DE2602997A1 - Loesliches kollagen und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Loesliches kollagen und verfahren zu seiner herstellungInfo
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PATENTANWÄLTE
HENKEL, KERN, FEILER &HÄNZEL
TEIFX- ns 5Q sn? HMiTT η BAYERISCHE HYPOTHEKEN- JND
Telex. 05 29 802 HNKL D EDUARD-SCHMID-STRASSE 2 wechselbankMünchenni.3is· sin
TELEFON: (089) 663197, 663091 - 92 _ _„.„ ,,VV»T^„„ DRESDNER BANK MÜNCHEN 39 4975
TELEGRAMME=ELLIPSOIDMuNCHEN D-8000 MÜNCHEN 90 Postscheck: Münchens« w.
γ -ι
Warner-Lambert Company-Morris Plains, N.J., V.St.A.
J 2 7. JAN. 1976
UNSER ZEICHEN: Dr . F/πΙΙ MÜNCHEN, DEN
BETRIFFT:
Der primäre hämostatische Vorgang im Körper besteht in der Adsorption von Blutplättchen an durch eine Verwundung in
einem Blutgefäß freigelegtes Subendothelialkollagen. Unmittelbar anschließend kommt es zu einer massenhaften Ansammlung
von Blutplättchen um die Wunde herum. Hierbei entsteht ein Blut(plättchen)pfropfen, der einen (weiteren)
Blutaustritt verhindert und eine Matrix zur Blutgerinnselbildung liefert.
Es gibt einige pathologische Zustände, die die Ansammlung bzw. Aggregation von Blutplättchen beeinflussen. So kann
beispielsweise eine Abnahme in der Fähigkeit von Blutplättchen zum Zusammenballen bzw. zur Aggregation zu
Blutgerinnsel- und Blutungsstörungen führen. Andererseits kann eine erhöhte Zusammenball- bzw. Aggregationsneigung
von Blutplättchen eine unerwünschte Thrombusbildung in Gang setzen und möglicherweise zu Herzinfarkten
oder sonstigen intravaskulären Gerinnungs- bzw. Klümpchenbildungsproblemen führen.
-2-
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Um nun einen speziellen Blutungsfall diagnostizieren zu können bzw. um die Wahrscheinlichkeit weiterer Blutungsoder Gerinnungsprobleme abschätzen zu können, ist es erforderlich,
die Fähigkeit von Patientenblutplättchen zum Zusammenballen bzw. zur Aggregation zu ermitteln. Dies
erfolgt in der Regel in vitro durch Bestimmen des durch verschiedene Aggregationsmittel, wie Adenosindiphosphat,
Epinephrin oder Kollagen, hervorgerufenen Grades der Blutplättchenaggregation.
Eine solche Bestimmung wird in der Regel mittels eines Blutplättchenaggregometers durchgeführt.
Dieses Instrument mißt die Lichtmenge, die durch eine Probe plättchenreichen Plasmas, in dem eine Aggregation
abläuft, hindurchtritt.
Kollagen ist in der Regel das Mittel der Wahl zur Bestimmung der Aggregation, da dieses in vivo bereits bei dem
primären hämostatischen Vorgang mitwirkt. Da jedoch im Handel keine geeigneten Kollagenzubereitungen erhältlich
sind, stellen lediglich einige wenige klinische Laboratorien ihre eigenen Kollagenzubereitungen her.
Diese Zubereitungen stellen in der Regel eher Suspensionen als echte Lösungen dar, weswegen sie von Zubereitung
zu Zubereitung schlecht reproduzierbare Ergebnisse liefern. Darüber hinaus verlieren sie beim Trocknen ihre
Blutplättchenaktivität, so daß sie als Suspension bei 40C gelagert werden müssen. Alles in allem bemißt sich
also die Stabilität solcher Kollagenzubereitungen nur nach Tagen.
Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, aus unlöslichem Kollagen ein zur Aggregation von Blutplättchen
-3-
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fähiges lösliches Kollagen, insbesondere eine stabile, lyophilisierte Form eines löslichen Kollagens, bei welchem
nach dem Wiederauflösen in Wasser die Blutplättchenagglutinierfähigkeit
erhalten geblieben ist, anzugeben.
Durch die neue lösliche Kollagenzubereitung gemäß der Erfindung lassen sich die meisten bei unlöslichen Kollagensuspensionen
auftretenden Probleme und Schwierigkeiten vermeiden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen
:
Herstellungsverfahren:
1. Säurelösliche Kollagensuspension:
25 mg Achillessellenkollagen wurden über Nacht bei einer
Temperatur von 4°C in 25 ml O,522m-Essigsäure hydratisiert.
Dann wurde das erhaltene Gemisch in einen 50 ml fassenden Homogenisierbecher überführt und darin bei
einer Temperatur von 5° bis 80C 30 min lang mittels eines handelsüblichen Homogenisators bei einer Einstellung
von 80 homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde 15 min lang bei Raumtemperatur mit 2500 χ g zentrifugiert.
Wenn sich am Boden des Zentrifugenröhrchens kein Pfropfen gebildet hat, wird die Suspension 15 min lang
langsam gerührt und dann durch einen Glaswollepfropfen
filtriert. Wenn sich dagegen ein Pfropfen gebildet hatte, wurde die Suspension verworfen.
-4-
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2. Verdünnen der Kollagensuspension:
Die 1 mg Kollagen/ml enthaltende filtrierte Suspension wird
mit einer 0,2%igen wäßrigen Rinderserumalbuminlösung derart
verdünnt, daß eine Lösung mit 8 ug Kollagen/ml erhalten wird.
3. Lyophilisierung der Kollagenlösung:
Aliquote Teile von 1 ml der Kollagenlösung werden 30 h lang in geeigneten Phiolen lyophilisiert. Nach dem Lyophilisieren
werden die· Phiolen verschlossen und bei 4°C gelagert.
4. Wiederaufbereiten des lyophilisierten Kollagens:
Der Phioleninhalt wird mit 1 ml Wasser versetzt und dann 10 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Hierauf
wird das Ganze 10 see lang in einem Wirbelmischer mit mittlerer Geschwindigkeit durchgemischt. Die wiederaufbereitete
Lösung sollte bei einem pH-Wert von 3»0 bis 4,5, vorzugsweise von 3»8, gelagert werden.
Verfahren zur Herstellung von gepuffertem löslichen Kollagen:
1. Säurelösliche Kollagensuspension:
Vgl. Stufe 1 von Beispiel 1.
Vgl. Stufe 1 von Beispiel 1.
-5-
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2. Zubereitung eines OjOSm-Glycin/HCl-Puffers:
3,7535 g Glycin und 2,0 g Rinderserumalbumin werden in
900 ml destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,In-HCl auf einen pH-Wert von 3,0 bis 4,5,
vorzugsweise von 3,8, eingestellt und dann mit Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml aufgefüllt. Erforderlichenfalls
wird der pH-Wert der Pufferlösung erneut durch zusätzliche HCl eingestellt.
3. Lösen der Kollagensuspension:
Die 1,0 mg Kollagen/ml enthaltende filtrierte Suspension wird mit der Glycinpuffer/Rinderserumalbumin-Lösung auf
die gewünschte Kollagenkonzentration, vorzugsweise 8 ug/ml,
verdünnt.
4. Lyophilisieren der Kollagenlösung: Vgl. Stufe 3 von Beispiel 1.
5. Wiederaufbereiten des lyophilisierten Kollagens: vgl. Stufe 4 von Beispiel· 1.
Eine saure Kollagensuspensionszubereitung (2,5 mg/ml) wurde entsprechend Beispiel 1 zusammen mit bzw. ohne 7%
Rinderserumalbumin lyophilisiert. Lediglich die das Rinderserumalbumin enthaltende lyophilisierte Zubereitung
ließ sich wieder in Lösung bringen und zeigte in dieser Form eine vollständige Blutplättchenaggregation.
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Es handelte sich hierbei allerdings lediglich um kleine Aggregate, die kleine Ausschläge auf der Aggregometeraufzeichnung
liefern. Eine erwünschte Eigenschaft einer Kollagenzubereitung besteht jedoch in der Fähigkeit,
große Blutplättchenaggregate und große Aggregometerausschläge zu liefern (vgl. die in der Zeichnung dargestellte
Aggregometeraufzeichnung). Aus der Aggregometeraufzeichnung
geht hervor, daß bei einer 7%igen Rinderserumalbuminkonzentration
ein geringer inhibierender Effekt auf die Blutplättchenaggregation festzustellen ist.
Ferner wurden 1 bis 5So Rinderserumalbumin enthaltende lyophilisierte Zubereitungen mit Wasser bzw. O,522m-Essigsäure
wieder aufbereitet. Die mit Wasser wieder aufbereiteten Zubereitungen aggregierten die Blutplättchen
vollständig, die Ausschläge auf der Aggregometeraufzeichnung waren jedoch gering. Dies zeigt, daß eine Rinderserumalbuminkonzentration
von nur Λ% noch eine schwach inhibierende Wirkung auf die Blutplättchenaggregation
besitzt. Die mit Essigsäure wieder aufbereiteten Zubereitungen ballten die Blutplättchen nicht zusammen, was
auf eine weitere zusätzliche Inhibierung durch die Essigsäure hinweist. Glücklicherweise wurden bei der zusätzlich
zum Trocknen der Zubereitung durchgeführten-Lyophilisierung etwas Essigsäure entfernt und so die
Azidität der mit Wasser wieder aufbereiteten Proben auf einen pH-Wert von 2 bis 4 eingestellt. Dies führt zu
einem stärker aktiven Produkt. Die unerwartete Aziditätserniedrigung durch die Lyophilisierung (und nicht
durch eine Neutralisation mit Alkali) verhinderte ferner eine Zunahme der Ionenstärke und stellte dadurch eine
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vollständige Wiederauflösung des Kollagens in Wasser sicher.
Es wurden weitere 0,05 Ms 1,0% Rinderserumalbumin enthaltende
Kollagenzubereitungen lyophilisiert. Dies führt zu einem Blutplättchenaggregationsgrad, der in direkter
Beziehung zur prozentualen Lichtdurchlässigkeit steht (vgl. die folgende Tabelle I).
Die Tabelle I zeigt, daß die Aggregation durch Rinderserumalbuminkonzentrationen
bis zu 1% nicht merklich beeinträchtigt wird. Eine vollständige Lösung des Kollagens
ließ sich bereits mit 0,2% Rinderserumalbumin erreichen, weswegen diese Konzentration für die weiteren Untersuchungen
gewählt wurde.
Zur Bestimmung der für eine Blutplättchenaggregation erforderlichen
optimalen Kollagenmenge wurden verschiedene Mengen an einer wiederaufbereiteten Kollagenzubereitung
mit 0,2% Rinderserumalbumin zu an menschlichen Blutplättchen reichem Plasma zugesetzt. Es zeigte sich,
daß 10 ul, 20 ill und 50 al einer 2,5 mg/ml Suspension
eine vollständige Aggregation hervorriefen. Folglich wurden stärker verdünnte Kollagenlösungen zubereitet,
lyophilisiert und in Wasser wieder aufbereitet. Der durch 50 ul jeder dieser Zubereitungen hervorgerufene
Aggregationsgrad ist ebenfalls in Tabelle I angegeben.
Schließlich wurden noch weitere Verdünnungen einer 0,125 mg/ml enthaltenden wiederaufbereiteten Kollagenzubereitung mit
1% Rinder serumalbumin hergestellt. Auch hier sind die Werte in Tabelle I enthalten.
-8-
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Grad der durch sieben verschiedene Kollagenkonzentrationen hervorgerufenen Blutplättchenaggregation
| Kollagen ( | (D | mg/ml) | Rinderserumal- bumin (%) |
Plättchenaggregation (prozentuale Durch lässigkeit) |
| A | (2) | 0,25 | 0,05 | nicht wieder aufbe reitbar |
| B | (3) | 0,25 | 0,10 | |
| C | (4) | 0,25 | 0,20 | 87 |
| D | (5) | 0,25 | 1,0 | 84 |
| E | (6) | 0,125 | 0,05 | 85 |
| F | (7) | 0,125 | 0,10 | 77 |
| G | 0,125 | 0,20 | 76 | |
| H | 0,125 | 1,0 | 84 | |
| 0,0625 | 1,0 | 82- | ||
| 0,0313 | 1,0 | 78 | ||
| 0,0156 | 1,0 | 76 | ||
| 0,008 | 1,0 | 64 | ||
| 0,005 | 1,0 | 17 | ||
| 0,004 | 1,0 | 21 | ||
Eine vollständige Aggregation ließ sich entweder mit der 0,250 mg/ml- oder 0,125 mg/ml-Zubereitung erreichen. Bei
einer untersuchung der sechs Verdünnungsstufen (aus der Verdünnungsreihe der 0,125 mg/ml-Lösung in 1% Rinderserumalbumin)
im Hinblick auf ihre Blutplättchenaggregationsaktivität zeigte es sich, daß bei einer Kollagenkonzentration
von 8 ug/ml eine optimale, jedoch nicht maximale Blutplättchenaggregation erreicht wird. Unter
diesen Versuchsbedingungen entspricht die optimale Blut-
-9-
609835/1052
plättchenaggregation bei normalen, d.h, gesunden Patienten
einer etwa 60%igen Durchlässigkeit, die ohne weiteres einen Nachweis großer Abweichungen über dem und unter
dem Normalwert ermöglichen.
dem Normalwert ermöglichen.
Stabilitätsuntersuchungen zeigten, daß die löslichen Kollagenzubereitungen
gemäß der Erfindung bei Raumtemperatur mindestens 8 Monate lang, bei 450C bis zu zwei Wochen und
bei 4°C mindestens 9 Monate lang stabil bleiben. Die Stabilität nach der Wiederaufbereitung beträgt 3 h bei Raumtemperatur
.
Es ist bekannt, daß Acetylsalicylsäure und verschiedene
andere Chemikalien eine Blutplättchenaggregation inhibieren. Folglich wurde eine Untersuchung darüber angestellt, ob die 8 ug Kollagen/ml-Zubereitung zwischen einer normalen Blutplättchenaggregation und abnormalen Blutplättchen unterscheiden kann. Von drei Versuchspersonen wurden vor und nach Verabreichung von Acetylsalicylsäure an
Blutplättchen reiche Plasmas gewonnen und diese dann
auf die Blutplättchenaggregation hin untersucht.
andere Chemikalien eine Blutplättchenaggregation inhibieren. Folglich wurde eine Untersuchung darüber angestellt, ob die 8 ug Kollagen/ml-Zubereitung zwischen einer normalen Blutplättchenaggregation und abnormalen Blutplättchen unterscheiden kann. Von drei Versuchspersonen wurden vor und nach Verabreichung von Acetylsalicylsäure an
Blutplättchen reiche Plasmas gewonnen und diese dann
auf die Blutplättchenaggregation hin untersucht.
Die folgende Tabelle II zeigt, daß die lösliche Kollagenzubereitung
gemäß der Erfindung bei sämtlichen Proben
eine in-vivo-Acetylsalicylsäureinhibierung der Blutplättchenaggregation nachzuweisen vermochte.
eine in-vivo-Acetylsalicylsäureinhibierung der Blutplättchenaggregation nachzuweisen vermochte.
-10-
609135/1052
In-vivo-Effekt von Acetylsalicylsäure auf die Blutplätt-
chenaggregation
Versuchs- prozentuale Durchlässigkeit
person vor der Acetylsalicyl- nach der Acetylsalicylsäureverabreichung Säureverabreichung
person vor der Acetylsalicyl- nach der Acetylsalicylsäureverabreichung Säureverabreichung
1 62 24
2 55 13
3 62 20
-11-
609835/1052
Claims (16)
- Patentansprücheί I Zubereitlang aus saurem Kollagen und RinderserumaTbumin.
- 2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rinderserumalbuminkonzentration ausreicht, um eine Kollagenkonzentration von etwa 5 bis 1000 iig
pro ml zu gewährleisten. - 3. Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer sauren Kollagensuspension besteht, welcher so viel Rinderserumalbumin zugesetzt ist, daß eine Kollagenkonzentration von etwa 5 bis etwa 10 iig/ml sichergestellt ist.
- 4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension Essigsäure und Kollagen enthält.
- 5. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie lyophilisiert ist.
- 6. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kollagenkonzentration etwa 8 ug/ml beträgt.
- 7. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihr pH-Wert zwischen etwa 3,0 und etwa 4,5 liegt.
- 8. Verfahren zur Zubereitung einer Kollagensuspension,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Menge Kollagen bei einer Temperatur von 40C in einer be--12-609835/1052stimmten Menge Säure hydratisiert, das hydratisierte Material homogenisiert, das homogenisierte Material zentrifugiert, das zentrifugierte Material rührt, das gerührte Material filtriert und das filtrierte Material mit so viel Rinderserumalbumin verdünnt, daß die Kollagenkonzentration pro ml verdünnter Lösung etwa 5 bis etwa 1000 ug beträgt. - 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die verdünnte Lösung lyophilisiert.
- 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer 0,2%igen wäßrigen Rinderserumalbuminlösung verdünnt.
- 11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kollagenkonzentration pro ml verdünnter Lösung auf etwa 5 bis etwa 10 ug einstellt.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kollagenkonzentration pro ml verdünnter Lösung auf 8 ug einstellt.
- 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa O,522m-Essigsäure verwendet.
- 14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Material bei einer Temperatur von 5° bis 8°C homogenisiert.
- 15. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa bei Raumtemperatur etwa 15 min lang-13-609835/1052mit etwa 2500 χ g zentrifugiert.
- 16. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das filtrierte Material mit einem Glycin/ Rinderserumarbumin-Puffer eines pH-Werts von 3,0 bis .4,5 verdünnt.608835/1052/ff.Leerseite
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