DE1798418A1 - Markierte Antikoerper gegen Reagin-Immunoglobuline - Google Patents

Markierte Antikoerper gegen Reagin-Immunoglobuline

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DE1798418A1
DE1798418A1 DE19681798418 DE1798418A DE1798418A1 DE 1798418 A1 DE1798418 A1 DE 1798418A1 DE 19681798418 DE19681798418 DE 19681798418 DE 1798418 A DE1798418 A DE 1798418A DE 1798418 A1 DE1798418 A1 DE 1798418A1
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allergen
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antibodies against
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Description

  • Markierte Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline.
  • Die Erfindung betrifft Antikörper gegen Reagin-Ig, verwendbar bei Radio-Immunountersuchungsmethoden zur Be -stimmung von Reagin-Ig, die durch eine Markierung, die sie zur Anwendung dieser Strahlung befähigt, gekennzeichnet sind.
  • Es ist bekannt, daß eine bestimmte Zahl von immunogenen Substanzen, sogenannte Allergene, von denen viele die Natur eines Proteins, Peptids oder Kohlehydrats aufweisen, allergische Reaktionen wie beispielsweise Asthma oder Heu -schnupfen hervorrufen können (solche Allergene sind weit rerbreitet und können beispielsweise von tierischen Schuppen, Pflanzenpollen, Mikroorganismen, einigen Parasiten usw. stammen). In Verbindung damit zeigt sich in der Regel in sehr niedrigen Konzentrationen - beispielsweise im Blut des Patienten ein bestimmter Typ von Antikörpern, sogenannte Reagine, welche Immunoglobuline darstellen und welche spezifisch gegen das Allergien oder die Allergene gerichtet sind; die Antikörper können im Blutserum gezeigt werden. Diese speziellen Immunoglobuline werden im folgenden als Reagin-Immunoglobuline oder Reagin-Ig bezeichnet.
  • Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung läßt sich die Anwesenheit von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Ig in wässrigen Proben bestimmen. Es ist besonders wich -tig, die Anwesenheit von Reagin-Ig in Verbindung mit der Diagnose der Hypersensivität von Tieren und Menschen festzu -stellen.
  • Die deutsche Patentschrift P 17 981 70.3 betrifft ein Verfahren und Hilfsmittel zur Bestimmung von Reagin-Ig in wässrigen Testproben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe, z.B. eine Körperflilssigkeit wie Blutserum oder Blutplasma in vitro mit einem wasserunlöslichen Polymer, welches vorzugsweise in Teilchenform vorliegt, und an welches ein Testallergen gebunden ist, zusammenbringt, worauf man das Polymer mit dem Testallergen und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven Aom bzw. einer radioaktiven Gruppe markiert sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe aarliert ist, zusammenbringt, anschließend das unlösliche Polymer mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schließlich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymer mit den daran be -findlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der abgetrennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, mißt oder die Wirkung derselben untersucht.
  • Ist in der Probe ein Reagin-Ig vorhanden, welches gegen das Allergen gerichtet ist, so wird markierter Reagenz an die-unlösliche Phase gebunden, die anschließend eine strahlung emittieren wird. Die letztere erhöht sich, wenn die Konzentration an Reagin-Ig in der Testprobe zunimmt.
  • Die Strahlung der flüssigen Phase wird im Gegensatz dazu bei sich erhöhender Konzentration an Reagin-Ig abnehmen, weil mehr markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden wird. Die gemessenen Strahlungswerte, die bei dieser methode für die Testprobe erhalten werden, können mit den Werten von Kontrollproben verglichen werden.
  • Wasser-unlösliche Polymere werden als Trägermaterialien für die Testallergene verwendet. Sie können beispielsweise in Form von Teilchen mit verschiedener Gestalt und Größe vorliegen. Die Polymere können beispielsweise auch die Form von flachen Gegenständen wie Scheiben oder Streifen aufweisen oder in Form von Rohrwänden, z. B. in Form einer Innenauskleidung eines Reagenzrohres vorliegen. Die Bindung zwischen dem Polymer und dem Testallergen sollte derart sein, daß bei normalen Waschvorgängen das Test -allergen sich nicht von dem Polymer ablöst. Damit dies erreicht wird, kann das Testallergen chemisch oder gegebenenfalls auch physikalisch gebunden sein. Bei einer geeigneten Form einer chemischen Bindung liegen zwischen dem Polymer und dem Testallergen Brücken mit kovalentem Charakter vor.
  • Um diese Art der Bindung zu erreichen, wird das Polymer so ausgewählt, daß es entweder geeignete reaktive Gruppen, z.B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen oder Carboxylgruppen enthält oder aber mit solchen Gruppen versehen werden kann, die es erlauben, daß das Testallergen leicht an das Polymer gebunden werden kann. Die Bindungsart, bei der zwischen dem Polymer und dem allergien chemische Bindungen in Form von Brücken mit : kovalentem Charakter vorliegen, wird be -vorzugt.
  • Es ist besonders günstig, Polymere auszuwählen, die eine drei-dimensionale Netzstruktur aufweisen, die durch Bindungen kovalenten Charakters zusammengehalten wird. Solche Polymere sind, obwohl quellbar in Wasser oder wässrigen Medien, vollständig unlöslich, so daß nichts von dem polymeren Material oder den Substanzen, die daran gebunden sind, während anschließender Waschverfahren abgegeben werden kann. Beispiele für solche Polymere sind Nischpolymerisate, die man durch Vernetzen von Substanzen mit einer größeren Anzahl von Hydroxylgruppen wie Kohlehydrate und Zuckeralkohole, z.B, Dextran, Stärke, Dextrine oder andere Polysaccharide sowie Vinylalkohol mit einer bifhnktionellen Substanz, beispielsweise einer bifunktionellen Substanz vom Typ X-R-Z erhält, wobei im letztgenannten Fall X und Z Halogen oder Epoxygruppen und R den Rest der bi -funktionellen Substanz, z.B. einen aliphatischen Rest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten.
  • FUr diese Zwecke kann beispielsweise das im Handel erhältliche Produkt "Sephadex" verwendet werden; dieses Produkt besteht aus einem durch Glyzerin-Ätherbrück vernetzten Dextran, welches durch Behandlung von Dextran mit Epichlorhydrin gewonnen wird. Das Produkt kann beispielsweise in Form kleiner Körner verwendet werden. Sephadex und Produkte, die in ähnlicher Weise gewonnen worden sind sind in Wasser quellbar, jedoch unlösliche Gele und können in Teilchenform hergestellt werden. Sie enthalten Bydroxyl gruppen, so daß sie leicht mit anderen Gruppen subetituiert werden können, z. B. mit Gruppen, die Aminogruppen oder Carboxylgruppen enthalten; diese Gruppen können leicht Brücken in Form von Bindungen kovalenten Charakters zu den Testallergen bilden.
  • Das Polymer wird vorzugsweise in einer solchen Form verwendet, daß eine große Oberfläche für die Beruhrung zur Verfügung steht, z.B. in Form von kleinen Teilchen.
  • Das Testallergen wird an das Trägerpolymer unter milden Bedingungen gebunden, damit die immunochemische Reaktivität des Allergens nicht nennenswert beeinträchtigt wird.
  • Zur chemischen Bindung des Allergens an das Polymer werden reaktive Gruppen wie Aminogruppen, Hydroiylgruppen, Mercaptogruppen, Amidogruppen und Carboxylgruppen verwendet, wobei eine Brücke in Form einer chemischen Bindung mit vorzugsweise kovalentem Charakter zwischen dem Testallergen und dem Polymer gebildet wird, u. zw. folgender Art: Allergen - NR - CS- NH-Polymer, Allergen - NH - CO - NH- Polymer.
  • Allergen - N = N - Polymer, Allergen - 0 - CO - Polymer, Allergen - NH - CO- Polymer, Allergen - CO - NR - Polymer
    Allergen-Nif - C - 0 -
    ,I
    0
    Polymer, Allergien Polymer Das Verfahren zur Bestimmung von Reagin-Ig beruht auf der Beobachtung, daß Reagin-Ig sowohl an ein Allergen, gegen welches es spezifisch gerichtet ist, als auch an Antikörper, die allgemein gegen Reagin-Ig gerichtet sind, gebunden werden kann. Solche Antikörper sind wenigstens zweiwertig, d.h. sie können an wenigstens zwei Moleküle Reagin-Ig gebunden werden. Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, wie auch Reagin-Ig selbst können mit Atomen oder Gruppen, die eine Strahlung hervorrufen, markiert werden, z.B. mit radioaktiven Isotopen oder fluoreszierenden Gruppen.
  • Im Vergleich zu bekannten Methoden zur Durchführung von Hauttests und Provozierungsteste weist das oben erwähnte Verfahren den Vorteil auf, daß die Anwesenheit und auch die Menge von Reagin-Ig, welches befähigt ist, mit einer bestimmten Art eines Allergens oder einer be -stimmte Gruppe von Allergenen, z. B. Tier- oder Pflanzen -allergenen, zu reagieren, in vitro in einer Blutprobe des Patienten bestimmt werden kann, u. sw. damit Hilfe einer sehr empfindlichen und einfachen Methode, die flir den Patienten vollkommen sicher ist. Es ist wesentlich für das Verfahren, daß das Testallergen, gegen welches das zu bestinmende Reagin-Ig gerichtet ist, sehr fest an das wasserunlösliche Trägermaterial gebunden ist. Dss Reagin-Ig, welches lait dem Allergen reagiert hat, kann dann leicht von den nicht-Allergen-gebundenen Immunoglobulinen abgetrennt werden. Während der weiteren Stufe des Verfahrens lassen sich die Antikörper und das Reagin-Ig, die nicht an das Polymer gebunden worden sind, außerdem sehr leicht von denen abtrennen, die an das Polymer gebunden worden sind.
  • Das Polymer mit den daran befindlichen Substanzen kann sehr leicht von der FlUssigkeit abgetrennt werden.
  • Die Abtrennung ist unempfindlich gegen Veränderungen des Salz- und Proteingehaltes der Flüssigkeit innerhalb der physiologischen Grenzen. Das vollständige Bestimmungs -verfahren einschließlich der Abtrennung der freien, markierten Antikörper und das Reagin-Ig bzw. der Polymergebundenen markierten Antikörper und das Reagin-Ig kann beispielsweise in demselben Reagenzrohr ohne Zugabe von Fällungsmitteln u.ä. durchgerührt werden.
  • Für das obenerwähnte Verfahren werden isoliertes Reagin-Ig sowie dagegenwirkende Antikörper benötigt.
  • Reagin-Ig kann aus dem Serum allergischer Patienten sowie in seltenen Fällen aus dem Serum von Patienten, die Reagin-Ig-bildende Tumore im Gewebe aufweisen, ge -wonnen werden. Reagin-Ig kann mit den verschiedenen Methoden zur Abtrennung von Proteinen gereinigt werden, z,B. durch Gelfiltration, lonenaustausch er-Chromatographie und Elektrophorese. Ähnlich wie andere Immunoglobuline kann Reagin-Ig chemisch oder enzymatisch in ein Antigenbindendes Fragment und ein Fragment, welches die Träger -substanz für die klassenspezifisch bestimmenden Gruppen ist, gespalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen, markierten Antikörper gegen Reagin-Ig lassen sich bei Radio- Immunountersuchungsmethoden &ur Bestimmung von Reagin-Ig, beispielsweise einer solchen Methode, wie sie vorstehend beschrieben wurde, verwenden.
  • Antikörper gegen Reagin-Ig können nach bekannten Methoden &ur Immunid erung von Versuchstieren hergestellt werden, z.B. durch wiederholte subkutane Injektionen kleiner Mengen von Antigenen in Mischung mit einem geeigneten Zusatzmittel, z.B. Freund'scher Mineralolsuspension.
  • Die Antikörper, die von dem Tier, z.B. einem Kaninchen, gebildet werden, können aus dem Blutserum des Tieres gewonnen werden.
  • Spezifische Antikörper, das sind Antikörper, die gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen des Reagin-Ig gerichtet sind, können erhalten werden, indem man die Immunisierung mit den aus den Reagin-Ig-Molekülen abgespalteten Fragmenten, die die bestimmenden Gruppen enthalten, vornimmt oder indem man die spezifischen Anti -körper aus einer Mischung von Antikörpern isoliert, die durch Immunisieren mit nativem Reagin-Ig gewonnen worden sind.
  • Spezifische Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, können gegebenenfalls aus dem Antiserum auch durch übliche immunosorbierende Techniken isoliert werden; beispielsweise kann Reagin-Ig mit Bromacetyl -cellulose gekuppelt werden, worauf die Antikörper, die an das gekuppelte Reagin-Ig gebunden sind, durch Erniedrigung des pH-Wertes freigesetzt werden.
  • Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, spezifische Antikörper gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen in dem Reagin-Ig zu verwenden, damit eine besonders hohe Sicherheit und Genauigkeit während der Versuche erreicht werden.
  • Die Markierung von Reagin-Ig und Antikörpern gegen Reagin-Ig mit radioaktiven Isotopen kann in üblicher Weise vorgenommen werden, wobei ein für diese Zwecke geeignetes Isotop, z.B. aus 125J besteht (Methode nach Hunter und Greenwood). Auch die Markierung mit einer fluoren -zierenden Gruppe kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z.B. mit einem Fluoreszeinderivat wie Fluoreszeinisothiocyanat.
  • Allergenhaltige Extrakte, z. B. von Hunder- oder Pferdeepithol, Timothy-Gras- oder Birkenpollen sind im Handel erhältlich.
  • Die Bestimmung der Radioaktivität kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z.B. mit Hilfe von Leucht -detektoren. Auch die Fluoreszenz kann in üblicher Weise gemessen werden.
  • Die lvlenge an Polymer, an welches Allergen gebunden ist, wird u.a. im Hinblick auf die Smpfindlichkeit, die während des Tests erforderlich ist, ausgewählt. Die Menge an Antikörpern gegen das Reagin-Ig, das der Reaktion zugesetzt wird, wird beispielsweise so ausgewählt, daß ein Überschuß im Hinblick auf die Zahl der Haftstellen für diese Antikörper an den an die Polymeren gebundenen Sub -stanzen vorhanden ist, nachdem die Allergene vollständig mit Reagin-Ig gesättigt worden sind. In entsprechender Weise wird die Menge an markierten Antikörpern und markiertem Reagin-Ig so ausgewählt, daß ein Überschuß in Bezug auf die maximale Zahl der Haftstellen an den an das Polymer gebundenen Substanzen vorhanden ist.
  • Das Testallergen kann ein einzelnes Allergen oder eine Mischung aus zwei oder mehr Allergenen sein. Im letzteren Fall bringt das Verfahren den Vorteil mit sich, daß während der Untersuchung ein schnelles lijalt oder nein" auf die Frage möglich ist, ob eine Überempfindlichkeit gegen ein oder mehrere Allergene in einer großen Gruppe von Allergenen existiert. Ist die Antwort "ja", so müssen weitere Bestimmungen durchgeführt werden, um festzustellen, gegen welche Allergene die Überempfindlichkeit des Patienten in der großen Gruppe gerichtet ist.
  • Das Verfahren kann auch zur quantitativen Bestimmung von Reagin-Ig dienen. Für diesen Zweck wird eine serielle Verdünnung des Testserums analysiert; das Ergebnis ergibt sich durch Vergleich mit der Wirkung einer Standardlösung, die in analoger Weise analysiert worden ist.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläu -terung der Erfindung.
  • Beispiel 1 : Bestimmung von Reagin-Ig, welches gegen ein Pflanzenallergen (Birkenpollen) gerichtet ist.
  • A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundenem All ergen.
  • Feine Teilchen eines Dextran, welches mit Glycerin-Ätherbrucken vernetzt ist (" Sephadex G 25", superfein), welches nach der Methode von R. Atmen und J. Porath, Acta Chem. Scand, 18 (1964) S. 2193 mit Isothiocyanatophenoxyhydroxypropylgruppen substifuiert waren, wurden als Ausgangsmaterial verwendet. Zu einer Suspension von 100 mg dieser Teilchen in einer wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gab man 1 ml Allergenlösung (einen handelsüblichen Allergenextrakt). Die Mischung wurde drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert und dabei langsam in vertikaler Ebene rotiert. Die Teilchen wurden dann zentrifugiert und zweimal mit je 0,5 m NaHCO3, 0,1 m Acetatpuffer, 0,1 m Trispuffer mit 1 * Schweineserumalbumin gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in 0,1 m Trispuffer mit 1 % Schweineserumalbumin suspendiert.
  • B. Herstellung von Reagin-Ig.
  • Proben von aufgetautem oder frisch gesammeltem Plasma eines Patienten mit Mielomatesia wurden mit 0,15 m Natriumchlorid verdünnt, so daß sich ein Gehalt von etwa 15 mg/ml mit Bezug auf die M-Komponente (Reagin-Ig) er -gab. Die Fällung mit wasserfreiem Natriumsulfat (18 g/100 ml) wurde bei 25°C durchgeführt. Nach einer Stunde wurde der Niederschlag abzentrifugiert (10000 x g, 20 Minuten, 250 C) .
  • Das Sediment wurde abgetrennt, mit Natriumsulfatlösung (18 g/100 ml) gewaschen und in 0,8 Volumteilen einer 0,1 m Natriumphosphatpufferlösung mit pH = 7,5 gelöst. Das Material wurde noch einmal wie beschrieben, ausgefällt.
  • Im Anschluß an die letzte Fällung wurde das Sediment in 0,1 m Tris-HCl-Puffer mit pH = 8,0 (2000) gelöst und auf eine Kolonne mit einer Größe von 3,2 x 30 cm aus einem mit Glycerin-Ätherbrücken quervernetztem Dextran, das mit Diäthylaminoäthylgruppen substituiert ist, aufgebracht und mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht.
  • Das Eluieren des Materials wurde mit Tris-HCl, dessen Stärke allmählich von 0,1 m auf 1 m zunahm, bei konstantem pH-Wert von 8,0 bei 20°C durchgeführt. Die Fraktionen, die das Reagin-Ig enthielten, wurden aufgefangen, eingeengt und auf eine Kolonne (Größe 3,2 x 95 cm) aus einem mit Glycerin-Ätherbrücken quervernetztem Dextran mit einem Perldurchmesser von 40-120 und einer Wasseraufnahme von etwa 15 ml Wasser pro Gramm trockner Substanz, aufgebracht, die mit 0,1 m Tris-CHl-0,2 m NaOl - 0,002 m EDTA Na2 (dem Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure)- = 7,7 - ins Gleichgewicht gebracht worden war und 0,02,' Natriumazid enthielt, Man ließ das Material die Kolonne dreimal passieren (Rücklaufchromatographiertechnik).
  • Fraktionen, welche das Reagin-Ig enthielten, wurden aufgefangen und durch Ultrafiltration bei 4°C konzentriert.
  • Das auf diese Weise hergestellte Reagin-Ig war mit weniger als 0,1% an Gesamtprotein von anderen tmmunoglobulinen verunreinigt. Daß gereinigte Reagin-Ig gab bei der Elektrophorese bei pH 8,6 einen einzelnen Peak, I = 0,05. Untersuchungen bei der Ultrazentrifugation zeigten das Vorliegen einer einzigen Grenzschicht; die Sedimentationskonstante, So20,w wurde 8,20 S berechnet. Das Molekulargewicht des Reagin-Ig wurde mit 200.000 + 5.000 berechnet, wobei man ein partielles spezifisches Volumen von 0,7/3 cm3/g benutzte, das auf der Basis der Aminosäure- und Kohl ehydratzusammens etzung des Reagin-Ig bestimmt worden war. Die Diffusionskonstante, D°20 wurde mit 3,71 x 10-7 cm02/Sek. berechnet. @@,w Reduktionsversuche zeigten, daß das Reagin-Ig aus zwei Arten von Polypeptidketten besteht, so daß es anderen Serum-Immunoglobulinen entspricht. Die Anwesenheit von zwei leichten Polypeptidketten mit einem Molekulargewicht von 22.600 konnte in dem Reagin-Ig erwiesen werden. Das Molekulargewicht der schweren Polypeptidketten, einschließlich der prosthetischen Kohlehydratgruppe(n) wurde mit etwa 77.400 berechnet, wobei ein Moleverhältnis von 1 : 1 für die schweren und leichten Polypeptidketten in nativem Reagin-Ig angenommen wurde. Die Aminosäure- und gohl ehydratzusammens eteung ist in Tabelle I angegeben.
  • Tabelle 1: Aminosällre-und Kohlehydratzusammensetzung von Reagin-Ig.
  • Aminosäure Aminosäurerest, g g pro 100 g Protein Tryptophan 3,67 Lysin 4,20 Histidin 2,16 Amid-N 1,34 Arginin 5,63 Asparaginsäure 6,73 Threonin 9,01 Serin 8,52 Glutaminsäure 8,93 Prolin 5,24 Glycin 3,13 Alanin 3,92 Halb- cystin 2,15 Valin 5,59 Methionin 1,17 Osoleucin 2,29 Leucin 6,08 Tyrosin 4,63 Phenylalanin 3,91 88,29 Kohlehydrat Kohlehydratrest, g pro 100 g Pro@ ein N-Acetyl-glucosamin 4,60 Hexoso (Galaktose + Mannose) 5,34 L-Pucose 0,51 N-Acetyl-neuraminsäure 1,26 11,71 C. Isolierung von Fragmenten des Reagin-Ig, welche klassenspezifische bestimmende Gruppen ent -halten (sogenannte Fe-Fragmente.
  • 100 mg Reagin-Ig, welches gemäß Beispiel 1 B hergestellt worden war, in Q, 1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 0,1 in Cystein wurden bei 37°C 4 Stunden mit 1 mg Papain inkubiert, worauf die Reaktion durch Zugabe von Jodacetamidlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,05 m unterbrochen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltration (Sephadex G 150") fraktioniert, wobei ein Mischpolymerisat aus Dextran und Epichlorhydrin verwendet wurde; die Wasserrückgewinnung lag bei 150 g feste Substanz und die Eluierung des Gelbettes wurde mit 0,1 m Tris (Trishydroxymethylaminomethan)-HCl, 0,2 m NaCl-Puffer (pH 7,7) durchgeführt. Die Fraktionen, welche das Fß Fragment enthielten, wurden für Immunisierungszwecke aufge -fangen.
  • D) Herstellung von Antikörpern gegen das Fo-Fragment des Reagin-Ig.
  • Kaninchen wurden intramuskulär mit einer Mischung aus 0,5 mg FO-Fragment des Reagin -Ig in 0,2 ml 0,15 m Natriumchloridlösung und 0,8 ml vollständiger Freund'scher Zusatzlösung injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und dann jede Woche drei Wochen lang wiederholt.
  • Nachdem weitere 10 Tage vergangen waren, wurde den Eaninchen Blut entnommen, aus welchem das Antiserum durch Koagulieren und Entfernung des Koagulates gewonnen wurde.
  • Das Antiserum wurde durch Adsorption während einer Stunde bei 37°C und 16 Stunden bei 400 spezifisch gemacht.
  • Nach dem Abzentrifugieren wurde die Spezifität des Antiserums durch Immunoelektrophorese gegen normales Menschenserum und durch Ochtorlony-Geldiffusionsanalyse gegen reine Immunoglobuline A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalen Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteine getestet; dabei konnte die Spezifität gegen Reagin- Ig festgestellt werden.
  • Antikörper gegen das Fg-Fragment wurden aus diesem Antiserum isoliert, in folgender Weise: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-Ig wurden mit 34 ml einer Lösung vermischt, die etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt, die aus dem Antiserum durch Ionenaustauscherchromatographie isoliert worden war. Die gewonnene Suspension wurde bei pH 7 und 400 zwei Stunden aktiviert und anschließend mit 20.000 x g 20 Minuten bei 10 C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit 0,15 m NaCl - 8 m Harnstoff (pH 6-7) gewaschen, anschließend wurde wieder zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde solange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit frei von Protein war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9 ml 0,1 m Glycin-HCl-Puffer (pH 3,1) gegeben und unter Rühren bei 370C 40 Minuten inkubiert. Die ganze Lösung wurde dann zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 1200 ml 0,01 m Tris-HCl, 0,1 m NaCl (ph 7,1) bei 40C 48 Stunden dialysiert. Diese Lösung enthielt Antikörper in einer Menge von ungefähr 1 mg pro ml, die gegen das Fe-Fragment des Reagin-Ig und damit also auch für das gesamte Reagin-Ig spezifisch sind; Dieses Antikörpermaterial reicht zur Durchführung von mehr als 10 Millionen Bestimmungen aus.
  • E. Markierung von Antikörpern, die gegen das Fe-Fragment des Reagin-Ig spezifisch sind.
  • Die Markierung wurde mit 125J nach der Methode von Hunter und Greenwood,"Nature"194 (1962), Seite 495, durchgeführt.
  • Die Markierung kann auch in entsprechender Weise durchgeführt werden, wie dies im Beispiel 2 für Anti -körper gegen Reagin-Ig beschrieben ist.
  • F. Bestimmungsverfahren.
  • 1. 0,5 ml einer Suspension gab man in jedes von zwei Reagenzgläsern. Die Suspension enthielt Teilchen mit chemisch gebundenen Pflanzenallergenen und war wie vorstehend unter A beschrieben, hergestellt worden; die Suspension enthielt 1 mg Teilchen pro ml.
  • 2. 0,05 ml des zu untersuchenden Serums eines Patienten wurde in eines der Reagenzgläser gegeben.
  • 3. 0,05 ml eines Kontrollserums, welches von einem nicht allergischen Patienten genommen worden war, wurde in das andere Reagenzglas eingeführt.
  • 4. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser langsam in senkrechter Ebene rotiert wurden.
  • 5. Die Teilchen wurden 1 Minute bei 9000 UpM abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.
  • 6. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 in Tris-Puffer (pH 7,4) mit 1,' Schweineserumalbumin gewaschen.
  • Die überstehende Flüssigkeit wurde nach jedem Zentrifugieren abgesaugt. Dabei wurde sichergestellt, daß beim Entfernen der überstehenden Flüssigkeit keine festen Teilchen mitgerissen wurden.
  • 7. 0,1 m der wie vorstehend unter C erhaltenen Lösung mit Antikörpern gegen das Fe-Fragment des Reagin-Ig, die mit 125J markiert worden war, wurde in alle Reagenzgläser gegeben.
  • 8. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser in senkrechter Ebene langsam rotiert wurden.
  • 9. Die Teilchen wurden eine Minute bei 3000 UpM abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.
  • 10. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Tris-Puffer (pH 7,4) mit 1 Gewichtsprozent Schweineserumalbumin gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang zentrifuglert und die Überstehende Flüssigkeit abgesaugt wurde. Es wurde sichergestellt, daß während der Entfernung der Uberstehenden Flüssigkeit keine festen Teilchen mitgerissen wurden.
  • 11. Die Reagenzgläser wurden vor einen Leucht -schirindetektor gesetzt, so daß die Gamma-Strahlung gemessen werden konnte.
  • Zur Abschätzung der Intensität der Strahlung des ersten Reagenzglases wurde mit der Strahlungsintensität des zweiten Reagenzglases, welches Kontrollserum von einem nicht allergischen Patenten enthielt, verglichen.
  • Es ist auch möglneh, nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe 9 eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden E'lüssigkeit in Zählröhrchen zu überführen, worauf die Gamma-Strahlung der markierten Antikörper gegen das Fe-Fragment frei in der Lösung gemessen werden kann.
  • Zur quantitativen Bestimmung können jeweils 0,05 ml Testserum in verschiedenen Verdünnungen in Stufe 2 zugesetzt werden. Eine Anzahl von Reagenzgläsern wurde in derselben Weise mit verschiedenen Verdünnungen eines Stan -dardserums versehen. Die Aktivität kann im Verhältnis zur Aktivität des Standardserums ausgedrückt werden.
  • BeisPiel 2: Markierung von Antikörpern gegen Reagin-Ig.
  • A) Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-Ig.
  • Antikörper gegen Reagin-Ig wurden hergestellt durch Immunisierung von Kaninchen mit Reagin-Ig auf gleiche Weise wie unter Beispiel 1 D beschrieben.
  • B) Radioaktives Jod (125j).
  • Jod-125, trägerfrei, gelöst als NaJ in 0,1 m NaOH und frei von Reduktionsnitteln wurde verwendet.
  • C) Herstellung von Jodmonochlorid.
  • Jodmonochlorid wurde hergestellt gemäß J.L.IZZO, W.F. BALE, M.J. IZZO und A. RONCONE, J. Biol. Chem., 239, Nr. 11, 3742 (1964) und der Jodgehalt wurde be -stimmt durch Reduktion des gesamten Jods zu Jodid mit Hilfe von Arsentrioxyd und nachfolgende Titration mit 0,1 m AgN03. Die JCl-Stammlösung enthielt 2,54 mg J/ml in 0,02 m KC1, 2,0 m NaCl und 1,0 m HC1 und ist bei Raumtemperatur wenigstens 18 Monate lang stabil. Vor Gebrauch wurde die JCl-Stammlösung auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde eine HCl-NaCl-Lösung bereitet, deren Konzentration für jeden Versuch individuell eingestellt wurde, um verläßlich Werte ober -halb der Minimalkonzentration an HC1 und NaCl zu erhalten, bei welchen JC1 als stabil bekannt ist @ R. W. HELMKAMP, M.A. CONTERAS und W.F. BALE: Int. J. appl. Radiat. Isotopes, 18, 737 (1967) 7 D) Markierungsverfahren.
  • Die Jodierung beruht auf HELMKAMP's Modifi -zierung der Jodmonochloridmethode nach MeFAIRLANE t A.S. McFAIRLANE, Nature, 182 , 53 (1958) #, mit weiteren Abänderungen # J.L. IZZO, W.F. BALE, M.J. IZZO und A. RONCONE, J. Biol. Chem. 239. Nr. 11 (1964), 3743, W.F. BALE, R.W. HELMKAMP, T.P. DAVIS, M.J. IZZO, R.L.
  • GOOLAND, M.A. CONTRERAS und I.L. SPAR, Proc. Soc. Exp., Med., 122 (1966), 407 und R.W. HELMKAXP, M.A. CONTRERAS und W.F.BALE, Int.J. appl. Radiat. Isotops, 18 (1967), 737 J.
  • Antikörper gegen Reagin-Ig (100 g) wurden markiert in einem Molverhältnis von JC1 zu Antikörper gegen Reagin-Ig von 2 : 1 und JC1 zu 125J von 1 : 1 . Folgende Lösungen wurden verwendet: Lösung I: Antikörper gegen Reagin-Ig wurde in 0,2 m tris-HCl-Puffer, pH 8, mit einer Konzentration von 10,0 mg/ml gelöst.
  • Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die JCl-Stammlösung wurde durch Auflösen von 5,84 g NaCl in 35 ml 2,0 m HCl und 65 ml destilliertem Wasser bereitet.
  • Lösung III: Die Endlösung von Jodmonochlorid wurde bereitet durch Verdünnen von 100µ1 der JCl-Stammlösung mit 20,2 ml Lösung II.
  • Lösung IV: 44.29 µ1 von Radiojodid (4,0 mCl) wurden zu 25µ1 1 Lösung III zugegeben und vor Gebrauch in einem Eisbad belassen. Alle Lösungen wurden kühl gehalten und die Jodierungsreaktion wurde bei Eistemperatur durchgeführt.
  • Die Reagentien wurden in der folgenden Reihenfolge in kleine Glas röhrchen gegeben: Zu 200 µ1 Borat-Carbonat-Puffer (0,4 m, pH = 9,1) und 10 µ1 Lösung I (100 µg antikörper gegen Reagin-Ig) wurden 50 µ1 Lösung IV zugesetzt und sofort kräftig gemischt. Nach 60 sec wurden 20 µ1 0,1 m Na2S203, 50 µ1 2 %-iges KJ und 200 µ1 5%-iges Human-Serum-Albumin-Blau (HSA-Blau) zugesetzt. Das HSA-Blau wurde gemäß MELANI (F.
  • MELANI, K.M. BARTELT, R. CONRADS, E.F. PFEIFFER, Z.klin.
  • Chem., 4 Jahrg. 1966 (Heft 4) bereitet. Letzteres wurde zur Verminderung von Strahlenschäden und zur Verminderung der Adsorption von Antikörpern gegen Reagin-Ig an den Glaswänden zugegeben. Zubereitungen von mit 125J jodierten Antikörpern gegen Reagin-Ig können gereinigt werden durch vernetztes Dextran oder agargel, u.zw. durch Gelfiltration oder durch Ionenaustauscher. Fraktionen aus der Kolonne wurden gewonnen bei t 4 0C in 0,1 m tris-HCl-Puffer, pH 7,72 mit einem Gehalt von 5% HSA. Frktionen, die die markierten Antikörper gegen Reagin-Ig enthielten, wurden gesammelt und in gefrorene Zustand auibewihrt.
  • Diese Methode ergab 81,34 % Bindung von gesamten jodierten Antikörpern gegen Reagin-Ig. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom 125J und etwa 1 Atom 127J pro Molekül (MW 150 000) und hatte eine spezifische Aktivität von etwa 16 mcl/Mg.

Claims (5)

  1. Pat entansprüche: 1. Antikörper gegen Reagin-Ig, verwendbar bei Radio -Immunountersuchungsmethoden zur Bestimmung von Reagin-Ig, gekennzeichnet durch eine Markierung, die sie zur Aussendung einer Strahlung befähigt.
  2. 2. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennseichnet, daß sie mit einem radioaktiven Isotop markiert sind.
  3. 3, Antikörper gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Isotop ein Jodisotop ist.
  4. 4. Antikörper geiäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Isotop Jod125 ist.
  5. 5. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert sind.
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