηιμ und ein Molekulargewicht von etwa 200 000 haben,

(i) Unterwerfen der gesammelten Eluate einer Elektrophorese,

(k) Sammeln der Fraktionen, die von der Aufbringungszone unter Verwendung von 400 V und etwa 20 mA mit einem Borat-Puffer von pH 8,6 und einer lonenstärke von 0,05 in anodischer Richtung etwa 10—14 cm wandern, wobei gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel vom Kathodenende in anodischer Richtung 18 cm wandert.

Das CEA wird isoliert und gereinigt durch Homogenisieren von Adenokarzinor.igewebe aus primären oder metastatischen Tumoren, die ihren Ursprung im Verdauungssystem haben.

Um das mit dem homogenisierten Tumorgewebe vergesellschaftete Antigen zu isolieren, ist es erforderlich, alle anderen Substanzen aus dem Homogenisat abzutrennen. Dies erreicht man durch chemische und physikalische Extraktions- und Reinigungsverfahren.

Wenn die Extraktions- und Reinigungsverfahren beendet sind, muß die Identität der isolierten Fraktion als CEA bestätigt werden. Dies wird mittels verschiedener bekannter Techniken erreicht zum Beispiel doppelte Diffusion an Agargel, !mmunoelektrophorese, Hämagglutination, passive kutane Anäphylaxie und dergleichen.

Um diese Techniken anzuwenden, muß bei den verwendeten Antikörpern nachgewiesen werden, daß sie für CEA spezifisch sind. Antikörper die mit diesem Kriterium übereinstimmen, können durch immunologisehe Toleranz- oder Absorptionstechniken gewonnen werden.

Bei der Absorptionstechnik wird das Antitumorantiserum an normalem Gewebe absorbiert, um antinormale Komponenten des Antiserums zu entfernen. Zurück-

is bleibende Antikörperaktivität bei dem absorbierten Antiseram, das gegen das Tumormaterial gerichtet ist wird dann als tumorspezifisch bezeichnet. Dieses Verfahren ist nicht fehlerfrei, da die Möglichkeit besteht, daß tumorspezifische Antikörper entfernt oder durch normale Gewebekomponenten inaktiviert werden können, ähnlich den — jedoch nicht mit ihnen identischen — Tumorantigenen, die ursprünglich die Antikörperbildung anregten.
Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tiere während des Neugeborenenlebensabschnittes gegen normale Gewebe immunologisch widerstandsfähig (tolerant) gemacht. Die widerstandsfähigen Tiere werden dann mit Tumorpräparaten der gleichen Spenderarten immunisiert. Wo eine entsprechende

so Unterdrückung der immunen Reaktion gegen normale Gewebebestandteile erreicht worden ist, ist die Entwicklung von für den Tumor anscheinend spezifischen Antikörpern erreicht worden. Bei Studien von menschlichem Krebs eröffnet diese Technik eine

j¹; mögliche Fehlinterpretation, da die Quellen des normalen und des Tumormaterials verschiedene Spender sind. Wenn jedoch Extrakte von Geweben verwendet werden, ist dieses Problem nicht signifikant, da alle Extrakte im wesentlichen ähnlich sind.

Es wurde gefunden, daß Tumorgewebe vom Adenokarzinom und normales Colongewebe von dem gleichen Individium verwendet werden können, weil sich ein Colonkaizinom praktisch niemals submukös mehr als 6—7 cm auf jeder Seite eines sichtbaren Tumors im allgemeinen ausdehnt.

Das Tumorgewebe des Colonadenokarzinoms und normales Colongewebe von dem gleichen Individium werden zwar getrennt, jedoch in paralleler Weise behandelt. Das Gewebe wird gemahlen, in einem Puffer suspendiert und dann homogenisiert. Das Homogenisat wird dann zur Entfernung fester Teilchen behandelt. Ein Zentrifugieren oder Filtrieren durch allmählich kleiner werdende Filteröffnungen werden bevorzugt. Dies erfolgt zu dem Zweck, alle Teilchen von etwa 0,22 μ

oder größer zu entfernen, wobei alle Bakterien gleichzeitig mit entfernt werden. Das Überstehende oder das Filtrat wird dadurch sterilisiert zur Sicherung

gegen bakterielle Verseuchung.

In geeignete Gruppen eingeteilte Versuchstiere werden dann mit den Extrakten immunisiert, und nach einem geeigneten Zeitintervall nimmt man von den Tieren ein Serum. Das Vorliegen von Antikörpern in den Prüfseren wird entweder durch die Ouchterlony-Technik einer doppelten Diffusion in Agargel, durch Immunoelektrophorese, durch Hämagglutinationsreaktionen oder durch passive kutane Anäphylaxie bewiesen. Die bevorzugte praktische Methode ist wegen ihrer Einfachheit und reproduzierbaren Ergebnisse die

Ouchterlony-Technik.

Wenn man die Anwesenheit von Antikörpern bewiesen hat, ist es möglich, das Antigen zu bestimmen, wenn tatsächlich eine besondere Extraktionstechnik eine Fraktion isolieren läßt, die CEA enthält

Die erfindungsgemäße Exuuktions- und Reinigungstechnik ergibt eine Fraktion, die stets eine Präzipitationslinie bei der Ouchterlony-Technik erzeugt, wenn sie gegen den Antikörper geprüft v/ird, der für CEA spezifisch ist, oder wenn sie gegen nicht absorbierte Antiaren geprüft wird.

Wie oben angegeben worden ist, wird das CEA nach vorliegender Erfindung aus primärem oder metastatischem Adanokarzinomgewebe isoliert und gereinigt, das seinen Ursprung im Verdauungssystemepithel hat, das sich von embryonalen entodermalen Zellen ableitet. Man kann das CEA nach vorliegender Erfindung auch aus embryonalen Verdauungsorganen von Feten im zweiten bis siebenten Schwangerschaftsmonat isolieren und reinigen. Die nachstehende Beschreibung ist auf die Extraktion von Krebsgewebe gerichtet, jedoch kann das Verfahren auch auf embryonales Gewebe angewendet werden.

CEA enthaltendes Gewebe, das entweder embryonales Gewebe aus Verdauungsorganen aus dem ersten und zweiten Trimester oder Adenokarzinomgewebe von Tumoren ist, das seinen Ursprung innerhalb des Verdauungssystemepithel hat, wie obc η beschrieben worden ist, wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel extrahiert, in dem das CEA löslich ist. Dies ist erforderlich, so daß fällbare normale Proteine und störende antigenische Materialien vom CEA-Material getrennt werden können. Geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind zum Beispiel Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure und dergleichen. Perchlorsäure wird jedoch wegen ihrer leichten Verfügbarkeit und Anwendbarkeit bevorzugt.

Das zu prüfende Gewebe wird mit Wasser homogenisiert, um das Antigen zu solubilisieren. Die Menge des verwendeten Wassers sollte ausreichend sein, um das gesamte CEA zu lösen. Im allgemeinen sind etwa 2 Liter Wasser pro Kilogramm Gewebe ausreichend. Man kann mehr Wasser verwenden, jedoch ist dies im allgemeinen nicht erforderlich.

Eine beliebige Temperatur unterhalb Raumtemperatur ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels zum Gewebehomogenisat geeignet. Vorzugsweise wendet man jedoch Raumtemperatur, zum Beispiel 20—25°C, an. Die Temperatur des Glycoprotein-Lösungsmittels, das dem Gewebehomogenisat zugefügt wird, kann ebenfalls variieren, jedoch wird Raumtemperatur bevorzugt. Im allgemeinen wird eine konzentrierte Säure als Glycoprotein-Lösungsmittel verwendet, beispielsweise von einer Konzentration von 0,5 η bis etwa 2 n; wobei 2 η-Säure bevorzugt wird. Das Lösungsmittel wird in etwa dem gleichen Volumen zum Homogenisat zugefügt. Die Zeit, in der dies erreicht wird, beträgt gewöhnlich etwa 10-30 Minuten. Längere Zeiten können zum Verlust dei Antigenwirksamkeit führen.

Man erhält ein Präzipitat. Dieses Präzipitat wird von dem Überstehenden abgetrennt, das das gelöste CEA enthält. Man kann beliebige übliche Trennungsverfahren anwenden, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen.

Man bevorzugt das Zentrifugieren, weil es schneller durchführbar ist und weil dabei eine ausreichende Kraft entwickelt werden kann, um im wesentlichen alle festen Teilchen zu entfernen. Im allgemeinen sind zum Erreichen dieser Wirkung etwa 3000 bis etwa 8000 Umdrehungen pro Minute (UpM) ausreichend. Dieses Zentrifugieren wird vorzugsweise bei niedrigen Tempe raturen, wie etwa 4—10°C durchgeführt, da bei diesen s Temperaturen die Sedimemationszeit wesentlich herabgesetzt wird.

Perchlorsäure, Salze, wie Natriumchlorid, und andere Substanzen von niedrigem Molekulargewicht werden dann entfernt, um das System weiter zu reinigen.

ίο Obwohl es möglich sein kann, dies durch Ausfällen der verbleibenden Proteine zu erreichen, hat man gefunden, daß eine Dialyse durch eine semipermeable Membran gegen Wasser am geeignetsten ist Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da sie alle diffusionsfähige lösliche Substanzen mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, die die CEA-Fraktion einschließen, entfernt Die Dialyse kann zuerst mit Leitungswasser etwa 24—48 Stunden durchgeführt werden. Dann kann die nachfolgende Dialyse mit kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa 4—10⁰C durchgeführt werden. Jedoch ist es möglich, lediglich destilliertes Wasser bei der Dialyse zu verwenden, vorausgesetzt, daß die Temperatur niedrig bleibt und daß das Wasser häufig gewechselt wird. Das vollständige Dialyseverfahren nimmt etwa 48—96 Stunden in Anspruch.

Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt, wird dann getrocknet. Man kann ein Sprühtrocknen anwenden, jedoch ist die Lyophylisierung das bevorzugte Verfahren, Wasser zu entfernen. Es sind beliebige Lyophylisierungsverfahren geeignet. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, daß das Material zuerst Schalen-gefroren und dann lyophylisiert wird. Dies nimmt etwa 32—36 Stunden für das zu lyophylisierende Produkt bis zur vollständigen Trockene in Anspruch. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird jedoch die Lyophylisierung etwa 24—30 Stunden durchgeführt, so daß das Produkt nicht vollständig trocken ist. Obwohl diese Verfahrensstufe für die schließliche Isolierung des reinen CEA nicht kritisch ist, wird sie bevorzugt, da sie Zeit spart.

Das teilweise lyophylisierte Material kann dann bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, wie etwa 37°C, eufgetaut werden. Es kann auch durch Verdünnen mit einer sehr geringen Menge Wasser aufgetaut werden. Danach werden die zurückbleibenden Teilchen entfernt. Es ist auch gefunden worden, daß, wenn das Volumen auf einem Minimum gehalten wird, die Klärung durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren

so erreicht werden kann. Alle Teilchen einer Größe, die nicht durch ein O,22^-Filter gehen (d. h. einer Größe der kleinsten Bakterien), werden demnach unter Klären urd Reinigen der Lösung entfernt.

Das bevorzugte Verfahren besteht darin, die Lösung bei einer hohen Geschwindigkeit, d. h. mit etwa 14 000 bis 30 000 UpM, vorzugsweise etwa 14 000 UpM, bei Temperaturen unterhalb etwa 10⁰C, d. h. etwa 4— 10⁰C, etwa 15—45 Minuten lang zu zentrifugieren. Höhere Temperaturen sind anwendbar, jedoch verzögern sie die Sedimentationsgeschwindigkeit und sind daher nicht zweckmäßig. Nach dem Zentrifugieren ist es erforderlich, die überstehende Lösung weiter zu klären und zu sterisilieren. Dies kann man durch Filtrieren durch Filter von sich allmählich verringender Porengröße erreichen',

b5 um im wesentlichen verbleibende Feststoffe und Bakterien zu entfernen. Die Porengröße der Filter kann von etwa 1,2—0,20 μ variieren. Bevorzugt verwendet man Filter mit 1,2 μ, 0,45 μ, 0,22 μ in der angegebenen

Reihenfolge.

Die Abtrennung eines Teils des erhaltenen lyophylisierlen, das CEA unter Ausschluß anderer Substanzen enthaltenden Pulvers wird nach vorliegender Erfindung durch Chromatographie mit zwei verschiedenen Gelsäulen und anschließende Elektrophorese erreicht.

Es wurde gefunden, daß die eluierten Fraktionen aus der Säulenchromatographie, die ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein definiertes Maximum bei der spektrophotometrischen Absorptionswellenlänge von 280 ιτιμ besitzen, das CEA enthalten. Es wurde weiter gefunden, daß wenn die das CEA enthaltenden Fraktionen einer Elektrophorese unterworfen werden, sie ein charakteristisches Wanderungsbild, das anodisch zur Aufbringungszone an der Kathode ist, bei pH 8.6 mit einem Boratpuffer mit einer lonenstärke von 0,05 haben. Das Ausmaß der Wanderung hängt von der angewendeten Stromstärke und Spannung, wie auch vom pH-Wert, vom Puffer und von der lonenstärke des Puffers ab. Wenn beispielsweise 400 V und 20 mA angewendet werden, wandert das CEA etwa 10—14 cm in anodischer Richtung (anodisch) zur Aufbringungszone in der gleichen Zeit, wie das als Markierungsmittel verwendete Ferritin (ein gefärbtes Protein) anodisch 18 cm wandert, wenn es am kathodischen Ende aufgebracht wird. Man kann andere Markierungsmittel verwenden, jedoch müssen dann die Elektrophoresebedingungen geändert und die Wanderung des CEA und des Markierungsmittels aufeinander abgestimmt werden.

Die Säulenchromatographie kann in der Weise durchgeführt werden, daß man das lyophylisierte Material in Lösung der anschließenden Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen in beliebiger Reihenfolge unterwirft. Zweckmäßigerweise jedoch ist eine Gelsäule, die erfindungsgemäß verwendet wird, ein Agarose-Gel. Agarose ist der neutrale Anteil von Agar. Das Gelmaterial ist von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem Warenzeichen »Sepharose« handelsüblich erhältlich. Die Gele sind als wäßrige Suspensionen in 0,02%igem Natriumazid als Schutzmittel erhältlich. Die Gelstruktur ist einer Wasserstoffbindung zu danken. Das Gel wird in Perlform mit einer ausgewählten Teilchengröße und einem Prozentsatz Agarose hergestellt. Die Konzentration der Agarose im Gel bestimmt seinen Fraktionierungsbereich.

Die zur erfindungsgemäßen Verwendung zweckmäßigsten Gele besitzen eine Teilchengröße von etwa 40—190 μ und enthalten 4 Gew.-% Agarose. Diese als »Sepharose 4B« bezeichneten Materialien haben einen Fraktionierungsbereich von 3 χ 10⁵ bis 3 χ 10⁶. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird »Sepharose 4B« verwendet, da sie die Abtrennung der das CEA enthaltenden Fraktion von Fremdmaterialien mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht als auch kolloidalen Teilchen gestattet

Die zweite Säule enthält ein Gelfiltermaterial, das ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymergel ist Dieses Material und sein Herstellungsverfahren sind in der britischen Patentschrift 8 54 715 beschrieben. Das Gelmaterial, das von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem Namen »Sephadex« handelsüblich erhältlich ist besteht aus einem dreidimensionalen makroskopischen Netzwerk von miteinander verbundenen oder vernetzten Dextransubstanzen, die beim Absorbieren von Wasser quellen können. Die Fähigkeit des Gelmaterials, Wasser aufzunehmen, ist dem Vernetzungsgrad der Dextransubstanzen im Gelmaterial umgekehrt proportional.

Das Gelmaterial ist in einer Vielzahl von Gradei erhältlich, die sich im Hinblick auf den Porositätsgra« unterschieden. Das bei der erfindungsgemäßen Verwen dung bevorzugte Gel hat eine annähernde Molekularge wichtsausschlußgrenze von 200 000, ein Wasserzurück haltevermögen von 20 ±2,0 g H2O/g trockenes Gel, eini Teilchengröße von 40—120 μ und ein Bettvolumen ml/g trockenes Gel von 30—40. Das Gel trägt dii Bezeichnung »Sephadex G-200«.

»Sephadex G-200« wird zur weiteren Reinigung dei das CEA enthaltenden Fraktion verwendet. Da di< Säule ein größeres Auftrennungsvermögen als die erst« Säule für den Molekulargewichtsbereich von 150 000 bii 250 000 besitzt, wird eine weitere Abtrennung des CE/ von Substanzen mit höherem oder niedrigeren Molekulargewicht erreicht. Die zweite Säule sollte ir praktischer Hinsicht nur verwendet werden, nachderr die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfern worden sind, da diese Teilchen die Säule verstopfen unc sie unwirksam machen. Die Chromatographie wire durch Lösen des lyophylisierten Materials in einen wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert, bei dem das CE/ elektrisch neutral ist, d. h. pH 4,5, dann durch Leiten dei Lösung durch die erste Säule, durch Sammeln, durcl Dialysieren, wie oben beschrieben, und Lyophylisierer der aktiven Fraktion zur Entfernung von Salzen, danr durch Wiederlösen der gesammelten aktiven Fraktior in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert bei dendas CEA elektrisch neutral ist, durch Leiten der Lösung

JO durch die zweite Säule, durch Sammeln der aktiver Fraktionen, durch Dialysieren wie oben und durch Lyophylisieren durchgeführt. Der Grund, das CEA elektrisch neutral zu machen (herzustellen), liegt darin die Wechselwirkung des Antigens mit den Säulen unc

die nachfolgende Überlagerung der Fremdstoffe bei der aktiven Fraktionen herabzusetzen. Obwohl beliebige wäßrige übliche Puffer geeignet sind, wird die Verwendung einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (0,9%) bevorzugt Der Vorteil der Anwendung niedriger Temperaturen, d. h. von etwa 4—10⁰C, liegt darin, daO man ein verbessertes Auflösevermögen erreicht. Die aus der zweiten Säule gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000 und ein Maximum bei 280 ΐημ im UV-Absorptionsmeßgerät. Die aus der ersten Säule gesammelten Fraktionen werden auf den gleichen Kriterien basierend ausgewählt jedoch enthalten sie Materialien, die ein etwas höheres oder etwas niedrigeres (bis herunter zu 70 000) Molekulargewicht als 200 000 haben.

so Die aktiven Fraktionen aus der zweiten Säule werden einer Elektrophorese unterworfen, um das CEA von Verunreinigungen weiter zu befreien. Dies erreicht man durch Auflösen der aktiven, zuvor konzentrierten Fraktion in einem Puffer bei einem pH von etwa 8,2-9,2 und einer lonenstärke von etwa 0,0125—0,10. Obwohl beliebige wäßrige Puffer mit diesen Eigenschaften geeignet sind, verwendet man vorzugsweise einen Puffer, der die Beweglichkeit der aktiven Fraktion steigert, d. h. einen Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und einer lonenstärke von etwa 0,05. Diese Eigenschaften lassen das CEA in der gleichen Weise wie das verwendete bevorzugte Markierungsmittel, d. h. Ferritin, wandern.
Die angewendete Stromstärke und Spannung bestimmen das Ausmaß der Trennung der Moleküle in der Fraktion. Es wurde gefunden, daß bei dem bevorzugten Verfahren, der Blockelektrophorese, etwa 300—500 V, vorzugsweise 400 V, mit einer Stromstärke von etwa

20 mA zweckmäßig sind. Man kann andere Stromstärken und Spannungen anwenden, jedoch werden die obengenannten bevorzugt.

Die Blockelektrophorese ist die bevorzugte Elektrophoresemethode, weil sie die Gewinnung der gewünschten Fraktion erleichtert. Jedoch kann man andere Typen der Elektrophorese ebenfalls anwenden.

Das bei der Blockelektrophorese verwendete Material sollte das zu prüfende Material tragen und elektrisch leitend sein, wenn es mit einem Puffer imprägniert wird. Typische geeignete Materialien sind Papier und Gele. Bei dem bevorzugten Elektrophoreseverfahren wird ein vernetztes Dextrangel, zum Beispiel »Sephadex G-25 fine« mit einer annäherenden Molekulargewichtsausschlußgrenze von 5000, einem Wasserzurückhaltevermögen von 2,5 ± 0,2 g hbO/g trockenes Gel, einer Teilchengröße von 20—SO μ und einem Bettvolumen/ ml/g trockenes Gel von 5, in dem Puffer angequollen und auf einem nichtleitfähigen Block, zum Beispiel »Lucite«, angeordnet.

Bei dem bevorzugten Verfahren wird das Gel mit dem gleichen Puffer, in dem auch die aktive Fraktion gelöst wird, in dem Block angeordnet und dann die Papierkontakte auf dem Gel angebracht Der Block wird dann in dem gleichen Puffer in einem Elektrophoresegerät unter Arbeitsbedingungen ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem die Gleichgewichtseinstellung durchgeführt worden ist, wird ein Streifen des Gels entfernt und mit der gepufferten, lyophylisierten CEA-Fraktion aus der zweiten Säule vermischt Die erhaltene Aufschlämmung wird dann auf den Block an die gleiche Stelle gegossen, von der der Streifen entfernt worden war, vorzugsweise in der Mitte des Blocks. Das geeignete Markierungsmittel, zum Beispiel Ferritin, ein Eisen enthaltendes Protein, wird dann am Kathodenende des Blocks aufgetupft Nachdem die Elektrophorese eine vorbestimmte Zeitdauer betrieben worden ist in diesem Falle etwa 24 Stunden, wird der die CEA-Aktivität enthaltende Bereich, d.h. 10—14cm anodisch zur Aufbringungszone, entfernt. Dieser Bereich wird nur entfernt, wenn sich das Markierungsmittel eine zuvor bestimmte Entfernung bewegt hat in diesem Falle 18 cm in anodischer Richtung. Die CEA-Aktivität wird unter Saugen durch ein verfügbares Ο^Ο-μ-Celluloseacetatfilter eluiert und vorzugsweise durch Dialyse gegen destilliertes Wasser zur Entfernung des bei der Eluierung verwendeten Salzes gewonnen. Man erhält ein Material, das im wesentlichen reines CEA ist Dies wird entweder durch die Precipitin-Inhibition oder unmittelbar durch die Ouchterlony-Prüfung gegen nichtabsorbiertes Tumor-Antiserum gezeigt Eine einzelne Präzipitationslinie zeigt reine CEA-Aktivität an.

In der deutschen Patentanmeldung P 20 29 499.9 wird ein Verfahren zur Bestimmung der Höhe des CEA-Gehaltes in Körperflüssigkeiten von Personen mit Krebs oder Krebsvermutung durch eine Radioimmuntechnik, die einfach durchzuführen ist und einen hohen Reproduzierbarkeitsgrad hat und spezifisch ist offenbart

Bei der Radioimmuntechnik ist es wichtig, daß das radioaktive Atom ausreichend reaktionsfähig mit dem zu kennzeichnenden Molekül ist, um eine entsprechende Konzentration der Radioaktivität zur Bestimmung zu schaffen, und daß das radioaktive Atom eine ausreichende Zerfallszahl pro Zeiteinheit zur Verfügung stellen muß, um eine ausreichende Empfindlichkeit für genaue Bestimmungen zu schaffen. Weiterhin darf die Antigenwirksamkeit durch die Verbindung des radioaktiven Atoms mit dem Antigen nicht schädlich beeinflußt ■ werden.

Das CEA kann durch radioaktive Atome markiert

werden, die mit dessen chemisch reaktionsfähigen Gruppen reagieren können und nicht wesentlich die Antigenwirksamkeit herabsetzen. Es wurde gefunden, daß ¹²⁵Jod besonders geeignet ist.

Das CEA kann mittels in der Technik bekannter Verfahren mit geringen Modifikationen bezüglich der

ίο Konzentration und der Volumina mit radioaktivem Jod umgesetzt (radiojodiert) werden. Die »Chloramine-T-Methode« von Hunter und Greenwood, Biochem. J. 91 (1964), Seite 46, unter Verwendung von ¹²⁵Jod ist besonders vorteilhaft.

Dieses Verfahren ergibt eine Radiojodierungswirksamkeit von etwa 20—50%. Beim Radiojodieren von CEA wird gereinigtes CEA verwendet. Die Reaktion wird zum Beispiel unter Verwendung von 200 μΐ einer 100 μg »Chloramine-T« (Natriumsalz des p-Toluolsulfochloramins) enthaltenden Reaktionslösung, von 0,25— 0,4 mg gereinigtem CEA und von 4 mCi ¹²⁵Jod in Form von KJ oder NaJ durchgeführt. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa einer Minute und wird durch Zugabe von Natrium-metabisulfit unterbrochen.

Die Funktion des »Chloramine-T« besteht darin, das Jodid im Salz zu Jod zu oxidieren. Die Funktion des Natrium-metabisulfits besteht darin, das nicht umgesetzte ^l25Jod zum Jodid zu reduzieren. Man kann auch andere Reduktionsmittel, wie Kalium-metabisulfit, verwenden. Die verwendeten Oxidations- und Reduktionsmittel sollten nicht so stark sein, daß sie das CEA schädigen. Das Produkt kann vom nicht umgesetzten ¹²⁵Jod durch Chromatographie in einer Säule mit vernetztem Dextrangel, zum Beispiel »Sephadex

3·; G-100«, abgetrennt werden, wobei das Gel eine annähernde Molekulargewichtsausschlußgrenze von 100 000, ein Wasserzurückhaltevermögen von 10,0 ± 1,0 g H₂O/g trockenes Gel, eine Teilchengröße von 40—120 μ und ein Bettvolumen/ml/g trockenes Gel von 15—20 hat Man entfernt das Rohr mit der größten Radioaktivität im ersten Maximum. Das Produkt hat die folgenden Eigenschaften:

Es ist mit einem spezifischen Antikörper reaktionsfähig, hat das CEA-Elektrophoresebild, ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und eine spezifische Aktivität von etwa 1000—25 000 dpm/ng, vorzugsweise von etwa 10 000-20 000 dpm/ng, d. h. etwa 5-10 n^Ci/ng CEA.

Um die Radioimmunprüfung wirksam zu leiten, muß

eine Zufuhr von CEA-spezifischen Antikörpern gewährleistet sein. Dies wird durch Immunisieren von Tieren mit gereinigter CEA in üblicher Weise erreicht

Man fügt dem CEA in einer Salzlösung ein Emulgiermittel zu, zum Beispiel Freund's Adjuvans (vollständig). Die Emulsion kann bei Tieren in den Fußballen intramuskulär und/oder subkutan injiziert werden. Geeignete Tiere sind Geflügel, Kaninchen, Pferde, Ziegen, Schafe und ähnliche. Die Regel bei Kaninchen ist zum Beispiel, wöchentlich zwei bis fünf Injektionen zu machen. Nach der letzten Injektion wird

μ vom Tier Blut entnommen. Das Serum aus diesem Blut ist nichtabsorbiertes Anti-CEA-Antiserum.

Bei einem Verfahren werden 400 μg CEA in 1 ml Salzlösung (0,9%) verwendet Die Injektion erfolgt intramuskulär unter Verwendung eines etwa viermaligen Volumens, das in den Fußballen injiziert wird.

Der in dem Antiserum vorhandene Antikörper ist nach Absorption an normalen Gewebebestandteilen in seiner Aktivität gegen CEA unter Ausschluß von

anderen Antigenen spezifisch.

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1
Isolierung der CEA-Fraktion

Es wird Tumorgewebe vom Adenokarzinom des Colon herausgeschnitten und soviel wie möglich normales Gewebe abgeschnitten. Das restliche Tumorgewebe wird durch einen Fleischwolf getrieben und in 1000-g-Mengen bei -20° C gelagert. 1000 g des zerkleinerten Gewebes wird in destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4000 ml suspendiert und bei 15 000 Umdrehungen pro Minute eine Stunde in einem wassergekühlten Homogenisator homogenisiert.

Unter ständigem Rühren fügt man ein gleiches Volumen 2 n-Perchlorsäure bei 4° C langsam zu. Diese Suspension rührt man 30 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugiert dann 30 Minuten bei 4° C mit 6000 UpM in einer gekühlten Zentrifuge (6 χ 250 ml, feststehender Winkelrotor). Das Überstehende wird entfernt und in einen flachen, etwa 7,62 cm weiten Dialysierschlauch gegeben, der zuvor 1 Stunde in destilliertes Wasser getaucht worden ist, um ihn geschmeidiger zu machen. Die Dialyse wird 48 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und dann gegen ständige Wechsel von großen Mengen destillierten Wassers bei 4°C während weiteren 48 Stunden durchgeführt. Der dialysierte Rückstand wird in 5000 ml fassende Rundkolben gegeben, und zwar jeweils 1500 ml pro Kolben, in einem Methanol-Trockeneis-Bad Schalen-gefroren und dann auf einem Lyophylisiergerät mit einer Kapazität von 8 Litern lyophylisiert. Unmittelbar vor der vollständigen Lyophylisation (24—30 Stunden) werden die Kolben herausgenommen, der teilweise trockene rohe Extrakt aufgetaut und die erhaltene Lösung in einer gekühlten Zentrifuge (8 χ 30 ml, feststehender Winkelrotor) 30 Minuten bei 14 000 UpM bei 4° C zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und dann nacheinander durch Membranfilter von 1,2 μ, 0,45 μ und 0,22 μ Milliporen filtriert. Die geklärte Lösung wird Schalen-gefroren und zur Trockene lyophylisiert

1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man in 50 ml eines 0,05 m-NaH₂PO₄-Puffers (pH 4,5) in normaler Salzlösung. Der Phosphat-Salz-Puffer vom pH 4,5 dient als Eluierungslösung bei allen nachfolgenden Säulenchromatographien. Die Probe wird dann durch eine »Sepharose 4-B«-Säule geleitet Die verwendete Säule ist eine »Pharmacia K100/100« (100 cm χ 10 cm) mit einer Bettlänge von 89 cm. Durch einen Umwälzkühle:· wird die Temperatur auf 4—5⁰C gehalten. Die Lösung wird mit einer Aufwärtsfließgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde mittels einer konstanten Strömungspumpe (LKB »Varioperpex 1200« Peristaltic Pump) gepumpt Man sammelt 25-ml-Fraktionen in einem Fraktionssammler (LKB »Ultrorac 7000«). Die Fraktionen werden laufend bei 280 πιμ in einem UV-Absorptionsmeßgerät überprüft Die aktive Fraktion wird nach der Eluierung von 4750 ml aufgefangen. Der Versuch dauert annähernd 47 Stunden.

Das Gesamtvolumen der aktiven Fraktion beträgt 75OmL Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 Stunden bei 4° C gegen zahlreiche Wechsel großer Volumina destillierten Wassers dialysiert Schalen-gefroren und lyophylisiert

200 mg des getrockneten Materials aus der »Sepharose 4-B«-Säule werden dann in 10 ml des Standard-Puffers gelöst und durch eine »Sephadex G-200«-Säule geschickt. Die verwendete Säule ist eine »Pharmacia K 50/100« (100 cm χ 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm. Durch einen Umwälzkühler wird die Temperatur auf 4⁰C gehalten. Die Lösung wird mit einer Aufwärtsfließgeschwindigkeit von 40 ml/Stunde mittels einer konstanten Strömungspumpe (LKB »Perpex 10200« Peristaltic Pump) gepumpt. 10-ml-Fraktionen

ίο werden laufend bei 280 πιμ in einem UV-Absorptionsmeßgerät überprüft. Die aktive Fraktion wird nach der Eluierung von 820 ml aufgefangen.

Die Dauer dieses Versuchs beträgt 30 Stunden und das Gesamtvolumen der aktiven Fraktion 190 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 Stunden bei 4° C gegen zahlreiche Wechsel großer Volumina destillierten Wassers dialysiert, Schalen-gefroren und lyophylisiert.

Reinigung der isoliertes CEA enthaltenden
Fraktion durch Blockelektrophorese

Das Blockelektrophoresemedium »Sephadex G-25 Fine« wird zwei Stunden bei 80° C in Wasser gequollen und durch Dekantieren mit Borat vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 gewaschen und dann durch eine gesinterte Glasplatte saugend filtriert

Man gießt eine dicke Gelaufschlämmung auf einen »Lücke«- Blockträger mit den Ausmaßen 61 cm χ 7,5 cm χ 1 cm und läßt sie sich gleichmäßig

jo über die Platte bis zu einer Tiefe von 1 cm verteilen. Die Oberfläche wird dann mit einem Wattebausch abgewischt, bis sie fest aber nicht vollständig trocken ist.

Der Block wird dann mit 3-mm-Chromatographiepapierkontakten (Whatman) versehen, die alle in der

r> gleichen Fließrichtung des Papiers ausgerichtet sind. Den Block ordnet man dann in dem Elektrophoresegerät an und läßt es sich während einer Stunde unter den Betriebsbedingungen von 400 V mit einer konstanten Stromstärke von —20 mA bei 4° C ins Gleichgewicht bringen. Dann entfernt man von der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm und vermengt ihn gut mit 60 mg trockenem CEA, das zuvor in einer Mindestmenge von 0,05 m-Borat annähernd 0,5 ml, gelöst worden ist Die erhaltene Aufschlämmung wird dann in den Mittelstreifen gegossen. Dann tupft man 1—2 Tropfen Ferritin (6mal umkristallisiert) bei einer Konzentration von 100 mg/ml auf das Kathodenende des Blocks. 24 Stunden nach Versuchsbeginn bewegt sich das Ferritin-Markierungsmittel 18 cm in anodischer Richtung.

Gleichzeitig wird der Block aus dem Elektrophoresegerät entnommen. Streifen von 2 cm zwischen der Aufbringungszone und dem Anodenende werden mit 2m-NaCl eluiert, die durch eine 0,20 μ ungebundene Gittermembran (»Nalgene«) geleitet worden war. Die Aktivität wird bei 10—14 cm in anodischer Richtung zur Aufbringungszone lokalisiert, wobei eine schwächere Aktivität bei 8—10 cm in anodischer Richtung zur Aufbringungszone gefunden wurde.

Jeder aktive Streifen wird eluiert und in einem eingeweichten 1—3/16"-Dialysierschlauch gegen zahlreiche Wechsel großer Volumina destillierten Wassers 48 Stunden bei 4° C dialysiert Das Dialysat wird Schalen-gefroren und zur Trockene lyophyiisiert Das getrocknete, gereinigte CEA wird unter vermindertem Druck über Calciumchlorid bei 4° C gelagert Das Produkt hat die folgenden charakterisierenden Eigenschaften:
Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nichtab-

sorbiertem Antiserum bei Geldiffusionsprüfungen, ist in Perchlorsäure löslich, wandert bei der Blockelektrophorese anodisch 10— 14 cm, wobei gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel anodisch 18 cm wandert, wenn ein Borat-Puffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 und 400 V und 20 mA die Bedingungen der Blockelektrophorese sind, es hat weiterhin ein Molekulargewicht von 200 000 und es zeigt ein Spektrophotometerabsorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 Γημ.

Beispiel 2
Umsetzung von CEA mit ¹²⁵Jod

Es wird eine 500 μΙ-Reaktionsmischung gebildet, die 100 μg »Chloramine-T«, 250 μg CEA aus Beispiel 2 und 4mCi ¹²⁵Jod in Form von KJ enthält. Man läßt die Reaktion 1 Minute bei Raumtemperatur ablaufen und unterbricht sie durch Zugabe von 240 μg Natrium-metabisulfit. Das erhaltene Produkt ¹²⁵J-CEA wird vom restlichen nichtreagierten ^t25Jod durch Chromatographie an einer »Sephadex G-100«-Säule abgetrennt. Das Produkt hat eine spezifische Aktivität von etwa

Beispiel 3
Herstellung des Anti-CEA-Antiserums

12 ausgewachsene, männliche, weiße Neu-Seeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,0 kg werden in 3 Gruppen zu je 4 Tieren) eingeteilt. Die verschiedenen Gruppen werden mit den folgenden Materialien immunisiert: normaler Colongewebeextrakt, Tumorgewebeextrakt des gleichen Individuums, von dem der normale Gewebeextrakt erhalten worden war, angesammeltes menschliches Plasma. Der Tumorgewebeextrakt stammt von Tumorproben, die diagnostiziert und bestätigt worden waren, daß sie ein Adenokarzinom des Colon sind. Die normalen Gewebeextrakte und die Turmorgewebeextrakte werden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gebildet. Das vereinigte menschliche Plasma wurde von 30 normalen Spendern erhalten, die alle Hauptblutgruppen repräsentieren.

Die Injektionen, die 4 Wochen lang zweimal wöchentlich gegeben wurden, enthielten 3 mg Protein in 0,6 ml Gewebeextrakt oder Plasma, die in dem gleichen Volumen Freund's Adjuvans (vollständig) emulgiert waren. Injektionen von 0,1—0,2 ml wurden in einem

ίο Fußballen und der Rest intramuskulär in die Flankengegend gegeben. 12 Tage nach den letzten Injektionen wurde den Tieren Blut aus ihren äußeren Ohrvenen entnommen, und die von jeder Gruppe erhaltenen Seren zu Prüfzwecken gesondert gesammelt.

Die Seren von jeder Gruppe wurden an normalem Gewebe absorbiert und das erhaltene Präzipätat abgetrennt. Die überstehenden Lösungen wurden dann der Ouchterlony-Technik einer doppelten Diffusion in Agargel unterworfen. Diese wurde in 1 % Agar-in-Salzlösung mit Merthiolat durchgeführt, das als Schutzstoff zu einer Endkonzentration von 1/10 000 zugefügt wurde. Die Proben wurden in den Gelplatten geschnitten, so daß die zentralen und peripheren Vertiefungen 1 cm voneinander angeordnet waren. Jede Vertiefung wurde mit 0,15 ml des zu untersuchenden Materials gefüllt. Die verwendete Antigenkonzentration betrug 10 mg Eiweiß pro ml. Die Anfangsinkubation der Platten wurde in einer feuchten Umgebung 24 Stunden bei 37° C durchgeführt, um die Diffusion des Materials aus den Zwischenräumen (Vertiefungen) heraus zu unterstützen. Man ließ die Proben sich in der gleichen feuchten Atmosphäre 7 Tage bei 25° C entwickeln. Die Proben aus den Seren von den Tieren, die mit dem Tumorgewebeextrakt immunisiert worden waren, zeigten eine einzige Linie, die angibt, daß das Serum für den Tumor spezifische Antikörper enthält Keine Proben wurden aus den Seren von Tieren entwickelt, die mit normalem Gewebe oder normalem menschlichen Plasma immunisiert worden waren.

Claims

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Patentansprüche:
1. Carcinoembryonales Antigen erhältlich durch:

(a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes von Tumoren, die im Verdauungssystemepithel entstehen, das sich von einem embryonalen entodermalen Gewebe ableitet,

(b) Behandeln des Homogenisais mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,

(c) Abtrennen des Niederschlags und Klären der erhaltenen Lösung,

(d) Dialysieren der geklärten Lösung gegen Wasser,

(e) Konzentrieren des Dialysats,

(f) Klären der erhaltenen Lösung,

(g) Trocknen der geklärten Lösung und Aufarbeiten durch Chromatographie und Elektrophorese, wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Verfahrensschritte:

(h) Unterwerfen des erhaltenen Materials einer Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mir. etwa 4 Gew.-% Agarose und einer Teilchengröße von 40—190 μ und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymerisatgel (Sephadex G-200®) darstellt, unter jeweiligem Sammeln und Konzentrieren der Eluate, die ein spektrophotometrisches Absorp tionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 ιημ und ein Molekulargewicht von etwa 200 000 haben,

(i) Unterwerfen der gesammelten Eluate einer Elektrophorese,

(k) Sammeln der Fraktionen, die von der Aufbringungszone unter Verwendung von 400 V und etwa 20 mA mit einem Borat-Puffer von pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 in anodischer Richtung etwa 10—14 cm wantiern, wobei gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel vom Kathodenende in anodischer Richtung 18 cm wandert.