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Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes und seine
Herstellung
Orale Antikoagulantien (Dikumarol und Dikumarol-Abkömmlinge, Phenylindandion und ähnliche Substanzen) bewirken eine Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Sie kommen in grossem Masse bei der Behandlung und Vorbeugung thrombotischer Geschehen zur Anwendung. Die Thromboseprophylaxe findet mehr und mehr bei arteriosklerotischen Leiden (Coronar-Infarkt, Angina pectoris, cerebrale und periphere arterielle Thrombosen) allgemeine Anwendung.
Eine wirkungsvolle Behandlung mit Antikoagulantien fordert eine regelmässige Überwachung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Es ist notwendig, die Dosierung individuell zu gestalten ; denn auf der einen Seite gilt es, Blutungs-Komplikationen, bedingt durch Überdosierung, zu meiden, auf der andern Seite ist die Behandlung bei zu kleinen Gaben wirkungslos.
Mit früher beschriebenen Kontrollmethoden war es nicht möglich, die Gerinnungsfähigkeit des Blutes in jedem Fall mit ausreichender Sicherheit individuell genug zu bestimmen, um die Schwierigkeiten bei der Dosierung zu lösen. Man benötigt daher dringend eine Bestimmungsmethode, die eine genaue Kontrolle möglich macht.
Aus folgender Darlegung der Erfindung geht hervor, wie das vorliegende Problem mit Hilfe eines besonderen, hiefür entwickelten Reagens in einer zufriedenstellenden Weise gelöst ist.
Um die Erfindung leichter verständlich zu machen, soll zunächst ein kurzer Überblick über den Wirkungsmechanismus der Antikoagulantien gegeben werden.
Die Blutgerinnung ist abhängig von zwei teilweise voneinander getrennten Gerinnungs-Systemen, dem externen und dem internen System. Die peroral applizierten Antikoagulantien bewirken eine Verminderung folgender Blutgerinnungsfaktoren ; Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und AntiHaemophilie-B-Faktor. Von diesen Faktoren sind das Prothrombin und der Stuart-Faktor an beiden Systemen beteiligt. Proconvertin ist nur im externen System, und der Anti-Haemophilie-B-Faktor nur im in- ternen System wirksam.
Dies zeigt das folgende Schema :
Systeme der Blutgerinnung
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<tb>
<tb> Das <SEP> "interne" <SEP> System <SEP> Das <SEP> "externe" <SEP> System <SEP>
<tb> ("Kephalin-Zeit") <SEP> ("Thromboplastin-Zeit") <SEP>
<tb> Blut-Plättchen-Faktor <SEP> 3 <SEP> ("Kephalin") <SEP> Gewebs-Thromboplastin <SEP>
<tb> Anti-Haemophilie-A-Faktor <SEP> (A. <SEP> H. <SEP> G.)
<tb> . <SEP> Anti-Haemophi1ie-B-Faktor <SEP> (P. <SEP> T. <SEP> C.) <SEP> Proconvertin
<tb> Anti-Haemophilie-C-Faktor <SEP> (P. <SEP> T. <SEP> A.)
<tb> "Hagema <SEP> n"-Faktor <SEP>
<tb> "Stuart"-Faktor
<tb> Prothrombin
<tb> Proaccelerin
<tb> Fibrinogen
<tb>
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Bisher gab es keine brauchbare Methode, die es ermöglichte, das völlige Ausmass der Verminderung der vier für den ganzen Gerinnungsprozess bedeutungsvollen Faktoren quantitativ zu erfassen, d. h.
sowohl im internen als auch im externen System. Die bisher gebräuchlichsten Methoden, nämlich die Quick'sche Methode und die sogenannte PP-Methode, zeigen nur Veränderungen im externen System an. Sie weisen daher, wenn sie zur Überwachung der Antikoagulantien-Behandlung verwendet werden, nur eine Verminderung von Proconvertin, Stuart-Faktor und Prothrombin nach. Eine Verminderung von Anti-HaemophilieB-Faktor wird durch die Quick'sche Methode überhaupt nicht und mit der PP-Methode nur zu einem sehr geringen Masse erfasst.
Die beigefügte Fig. 1 zeigt die Empfindlichkeit der drei diskutierten Methoden gegenüber abfallenden Mengen von Anti-Haemophilie-B-Faktor. Die "Konzentration" des Anti-Haemophilie-B-Faktors im Vergleich zu den übrigen Faktoren ist in Prozent der Norm auf der Abszisse abgetragen. Die Gerinnungszeit ist in Sekunden (20-160 Sekunden) auf der Ordinate abgetragen.
Die Untersuchung wurde durch Mischen von Anti-Haemophilie-B-Plasma mit Normal-Plasma in verschiedenen Mengenverhältnissen ausgeführt.
Kurve A zeigt die Empfindlichkeit der neuen Methode auf die Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors.
Kurve B zeigt die Empfindlichkeit der PP-Methode und Kurve C die der Quick'schen Methode auf Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors.
Die in den Kurven dargestellten Unterschiede lassen sich dadurch erklären, dass bei der PP-Methode und der der Quick'sehen Methode dem Plasma oder Blut ein sehr aktives Gewebsthromboplastin zugeführt wird.
Bei der Quick'schen Methode verwendet man ein Kaninchenhirn-Extrakt und bei der PP-Methode ein Menschenhirn-Extrakt. Diese sehr aktiven Gewebsthromboplastine bewirken, dass ausschliesslich eine Gerinnung über das äussere System abläuft, da sich der Gerinnungsvorgang hiebei sehr schnell vollzieht, lange bevor das interne System voll aktiviert ist. Daher beträgt die normale Gerinnungszeit von Plasma nach Zugabe von aktivem Thromboplastin, wie bei der Quick'schen Methode, nur 12 - 13 Sekunden.
Das interne System braucht dagegen sogar nach Zufügung der optimalen Menge von Kephalin mindestens 50 Sekunden zur Bildung von Thrombin, das in einem weiteren Schritt Fibrinogen zur Gerinnung bringt. Die Hinzufügung von derartig aktivem Thromboplastin umgeht das interne System völlig. Die Quick'sche Methode der Gerinnungszeit (auch"Prothrombin-Zeit"oder"Thromboplastin-Zeit"genannt) weist demnach sogar bei völligem Fehlen des Anti-Haemophilie-B-Faktors ganz normale Werte auf (vgl. Fig. 1).
Es soll auch darauf hingewiesen werden, dass es Methoden zur Kontrolle des internen Systems gibt, die Kephalin an Stelle von Thromboplastin verwenden. Diese Methoden können je nach ihrer Art für die Bestimmung der verschiedenen Anti-Haemophilie-Faktoren verwendet werden. Methoden dieser Art wurden jedoch aus zwei Gründen nie zur Überwachung der Antikoagulantien-Therapie benutzt. Erstens sind solche "Kephalin-Zeiten" sehr empfindlich gegenüber einer Reihe äusserer Einflüsse. Zweitens sprechen sie überhaupt nicht auf Veränderungen im externen Gerinnungssystem an, wobei insbesondere Schwankungen in der Proconvertin-Konzentration sehr bedeutungsvoll sein können.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode dar, die es dem praktischen Arzt möglich macht, in einem Untersuchungsgang gleichzeitig die Gerinnungsfähigkeit des Blutes im internen und externen System zu bestimmen. Mit Hilfe des neuen Reagens wird der Gerinnungsablauf im internen und externen System gleichzeitig in Gang gesetzt, u. zw. in der Art, dass sie annähernd mit der gleichen Geschwindigkeit ablaufen. Hiedurch wird erreicht, dass beide Systeme annähernd gleichen Einfluss auf die Gerinnungszeit des Bestimmungssystems ausüben.
Frühere Methoden zur Überwachung der Antikoagulantien-Therapie
Hauptsächlich zwei Methoden wurden bisher, wie bereits berichtet, zur Überwachung der Anti- koagulantien-Therapie verwendet :
1. Die Quick'sche Methode,
2. Die PP-Methode.
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Die Quick'sche Methode war ursprünglich als Methode zur Bestimmung des Prothrombins im Blut eingeführt worden. Das Proconvertin, der Stuart-Faktor und das Proaccelerin waren zu der Zeit noch unbekannt. Bei dieser Methode werden die Konzentrationen von Calcium und Thromboplastin konstant gehalten.
Diese Methode wurde geringfügigen Veränderungen unterzogen. Die letzte ausführliche Beschreibung ist folgende : Quick, A. J. Hemoorrhagic Diseases, Lea and Fibinger, Philadelphia [1957], pp. 379-387.
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2. Calciumchlorid-Lösung 0,01 M.
Bestimmung : 0, 1 ml Oxalat-Plasma wird mit 0, 1 ml Thromboplastin-Lösung versetzt und im Wasserbad bei 370C gehalten. Nach Zufügung von 0, 1 ml einer 0,01 M Calciumchlorid-Lösung wird die Gerinnungszeit bzw."Thromboplastin-Zeit" (auch"Quick* sehe Prothrombin-Zeit"genannt) bestimmt.
Beurteilung : Die Methode erfasst nur das externe Gerinnungssystem (s. Schema auf Seite 1). Wie bereits dargelegt, ist das interne Gerinnungssystem ohne Einfluss auf diese Bestimmung.
Nur das Thromboplastin und Calcium werden bei der Quick'schen Methode konstant gehalten. Die Veränderung irgendeines der übrigen Faktoren im externen System, Prothrombin, Proconvertin, StuartFaktor, Proaccelerin und Fibrinogen, würde demnach die beschriebene Quick'sche "ThromboplastinZeit" beeinflussen können. Man nimmt an, dass während einer Behandlung mit Antikoagulantien Proaccelerin und Fibrinogen weitgehend konstant bleiben. Jede Verlängerung der Quick'schen "Thrombo- plastin-Zeit"wird so auf eine Verminderung des Proconvertins, Stuart-Faktors und/oder Prothrombins, zurückzuführen sein. Auf der andern Seite wird eine Verminderung des Ahti-Haemophilie-B-Faktors mit dieser Methode überhaupt nicht erfasst. Bei der Haemophilie B ist die Quick'sche "Thromboplastin-Zeit" normal (s. Fig. 1).
Wird diese Methode daher zur Kontrolle bei der Dosierung im Verlaufe einer Antikoagulantien-Therapie verwendet, so besteht die Gefahr einer Blutungskomplikation infolge einer besonders starken Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors, da solch eine Veränderung mit Hilfe dieser Methode nicht nachgewiesen werden kann. Bei dem quantitativen Nachweis der verschiedenen beteiligten Faktoren in spezifischen Bestimmungssystemen wurde gefunden, dass der Anti-Haemophilie-B-Faktor oft bedeutend stärker vermindert ist als alle übrigen Faktoren. Dies kann man aus der beigefügten Fig. 2 ersehen. Diese Ergebnisse gelten für Phenylindandion, aber Dikumarol und DikumaroI-Abkömmlinge haben grundsätzlich den gleichen Effekt.
Auf der Abszisse bedeuten die Zahlen 8 - 30 das Datum im März 1957, als diese Untersuchungen ausgeführt wurden. Die Untersuchungen wurden am 2. April 1957 abgeschlossen.
Auf der Ordinate ist der Prozentgehalt (dieser versteht sich nicht absolut, 100% bedeutet : normale "Konzentration" an Prothrombin, Proconvertin und Anti-Haemophilie-B-Faktor), der an den betreffenden Tagen im Blut gefunden wurde, abgetragen.
Kurve D zeigt den Prozentgehalt an Prothrombin im Blut, Kurve E zeigt den Prozentgehalt an Proconvertin und Kurve F den Prozentgehalt an Anti-Haemophilie-B-Faktor.
Wie hieraus hervorgeht, war der Spiegel der drei erwähnten Faktoren bei Beginn der Untersuchung annähernd 100%. Am 9. März 1957 wurde mit der Gabe des Antikoagulans Phenylindandion begonnen.
Die tägliche Dosis ist im oberen Anteil der Figuren aufgezeichnet. Die vertikale Linie zur Linken dieses Anteiles bedeutet 100 mg Phenylindandion. Die Grösse jeder Tagesdosis erscheint, auf der vertikalen Linie herab abgetragen, in Höhe des betreffenden auf der Abszisse verzeichneten Datums. Am 25. März wurde mit der Verabreichung des Antikoagulans aufgehört. Der Prozentgehalt der Faktoren stieg daraufhin schnell an.
Man ist der Ansicht, dass die Tatsache, dass die Quick'sche Methode unempfindlich gegenüber einer Verminderung an Anti-Haemophilie-B-Faktor ist, eine der Ursachen für die relativ häufigen Blutungskomplikationen, wenn die Quick'sche Methode als Kontrolle für die Antikoagulantien-Therapie benutzt wird, ist.
Unter andern Nachteilen dieser Methode möge noch hervorgehoben werden, dass sie unempfindlich gegenüber Veränderungen aller drei beteiligten Faktoren, sofern diese sich. im Bereich von 50 bis 100% des Normalen bewegen, ist. Ferner ist die verwendete Calcium-Konzentration, wenn der HämatokritWert des Blutes nicht normal ist, nicht optimal. Ausserdem ist die"Thromboplastin-Zeit"durch die Proaccelerin-Konzentration im Testplasma beeinflusst. Das Proaccelerin ist unstabil und wird während der Lagerung von Oxalatplasma inaktiviert. Aus diesem Grunde werden für diese Methode relativ frische Blutproben benötigt.
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:Invest. 3 [1951], S. 201-208.
Reagentien :
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: wässeriger Menschenhirn-Extrakt.Ausführung : 0,2 ml absorbiertes Rinderplasma werden mit 0,2 ml Thromboplastin-Suspension und 0, 2 ml einer 1 : 10 Verdünnung des Testplasmas versetzt. Dieses Inkubationsgemisch wird im Wasserbad bei 370C gehalten. Nach Zufügung von 0,2 ml Calciumchlorid-Lösung wird die Gerinnungszeit gemessen.
Beurteilung : Wie im Falle der Quick'schen Methode ist die PP-Methode eine Bestimmung der Thromboplastin-Zeit, d. h. sie ist in erster Linie eine Methode zur Bestimmung der Aktivität im externen Gerinnungssystem. Die hauptsächlichen Unterschiede zwischen der PP-Methode und der Quick'schen Methode sind folgende :
1. Zur Stabilisierung der Proaccelerin-und Fibrinogen-Konzentrationen wird ein neues Reagens, das absorbierte Rinderplasma, eingeführt. Die Bestimmung ist daher unabhängig von der Konzentration dieser Faktoren im Testplasma. Da die Faktoren, die im Verlaufe einer Antikoagulantien-Behandlung vermindert werden, während der Lagerung von Blut oder Plasma relativ stabil sind, kann diese Methode auch bei gelagerten Blutproben zur Anwendung kommen.
2. Kommt eine Verdünnung des Testplasmas im Verhältnis 1 : 10 zur Anwendung. Dies erhöht die Empfindlichkeit der Methode, besonders im Bereich zwischen 50 und 100%. Die Verdünnung des Testplasmas hat ausserdem den Vorteil, dass bei unterschiedlichen Hämatokrit-Werten das Risiko einer inoptimalen Calcium-Konzentration weit geringer als bei der Quick'schen Methode ist. Das Verdünnen eliminiert auch noch die Einwirkung kleiner Heparinmengen auf das Testplasma.
Wie die Quick'sche Methode, so ist auch die PP-Methode empfindlich gegenüber Verminderungen des Prothrombins, des Stuart-Faktors und des Proconvertins (Gonyea, L. M. Hjort, P., Owren, P. A. : The Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 48 [1. 956], S. 624-633).
Das in der PP-Methode verwendete Thromboplastin (wässeriger Menschenhirn-Extrakt) abt zusätzlich zu seinem thromboplastischen Effekt einen Kephalineffekt auf das interne Gerinnungssystem aus. Dieser Effekt ist jedoch nicht optimal. Als Folge dieses Kephalineffektes und der Testplasma-Verdünnung kann man nachweisen, dass die PP-Methode eine gewisse, wenn auch ausserordentlich geringe Empfindlichkeit gegenüber einer starken Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors, falls das äussere Gerinnungssystem bereits weitgehend im Verlaufe einer Antikoagulantien-Behandlung gestört ist, besitzt (s. Fig. 1).
(Waaler, B. A. Scand. J. clin. Lab. Invest. 9 [1957], S. 322-330.) Diese Empfindlichkeit der PP-Methode auf Verminderungen an Anti-Haemophilie-B-Faktor ist, vom Standpunkt der klinischen Praxis aus gesehen, bei weitem zu gering, als dass sie einen sicheren Schutz gegen Blutungskomplikationen infolge starker Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors bieten könnte.
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getrockneter Form und andere in lyophilisierter Form. Testplasma-Verdünnungen mit der Absicht, die Empfindlichkeit der Methode besonders im Bereich von 50 bis 100% zu erhöhen, kamen ebenfalls zur Anwendung. Die Änderung der Calcium-Konzentration in bezug auf den Hämatokrit-Wert des Blutes wurde auch schon empfohlen, um eine optimale Rekalzifizierung zu sichern.
Jedoch hat keine dieser Modifikationen das Prinzip der Methode geändert, und keine vermochte es, die fehlende Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors zu beheben.
Die Reagentien für die PP-Methode-das absorbierte Rinderplasma und die Thromboplastin-Suspensionen - wurden auch in lyophilisierter Form hergestellt. Diese Änderung übte natürlich keinen Einfluss auf die fehlende Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Verminderung des Anti-Haemophilie- B-Faktors.
Methode zur Überwachung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während der Antikoagulantien-Therapie
Aus obiger Beschreibung geht hervor, dass keines der bisher zur Verfügung stehenden Hilfsmittel eine zufriedenstellende Kontrolle bei der Antikoagulantien-Therapie darstellt.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung beschrieben : Ein Präparat, das eine zufriedenstellende Kontrolle dieser Therapie erlaubt.
Dieser Vorgang basiert auf einem gänzlich neuen Prinzip, u. zw. : dass die Bestimmung der Aktivität im internen und externen Gerinnungssystem gleichzeitig und kombiniert durchgeführt wird. Bisher gab es keine Methode für solch eine kombinierte Bestimmung. Die beiden Gerinnungssysteme wurden immer getrennt untersucht. Die Methode basiert auf einem Reagens, das beide Gerinnungssysteme gleichzeitig und derart in Gang setzt, dass beide nahezu die gleiche Zeit gebrauchen. Um diese Bedingung zu erfüllen, wurden dem internen Gerinnungssystem optimale Bedingungen für grösste Geschwindigkeit gegeben, indem Kephalin aus Menschenhirn oder andere Kephaline, welche die gleiche Aktivität besitzen, dem
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Reagens in optimaler Konzentration zugesetzt wurden.
Unter diesen Bedingungen wird das interne Gerinnungssystem allein in ungefähr 50 Sekunden zur vollständigen Gerinnung führen.
Gleichzeitig enthält das Reagens ein Thromboplastin, das das externe Gerinnungssystem in Gang setzt. Dieses Thromboplastin ist solcher Natur, dass es in optimaler Konzentration eine geringe und konstante Aktivität besitzt. Das hat zur Folge, dass die Geschwindigkeit im externen Gerinnungssystem im Vergleich zu der normalen Geschwindigkeit aktiver Thromboplastin-Arten, wie sie bei der Quick'schen und PP-Methode zur Anwendung kommen, bedeutend herabgesetzt ist. Das Thromboplastin, das bei dieser Methode zur Anwendung kommt, soll in optimaler Konzentration bei der Verwendung von normalem Plasma eine Thromooplastin-Zeit von 35 bis 50 Sekunden geben.
Theoretisch könnte ein solch schwaches Thromboplastin durch Verdünnung eines aktiven Thromboplastins (derart, wie es für die Quick'sche und PP-Methode verwendet wird) erhalten werden. Bei solchem Vorgehen erhält man jedoch ein labiles und praktisch unbrauchbares Reagens, da kleine Änderungen in seiner Aktivität beträchtliche Schwankungen in der Zeitmessung verursachen. In unserem Reagens kommt daher ein Thromboplastin zur Anwendung, das eine stabile und niedrigere Aktivität bei optimaler Konzentration aufweist und einen relativ weiten Bereich optimaler Konzentrationen besitzt.
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines solchen Thromboplastins werden Organe gewisser Tierarten verwendet. Das hergestellte Thromboplastin ist artspezifisch und reagiert nur langsam mit menschlichem Proconvertin. Thromboplastin, hergestellt aus Rinder-, Schweine- und Pferdehirn, haben dieses Charakteristikum.
Diese Kombinationen in einem Reagens : Ein Thromboplastin mit schwacher Aktivität gegenüber Menschenplasma, zusammen mit einem menschlichen Kephalin (oder Kephalin-Substituenten), beide in optimaler Konzentration, zu mischen, hat zur Folge, dass das interne und externe Gerinnungssystem nahezu gleichen Einfluss auf die Gerinnungszeit ausüben. Daher ist diese Methode sowohl empfindlich gegenüber einer Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors im internen System, als auch gegenüber einer Verminderung des Proconvertins im externen System. Ausserdem zeigen natürlich der Stuart-Faktor und das Prothrombin, die in beiden Systemen eingreifen, ihre Wirkung.
Fig. 1 zeigt die deutliche Empfindlichkeit dieser Methode gegenüber einer grossen Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors, im Gegensatz zu der sehr mangelhaften Empfindlichkeit der Quick'sehen Methode und der sehr schwachen Empfindlichkeit der PP-Methode. Hieraus folgt, dass die prinzipiellen Unzulänglichkeiten der bisher gebräuchlichen Methoden und Reagentien in allen wesentlichen Punkten abgeschafft wurden.
'Die Erfindung basiert fernerhin auf der Erkenntnis, dass die bestimmten Gerinnungszeiten unabhängig von Veränderungen aller der Gerinnungsfaktoren, die bei der Antikoagulantien-Behandlung nicht betroffen werden, sein sollen. Dem wird Rechnung getragen, indem alle diese Faktoren in hoher und konstanter Menge in das Reagens einbezogen werden. Hiezu wird ein sorgfältig absorbiertes Ochsenplasma, ähnlich
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und Proaccelerin und Fibrinogen (die auf beide Systeme einwirken). Ferner ist es derart aufbereitet, dass es keine nachweisbaren Mengen an Proconvertin, Anti-Haemophilie-B-Faktor, Stuart-Faktor und Prothrombin (gerade die vier während der Antikoagulantien-Behandlung verminderten Faktoren) enthält.
Daraus folgt, dass das Reagens spezifisch für und empfindlich gegenüber all den vier während einer Antikoagulantien-Behandlung verminderten Faktoren ist. Gleichzeitig wird es durch Veränderungen anderer Gerinnungsfaktoren nicht beeinflusst. Die durch diese Methode erzielten Gerinnungszeiten stellen daher einen der vollständigen Wirkung der Antikoagulantien auf die Blutgerinnung entsprechenden Index dar. Der entscheidende Unterschied gegenüber früheren Methoden ist, wie bereits beschrieben, die Empfindlichkeit der neuen Methode gegenüber einer Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors.
Zusammensetzung des Reagens : Das neue Reagens hat die folgende Zusammensetzung :
1. Thromboplastin. Dieses Thromboplastin hat in optimaler Konzentration eine niedrige Aktivität und zeigt mit Normalplasma eine Thromboplastin-Zeit von 35 bis 50 Sekunden. Dieses Thromboplastin wird aus tierischen Organen, die auf Grund ihrer Art-Spezifität nur langsam mit menschlichem Proconvertin reagieren, hergestellt. Beispiele sind : Rinder-, Pferde- und Schweinehirn.
2. Kephalin. Dieses Kephalin ist dadurch charakterisiert, dass es mit menschlichem Plasma intensiv reagiert. Es kann aus Menschenhirn hergestellt werden. Auch andere Kephalin-Lezithin-Präparate, die intensiv mit menschlichem Plasma reagieren, können verwendet werden, z. B. ein Kephalinpräparat von Soyabohnen (das im Handel erhältliche Asolectin von der Associated Concentrates Inc., 57-01, 32nd Avenue, Woodside, New York).
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3. Absorbiertes Ochsenplasma. Dieses wird in der Art hergestellt, dass es eine hohe und gleichbleibende Menge all der Gerinnungsfaktoren, die durch die Antikoagulantien-Behandlung nicht verändert werden, enthält, während es gleichzeitig frei von den folgenden vier Faktoren, Prothrombin, StuartFaktor, Proconvertin und Anti-Haemophilie-B-Faktor, ist.
4. Calciumchlorid. Calciumchlorid ist dem Reagens in einer Menge zugesetzt, die nach Zuftigung des Testplasmas eine optimale Konzentration für die Gerinnung bietet.
All die vier aufgeführten Anteile werden in einem Reagens vereinigt. Dieses Reagens ist so stabil, dass es sogar in Lösung nach 24 Stunden Lagerung bei Zimmertemperatur unveränderte Aktivität zeigt.
Diese Stabilität wird unter anderem dadurch erzielt, dass es gelang, die obenerwähnten vier Gerinnungsfaktoren völlig zu eliminieren. Natürlich war es früher möglich, Thromboplastin und Calcium in einem Reagens zu vereinigen. Jedoch war es nicht möglich, nach Zusatz von Calcium zu einem absorbierten Plasma in oder ohne Gegenwart von Thromboplastin dieses als ein stabiles Reagens zu erhalten.
Dieses "Alles in Einem"-Reagens wird ampulliert in lyophilisierter Form zur Verteilung gebracht.
Die Untersuchungen zeigten eindeutig die optimalen Bedingungen für die Stabilität des getrockneten Präparates, insbesondere in bezug auf die Ionenstärke, die Konzentration der Antikoagulantien usw.
Das lyophilisierte Reagens wird für die Kapillarmethode oder die Venenblutmethode in destilliertem Wasser bzw. einer Calciumchlorid-Lösung gelöst.
Stabilität : Nach Lagerung der Ampullen über 30 Tage bei 470C zeigte das Reagens unveränderte Aktivität.
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Reagens beschrieben.
Thromboplastin : Wir verwendeten Rinderhirn, da wir, wie wir schon oben beschrieben haben, zeigten, dass Rinderhirn-Thromboplastin träge mit menschlichem Proconvertin auf Grund seiner Artspezifität reagiert. Rinderhirn-Extrakt gibt in optimaler Konzentration mit normalem menschlichem Plasma eine Thromboplastin-Zeit von annähernd 35 Sekunden. Es wird in der gleichen Weise wie das MenschenhirnThromboplastin aufbereitet (Owren, P. A. : J. clin. Lab. Invest. 1 [1949], S. 81).
"Rohe" Kephalin-Suspension : Diese wird entsprechend der von unserem Laboratorium veröffentlichten Methode aus Menschenhirn hergestellt (Hjort, P., Rapaport, S. I. and Owren, P. A. : Lab. clin.
Medicine, 46 1955, S. 89-97).
Die Menge an Thromboplastin und Kephalin (oder Kephalin-Substituenten) ist derart abgestimmt, dass ihre Konzentration im endgültigen Reagens optimal ist.
Absorbiertes Ochsenplasma: Ochsenplasma :
1. Blut und Plasma werden so behandelt, dass das absorbierte Plasma neben dem Anti-HaemophilieA-Faktor, Proaccelerin und Fibrinogen eine hohe Konzentration an Anti-Haemophilie-C-Faktor in nicht aktivierter Form enthält. Das Entscheidende dieses Umstandes hat man früher nicht verstanden.
2. Absorption wird mit Barium-Sulfat ausgeführt, u. zw. in solcher Menge und durch wiederholte Absorption, dass das Substrat völlig frei von Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Anti-Haemophilie-B-Faktor ist.
3. Zur vollständigen Entfernung des suspendierten Barium-Sulfates wird ausserordentlich sorgfältig zentrifugiert.
4. Als neues Prinzip kommt die Dialyse bei der Aufbereitung dieses Reagens zur Anwendung, um folgendes zu erreichen : a) Entfernung des plasmatischen Kohlensäure-Bikarbonat-Puffersystems. Dies ist für eine genaue Einstellung und Stabilisierung des pH in dem endgültigen, getrockneten Präparat nötig. b) Entfernung des Oxalates. Dies ist nötig 1. für die Stabilität des Proaccelerins, 2. um das Ausfallen des Calcium-Oxalates mit der damit verknüpften Absorption von Gerinnungsfaktoren während der Ausführung des Tests zu verhindern, und 3. um die Verwendung von Citrat-Testplasma während der Bestimmungen zu erlauben.
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optimales und stabiles PH nach der Wiederauflösung des getrockneten Präparates zu erzielen.
Dies hat entscheidenden Einfluss auf die bleibende Qualität des Reagens und auf die Löslichkeit des Fibrinogens bei . der Wiederauflösung.
Thromboplastin, Kephalin (oder Kephalin-Substituent) und Calcium werden dem absorbierten Ochsenplasma in einer für den im Test ablaufenden Gerinnungsprozess optimalen Konzentration zugesetzt.
Das so erhaltene Präparat wird gefriergetrocknet.
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Gebrauchsanweisung :
Bei der Verwendung unseres Präparates zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes verfährt man auf folgende Weise :
Nach Auflösung des Reagens in destilliertem Wasser oder einer Calciumchlorid-Lösung (s. oben) werden 0,5 ml davon mit Hilfe einer Pipette in kleine Teströhrchen (Durchmesser 8-9 mm, Länge 60 mm) überführt. Eine abgemessene Menge des zu untersuchenden Plasmas oder Blutes (s. unten) wird hinzugefügt und die Gerinnungszeit mit einer Stoppuhr gemessen. Die erhaltene Zeit bringt die Einwirkung der Antikoagulantien-Behandlung auf den Gerinnungsprozess zum Ausdruck. Die Bestimmung wird in einem Wasserbad bei 37 C ausgeführt.
Die erhaltene Gerinnungszeit wird auf die in Prozenten ausgedrückte relative Aktivität an Hand einer Korrelationskurve übertragen. Beispiele für Korrelationskurven sind in der beigefügten Fig. 3 gegeben. Diese Korrelationskurven zeigen das Verhältnis der erzielten Gerinnungszeit in den zwei Systemen zur Gerinnungsaktivität in Prozent.
Auf doppelt-logarithmischem Papier wird die Konzentration des Normalplasmas in Prozent auf der Abszisse und die Gerinnungszeit in Sekunden auf der Ordinate abgetragen. Die Kurve K zeigt die Kapillarblutmethode, die eine Menge von 0, 10 ml gebraucht. Kurve H zeigt die Methode, die für Citrat Vollblut, Menge 0, 10 ml, und für Citrat Plasma in folgender Verdünnung : 3 Teile Plasma zu 2 Teilen physiologischer Kochsalzlösung, Menge 0, 10 ml. Die Kurve G zeigt die Methode für Citrat Plasma in Verdünnung 1 : 5 und mit einer Plasmamenge von 0,20 ml.
Die Methode kann sowohl für Kapillarblut (Vollblut), das keinen Zusatz an Antikoagulantien enthält, als auch für Citratblut oder Citrat Plasma verwendet werden. Das Reagens ist mit einer optimalen Calcium-Konzentration für Kapillarblut versehen und kann daher nicht ohne weiteres für Citratblut oder Citratplasma, da die Calciumkonzentration hiefür nicht optimal ist, verwendet werden.
Bei Verwendung von Citratblut oder Citratplasma muss daher das getrocknete Reagens mit einer 3, 2 mM Calciumchlorid-Lösung. die die in der zu testenden Blutprobe befindliche Citratmenge kompensiert, aufgelöst werden.
1. Kapillarblut. In die Fingerbeere oder das Ohrläppchen wird ein Hautschnitt gelegt, der ausreichenden Blutaustritt gewährleistet. 0, 10 ml des Vollblutes werden in eine Pipette aufgezogen und sofort mit 0,5 ml des Reagens, das bereits bei 370C in einem Wasserbad aufbewahrt wurde, gemischt. Die Gerinnungszeit wird daraufhin bestimmt.
2. Citratblut. Venenblut wird mit 3, 13%piger Natrium-Citrat-Dihydratlösung (im Verhältnis 1 Teil Natrium-Citrat-Lösung zu 9 Teilen Blut) versetzt. Beispiel : 0,2 ml Natrium-Citrat-Lösung wird in eine 2 ml Spritze aufgezogen. Aus einer Venenpunktion wird dann die Spritze bis zur Menge von 2 ml mit Blut aufgefüllt. Die Blutprobe wird dann in ein Teströhrchen gefüllt, 0, 10 ml Citratblut werden mit Hilfe einer Pipette entfernt und mit 0,5 ml Reagens vermischt. Die Gerinnungszeit wird in der oben beschriebenen Weise bestimmt.
3. Citratplasma. Citratblut wird in der gleichen Weise wie unter Punkt 2 abgenommen. Nach dem Zentrifugieren werden 0,6 ml Citratplasma in ein Teströhrchen überführt, 0,4 ml physiologische Kochsalzlösung hinzugefugt und beides gemischt. Mit Hilfe einer Pipette werden 0, 10 ml des verdünnten Plasmas entfernt und sofort mit 0,5 ml des Reagens vermischt. Die Gerinnungszeit wird in der oben angegebenen Weise bestimmt.
Das neue"Alles in Einem"-Reagens stellt eine neue Erfindung dar, die es möglich macht, eine kombinierte Bestimmung der Gerinnungsaktivität sowohl des internen als auch des externen Gerinnungssystems auszuführen.
Die Herstellung des Reagens beruht auf bisher noch nicht angewandten Grundsätzen. Das Reagens zeigt im Vergleich zu früheren Reagentien eine Anzahl von Vorteilen : 1. ist es sehr stabil bei Zimmertemperatur und vereinfacht so die Verteilung und Lagerung ; 2. hält es eine Erhitzung bis zu 470C für mindestens 30 Tage aus und kann daher auch in tropischen Regionen verwendet werden ; 3. erweist sich, da man nur ein Reagens benötigt, die Herstellung als vereinfacht, und die Ausführung des Tests geht schneller vor sich als bei früheren Methoden ; 4. stellt die Methode die einzige bisher bekannte Methode dar, die einen durch orale Antikoagulantien hervorgerufenen Gerinnungsdefekt in genügend sicherer Weise erkennen lässt.
Im Gegensatz zu früheren Methoden zeigt diese sich gegenüber einer Verminderung des Anti-Haemophilie-B-Faktors empfindlich ; 5. infolge der oben beschriebenen Besonderheiten gewährt diese Methode einen weit grösseren Schutz gegenüber Blutungskomplikationen als andere Methoden ; 6. ist diese Methode zeitsparend ; 7. zeigt sie auf Grund der Stabilität des Reagens in wiederaufgelöster Form verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse.