JPH03191789A - 百日咳菌からの６９０００ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法 - Google Patents
百日咳菌からの６９０００ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、バクテリアの百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外膜から約６９．０００
ダルトンの見掛けの分子量を有するタンパク質を抽出お
よび精製する方法に関する。
ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外膜から約６９．０００
ダルトンの見掛けの分子量を有するタンパク質を抽出お
よび精製する方法に関する。
そのように抽出および精製されたタンパク質は、細胞を
含まない百日咳のワクチンの成分として利用することが
できる。
含まない百日咳のワクチンの成分として利用することが
できる。
本発明は、要約すれば、次の通りである：バクテリアの
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）の外膜から約６９，０００ダルトンの見掛けの分子
量を有するタンパク質を抽出および精製する方法が提供
される。この方法は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞を静菌剤で不活性化し、
反復して抽出し、そして抽出物を６９．０００ダルトン
タンパク質を色素配位子のクロマトグラフィーおよび引
き続（クロマトフオーカシングにより精製することを包
含する。この方法は６９．０００ダルトンのタンパク質
の改良された収率および安定性を生ずる。
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）の外膜から約６９，０００ダルトンの見掛けの分子
量を有するタンパク質を抽出および精製する方法が提供
される。この方法は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞を静菌剤で不活性化し、
反復して抽出し、そして抽出物を６９．０００ダルトン
タンパク質を色素配位子のクロマトグラフィーおよび引
き続（クロマトフオーカシングにより精製することを包
含する。この方法は６９．０００ダルトンのタンパク質
の改良された収率および安定性を生ずる。
バクテリアの百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ）は、百日咳として知られている重大な感染
症の原因となる因子である。乳児および子供を免疫化す
るために使用されるワクチンは、化学的因子または熱に
より不活性化された百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）の全細胞から構成されている。全細胞のワクチンは保
護の免疫性を誘発するために必要な抗原性成分を含有す
るが、それらは、また、保護に無関係な物質を含有し、
そして多分免疫化の望ましくない副作用に関係すること
がある。
ｕｓｓｉｓ）は、百日咳として知られている重大な感染
症の原因となる因子である。乳児および子供を免疫化す
るために使用されるワクチンは、化学的因子または熱に
より不活性化された百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）の全細胞から構成されている。全細胞のワクチンは保
護の免疫性を誘発するために必要な抗原性成分を含有す
るが、それらは、また、保護に無関係な物質を含有し、
そして多分免疫化の望ましくない副作用に関係すること
がある。
全細胞ワクチンを使用する免疫化の望ましくない副作用
を最小とする努力において、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）の病原性機構は、保護の免疫性にどの抗原性
成分が寄与するかを決定するために研究されてきている
。こうして、そのように同定された特定の抗原は、免疫
化において無関係の可能な物質を導入しないで、病気に
対する免疫性を付与する細胞を含まないワクチン中に含
むことができるであろう。ある数の抗原は、細胞を含ま
ないワクチン成分として提案されてきており、それらの
例は次の通りである：リンパ球促進因子（ＬＰＦ；また
、ヒスタミン感作因子、小島活性化タンパク質、および
百日咳トキシン）、フィラメント状赤血球凝集素（ＦＨ
Ａ） 、およびふさ状凝集原［ウニイス（Ｗｅ ｓ ｓ
） 、Ａ、Ａ。
を最小とする努力において、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）の病原性機構は、保護の免疫性にどの抗原性
成分が寄与するかを決定するために研究されてきている
。こうして、そのように同定された特定の抗原は、免疫
化において無関係の可能な物質を導入しないで、病気に
対する免疫性を付与する細胞を含まないワクチン中に含
むことができるであろう。ある数の抗原は、細胞を含ま
ないワクチン成分として提案されてきており、それらの
例は次の通りである：リンパ球促進因子（ＬＰＦ；また
、ヒスタミン感作因子、小島活性化タンパク質、および
百日咳トキシン）、フィラメント状赤血球凝集素（ＦＨ
Ａ） 、およびふさ状凝集原［ウニイス（Ｗｅ ｓ ｓ
） 、Ａ、Ａ。
およびヘラレット（Ｈｅｗｌ ｅ ｔ ｔ） 、Ｅ、Ｌ
、、１９８６、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉ ｃ ｒｏｂ ｉ
ｏ ｌ。
、、１９８６、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉ ｃ ｒｏｂ ｉ
ｏ ｌ。
４０ ： ６６１−６８６１゜
百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外膜に関連し、
そして約６９，０００ダルトンの分子量を有する、他の
抗原は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６９に
タンパク質またはＰ、６９と呼ぶ。百日咳菌（Ｂ、ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）の６９にタンパク質は、ヒト病原性パ
ラ百日咳菌（Ｂ、ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）および
動物の病原性気管支敗血症菌（Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ
ｐｔｉｃａ）により産生される、電気泳動移動度がわず
かに異なる、同様なタンパク質に免疫学的に関する。６
９にタンパク質はワクチンの成分として有用な保護的抗
原であることが示唆された。
そして約６９，０００ダルトンの分子量を有する、他の
抗原は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６９に
タンパク質またはＰ、６９と呼ぶ。百日咳菌（Ｂ、ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）の６９にタンパク質は、ヒト病原性パ
ラ百日咳菌（Ｂ、ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）および
動物の病原性気管支敗血症菌（Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ
ｐｔｉｃａ）により産生される、電気泳動移動度がわず
かに異なる、同様なタンパク質に免疫学的に関する。６
９にタンパク質はワクチンの成分として有用な保護的抗
原であることが示唆された。
病気に対する保護と特定の抗体の間の相関関係は、第１
気管支敗血症菌（Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）
の６８にタンパク質について確立され、そして研究は後
にノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ）らにより百日咳菌（Ｂ
、ｐｅｒｔｕｓｓｊｓ）の６９にタンパク質に伸長され
た［ノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ） 、Ｐ、 、チュブ
（Ｃｈｕｂｂ）、Ａ、Ｐ、 、：Ｉランレイ（Ｃｏｗｎ
Ｉ ｅｙ） 、Ｋ、、モンタラズ（Ｍｏｎｔａｒａｚ
） 、Ｊ、Ａ、およびビースレイ（Ｂｅｅｓ Ｉｅｙ）
、Ｊ、Ｅ、 、１９８５、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、５ｔａ
ｎｄ、６１：２７−４１；ノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ
）、Ｐｌ、コリッシ（Ｋｏｒｉｓｃｈ）、Ｍｌ、：７ウ
ンレイ（Ｃｏｗｎ ｌ ｅｙ） 、Ｋ、チュブ（Ｃｈｕ
ｂｂ）、Ａ、Ｐ、およびモンタラズ（Ｍｏｎｔａｒａｚ
）、Ｊ、Ａ、 、１９８５、感染および免疫性（Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、５０
：１９０−１９８ ；モンタラズ（Ｍｏｎｔａｒａｚ
） 、Ｊ、Ａ、、ノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｐ、
およびイバニイ（Ｉｖａｎｙｉ）、Ｊ、 、１９８５、
感染および免疫性（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ）、４７：７４４−７５１；およびノボト
ニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｐｌ、コランレイ（Ｃｏｗｎ
ｌ ｅｙ） 、Ｋ、、１９８５、感染および免疫性（
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍｍｕｎ ｉ ｔｙ）
、５０ ：１９９−２０６］。他の研究者らは、６９に
は百日咳のある種の動物のモデルにおいて、活性または
受動的免疫性により、保護的であることが示した。さら
に、６９Ｋに対する抗体は百日咳から回収したヒトの血
清中に存在する。６９にタンパク質は百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）の凝集原の性質を有し、そして付着
剤として作用して、哺乳動物の細胞への取り付けを引き
起こすことができる。６９にタンパク質は共同してＬＰ
ＦＳＦＨＡおよび他の特定の因子で、百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）のビルレンスに関する遺伝子座の制
御下に発現され、そしてビルレフト菌株中においてのみ
発現される。最後に、６９にタンパク質は日本において
首尾よく利用される、細胞を含まない百日咳ワクチンの
１成分として報告された［アオヤマ（Ａｏｙａｍａ）、
Ｊｌ、ムラゼ（Ｍｕｒａｓｅ）、Ｙｌ、カド（Ｋａｔｏ
）、Ｍ８、イワイ（Ｉｗａ ｉ）、Ｈｏおよびイワタ（
Ｉｗａ ｔ ａ） 、Ｊ、、１９８９、Ａｍ、Ｊ、Ｄｉ
ｓ、Ｃｈｉｌｄ、１４３：６５５−６５９ ；シャヒン
（Ｓｈａｈ ｉｎ） 、Ｒ。
気管支敗血症菌（Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）
の６８にタンパク質について確立され、そして研究は後
にノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ）らにより百日咳菌（Ｂ
、ｐｅｒｔｕｓｓｊｓ）の６９にタンパク質に伸長され
た［ノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ） 、Ｐ、 、チュブ
（Ｃｈｕｂｂ）、Ａ、Ｐ、 、：Ｉランレイ（Ｃｏｗｎ
Ｉ ｅｙ） 、Ｋ、、モンタラズ（Ｍｏｎｔａｒａｚ
） 、Ｊ、Ａ、およびビースレイ（Ｂｅｅｓ Ｉｅｙ）
、Ｊ、Ｅ、 、１９８５、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、５ｔａ
ｎｄ、６１：２７−４１；ノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ
）、Ｐｌ、コリッシ（Ｋｏｒｉｓｃｈ）、Ｍｌ、：７ウ
ンレイ（Ｃｏｗｎ ｌ ｅｙ） 、Ｋ、チュブ（Ｃｈｕ
ｂｂ）、Ａ、Ｐ、およびモンタラズ（Ｍｏｎｔａｒａｚ
）、Ｊ、Ａ、 、１９８５、感染および免疫性（Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、５０
：１９０−１９８ ；モンタラズ（Ｍｏｎｔａｒａｚ
） 、Ｊ、Ａ、、ノボトニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｐ、
およびイバニイ（Ｉｖａｎｙｉ）、Ｊ、 、１９８５、
感染および免疫性（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ）、４７：７４４−７５１；およびノボト
ニイ（Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｐｌ、コランレイ（Ｃｏｗｎ
ｌ ｅｙ） 、Ｋ、、１９８５、感染および免疫性（
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍｍｕｎ ｉ ｔｙ）
、５０ ：１９９−２０６］。他の研究者らは、６９に
は百日咳のある種の動物のモデルにおいて、活性または
受動的免疫性により、保護的であることが示した。さら
に、６９Ｋに対する抗体は百日咳から回収したヒトの血
清中に存在する。６９にタンパク質は百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）の凝集原の性質を有し、そして付着
剤として作用して、哺乳動物の細胞への取り付けを引き
起こすことができる。６９にタンパク質は共同してＬＰ
ＦＳＦＨＡおよび他の特定の因子で、百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）のビルレンスに関する遺伝子座の制
御下に発現され、そしてビルレフト菌株中においてのみ
発現される。最後に、６９にタンパク質は日本において
首尾よく利用される、細胞を含まない百日咳ワクチンの
１成分として報告された［アオヤマ（Ａｏｙａｍａ）、
Ｊｌ、ムラゼ（Ｍｕｒａｓｅ）、Ｙｌ、カド（Ｋａｔｏ
）、Ｍ８、イワイ（Ｉｗａ ｉ）、Ｈｏおよびイワタ（
Ｉｗａ ｔ ａ） 、Ｊ、、１９８９、Ａｍ、Ｊ、Ｄｉ
ｓ、Ｃｈｉｌｄ、１４３：６５５−６５９ ；シャヒン
（Ｓｈａｈ ｉｎ） 、Ｒ。
Ｄｌ、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ） 、Ｍ、Ｊ、、Ｌ
ｉ、Ｚ、Ｍ、メアデ（Ｍｅａｄｅ） 、Ｂ、Ｄ。
ｉ、Ｚ、Ｍ、メアデ（Ｍｅａｄｅ） 、Ｂ、Ｄ。
およびマンクラーク（Ｍａｎｃｌａｒｋ） 、Ｃ。
Ｒ，，１９８９、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタ
ル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）（印刷中）；
ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ） 、Ｍ。
ル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）（印刷中）；
ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ） 、Ｍ。
Ｊｌ、Ｌｉ、Ｚ、Ｍ、、ロウレル（Ｌｏｗｅｌｌ）、Ｊ
、 Ｌ、、ビシャー（Ｂｉｓｈｅｒ） 、Ｍ、Ｅ、、
ステベン（Ｓｔｅｖｅｎ） 、Ａ、Ｃ，、ノボトニー（
Ｎｏｖｏｔｎｙ） 、Ｐ、およびマンクラーク（Ｍａｎ
ｃ ｌ ａ ｒｋ） 、Ｃ，Ｒ，，１９８８、感染およ
び免疫性（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄＩｍｍｕｎ
ｉ ｔ ｙ）、５６ ：３１８９−３１９５；チャール
ス（Ｃｈａｒｌｅｓ）、１．Ｇ、、ドウガン（Ｄｏｕｇ
ａｎ） 、Ｇ、、ピッカード（Ｐｉｃｋａｒｄ）、Ｄ、
、チャトフィールド（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ）、Ｓ、、ス
ミス（Ｓｍｉ ｔｈ）、Ｍｌ、ノボト：−−（Ｎｏｖｏ
ｔｎｙ） 、Ｐ、、モリッセイ（Ｍｏｒｒ １ｓｓｅ
ｙ） 、Ｐ、およびファイアウェザ−（Ｆａｉｒｗｅａ
ｈｔｅｒ）、Ｎ、 Ｆ、、１９８９ ；プロシーデイン
ダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シズ（Ｐ ｒ ｏ ｃ。
、 Ｌ、、ビシャー（Ｂｉｓｈｅｒ） 、Ｍ、Ｅ、、
ステベン（Ｓｔｅｖｅｎ） 、Ａ、Ｃ，、ノボトニー（
Ｎｏｖｏｔｎｙ） 、Ｐ、およびマンクラーク（Ｍａｎ
ｃ ｌ ａ ｒｋ） 、Ｃ，Ｒ，，１９８８、感染およ
び免疫性（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄＩｍｍｕｎ
ｉ ｔ ｙ）、５６ ：３１８９−３１９５；チャール
ス（Ｃｈａｒｌｅｓ）、１．Ｇ、、ドウガン（Ｄｏｕｇ
ａｎ） 、Ｇ、、ピッカード（Ｐｉｃｋａｒｄ）、Ｄ、
、チャトフィールド（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ）、Ｓ、、ス
ミス（Ｓｍｉ ｔｈ）、Ｍｌ、ノボト：−−（Ｎｏｖｏ
ｔｎｙ） 、Ｐ、、モリッセイ（Ｍｏｒｒ １ｓｓｅ
ｙ） 、Ｐ、およびファイアウェザ−（Ｆａｉｒｗｅａ
ｈｔｅｒ）、Ｎ、 Ｆ、、１９８９ ；プロシーデイン
ダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シズ（Ｐ ｒ ｏ ｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８６：３５５
４−３５５８ ；レイニンガー（Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ）
−ザパタ（Ｚａｐａ ｔ ａ） 、Ｅ、、ブレンナン（
Ｂｒｅｎｎａｎ） 、Ｍ、Ｊｏ、ケニマー（Ｋｎ ｉｍ
ｅ ｒ） 、Ｊ、Ｇ、、チャールス（Ｃｈａｒｌｅｓ）
、１０、ファイアウェザ−（Ｆａｉｒｗｅａｈｔｅｒ）
、Ｎ、およびノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｐ、、１
９８９、Ａｂｓｔｒ、Ａｍｅｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
ｐ、５１、ａｂｓｔｒ、Ｂ−１２３；およびシャイヒン
（Ｓｈａｈｆｎ）、Ｒ，、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ
）、Ｍ、Ｊ、およびメアデ（Ｍｅ ａ ｄ ｅ） 、Ｂ
。
４−３５５８ ；レイニンガー（Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ）
−ザパタ（Ｚａｐａ ｔ ａ） 、Ｅ、、ブレンナン（
Ｂｒｅｎｎａｎ） 、Ｍ、Ｊｏ、ケニマー（Ｋｎ ｉｍ
ｅ ｒ） 、Ｊ、Ｇ、、チャールス（Ｃｈａｒｌｅｓ）
、１０、ファイアウェザ−（Ｆａｉｒｗｅａｈｔｅｒ）
、Ｎ、およびノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｐ、、１
９８９、Ａｂｓｔｒ、Ａｍｅｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
ｐ、５１、ａｂｓｔｒ、Ｂ−１２３；およびシャイヒン
（Ｓｈａｈｆｎ）、Ｒ，、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ
）、Ｍ、Ｊ、およびメアデ（Ｍｅ ａ ｄ ｅ） 、Ｂ
。
Ｄｌ、１９８９、Ａｂｓ ｔ ｒ、 Ａｍｅ ｒ、 Ｍ
ｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、ｐ、５１、ａｂｓｔｒ、Ｂ−１２
５］。
ｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、ｐ、５１、ａｂｓｔｒ、Ｂ−１２
５］。
細胞を含まない百日咳ワクチンの１成分として６９にタ
ンパク質を使用するために、商業的製造規模に適用可能
なタンパク質の効率よい精製する方法が要求される。し
かしながら、前述の方法は大規模に適合させるためにい
くつかの欠点を有する。
ンパク質を使用するために、商業的製造規模に適用可能
なタンパク質の効率よい精製する方法が要求される。し
かしながら、前述の方法は大規模に適合させるためにい
くつかの欠点を有する。
ノボト＝−（Ｎｏｖｏｔｎｙ）ら［感染および免疫性（
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）
、旦旦：１９９−２０６ （１９８５）；欧州特許（Ｅ
Ｐ）０ １６２ ６３９号］ Ｉｔ、百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）のからの６９にタンパク質を抽出お
よび精製する方法を記載している。ノボトニー（Ｎｏｖ
ｏｔｎｙ）らが記載する方法は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）の全細胞を水中に懸濁し、緩衝液でｐＨ
３に調節し、３７℃においてほぼ１８時間インキュベー
ションして、６９にタンパク質を含むタンパク質を全細
胞から解放し、遠心により細胞を除去してタンパク質抽
出物を残し、タンパク質抽出物をアセトンで一２０℃に
おいて沈澱させ、そして沈澱物を遠心して溶液中に残る
非タンパク質物質から分離することを包含する。生ずる
タンパク質抽出物をＤＥＡＥ−トＩＪスアシルイオン交
換カラムのクロマトグラフィーにかけ、そして塩の勾配
で溶離した。イオン交換カラムにより保持されない物質
を、調製用等電点電気泳動ゲルまたはクロマトフオーカ
シングを使用する等電点電気泳動にかけた。次いで、抗
６９にタンパク質のモノクローナル抗体により認識され
るタンパク質を含有する分画をモノクローナル抗体のカ
ラムに適用し、次いでこのカラムを６モルの尿素で溶離
して６９にタンパク質を得る。
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）
、旦旦：１９９−２０６ （１９８５）；欧州特許（Ｅ
Ｐ）０ １６２ ６３９号］ Ｉｔ、百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）のからの６９にタンパク質を抽出お
よび精製する方法を記載している。ノボトニー（Ｎｏｖ
ｏｔｎｙ）らが記載する方法は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）の全細胞を水中に懸濁し、緩衝液でｐＨ
３に調節し、３７℃においてほぼ１８時間インキュベー
ションして、６９にタンパク質を含むタンパク質を全細
胞から解放し、遠心により細胞を除去してタンパク質抽
出物を残し、タンパク質抽出物をアセトンで一２０℃に
おいて沈澱させ、そして沈澱物を遠心して溶液中に残る
非タンパク質物質から分離することを包含する。生ずる
タンパク質抽出物をＤＥＡＥ−トＩＪスアシルイオン交
換カラムのクロマトグラフィーにかけ、そして塩の勾配
で溶離した。イオン交換カラムにより保持されない物質
を、調製用等電点電気泳動ゲルまたはクロマトフオーカ
シングを使用する等電点電気泳動にかけた。次いで、抗
６９にタンパク質のモノクローナル抗体により認識され
るタンパク質を含有する分画をモノクローナル抗体のカ
ラムに適用し、次いでこのカラムを６モルの尿素で溶離
して６９にタンパク質を得る。
しかしながら、この方法は６９にタンパク質の商業的製
造に実施されないであろう。なぜなら、それは細胞から
のタンパク質の抽出に１８時間を要し、沈澱工程におい
て危険な溶媒であるアセトンを使用し、２０時間を要す
るイオン交換クロマトグラフィーのカラムを必要とし、
そして１６時間を要する面倒な調製用等電点電気泳動手
順を必要とするからである。さらに、生ずるタンパク質
調製物は完全には精製されず、追加の工程を必要とし、
ここでそれをポリマーの支持体に結合した抗６９にモノ
クローナル抗体を利用する親和カラムに通過させる。最
後に、タンパク質は精製プロセスを通じて不安定であり
、精製の間にタンパク質は多少劣化する。
造に実施されないであろう。なぜなら、それは細胞から
のタンパク質の抽出に１８時間を要し、沈澱工程におい
て危険な溶媒であるアセトンを使用し、２０時間を要す
るイオン交換クロマトグラフィーのカラムを必要とし、
そして１６時間を要する面倒な調製用等電点電気泳動手
順を必要とするからである。さらに、生ずるタンパク質
調製物は完全には精製されず、追加の工程を必要とし、
ここでそれをポリマーの支持体に結合した抗６９にモノ
クローナル抗体を利用する親和カラムに通過させる。最
後に、タンパク質は精製プロセスを通じて不安定であり
、精製の間にタンパク質は多少劣化する。
ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら［感染および免疫性（
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ ｉ
ｔｙ） 、５６ ： ３１８９−３１９５ （１９８
８）］は、また、百日咳菌（Ｂ、 ｐ ｅ ｒ ｔ
ｕ ｓ ５ｉｓ）の全細胞から百日咳菌（Ｂ、ｐ ｅ
ｒ ｔ ｕ ５ｓｉｓ）の６９にタンパク質を抽出およ
び精製する方法を記載している。ブレンナン（Ｂｒｅｎ
ｎａｎ）らが記載する方法は、生きている百日咳菌（Ｂ
、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞をリン酸塩緩衝液中に懸濁
し、６０℃において１時間インキュベーションして細胞
からタンパク質を解放し、遠心により細胞を除去し、そ
してそのようにして得られたタンパク質抽出物を、プロ
テアーゼ阻害因子のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）および洗浄剤のＢｒ１ｊ ３５を含有する、トリス
緩衝化生理的食塩水中で透析することを包含する。次い
で、抽出物をフェツイン（ｆ６ｔｕｉｎ）−セファロー
ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに適用して百日咳トキ
シンを除去し、次いでモノクローナル抗体の親和カラム
に適用し、このカラムを６モルの尿素で溶離して６９に
タンパク質を生成する。
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ ｉ
ｔｙ） 、５６ ： ３１８９−３１９５ （１９８
８）］は、また、百日咳菌（Ｂ、 ｐ ｅ ｒ ｔ
ｕ ｓ ５ｉｓ）の全細胞から百日咳菌（Ｂ、ｐ ｅ
ｒ ｔ ｕ ５ｓｉｓ）の６９にタンパク質を抽出およ
び精製する方法を記載している。ブレンナン（Ｂｒｅｎ
ｎａｎ）らが記載する方法は、生きている百日咳菌（Ｂ
、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞をリン酸塩緩衝液中に懸濁
し、６０℃において１時間インキュベーションして細胞
からタンパク質を解放し、遠心により細胞を除去し、そ
してそのようにして得られたタンパク質抽出物を、プロ
テアーゼ阻害因子のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）および洗浄剤のＢｒ１ｊ ３５を含有する、トリス
緩衝化生理的食塩水中で透析することを包含する。次い
で、抽出物をフェツイン（ｆ６ｔｕｉｎ）−セファロー
ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに適用して百日咳トキ
シンを除去し、次いでモノクローナル抗体の親和カラム
に適用し、このカラムを６モルの尿素で溶離して６９に
タンパク質を生成する。
ノポトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）らが開示する方法に関す
ると、この方法は多少の制限を受け、このために商業的
規模で効率よ〈実施することは比較的困難である。例え
ば、本発明の多数のインキュベーション抽出工程をブレ
ンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らの単一工程と比較すると、
単一インキュベーション抽出工程は細胞からの６９にタ
ンパク質の抽出が不完全であることが実証される。さら
に、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らが開示する方法は
、それを商業的規模で実施する場合、毒性および高価な
化学物質の大規模な使用を必要とするであろう。最後に
、ノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）らおよびブレンナン（
Ｂ ｒ ｅ ｎ ｎ ａ ｎ）らの両者は、モノクロー
ナル抗体の親和カラムの使用を必要とする。
ると、この方法は多少の制限を受け、このために商業的
規模で効率よ〈実施することは比較的困難である。例え
ば、本発明の多数のインキュベーション抽出工程をブレ
ンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らの単一工程と比較すると、
単一インキュベーション抽出工程は細胞からの６９にタ
ンパク質の抽出が不完全であることが実証される。さら
に、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らが開示する方法は
、それを商業的規模で実施する場合、毒性および高価な
化学物質の大規模な使用を必要とするであろう。最後に
、ノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）らおよびブレンナン（
Ｂ ｒ ｅ ｎ ｎ ａ ｎ）らの両者は、モノクロー
ナル抗体の親和カラムの使用を必要とする。
一般に、モノクローナル抗体の親和カラムを使用する方
法は商業的生産に適さない。なぜなら、抗体は商業的に
入手可能でなく、そして免疫化および引き続（ハイブリ
ドーマの産生およびスクリニングの時間を要する手順で
発生させなくてはならないからである。次いで、抗体を
精製し、そして親和支持体に結合しな（ではならず、そ
れらのすべては労力を要しかつ時間を消費する。さらに
、親和カラムからの溶離は尿素の高い濃度を包含し、こ
れは有害である。なぜなら、尿素は既知の変性剤であり
、そしてタンパク質の構造特性を変更することがあるか
らである。
法は商業的生産に適さない。なぜなら、抗体は商業的に
入手可能でなく、そして免疫化および引き続（ハイブリ
ドーマの産生およびスクリニングの時間を要する手順で
発生させなくてはならないからである。次いで、抗体を
精製し、そして親和支持体に結合しな（ではならず、そ
れらのすべては労力を要しかつ時間を消費する。さらに
、親和カラムからの溶離は尿素の高い濃度を包含し、こ
れは有害である。なぜなら、尿素は既知の変性剤であり
、そしてタンパク質の構造特性を変更することがあるか
らである。
百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全細胞から６９
にタンパク質を抽出および精製する第３の方法は、バー
ンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、米国特許出願第７／３０８，８
６４号、１９８９年２月１０日提出およびアメリカン・
ソサイアテイ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｓ。
にタンパク質を抽出および精製する第３の方法は、バー
ンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、米国特許出願第７／３０８，８
６４号、１９８９年２月１０日提出およびアメリカン・
ソサイアテイ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｓ。
ｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
）のアブストラクト、ｐ、５１、アブストラクトＢ−１
２６（１９８９）に記載されている。この方法は、生き
ている百日咳菌（Ｂ、 ｐ ｅ ｒ ｔ ｕ ｓ ５
ｉｓ）細胞をＰＭＳＦおよびアジ化ナトリウムを含有す
るトリス緩衝液化塩類溶液中に懸濁し、６０℃において
１時間インキュベーションして細胞からタンパク質を解
放し、細胞を遠心により除去してタンパク質抽出物を残
し、そしてそのように得られたタンパク質抽出物を、プ
ロテアーゼ阻害因子のＰＭＳＦを実質的な濃度（１ミリ
モル）で含有するトリス緩衝化塩類溶液中で透析するこ
とを包含する。次いで、抽出物をＤＥＡＥ−セファロー
スのイオン交換カラムに適用し、このカラムを塩勾配で
溶離する。溶離液を透析し、次いで色素配位子のクロマ
トグラフィーのカラム［アフィーゲル・ブルー（Ａｆｆ
ｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）（Ｂ ｉ ｏ−Ｒａ ｄ）
］に通し、そして高い濃度の尿素で洗浄剤の存在下に溶
離して、６９にタンパク質を得る。ノボトニー（Ｎｏｖ
ｏｔｎｙ）らおよびブレンナン（Ｂ ｒ ｅ ｎ ｎ
ａ ｎ）らに関すると、この方法は、また、６９にタン
パク質の商業的生産に適当ではない。なぜなら、それは
この方法を通じて６９にタンパク質をタンパク質分解劣
化から保護するために実質的な濃度（例えば、１ミリモ
ルのＰＭＳＦ）の存在を必要とするからである。
）のアブストラクト、ｐ、５１、アブストラクトＢ−１
２６（１９８９）に記載されている。この方法は、生き
ている百日咳菌（Ｂ、 ｐ ｅ ｒ ｔ ｕ ｓ ５
ｉｓ）細胞をＰＭＳＦおよびアジ化ナトリウムを含有す
るトリス緩衝液化塩類溶液中に懸濁し、６０℃において
１時間インキュベーションして細胞からタンパク質を解
放し、細胞を遠心により除去してタンパク質抽出物を残
し、そしてそのように得られたタンパク質抽出物を、プ
ロテアーゼ阻害因子のＰＭＳＦを実質的な濃度（１ミリ
モル）で含有するトリス緩衝化塩類溶液中で透析するこ
とを包含する。次いで、抽出物をＤＥＡＥ−セファロー
スのイオン交換カラムに適用し、このカラムを塩勾配で
溶離する。溶離液を透析し、次いで色素配位子のクロマ
トグラフィーのカラム［アフィーゲル・ブルー（Ａｆｆ
ｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）（Ｂ ｉ ｏ−Ｒａ ｄ）
］に通し、そして高い濃度の尿素で洗浄剤の存在下に溶
離して、６９にタンパク質を得る。ノボトニー（Ｎｏｖ
ｏｔｎｙ）らおよびブレンナン（Ｂ ｒ ｅ ｎ ｎ
ａ ｎ）らに関すると、この方法は、また、６９にタン
パク質の商業的生産に適当ではない。なぜなら、それは
この方法を通じて６９にタンパク質をタンパク質分解劣
化から保護するために実質的な濃度（例えば、１ミリモ
ルのＰＭＳＦ）の存在を必要とするからである。
大規模に適合させるために、このような毒性および高価
な物質を含有する緩衝液の大きい体積の使用は１つの欠
点であり、そして最終産生物からのこれらの物質の完全
な除去は確実にしなくてはならない。さらに、色素配位
子のカラムからのタンパク質の溶離に使用する尿素およ
び洗浄剤物質は、変性を経てタンパク質構造に悪影響を
及ぼすことがある。
な物質を含有する緩衝液の大きい体積の使用は１つの欠
点であり、そして最終産生物からのこれらの物質の完全
な除去は確実にしなくてはならない。さらに、色素配位
子のカラムからのタンパク質の溶離に使用する尿素およ
び洗浄剤物質は、変性を経てタンパク質構造に悪影響を
及ぼすことがある。
したがって、本発明の目的は、百日咳菌（Ｂ。
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全細胞から６９にタンパク質を
抽出および精製する、タンパク質の商業的生産に適する
、改良された方法を提供することである。他の目的は、
タンパク質の収率を増加する方法を提供することである
。他の目的は、６９にタンパク質の安定性を増加する方
法を提供することである。それ以上の目的は、毒性プロ
テアーゼ阻害因子または激烈な変性剤、例えば、高い濃
度の尿素を使用しない方法を提供することである。
抽出および精製する、タンパク質の商業的生産に適する
、改良された方法を提供することである。他の目的は、
タンパク質の収率を増加する方法を提供することである
。他の目的は、６９にタンパク質の安定性を増加する方
法を提供することである。それ以上の目的は、毒性プロ
テアーゼ阻害因子または激烈な変性剤、例えば、高い濃
度の尿素を使用しない方法を提供することである。
本発明は、商業的規模の生産によく適し、そして先行技
術の方法より、ことにタンパク質の増大した収率および
安定性に関して、百日咳菌（Ｂ。
術の方法より、ことにタンパク質の増大した収率および
安定性に関して、百日咳菌（Ｂ。
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全細胞から６９にタンパク質を
抽出、精製および回収する方法を提供する。
抽出、精製および回収する方法を提供する。
とくに、本発明の方法は百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）の細胞からのタンパク質の抽出前に、バクテリア
との接触を経て百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の
細胞の不活性化により６９にタンパク質の収率および安
定性を増大する。この方法における不活性化は、６９に
タンパク質を劣化に対して安定化し、そしてプロテアー
ゼ阻害因子の利用の必要性を排除する。驚くべきことに
は、この方法における不活性化は、また、６９にタンパ
ク質の収率を増加する。
ｉｓ）の細胞からのタンパク質の抽出前に、バクテリア
との接触を経て百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の
細胞の不活性化により６９にタンパク質の収率および安
定性を増大する。この方法における不活性化は、６９に
タンパク質を劣化に対して安定化し、そしてプロテアー
ゼ阻害因子の利用の必要性を排除する。驚くべきことに
は、この方法における不活性化は、また、６９にタンパ
ク質の収率を増加する。
さらに、本発明の方法は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）細胞からのタンパク質の反復した抽出によりタ
ンパク質の収率を増大する。反復した抽出は、生きてい
る細胞または不活性化された細胞を使用して実施すると
き、収率を増加するが、不活性化細胞を利用するとき、
最良の収率が得られることが発見された。反復した抽出
は複数の抽出工程を包含し、各抽出工程は好ましくは緩
衝剤を含む水性媒質中に細胞を懸濁し、細胞を約り５℃
〜約６５℃の温度において３０分〜約１゜５時間インキ
ュベーションして、細胞からタンパク質を解放し、次い
で解放されたタンパク質を細胞から分離してタンパク質
抽出物を得ることを包含する。残る細胞を新鮮な媒質中
に再懸濁し、そしてインキュベーションおよび分離の工
程を、細胞から６９にタンパク質の大部分を得るために
必要な回数だけ反復する。
ｓｉｓ）細胞からのタンパク質の反復した抽出によりタ
ンパク質の収率を増大する。反復した抽出は、生きてい
る細胞または不活性化された細胞を使用して実施すると
き、収率を増加するが、不活性化細胞を利用するとき、
最良の収率が得られることが発見された。反復した抽出
は複数の抽出工程を包含し、各抽出工程は好ましくは緩
衝剤を含む水性媒質中に細胞を懸濁し、細胞を約り５℃
〜約６５℃の温度において３０分〜約１゜５時間インキ
ュベーションして、細胞からタンパク質を解放し、次い
で解放されたタンパク質を細胞から分離してタンパク質
抽出物を得ることを包含する。残る細胞を新鮮な媒質中
に再懸濁し、そしてインキュベーションおよび分離の工
程を、細胞から６９にタンパク質の大部分を得るために
必要な回数だけ反復する。
最後に、本発明の方法は、６９にタンパク質を色素配位
子のクロマトグラフィーおよび引き続くクロマトフオー
カシングによりタンパク質抽出物から精製および回収す
る、改良された精製の配置を提供する。とくに、タンパ
ク質抽出物をまず色素配位子のクロマトグラフィーを使
用して部分的に精製する。色素配位子のクロマトグラフ
ィーは、６９にタンパク質および制限された数の他のタ
ンパク質を選択的に結合し、モしてカラムの通過により
汚染性タンパク質および他の汚染物質の分離を可能とす
る。次いで、６９にタンパク質を色素配位子のクロマト
グラフィーのカラムから溶離された制限した数の他のタ
ンパク質から、弁別結合によりタンパク質を分離するク
ロマトフオーカシング操作および等電点差に基づく溶離
により、完全に分離する。予期せざることには、色素配
位子のクロマトグラフィーおよび引き続くクロマトフオ
ーカシングの特定の順序はカラムの容量を最大とし、こ
の配置を商業的規模拡大にとくに適するようにする。
子のクロマトグラフィーおよび引き続くクロマトフオー
カシングによりタンパク質抽出物から精製および回収す
る、改良された精製の配置を提供する。とくに、タンパ
ク質抽出物をまず色素配位子のクロマトグラフィーを使
用して部分的に精製する。色素配位子のクロマトグラフ
ィーは、６９にタンパク質および制限された数の他のタ
ンパク質を選択的に結合し、モしてカラムの通過により
汚染性タンパク質および他の汚染物質の分離を可能とす
る。次いで、６９にタンパク質を色素配位子のクロマト
グラフィーのカラムから溶離された制限した数の他のタ
ンパク質から、弁別結合によりタンパク質を分離するク
ロマトフオーカシング操作および等電点差に基づく溶離
により、完全に分離する。予期せざることには、色素配
位子のクロマトグラフィーおよび引き続くクロマトフオ
ーカシングの特定の順序はカラムの容量を最大とし、こ
の配置を商業的規模拡大にとくに適するようにする。
こうして記載する方法は、簡単な信頼性ある手順を表し
、ここでタンパク質の収率は精製の間の安定性および抽
出の効率の両者により増大する。
、ここでタンパク質の収率は精製の間の安定性および抽
出の効率の両者により増大する。
さらに、６９にタンパク質の回収に要求される時間は透
析工程の結果として最小となる。また、クロマトグラフ
ィーの手順は、予期せざるほどにカラムの容量を最大と
しかつ装入および溶離をより速（する、特定の順序で使
用する。したがって、本発明の方法は、現在の既知の方
法により時間を消費せずかつ安価であり、そして商業的
生産に理想的に適する方法を提供する。
析工程の結果として最小となる。また、クロマトグラフ
ィーの手順は、予期せざるほどにカラムの容量を最大と
しかつ装入および溶離をより速（する、特定の順序で使
用する。したがって、本発明の方法は、現在の既知の方
法により時間を消費せずかつ安価であり、そして商業的
生産に理想的に適する方法を提供する。
本発明の方法は、百日咳菌（ＢｏｒｄｅｔｅｌＩａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のすべての６９に産生菌株から６
９にタンパク質を抽出および精製するために適する。６
９にタンパク質は、ビルレンス因子が発現される条件下
に増殖した百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）のビルレント菌株から精製することがで
きる。適当な菌株は、例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）Ｔｏｈａｍａ Ｉ
、１６５．１８３２３の１期（ｐｈａｓｅ）などであり
、全細胞の百日咳ワクチンの生産に菌株する臨床的分離
物および菌株を包含する。例えば、気管支敗血症菌（Ｂ
、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）６８にタンパク質お
よびバラ百日咳菌（Ｂ。
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のすべての６９に産生菌株から６
９にタンパク質を抽出および精製するために適する。６
９にタンパク質は、ビルレンス因子が発現される条件下
に増殖した百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）のビルレント菌株から精製することがで
きる。適当な菌株は、例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）Ｔｏｈａｍａ Ｉ
、１６５．１８３２３の１期（ｐｈａｓｅ）などであり
、全細胞の百日咳ワクチンの生産に菌株する臨床的分離
物および菌株を包含する。例えば、気管支敗血症菌（Ｂ
、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）６８にタンパク質お
よびバラ百日咳菌（Ｂ。
ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓ １ｓ）７０にタンパク質を包
含する、６９にタンパク質を、また、ここに記載する方
法により、これらのボルデテラ（Ｂ。
含する、６９にタンパク質を、また、ここに記載する方
法により、これらのボルデテラ（Ｂ。
ｒｃｉｅｔｅｌｌａ）種から抽出および精製することが
できることが考えられる。さらに、６９にタンパク質の
組み換え変型（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｒｓ
１ｏｎｓ）は、そのタンパク質の発現に使用した遺伝子
操作した細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃ ｉ １１ｕｓ
） 、ストレプトマイセス属（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍａｙ
ｃｅｓ） 、酵母菌、哺乳動物細胞培養物などから抽出
後、記載する方法で精製できることが考えられる。
できることが考えられる。さらに、６９にタンパク質の
組み換え変型（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｒｓ
１ｏｎｓ）は、そのタンパク質の発現に使用した遺伝子
操作した細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃ ｉ １１ｕｓ
） 、ストレプトマイセス属（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍａｙ
ｃｅｓ） 、酵母菌、哺乳動物細胞培養物などから抽出
後、記載する方法で精製できることが考えられる。
培地中のビルレント百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）の増殖は、よく知られており、そして従来記載された
条件は一般に適当である。増殖は期Ｉの菌株に適当な培
地、例えば、コーヘンーＵｉ−１ａ−（Ｃｏｈｅｎ−Ｗ
ｈｅｅｌｅｒ）、スタイナーーショルテ（Ｓｔａｉｎｅ
ｒ−３ｃｈ。
）の増殖は、よく知られており、そして従来記載された
条件は一般に適当である。増殖は期Ｉの菌株に適当な培
地、例えば、コーヘンーＵｉ−１ａ−（Ｃｏｈｅｎ−Ｗ
ｈｅｅｌｅｒ）、スタイナーーショルテ（Ｓｔａｉｎｅ
ｒ−３ｃｈ。
１ｔｅ）、ベルウェイ（Ｖｅｒｗｅｙ）など中で実施す
ることができる。培養物は静止条件下に、震盪培養で、
または液内発酵に使用する容器中で、ビルレンス因子の
発現と適合する温度、例えば、３０℃〜３７℃、ことに
３７℃において増殖することができる。培養物は少な（
とも対数中期までの増殖を可能とするが、定常中期まで
長くない期間、例えば、発酵器の培養において２４時間
の間増殖させるべきである。
ることができる。培養物は静止条件下に、震盪培養で、
または液内発酵に使用する容器中で、ビルレンス因子の
発現と適合する温度、例えば、３０℃〜３７℃、ことに
３７℃において増殖することができる。培養物は少な（
とも対数中期までの増殖を可能とするが、定常中期まで
長くない期間、例えば、発酵器の培養において２４時間
の間増殖させるべきである。
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）または同等の細胞の増殖培養物を、本発明に従い、
静菌剤、好ましくは重金属化合物の阻害性質を示すタイ
プの添加により不活性化する。
ｓ）または同等の細胞の増殖培養物を、本発明に従い、
静菌剤、好ましくは重金属化合物の阻害性質を示すタイ
プの添加により不活性化する。
「メルクリアルス（ｍｅｒｃｕｒｉａｌｓ）Ｊとして知
られている静菌剤のクラス、例えば、チメロサール、塩
化第二水銀、および種々の有機または無機の水銀含有化
合物はとくに好ましい。チメロサールは、それを培養物
に０．００５〜０．２％（ｗ ／ ｖ培養物）、好まし
くは０．０２％の最終濃度で添加することによって、増
殖する培養を不活性化するために使用できる。チメロサ
ールへの暴露は任意の適当な条件下に実施できるが、３
７℃〜１０℃の温度において１２〜１８時間の暴露は好
ましい。次いで、不活性化した細胞を増殖培地から、任
意の物理学的方法により、好ましくは沈降した細胞の遠
心および回収により分離する。
られている静菌剤のクラス、例えば、チメロサール、塩
化第二水銀、および種々の有機または無機の水銀含有化
合物はとくに好ましい。チメロサールは、それを培養物
に０．００５〜０．２％（ｗ ／ ｖ培養物）、好まし
くは０．０２％の最終濃度で添加することによって、増
殖する培養を不活性化するために使用できる。チメロサ
ールへの暴露は任意の適当な条件下に実施できるが、３
７℃〜１０℃の温度において１２〜１８時間の暴露は好
ましい。次いで、不活性化した細胞を増殖培地から、任
意の物理学的方法により、好ましくは沈降した細胞の遠
心および回収により分離する。
細胞を６９にタンパク質の抽出前に０．０２％のチメロ
サール（米国薬局方ＸＸ、ｐ、７９１．１９８０）で不
活性化することはと（に好ましい。
サール（米国薬局方ＸＸ、ｐ、７９１．１９８０）で不
活性化することはと（に好ましい。
０．０２％のチメロサールで前以て不活性化した細胞は
、商業的に入手可能であり、そして、また、使用するこ
とができる。精製の間のタンパク質のタンパク質分解的
劣化に伴う特定の問題は、不活性化した細胞を使用する
とき、観察されない。いずれの理論にも拘束されたくな
いが、チメロサールによる細胞の初期の不活性化は、抽
出および精製工程の残部を通じて、６９にタンパク質を
安定化するか、あるいはタンパク質分解酵素の阻害にお
いてい（つかの利点を有すると思われる。したがって、
タンパク質分解酵素がタンパク質を破壊しないので、収
率は増加する。また、６９にタンパク質の安定性の増加
は、他の既知の方法において要求されるような、高価な
毒性のプロテアーゼ阻害因子の必要性を回避する。
、商業的に入手可能であり、そして、また、使用するこ
とができる。精製の間のタンパク質のタンパク質分解的
劣化に伴う特定の問題は、不活性化した細胞を使用する
とき、観察されない。いずれの理論にも拘束されたくな
いが、チメロサールによる細胞の初期の不活性化は、抽
出および精製工程の残部を通じて、６９にタンパク質を
安定化するか、あるいはタンパク質分解酵素の阻害にお
いてい（つかの利点を有すると思われる。したがって、
タンパク質分解酵素がタンパク質を破壊しないので、収
率は増加する。また、６９にタンパク質の安定性の増加
は、他の既知の方法において要求されるような、高価な
毒性のプロテアーゼ阻害因子の必要性を回避する。
６９にタンパク質の抽出および精製前の細胞の不活性化
から得られる予期せざる利点は、実施例工および２によ
り実証され、そしてそれらの結果は表１に報告されてい
る。実施例２は、プロテア−ゼ阻害因子の不存在下に、
生きている細胞から６９Ｋを精製する試みを表す。この
実施例におい・て、細胞の１ｇの湿潤重量当たり０．８
μｇのタンパク質を最後に回収した。実施例１はチメロ
サールで不活性化した細胞を使用した。この実施例にお
いて、細胞の１ｇの湿潤重量当たり１９６μｇの６９Ｋ
を回収した。差の一部分は、実施例１において不活性化
した細胞について使用したが、実施例２において生きて
いる細胞について使用しなかった、より効率よい反復抽
出手順に起因する。
から得られる予期せざる利点は、実施例工および２によ
り実証され、そしてそれらの結果は表１に報告されてい
る。実施例２は、プロテア−ゼ阻害因子の不存在下に、
生きている細胞から６９Ｋを精製する試みを表す。この
実施例におい・て、細胞の１ｇの湿潤重量当たり０．８
μｇのタンパク質を最後に回収した。実施例１はチメロ
サールで不活性化した細胞を使用した。この実施例にお
いて、細胞の１ｇの湿潤重量当たり１９６μｇの６９Ｋ
を回収した。差の一部分は、実施例１において不活性化
した細胞について使用したが、実施例２において生きて
いる細胞について使用しなかった、より効率よい反復抽
出手順に起因する。
しかしながら、反復抽出は、表２、実施例１および２に
示すように、単一の抽出より少なくとも２゜７倍だけ細
胞からの６９にの解放を増加すると推定することができ
る。こうして、単一の抽出を使用する場合、実施例１に
おける不活性化した細胞からの収量は、その時実際に回
収される１９６μｇよりむしろ、細胞の１ｇの湿潤重量
当たりほぼ７３μｇであると期待されるであろう。しか
しながら、この結果は、なお、生きている細胞よりむし
ろ不活性化した細胞を使用する最終収量の予期しない９
０倍の改良を表す。６９にタンパク質の精製の前にチメ
ロサールで細胞を不活性化することの収量への有益な効
果は、完全に予期せざることであった。静菌剤としての
チメロサールの有効性は、その水銀含有化合物の含量に
基づく。水銀および他の重金属は、多数の種類の酵素反
応の既知の阻害因子である。細胞のチメロサールの不活
性化後の劣化からの６９にの見掛けの保護は細胞抽出物
中のタンパク質分解酵素の水銀の阻害の結果である得る
と仮定される。こうして、これに関して、チメロサール
は「メルクリアルス」として知られている静菌剤の一般
クラスおよび、同様によく有益であると期待される、他
の重金属に基づく他の因子を代表する。細胞は熱による
か、あるいは他の種類の化学的因子、例えば、アジドま
たは他の呼吸の毒を使用する処置により不活性化するこ
とができるが、これらの処理はタンパク質分解的劣化の
防止という利益を有するように思われるであろう。
示すように、単一の抽出より少なくとも２゜７倍だけ細
胞からの６９にの解放を増加すると推定することができ
る。こうして、単一の抽出を使用する場合、実施例１に
おける不活性化した細胞からの収量は、その時実際に回
収される１９６μｇよりむしろ、細胞の１ｇの湿潤重量
当たりほぼ７３μｇであると期待されるであろう。しか
しながら、この結果は、なお、生きている細胞よりむし
ろ不活性化した細胞を使用する最終収量の予期しない９
０倍の改良を表す。６９にタンパク質の精製の前にチメ
ロサールで細胞を不活性化することの収量への有益な効
果は、完全に予期せざることであった。静菌剤としての
チメロサールの有効性は、その水銀含有化合物の含量に
基づく。水銀および他の重金属は、多数の種類の酵素反
応の既知の阻害因子である。細胞のチメロサールの不活
性化後の劣化からの６９にの見掛けの保護は細胞抽出物
中のタンパク質分解酵素の水銀の阻害の結果である得る
と仮定される。こうして、これに関して、チメロサール
は「メルクリアルス」として知られている静菌剤の一般
クラスおよび、同様によく有益であると期待される、他
の重金属に基づく他の因子を代表する。細胞は熱による
か、あるいは他の種類の化学的因子、例えば、アジドま
たは他の呼吸の毒を使用する処置により不活性化するこ
とができるが、これらの処理はタンパク質分解的劣化の
防止という利益を有するように思われるであろう。
百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞の細胞表面か
らの６９にタンパク質の抽出は、ブレンナン（Ｂ ｒ
ｅ ｎ ｎ ａ ｎ）らにより報告されているように、
細胞の培養から最初に分離した湿潤細胞材料を緩衝液中
に懸濁し、細胞懸濁液をインキュベーションしてタンパ
ク質を解放し、そしてそのように解放されたタンパク質
を遠心により分離してタンパク質抽出物を得るすること
によって達成される。ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら
はこのタイプの１つの抽出工程を開示している。しかし
ながら、この単一の抽出工程は、６９にタンパク質の合
計量のかなりの部分が解放されないことにおいて、比較
的非効率的であることが発見された。
らの６９にタンパク質の抽出は、ブレンナン（Ｂ ｒ
ｅ ｎ ｎ ａ ｎ）らにより報告されているように、
細胞の培養から最初に分離した湿潤細胞材料を緩衝液中
に懸濁し、細胞懸濁液をインキュベーションしてタンパ
ク質を解放し、そしてそのように解放されたタンパク質
を遠心により分離してタンパク質抽出物を得るすること
によって達成される。ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら
はこのタイプの１つの抽出工程を開示している。しかし
ながら、この単一の抽出工程は、６９にタンパク質の合
計量のかなりの部分が解放されないことにおいて、比較
的非効率的であることが発見された。
予期せざることには、複数の抽出工程を組み込んだ反復
抽出は、有意な量の６９にタンパク質を解放することが
発見された。表２を参照すると、各々が６０℃において
９０分から成る、３つの抽出工程の反復は細胞の１ｇの
湿潤重量当たり５７０μｇの６９にタンパク質を解放し
く実施例１）、これに比較して４．５時間の単一の抽出
について細胞の１ｇの湿潤重量当たりわずかに２１２μ
ｇの６９にタンパク質の解放である（実施例７）。
抽出は、有意な量の６９にタンパク質を解放することが
発見された。表２を参照すると、各々が６０℃において
９０分から成る、３つの抽出工程の反復は細胞の１ｇの
湿潤重量当たり５７０μｇの６９にタンパク質を解放し
く実施例１）、これに比較して４．５時間の単一の抽出
について細胞の１ｇの湿潤重量当たりわずかに２１２μ
ｇの６９にタンパク質の解放である（実施例７）。
したがって、解放された量は抽出時間の増加よりむしろ
反復について予期せざるほどに高い。イムノアッセイに
よりおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞の合計のタンパク質の合計のタ
ンパク質の１％より小が６９にタンパク質であると推定
される。したがって、細胞の１ｇの湿潤重量当たり５７
０μｇ（合計の細胞タンパク質の０．４６％に等しい）
の初期の抽出は、細胞から６９にタンパク質を解放する
極めて効率よい方法を示す。いずれの理論よっても拘束
されたくないが、抽出物中の６９にタンパク質の収量は
反復抽出プロセスにより太き（増加すると信じられる。
反復について予期せざるほどに高い。イムノアッセイに
よりおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、百日咳菌（Ｂ、ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞の合計のタンパク質の合計のタ
ンパク質の１％より小が６９にタンパク質であると推定
される。したがって、細胞の１ｇの湿潤重量当たり５７
０μｇ（合計の細胞タンパク質の０．４６％に等しい）
の初期の抽出は、細胞から６９にタンパク質を解放する
極めて効率よい方法を示す。いずれの理論よっても拘束
されたくないが、抽出物中の６９にタンパク質の収量は
反復抽出プロセスにより太き（増加すると信じられる。
なぜなら、新鮮な水性培地および好ましくは緩衝液を使
用する抽出の更新は、初期のインキュベーションにおけ
る６９にタンパク質の解放に対して制限となりうる１組
の条件を克服することができるからである。
用する抽出の更新は、初期のインキュベーションにおけ
る６９にタンパク質の解放に対して制限となりうる１組
の条件を克服することができるからである。
本発明による反復抽出は、複数の抽出工程を直列に包含
する。各工程はブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らにより
に開示されている単一の抽出に類似し、そして細胞を水
性媒質中に懸濁し、細胞懸濁液をインキュベーションし
て水性媒質中の溶液中にタンパク質を解放し、そしてそ
のように解放されたタンパク質を分離してタンパク質抽
出物を得ることを包含する。タンパク質を任意の物理学
的手段、好ましくは遠心により細胞から分離する。
する。各工程はブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らにより
に開示されている単一の抽出に類似し、そして細胞を水
性媒質中に懸濁し、細胞懸濁液をインキュベーションし
て水性媒質中の溶液中にタンパク質を解放し、そしてそ
のように解放されたタンパク質を分離してタンパク質抽
出物を得ることを包含する。タンパク質を任意の物理学
的手段、好ましくは遠心により細胞から分離する。
タンパク質を含有する上澄み液を取って置き、そしてタ
ンパク質抽出物の分離後に残る細胞を新鮮な水性媒質中
に再懸濁し、そしてインキュベーションおよび分離を反
復して追加のタンパク質抽出物を解放および回収する。
ンパク質抽出物の分離後に残る細胞を新鮮な水性媒質中
に再懸濁し、そしてインキュベーションおよび分離を反
復して追加のタンパク質抽出物を解放および回収する。
これらの反復は好ましいが、ある追加のタンパク質をそ
れ以上の反復から回収できることが考えられる。
れ以上の反復から回収できることが考えられる。
タンパク質の反復抽出は、かなり広い温度および時間の
範囲にわたる高温により達成することができる。３７℃
〜７０℃、好ましくは６０℃の有効な有用な温度範囲が
考えられる。各インキュベーションの長さは、３０分〜
２時間、好ましくは９０分の有効な時間に調節できる。
範囲にわたる高温により達成することができる。３７℃
〜７０℃、好ましくは６０℃の有効な有用な温度範囲が
考えられる。各インキュベーションの長さは、３０分〜
２時間、好ましくは９０分の有効な時間に調節できる。
各抽出工程は工程毎に同一であるか、あるいは異なるこ
とができる、有効な時間および温度の条件を使用するこ
とが考えられる。
とができる、有効な時間および温度の条件を使用するこ
とが考えられる。
反復抽出は、インキュベーションの前に、百日咳菌（Ｂ
、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞材料を水性媒質中に懸濁す
ることによって達成できる。好ましい水性媒質は、ｐＨ
７〜８に調節した緩衝液である。とくに好ましい水性媒
質は０．０１モルのリン酸塩緩衝液であり、湿潤細胞材
料の１体積当たりほぼ５体積の濃度で使用する。
、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞材料を水性媒質中に懸濁す
ることによって達成できる。好ましい水性媒質は、ｐＨ
７〜８に調節した緩衝液である。とくに好ましい水性媒
質は０．０１モルのリン酸塩緩衝液であり、湿潤細胞材
料の１体積当たりほぼ５体積の濃度で使用する。
次いで、タンパク質抽出材料をポリエチレングリコール
で沈澱させる。ポリエチレングリコールは、３０％（Ｗ
／ Ｖ ）の濃度で、タンパク質抽出物に添加して６
９にタンパク質に富んだ沈澱の分画を得る。タンパク質
の沈澱に普通に使用される他の試薬、例えば、硫酸アン
モニウムまたは有機溶媒、例えば、エタノールまたはア
セトンは、また、適当であろう。タンパク質抽出物から
のタンパク質の直ちの沈澱は、６９にタンパク質の安定
性に悪影響を及ぼし得る抽出物中の他の他の物質からの
６９にタンパク質の分離に有益であることがある。さら
に、直ちの沈澱は、そうでなければ要求される長たらし
い透析手順と必要とせずに、タンパク質抽出物を所望の
緩衝液中に濃縮された形態で再溶解することによって、
この方法をクロマトグラフィー工程に続けることができ
るようにする。
で沈澱させる。ポリエチレングリコールは、３０％（Ｗ
／ Ｖ ）の濃度で、タンパク質抽出物に添加して６
９にタンパク質に富んだ沈澱の分画を得る。タンパク質
の沈澱に普通に使用される他の試薬、例えば、硫酸アン
モニウムまたは有機溶媒、例えば、エタノールまたはア
セトンは、また、適当であろう。タンパク質抽出物から
のタンパク質の直ちの沈澱は、６９にタンパク質の安定
性に悪影響を及ぼし得る抽出物中の他の他の物質からの
６９にタンパク質の分離に有益であることがある。さら
に、直ちの沈澱は、そうでなければ要求される長たらし
い透析手順と必要とせずに、タンパク質抽出物を所望の
緩衝液中に濃縮された形態で再溶解することによって、
この方法をクロマトグラフィー工程に続けることができ
るようにする。
６９にタンパク質を沈澱した抽出タンパク質から、色素
配位子のクロマトグラフィーおよび引き続くクロマトフ
オーカシングにより回収する。予期せざることには、色
素配位子のクロマトグラフィーを第１精製工程として使
用すると、６９Ｋを包含する、あるタンパク質のみを選
択的にこの物質に結合するという利点が得られる。した
がって、汚染性タンパク質および他の汚染物質の大部分
は、それらのほとんどが結合せずそして単に通過するの
で、タンパク質抽出物から除去される。結合する汚染物
質のあるものは、色素配位子のカラムから勾配濃度の溶
離剤で示差溶離により６９にタンパク質からさらに分離
することができる。この方法のこの段階における色素配
位子のクロマトグラフィーの他の利点はその容量である
；タンパク質の大部分は結合しないので、大量の細胞か
ら由来する抽出物のクロマトグラフィーに比較的小さい
カラムを使用することができる。例えば、３０ｙ、１の
ゲルは少なくとも１２０ｇの湿潤重量の細胞からの抽出
に十分である。選択性および比較的高い容量は、比較的
小さい色素配位子のクロマトグラフィーのカラムの使用
を可能とし、その結実装入および溶離は急速となる。
配位子のクロマトグラフィーおよび引き続くクロマトフ
オーカシングにより回収する。予期せざることには、色
素配位子のクロマトグラフィーを第１精製工程として使
用すると、６９Ｋを包含する、あるタンパク質のみを選
択的にこの物質に結合するという利点が得られる。した
がって、汚染性タンパク質および他の汚染物質の大部分
は、それらのほとんどが結合せずそして単に通過するの
で、タンパク質抽出物から除去される。結合する汚染物
質のあるものは、色素配位子のカラムから勾配濃度の溶
離剤で示差溶離により６９にタンパク質からさらに分離
することができる。この方法のこの段階における色素配
位子のクロマトグラフィーの他の利点はその容量である
；タンパク質の大部分は結合しないので、大量の細胞か
ら由来する抽出物のクロマトグラフィーに比較的小さい
カラムを使用することができる。例えば、３０ｙ、１の
ゲルは少なくとも１２０ｇの湿潤重量の細胞からの抽出
に十分である。選択性および比較的高い容量は、比較的
小さい色素配位子のクロマトグラフィーのカラムの使用
を可能とし、その結実装入および溶離は急速となる。
適当な色素配位子のクロマトグラフィーのマトリックス
は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６９にタン
パク質に結合する、タンパク質特異的結合媒体、例えば
、色素を含有する親和性マトリックスを包含する。ヌク
レオチドに類似する構造を有する有機分子である色素配
位子は、とくに有用である。このようなマトリックスの
例は、アフィーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂ
ｌｕｅ）［バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）コ、ブルー
−セファ０−ス（Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ
−６Ｂ、レッド（Ｒｅｄ）−セファロースＣＬ−６Ｂ
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］である。
は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６９にタン
パク質に結合する、タンパク質特異的結合媒体、例えば
、色素を含有する親和性マトリックスを包含する。ヌク
レオチドに類似する構造を有する有機分子である色素配
位子は、とくに有用である。このようなマトリックスの
例は、アフィーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂ
ｌｕｅ）［バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）コ、ブルー
−セファ０−ス（Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ
−６Ｂ、レッド（Ｒｅｄ）−セファロースＣＬ−６Ｂ
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］である。
色素配位子のクロマトグラフィーを達成するために、沈
澱したタンパク質抽出物を、はぼ６〜８゜５のｐＨ範囲
で低いイオン強度の緩衝液、好ましくはｐＨ７，４にお
いて０．０５モルのトリス−ヒドロキシメチルアミノメ
タン（トリス）溶液中に再溶解する。次いで、溶解した
タンパク質抽出物の沈澱物を、上の緩衝液中で平衡化し
た、マトリックス、例えば、アフィーゲル・ブルー（Ａ
ｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）［パイオーラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）］、］ブルーーセファ０−スＢｌｕｅ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ、レッド（Ｒｅｄ）−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂ ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）］または他の色素配位子ゲル、好ましくはアフィ
ーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）を充
填したクロマトグラフィーのカラムに適用する。タンパ
ク質抽出物の沈澱物をカラム上に装入した後、このカラ
ムを平衡化緩衝液で洗浄する。次いで、カラムに結合し
た６９にタンパク質を、タンパク質−配位子の相互作用
を崩壊する塩または他の物質の溶液で溶離する。溶離剤
は塩、例えば、ＭｇＣ１，、ＮａＣ１゜ＫＣＩなどであ
ることができる。カオトローツプ剤として酢酸塩する、
他の溶離剤、例えば、ＫＳＣＮまたは尿素をまた使用で
きるであろう。あるいは、生物特異的化合物、例えば、
ＭＡＤ＋、ＡＴＰまたは他のヌクレオチドを溶離剤とし
て使用できるであろう。Ｍ ｇ Ｃ１２は安価でありそ
して、低い濃度において、タンパク質の構造に悪影響を
及ぼすさないと思われるので、それを使用することが好
ましい。さらに、ＭｇＣｌ２溶離剤は０〜０゜５モルの
直線の勾配で使用することが好ましく、これはさらに増
加するＭｇ−濃度で示差溶離により汚染物質から６９Ｋ
を分離する。溶離した分画中の６９にタンパク質の存在
は、試料の電気泳動の分析によるか、あるいは６９にタ
ンパク質に対して特異的なアッセイ、例えば、ＥＬ Ｉ
ＳＡまたは抗６９に抗体を使用するドツト・プロット
のイムノアッセイにより監視することができる。 色素
配位子のクロマトグラフィー工程からの６９にタンパク
質を含有する溶離液を透析して、ＭｇＣｌ２を除去し、
そしてクロマトフオーカシング支持体の実施に適当な緩
衝液中で溶離液を調製する。
澱したタンパク質抽出物を、はぼ６〜８゜５のｐＨ範囲
で低いイオン強度の緩衝液、好ましくはｐＨ７，４にお
いて０．０５モルのトリス−ヒドロキシメチルアミノメ
タン（トリス）溶液中に再溶解する。次いで、溶解した
タンパク質抽出物の沈澱物を、上の緩衝液中で平衡化し
た、マトリックス、例えば、アフィーゲル・ブルー（Ａ
ｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）［パイオーラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）］、］ブルーーセファ０−スＢｌｕｅ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ、レッド（Ｒｅｄ）−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂ ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）］または他の色素配位子ゲル、好ましくはアフィ
ーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）を充
填したクロマトグラフィーのカラムに適用する。タンパ
ク質抽出物の沈澱物をカラム上に装入した後、このカラ
ムを平衡化緩衝液で洗浄する。次いで、カラムに結合し
た６９にタンパク質を、タンパク質−配位子の相互作用
を崩壊する塩または他の物質の溶液で溶離する。溶離剤
は塩、例えば、ＭｇＣ１，、ＮａＣ１゜ＫＣＩなどであ
ることができる。カオトローツプ剤として酢酸塩する、
他の溶離剤、例えば、ＫＳＣＮまたは尿素をまた使用で
きるであろう。あるいは、生物特異的化合物、例えば、
ＭＡＤ＋、ＡＴＰまたは他のヌクレオチドを溶離剤とし
て使用できるであろう。Ｍ ｇ Ｃ１２は安価でありそ
して、低い濃度において、タンパク質の構造に悪影響を
及ぼすさないと思われるので、それを使用することが好
ましい。さらに、ＭｇＣｌ２溶離剤は０〜０゜５モルの
直線の勾配で使用することが好ましく、これはさらに増
加するＭｇ−濃度で示差溶離により汚染物質から６９Ｋ
を分離する。溶離した分画中の６９にタンパク質の存在
は、試料の電気泳動の分析によるか、あるいは６９にタ
ンパク質に対して特異的なアッセイ、例えば、ＥＬ Ｉ
ＳＡまたは抗６９に抗体を使用するドツト・プロット
のイムノアッセイにより監視することができる。 色素
配位子のクロマトグラフィー工程からの６９にタンパク
質を含有する溶離液を透析して、ＭｇＣｌ２を除去し、
そしてクロマトフオーカシング支持体の実施に適当な緩
衝液中で溶離液を調製する。
他の方法、例えば、脱塩ゲルのカラムを使用する透析濾
過を、また、使用することができる。電気泳動、特異的
イムノアッセイまたは任意の他の適当な手段により決定
して、アフィーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂ
ｌｕｅ）のカラムから溶離された６９にタンパク質を含
有する分画をプールし、次いで低いイオン強度および高
いｐＨの緩衝液、好ましくは０．０２５モルのエタノー
ルアミン／アセテートｐＨ９，４に対して透析する。
過を、また、使用することができる。電気泳動、特異的
イムノアッセイまたは任意の他の適当な手段により決定
して、アフィーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂ
ｌｕｅ）のカラムから溶離された６９にタンパク質を含
有する分画をプールし、次いで低いイオン強度および高
いｐＨの緩衝液、好ましくは０．０２５モルのエタノー
ルアミン／アセテートｐＨ９，４に対して透析する。
最後の精製は、高いｐＨで結合しそして低下するｐＨの
勾配で溶離するタイプのクロマトフオーカシングのマト
リックスを利用する。クロマトフオーカシングの作業は
、６９にタンパク質の回収のための最後の精製工程とし
てとくに有効である。
勾配で溶離するタイプのクロマトフオーカシングのマト
リックスを利用する。クロマトフオーカシングの作業は
、６９にタンパク質の回収のための最後の精製工程とし
てとくに有効である。
かなり小さいカラムは、大量の細胞から由来する部分的
に精製した材料のために十分な容量を有する。低いイオ
ン強度／高いｐＨの緩衝液、好ましくは０．０２５モル
のエタノールアミン／アセテートｐＨ９，４中で平衡化
した、クロマトフオーカシングゲル、例えば、ポリバッ
ファー・エキスチェンジャー・ゲル（Ｐｏｌｙｂｕｆｆ
ｅｒ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ Ｇｅ１）ＰＢＥ９４を
クロマトグラフィーのカラムに充填する。色素配位子の
クロマトグラフィー工程からの透析した溶離液をカラム
上に適用し、次いでこのカラムを１床体積の平衡化結合
で洗浄する。結合したタンパク質を低下するｐＨ（９，
４から６．０）の勾配で溶離し、これはほぼ１２床体積
の酢酸でｐＨ６に調節したポリバッファー９６ ［ファ
ーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の１／１０希釈物を
カラムに通過させることによって達成する。カラムから
溶離した分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマツシー・
ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）を使用する
染色により分析すると、６９にはクロマトフオーカシン
グのカラムにより残る汚染物質から効果的に分離し、そ
してタンパク質は、同一タンパク質の等電点の変動に相
当する、ｐＨ７，２および６．５において、２つのピー
クとして再現的に溶離される。この方法は高い純度の精
製された６９に調製物を生じ、これはバクテリアのエン
ドトキシンによる汚染を本質的に含まない。
に精製した材料のために十分な容量を有する。低いイオ
ン強度／高いｐＨの緩衝液、好ましくは０．０２５モル
のエタノールアミン／アセテートｐＨ９，４中で平衡化
した、クロマトフオーカシングゲル、例えば、ポリバッ
ファー・エキスチェンジャー・ゲル（Ｐｏｌｙｂｕｆｆ
ｅｒ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ Ｇｅ１）ＰＢＥ９４を
クロマトグラフィーのカラムに充填する。色素配位子の
クロマトグラフィー工程からの透析した溶離液をカラム
上に適用し、次いでこのカラムを１床体積の平衡化結合
で洗浄する。結合したタンパク質を低下するｐＨ（９，
４から６．０）の勾配で溶離し、これはほぼ１２床体積
の酢酸でｐＨ６に調節したポリバッファー９６ ［ファ
ーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の１／１０希釈物を
カラムに通過させることによって達成する。カラムから
溶離した分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマツシー・
ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）を使用する
染色により分析すると、６９にはクロマトフオーカシン
グのカラムにより残る汚染物質から効果的に分離し、そ
してタンパク質は、同一タンパク質の等電点の変動に相
当する、ｐＨ７，２および６．５において、２つのピー
クとして再現的に溶離される。この方法は高い純度の精
製された６９に調製物を生じ、これはバクテリアのエン
ドトキシンによる汚染を本質的に含まない。
ポリバッファーの溶離剤系を使用するファーマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）ＰＢＥゲルは便利な商業的に入手可
能な材料であるが、６９にタンパク質の最後の精製はイ
オン交換ゲル系により達成することができ、この系は高
いｐＨにおいてタンパク質と結合し、そして低下するｐ
Ｈ勾配においてそれらの溶離を可能とする。
ｈａｒｍａｃｉａ）ＰＢＥゲルは便利な商業的に入手可
能な材料であるが、６９にタンパク質の最後の精製はイ
オン交換ゲル系により達成することができ、この系は高
いｐＨにおいてタンパク質と結合し、そして低下するｐ
Ｈ勾配においてそれらの溶離を可能とする。
本発明に従い産生された純粋な６９に材料を利用して、
哺乳動物において百日咳に対する免疫性を誘発するため
の細胞を含まない百日咳菌（Ｂ。
哺乳動物において百日咳に対する免疫性を誘発するため
の細胞を含まない百日咳菌（Ｂ。
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン配合物を産生ずることが
できる。こうして、６９にタンパク質を製剤学的に許容
されうる担体、例えば、任意の適当な液状媒質と混合す
ることができる。このような担体の１例は生理的食塩溶
液である。抗原性タンパク質は担体中に溶解するか、あ
るいは固体として懸濁することができる。ワクチン配合
物は、また、免疫応答を刺激し、これによりワクチンの
効能を増強するためのアジュバントからなることができ
る。本発明において使用に便利なアジュバントは、例え
ば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムを包
含する。便利には、ワクチン配合物は０．０１〜５ｍｇ
／ｍｆ、好ましくは０．０３〜２ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ
、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｍ１の範囲の最終濃度
で抗原性タンパク質を含有するようにして提供される。
できる。こうして、６９にタンパク質を製剤学的に許容
されうる担体、例えば、任意の適当な液状媒質と混合す
ることができる。このような担体の１例は生理的食塩溶
液である。抗原性タンパク質は担体中に溶解するか、あ
るいは固体として懸濁することができる。ワクチン配合
物は、また、免疫応答を刺激し、これによりワクチンの
効能を増強するためのアジュバントからなることができ
る。本発明において使用に便利なアジュバントは、例え
ば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムを包
含する。便利には、ワクチン配合物は０．０１〜５ｍｇ
／ｍｆ、好ましくは０．０３〜２ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ
、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｍ１の範囲の最終濃度
で抗原性タンパク質を含有するようにして提供される。
配合後、ワクチンは無菌の容器中に入れ、次いでこの容
器を密閉し、そして低温、例えば、４℃で貯蔵するか、
あるいは凍結乾燥することができる。人間において百日
咳に対する免疫性を誘発するために、１または２以上の
投与量の適当に配合したワクチンを投与することができ
る。各投与量は０．１〜２ｍｌ！、好ましくは０．２〜
Ｉｎｎ、最も好ましくは（Ｊ、５ｔｓｌのワクチンであ
ることが推奨される。本発明は、それ以上の面において
、宿主に、前に定義した、ワクチン配合物の有効量を投
与することからなる、人間を包含する哺乳動物において
百日咳に対する免疫性を誘発する方法を提供する。本発
明のワクチンは、経口的および非経口的（例えば、皮下
または筋肉内）注射を包含する慣用方法により投与する
ことができる。処置はワクチンの単一の投与またはある
期間にわたる複数の投与量から成ることができる。本発
明によるワクチンは、また、１または２以上の他の抗原
性成分、例えば、適当にトキソイド化ＬＰＦを含んで、
同時の免疫応答回避する百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）の突然変異菌株の傾向を減少することができる。
器を密閉し、そして低温、例えば、４℃で貯蔵するか、
あるいは凍結乾燥することができる。人間において百日
咳に対する免疫性を誘発するために、１または２以上の
投与量の適当に配合したワクチンを投与することができ
る。各投与量は０．１〜２ｍｌ！、好ましくは０．２〜
Ｉｎｎ、最も好ましくは（Ｊ、５ｔｓｌのワクチンであ
ることが推奨される。本発明は、それ以上の面において
、宿主に、前に定義した、ワクチン配合物の有効量を投
与することからなる、人間を包含する哺乳動物において
百日咳に対する免疫性を誘発する方法を提供する。本発
明のワクチンは、経口的および非経口的（例えば、皮下
または筋肉内）注射を包含する慣用方法により投与する
ことができる。処置はワクチンの単一の投与またはある
期間にわたる複数の投与量から成ることができる。本発
明によるワクチンは、また、１または２以上の他の抗原
性成分、例えば、適当にトキソイド化ＬＰＦを含んで、
同時の免疫応答回避する百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）の突然変異菌株の傾向を減少することができる。
本発明の方法により産生された純粋な６９に材料は、ま
た、病気またはワクチン接種に対する免疫応答の評価に
おいて、分析または診断の目的で利用できる。例えば、
特異的抗体の検出についてのＥＬＩ ＳＡ技術（酵素連
鎖免疫収着アッセイ）は、関連する抗原源を必要とする
。本発明の方法により精製された６９にタンパク質は、
汚染物質を含有せず、こうして６９にタンパク質に対し
て向けられた明瞭な検出および定量のためのＥＬＩＳＡ
において使用するために望ましいタンパク質調製物であ
ろう。それは、また、免疫応答の測定のための精製した
抗原を必要とする、任意の他の免疫学的方法において使
用できるであろう。同様に、精製した６９には特異的抗
体の開発の免疫原として使用することができ、次いでこ
れは６９にタンパク質の特異的認識を包含する診断方法
の他の免疫学的応用において使用できるであろう。
た、病気またはワクチン接種に対する免疫応答の評価に
おいて、分析または診断の目的で利用できる。例えば、
特異的抗体の検出についてのＥＬＩ ＳＡ技術（酵素連
鎖免疫収着アッセイ）は、関連する抗原源を必要とする
。本発明の方法により精製された６９にタンパク質は、
汚染物質を含有せず、こうして６９にタンパク質に対し
て向けられた明瞭な検出および定量のためのＥＬＩＳＡ
において使用するために望ましいタンパク質調製物であ
ろう。それは、また、免疫応答の測定のための精製した
抗原を必要とする、任意の他の免疫学的方法において使
用できるであろう。同様に、精製した６９には特異的抗
体の開発の免疫原として使用することができ、次いでこ
れは６９にタンパク質の特異的認識を包含する診断方法
の他の免疫学的応用において使用できるであろう。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例１
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
Ｗ、およびショルテ（Ｓｃｈｏｌｔｅ）、Ｍ、Ｊ。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３ ：
２１１−２２０］中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。培養物が３７℃の温度に
あるとき、チメロサールを培養物に添加し、そして不活
性化を一夜実施し、その間温度を１０〜１５℃に低下さ
せる。不活性化した細胞を遠心により回収し、そして湿
潤した細胞のペースト（１１２ｇ）０．０１モルのリン
酸塩緩衝液ｐＨ７，２（ＰＢＳ）中で６４０ｍ１の最終
体積に懸濁する。懸濁液を６０℃において９０分間イン
キュベーションし、次いで細胞を遠心により除去し、そ
して上澄み液を４℃で取って置く。
２１１−２２０］中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。培養物が３７℃の温度に
あるとき、チメロサールを培養物に添加し、そして不活
性化を一夜実施し、その間温度を１０〜１５℃に低下さ
せる。不活性化した細胞を遠心により回収し、そして湿
潤した細胞のペースト（１１２ｇ）０．０１モルのリン
酸塩緩衝液ｐＨ７，２（ＰＢＳ）中で６４０ｍ１の最終
体積に懸濁する。懸濁液を６０℃において９０分間イン
キュベーションし、次いで細胞を遠心により除去し、そ
して上澄み液を４℃で取って置く。
細胞を再びリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で６４０ｍ１の
最終体積に懸濁し、６０℃において９０分間インキュベ
ーションし、そして細胞を遠心により除去する。この第
２インキユベーシヨンからの上澄み液を第１上澄み液と
一緒にし、そして４℃で貯蔵する。細胞を、前述したよ
うに、リン酸塩緩衝液中に第３回目に再懸濁し、そして
細胞を遠心除去する。第３上澄み液を最初の２つと４℃
において一緒にする。−緒にした上澄み液のプール中の
タンパク質を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ、分子量８０００）を３０％（Ｗ／Ｖ）
に徐々に添加することによって沈澱する。生ずる沈澱物
を遠心（１０，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、
そして上澄み液を廃棄する。ベレットを０．０５モルの
トリスｐＨ７，４（緩衝液Ａ）から成る８３０ｍ１の緩
衝液中に再溶解する。このタンパク質溶液は細胞表面の
抽出物（ＣＳ Ｅ）を表す。
最終体積に懸濁し、６０℃において９０分間インキュベ
ーションし、そして細胞を遠心により除去する。この第
２インキユベーシヨンからの上澄み液を第１上澄み液と
一緒にし、そして４℃で貯蔵する。細胞を、前述したよ
うに、リン酸塩緩衝液中に第３回目に再懸濁し、そして
細胞を遠心除去する。第３上澄み液を最初の２つと４℃
において一緒にする。−緒にした上澄み液のプール中の
タンパク質を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ、分子量８０００）を３０％（Ｗ／Ｖ）
に徐々に添加することによって沈澱する。生ずる沈澱物
を遠心（１０，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、
そして上澄み液を廃棄する。ベレットを０．０５モルの
トリスｐＨ７，４（緩衝液Ａ）から成る８３０ｍ１の緩
衝液中に再溶解する。このタンパク質溶液は細胞表面の
抽出物（ＣＳ Ｅ）を表す。
Ｃ３Ｅ中の６９にタンパク質の濃度をドツトプロットイ
ムノアッセイにより測定し、ここで無菌的に希釈した試
料および精製した６９にの標準をニトロセルロース膜上
にスポツティングし、そしてまず特異的抗６９に抗体と
反応させ、次いでペルオキシダーゼ接合抗体と反応させ
、最後にペルオキシドおよびペルオキシダーゼの存在下
に色を発現する試薬（４−クロロ−１−ナフトール）と
反応させる。イムノアッセイの結果は、５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで実施した試料中の６９にのバンドの比較的比率に基
づく測定と一致する。ドツトプロットイムノアッセイに
より測定したとき、Ｃ８Ｅの６９に含量はＣ３Ｅの調製
に使用した細胞の１ｇの湿潤重量当たり５７０ｇｇの６
９にである。
ムノアッセイにより測定し、ここで無菌的に希釈した試
料および精製した６９にの標準をニトロセルロース膜上
にスポツティングし、そしてまず特異的抗６９に抗体と
反応させ、次いでペルオキシダーゼ接合抗体と反応させ
、最後にペルオキシドおよびペルオキシダーゼの存在下
に色を発現する試薬（４−クロロ−１−ナフトール）と
反応させる。イムノアッセイの結果は、５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで実施した試料中の６９にのバンドの比較的比率に基
づく測定と一致する。ドツトプロットイムノアッセイに
より測定したとき、Ｃ８Ｅの６９に含量はＣ３Ｅの調製
に使用した細胞の１ｇの湿潤重量当たり５７０ｇｇの６
９にである。
細胞表面の抽出物の色素配位子のクロマトグラフイアフ
ィーゲル・ブルー（Ａｆ ｆ ｉ−ｇｅ ｌ Ｂｌｕ
ｅ）［バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）］を緩衝液Ａで
洗浄し、そして平衡化し、そして約２゜５ｘ９ｃｍ（約
３Ｑｍｉ’の床体積）のカラム中に充填する。８３０ｍ
１の細胞表面の抽出物をカラムに適用し、次いで１床体
積の緩衝液Ａで洗浄する。カラムをまず緩衝液Ａ中の０
〜０．５モルの塩化マグネシウムの直線の勾配（各５０
ｍｊｌ’）で洗浄し、次いで３０ｍ１の塩化マグネシウ
ムで洗浄する。最後に、５Ｑｍｆの２モルの塩化マグネ
シウムをカラムに通過させる。溶離液中のタンパク質を
２８０ｎｍにおける吸収により監視する。
ィーゲル・ブルー（Ａｆ ｆ ｉ−ｇｅ ｌ Ｂｌｕ
ｅ）［バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）］を緩衝液Ａで
洗浄し、そして平衡化し、そして約２゜５ｘ９ｃｍ（約
３Ｑｍｉ’の床体積）のカラム中に充填する。８３０ｍ
１の細胞表面の抽出物をカラムに適用し、次いで１床体
積の緩衝液Ａで洗浄する。カラムをまず緩衝液Ａ中の０
〜０．５モルの塩化マグネシウムの直線の勾配（各５０
ｍｊｌ’）で洗浄し、次いで３０ｍ１の塩化マグネシウ
ムで洗浄する。最後に、５Ｑｍｆの２モルの塩化マグネ
シウムをカラムに通過させる。溶離液中のタンパク質を
２８０ｎｍにおける吸収により監視する。
主なピークは塩化マグネシウムの勾配で溶離するとき観
測される。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分画の分析は、溶離
液のピークを表す分画中に大きく濃縮した６９にタンパ
ク質を示す。それらを−緒にし、そして０．０２５モル
のエタノールアミン／アセテートｐＨ９，４（緩衝液Ｂ
）に対して透析する。
測される。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分画の分析は、溶離
液のピークを表す分画中に大きく濃縮した６９にタンパ
ク質を示す。それらを−緒にし、そして０．０２５モル
のエタノールアミン／アセテートｐＨ９，４（緩衝液Ｂ
）に対して透析する。
クロマトフオーカシング
クロマトフオーカシング支持体は、緩衝液Ｂ中で平衡化
しそして１．７Ｘ１５ｃｍのカラム中に充填したポリバ
ッファー交換体ＰＢＥ９４ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）］ （約３５ｍ１のゲル）である。アフィー
ゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）カラム
からの透析した溶離液のプール（約１３５ｍｆ）をＰＢ
Ｅカラム上に適用し、次いで１床体積の緩衝液Ｂで洗浄
する。
しそして１．７Ｘ１５ｃｍのカラム中に充填したポリバ
ッファー交換体ＰＢＥ９４ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）］ （約３５ｍ１のゲル）である。アフィー
ゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）カラム
からの透析した溶離液のプール（約１３５ｍｆ）をＰＢ
Ｅカラム上に適用し、次いで１床体積の緩衝液Ｂで洗浄
する。
カラムを、酢酸でｐＨ６に調節したポリバッファー９６
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の１／１０希
釈物の４００ｍ１を通過させることによって、自己形成
勾配（ｐＨ９，４〜６．０）で溶離する。いくらかのタ
ンパク質（Ａ２８０により監視して）はカラムにより保
持されなかった。
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の１／１０希
釈物の４００ｍ１を通過させることによって、自己形成
勾配（ｐＨ９，４〜６．０）で溶離する。いくらかのタ
ンパク質（Ａ２８０により監視して）はカラムにより保
持されなかった。
ｐＨの勾配は、いくつかのピーク、最も主としてｐＨ７
，２および６．５におけるピークの溶離を生ずる。抗６
９に抗体を使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン
プロットは、これらの２つのピーク中のタンパク質が高
い純度の６９にタンパク質であることを示した。ポリバ
ッファー塩を除去するために、プールした分画中のタン
パク質を溶離液の１ｍｌ当たり０．７ｇの固体の硫酸ア
ンモニウムの添加により沈澱させ、そして沈澱物を１０
、ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心することによって回収す
る。ペレットを最小体積のリン酸塩緩衝液中に再溶解す
る。この方法からの純粋な６９にタンパク質の収量は、
出発細胞材料の１ｇの湿潤重量当たり２２ｍｇである。
，２および６．５におけるピークの溶離を生ずる。抗６
９に抗体を使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン
プロットは、これらの２つのピーク中のタンパク質が高
い純度の６９にタンパク質であることを示した。ポリバ
ッファー塩を除去するために、プールした分画中のタン
パク質を溶離液の１ｍｌ当たり０．７ｇの固体の硫酸ア
ンモニウムの添加により沈澱させ、そして沈澱物を１０
、ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心することによって回収す
る。ペレットを最小体積のリン酸塩緩衝液中に再溶解す
る。この方法からの純粋な６９にタンパク質の収量は、
出発細胞材料の１ｇの湿潤重量当たり２２ｍｇである。
こうして、最初のＣ３Ｅ抽出物からの回収効率は約３５
％（１９６μｇ÷５７０μｇ）である。精製したタンパ
ク質中のバクテリアのエンドトキシンは、リムルスのア
メボサイト（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ
）リゼイト（ＬＡＬ）アッセイにより測定して、タンパ
ク質の１ｇｇ当たり０．０６ＥＵである。
％（１９６μｇ÷５７０μｇ）である。精製したタンパ
ク質中のバクテリアのエンドトキシンは、リムルスのア
メボサイト（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ
）リゼイト（ＬＡＬ）アッセイにより測定して、タンパ
ク質の１ｇｇ当たり０．０６ＥＵである。
実施例２
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ） 、Ｄ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ） 、Ｄ。
Ｗ、およびショルテ（Ｓｃｈｏ ｌ ｔ ｅ） 、Ｍ、
Ｊ。
Ｊ。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３ ：
２１１−２２０］中で増殖させ、そして不活性化しな
い。細胞を遠心により回収し、そして湿潤細胞ペースト
（２６ｇ）をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中に６２ｍｆの
最終体積に懸濁する。懸濁液を６０℃において９０分間
インキュベーションし、次いで細胞を遠心により除去し
、そして上澄み液を４℃で取って置く。上澄み液中のタ
ンパク質を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ、分子量８０００）を３０％（Ｗ／Ｖ）に
徐々に添加することによって沈澱する。生ずる沈澱物を
遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０分）により回収し、そ
して上澄み液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのト
リスｐＨ７，４（緩衝液Ａ）から成る２ ２ｍｌ！の緩
衝液中に再溶解する。このタンパク質溶液は細胞表面の
抽出物（ＣＳ Ｅ）を表す。
２１１−２２０］中で増殖させ、そして不活性化しな
い。細胞を遠心により回収し、そして湿潤細胞ペースト
（２６ｇ）をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中に６２ｍｆの
最終体積に懸濁する。懸濁液を６０℃において９０分間
インキュベーションし、次いで細胞を遠心により除去し
、そして上澄み液を４℃で取って置く。上澄み液中のタ
ンパク質を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ、分子量８０００）を３０％（Ｗ／Ｖ）に
徐々に添加することによって沈澱する。生ずる沈澱物を
遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０分）により回収し、そ
して上澄み液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのト
リスｐＨ７，４（緩衝液Ａ）から成る２ ２ｍｌ！の緩
衝液中に再溶解する。このタンパク質溶液は細胞表面の
抽出物（ＣＳ Ｅ）を表す。
細胞表面の抽出物の色素配位子のクロマトグラフイアフ
ィーゲル・ブルー（Ａｆ ｆ ｉ−ｇｅ Ｉ ＢＪｕ
ｅ）［パイオーラド（Ｂ ｉ ｏ−Ｒａ ｄ） ］を緩
衝液Ａで洗浄し、そして平衡化し、そして約１゜７Ｘ９
ｃｍ （約２０ｍ１の床体槽）のカラム中に充填する。
ィーゲル・ブルー（Ａｆ ｆ ｉ−ｇｅ Ｉ ＢＪｕ
ｅ）［パイオーラド（Ｂ ｉ ｏ−Ｒａ ｄ） ］を緩
衝液Ａで洗浄し、そして平衡化し、そして約１゜７Ｘ９
ｃｍ （約２０ｍ１の床体槽）のカラム中に充填する。
２２ｍｆの細胞表面の抽出物をカラムに適用し、次いで
１床体積の緩衝液Ａで洗浄する。
１床体積の緩衝液Ａで洗浄する。
カラムをまず緩衝液Ａ中の０〜０．５モルの塩化マグネ
シウムの直線の勾配（各５０ｍｆ）で洗浄し、次いで３
０ｍ１の塩化マグネシウムで洗浄する。最後に、５０ｍ
１の２モルの塩化マグネシウムをカラムに通過させる。
シウムの直線の勾配（各５０ｍｆ）で洗浄し、次いで３
０ｍ１の塩化マグネシウムで洗浄する。最後に、５０ｍ
１の２モルの塩化マグネシウムをカラムに通過させる。
溶離液中のタンパク質を２８０ｎｍにおける吸収により
監視する。小さいピークは塩化マグネシウムの勾配で溶
離するとき観測される。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分画の
分析は、溶離液のピークを表す分画中に存在する６９に
タンパク質を示す。これらを−緒にし、そして０．０２
５モルのエタノールアミン／アセテートｐＨ９，４（緩
衝液Ｂ）に対して透析する。
監視する。小さいピークは塩化マグネシウムの勾配で溶
離するとき観測される。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分画の
分析は、溶離液のピークを表す分画中に存在する６９に
タンパク質を示す。これらを−緒にし、そして０．０２
５モルのエタノールアミン／アセテートｐＨ９，４（緩
衝液Ｂ）に対して透析する。
クロマトフオーカシング
クロマトフオーカシング支持体は、緩衝液Ｂ中で平衡化
しそして０．９Ｘ５ｃｍのカラム中に充填したポリバッ
ファー交換体ＰＢＥ９４ファーマシ７（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）］ （約３ｍｌのゲル）である。アフィーゲル
・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）カラムから
の透析した溶離液のプール（約２４ｍ１＞をＰＢＥカラ
ム上に適用し、次いで１床体積の緩衝液Ｂで洗浄する。
しそして０．９Ｘ５ｃｍのカラム中に充填したポリバッ
ファー交換体ＰＢＥ９４ファーマシ７（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）］ （約３ｍｌのゲル）である。アフィーゲル
・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）カラムから
の透析した溶離液のプール（約２４ｍ１＞をＰＢＥカラ
ム上に適用し、次いで１床体積の緩衝液Ｂで洗浄する。
カラムを、酢酸でｐＨ６に調節したポリバッファー９６
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｔａ）］ （７）１
／１０希釈物の４００ｍ！！を通過させることによって
、自己形成勾配（ｐＨ９，４〜６．０）で溶離する。い
＜ラカのタンパク質（Ａ２８０により監視して）はカラ
ムにより保持されなかった。ｐＨの勾配は、ｐ Ｈ７，
２および６．５におけるピークの溶離を生ずる。抗６９
に抗体を使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンプ
ロットは、これらの２つのピーク中のタンパク質が高い
純度の６９にタンパク質であることを示したが、濃度は
非常に低いので、それは凍結乾燥により約３０倍に試料
をまず濃縮しないと検出されなかった。この方法からの
純粋な６９にタンパク質の収量は０．０２ｇｇまたは細
胞材料の１ｇの湿潤重量当たり０．８μｇである。
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｔａ）］ （７）１
／１０希釈物の４００ｍ！！を通過させることによって
、自己形成勾配（ｐＨ９，４〜６．０）で溶離する。い
＜ラカのタンパク質（Ａ２８０により監視して）はカラ
ムにより保持されなかった。ｐＨの勾配は、ｐ Ｈ７，
２および６．５におけるピークの溶離を生ずる。抗６９
に抗体を使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンプ
ロットは、これらの２つのピーク中のタンパク質が高い
純度の６９にタンパク質であることを示したが、濃度は
非常に低いので、それは凍結乾燥により約３０倍に試料
をまず濃縮しないと検出されなかった。この方法からの
純粋な６９にタンパク質の収量は０．０２ｇｇまたは細
胞材料の１ｇの湿潤重量当たり０．８μｇである。
表１
９６
０．８
実施例３
細胞表面の抽出物
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナー−
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナー−
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
Ｗ、およびショルテ（Ｓｃｈｏ １ ｔｅ） 、Ｍ、Ｊ
。
。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ６３
：２１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（３７ｇ）をリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）中に２１３ｍｌの最終体積に懸濁する。この
懸濁液を２５℃において１６時間インキュベーションし
、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を４
℃で取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質を、
撹拌しながら、固体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）！：：徐々に添
加することによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１
０，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄
み液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ
７，４（緩衝液Ａ）から成る３２ｍＡ’の緩衝液中に再
溶解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（Ｃ
Ｓ Ｅ）を表す。
：２１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（３７ｇ）をリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）中に２１３ｍｌの最終体積に懸濁する。この
懸濁液を２５℃において１６時間インキュベーションし
、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を４
℃で取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質を、
撹拌しながら、固体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）！：：徐々に添
加することによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１
０，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄
み液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ
７，４（緩衝液Ａ）から成る３２ｍＡ’の緩衝液中に再
溶解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（Ｃ
Ｓ Ｅ）を表す。
Ｃ８Ｅ中の６９にタンパク質の濃度を、実施例１におけ
るようにドロットイムノアッセイおよび５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析により、細胞材料の１ｇの湿潤重量当たり７．５
μｇであると測定される。
るようにドロットイムノアッセイおよび５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析により、細胞材料の１ｇの湿潤重量当たり７．５
μｇであると測定される。
実施例４
細胞表面の抽出物
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−８ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ、Ｗ、およびショルテ（Ｓ
ｃｈｏ ｌ ｔ ｅ） 、Ｍ、Ｊ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−８ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ、Ｗ、およびショルテ（Ｓ
ｃｈｏ ｌ ｔ ｅ） 、Ｍ、Ｊ。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３：２
１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％のチメ
ロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し、そ
して湿潤細胞ペースト（３７ｇ）をリン酸塩緩衝液（Ｐ
ＢＳ）中に２１３ｍｌの最終体積に懸濁する。この懸濁
液を３７℃において１６時間インキュベーションし、次
いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を４℃で
取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質を、撹拌
しながら、固体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分
子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）ｉ、−徐々に添加す
ることによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１０，
００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄み液
を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ７，
４（緩衝液Ａ）から成る５ ９ｍＡ’の緩衝液中に再溶
解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（ＣＳ
Ｅ）を表す。
１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％のチメ
ロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し、そ
して湿潤細胞ペースト（３７ｇ）をリン酸塩緩衝液（Ｐ
ＢＳ）中に２１３ｍｌの最終体積に懸濁する。この懸濁
液を３７℃において１６時間インキュベーションし、次
いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を４℃で
取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質を、撹拌
しながら、固体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分
子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）ｉ、−徐々に添加す
ることによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１０，
００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄み液
を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ７，
４（緩衝液Ａ）から成る５ ９ｍＡ’の緩衝液中に再溶
解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（ＣＳ
Ｅ）を表す。
Ｃ８Ｅ中の６９にタンパク質の濃度を、実施例１におけ
るようにドロットイムノアッセイおよび５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析により、細胞材料の１ｇの湿潤重量当たり５３．
４μｇであると測定される。
るようにドロットイムノアッセイおよび５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析により、細胞材料の１ｇの湿潤重量当たり５３．
４μｇであると測定される。
実施例５
細胞表面の抽出物
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−８ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−８ｃｈｏ１ｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
Ｗ、およびショルテ（Ｓｃｈｏ ｌ ｔ ｅ） 、Ｍ、
Ｊ。
Ｊ。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ６３
：２１１−２２０コ中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（１１゜３ｇ、）をリン酸塩
緩衝液（ＰＢＳ）中に６５ｍｌの最終体積に懸濁する。
：２１１−２２０コ中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（１１゜３ｇ、）をリン酸塩
緩衝液（ＰＢＳ）中に６５ｍｌの最終体積に懸濁する。
この懸濁液を５０℃において６０分間インキュベーショ
ンし、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液
を４℃で取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質
を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）に徐々に添
加することによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１
０，０００ｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄
み液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ
７，４（緩衝液Ａ）から成る６９ｍｆの緩衝液中に再溶
解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（ＣＳ
Ｅ）を表す。Ｃ３Ｅ中の６９にタンパク質の濃度を、
商用タンパク質アッセイｋｉｔ［パイオーラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）］により合計のタンパク質含量を測定し、次
いで５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、染色したゲル中
の６９にのバンドとして現れる合計の百分率を測定する
ことによって決定する。こうして、濃度は出発細胞の１
ｇの湿潤重量当たり１６１μｇであることが発見された
。
ンし、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液
を４℃で取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質
を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）に徐々に添
加することによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１
０，０００ｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄
み液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ
７，４（緩衝液Ａ）から成る６９ｍｆの緩衝液中に再溶
解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（ＣＳ
Ｅ）を表す。Ｃ３Ｅ中の６９にタンパク質の濃度を、
商用タンパク質アッセイｋｉｔ［パイオーラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）］により合計のタンパク質含量を測定し、次
いで５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、染色したゲル中
の６９にのバンドとして現れる合計の百分率を測定する
ことによって決定する。こうして、濃度は出発細胞の１
ｇの湿潤重量当たり１６１μｇであることが発見された
。
実施例６
細胞表面の抽出物
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナーー
ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ）［ステイ
ナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
Ｗ、およびショルテ（Ｓｃｈｏ １ ｔ ｅ） 、Ｍ、
Ｊ。
Ｊ。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３ ：
２１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（１１゜３ｇ）をリン酸塩緩
衝液（ＰＢＳ）中に６５ｍ１の最終体積に懸濁する。こ
の懸濁液を５０℃において６０分間インキュベーション
し、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を
４℃で取りて置（。細胞を再びリン酸塩緩衝液（Ｐ Ｂ
Ｓ）中に６５ｍＩ！の最終体積に懸濁し、５０℃にお
いて６０分間インキュベーションし、そして細胞を遠心
により除去する。この第２インキユベーシヨンからの上
澄み液を第１上澄み液と別に保持し、そして４℃におい
て貯蔵する。細胞を、前述したように、リン酸塩緩衝液
中に第３回目に再懸濁し、インキュベーションし、そし
て細胞を遠心により除去する。第３上澄み液を最初の２
つと別に４℃に保持する。各上澄み液のプール中のタン
パク質を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコ−
／ｌ／（ＰＥＧ、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）
に徐々に添加することによって沈澱する。生ずる沈澱物
を遠心（１０，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、
そして上澄み液を廃棄する。ペレットの各々を０．０５
モルのトリスｐＨ７，４（緩衝液Ａ）から成る８ｍｎの
緩衝液中に再溶解する。
２１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（１１゜３ｇ）をリン酸塩緩
衝液（ＰＢＳ）中に６５ｍ１の最終体積に懸濁する。こ
の懸濁液を５０℃において６０分間インキュベーション
し、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を
４℃で取りて置（。細胞を再びリン酸塩緩衝液（Ｐ Ｂ
Ｓ）中に６５ｍＩ！の最終体積に懸濁し、５０℃にお
いて６０分間インキュベーションし、そして細胞を遠心
により除去する。この第２インキユベーシヨンからの上
澄み液を第１上澄み液と別に保持し、そして４℃におい
て貯蔵する。細胞を、前述したように、リン酸塩緩衝液
中に第３回目に再懸濁し、インキュベーションし、そし
て細胞を遠心により除去する。第３上澄み液を最初の２
つと別に４℃に保持する。各上澄み液のプール中のタン
パク質を、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコ−
／ｌ／（ＰＥＧ、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）
に徐々に添加することによって沈澱する。生ずる沈澱物
を遠心（１０，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、
そして上澄み液を廃棄する。ペレットの各々を０．０５
モルのトリスｐＨ７，４（緩衝液Ａ）から成る８ｍｎの
緩衝液中に再溶解する。
各再溶解した沈澱物を、実施例５におけるように、タン
パク質含量および６９に含量について分析する。次いで
、３つの溶液をプールし、そしてこのプールは完全な細
胞表面の抽出物（ＣＳ Ｅ）を表す。こうして、６９に
タンパク質の合計の回収は細胞材料の１ｇの湿潤重量当
たり２７１μｇであることが発見された。
パク質含量および６９に含量について分析する。次いで
、３つの溶液をプールし、そしてこのプールは完全な細
胞表面の抽出物（ＣＳ Ｅ）を表す。こうして、６９に
タンパク質の合計の回収は細胞材料の１ｇの湿潤重量当
たり２７１μｇであることが発見された。
実施例７
細胞表面の抽出物
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナー−
ショルテ（Ｓｔａ １ｎｅｒ−８ｃｈｏ１ｔｅ）［ステ
イナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
ｓ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ菌株１３０を、液状ステイナー−
ショルテ（Ｓｔａ １ｎｅｒ−８ｃｈｏ１ｔｅ）［ステ
イナー（Ｓｔａｉｎｅｒ）、Ｄ。
Ｗ、およびショルテ（Ｓｃｈｏｌｔｅ）、Ｍ、Ｊ。
１９７１、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３ ：
２１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（３７ｇ）をリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）中に２１３ｍｌの最終体積に懸濁する。この
懸濁液を６０℃において４．５分間インキュベーション
し、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を
４℃で取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質を
、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）に徐々に添加
することによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１０
，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄み
液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ７
，４（緩衝液Ａ）から成る１０３ｍ１の緩衝液中に再溶
解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（ＣＳ
Ｅ）を表す。Ｃ８Ｅ中の６９にタンパク質の濃度は、
実施例１におけるようにドツトプロットイムノアッセイ
によりおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、出発細胞の
１ｇの湿潤重量当たり２１２μｇであると測定される。
２１１−２２０１中で増殖させ、そして０゜０２％の
チメロサールで不活性化する。細胞を遠心により回収し
、そして湿潤細胞ペースト（３７ｇ）をリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）中に２１３ｍｌの最終体積に懸濁する。この
懸濁液を６０℃において４．５分間インキュベーション
し、次いで細胞を遠心により除去し、そして上澄み液を
４℃で取って置く。上澄み液のプール中のタンパク質を
、撹拌しながら、固体のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ、分子量８０００）を３０％（ｗ／ｖ）に徐々に添加
することによって沈澱する。生ずる沈澱物を遠心（１０
，００Ｏｒｐｍ、２０分）により回収し、そして上澄み
液を廃棄する。ペレットを０．０５モルのトリスｐＨ７
，４（緩衝液Ａ）から成る１０３ｍ１の緩衝液中に再溶
解する。このタンパク質溶液は細胞表面の抽出物（ＣＳ
Ｅ）を表す。Ｃ８Ｅ中の６９にタンパク質の濃度は、
実施例１におけるようにドツトプロットイムノアッセイ
によりおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、出発細胞の
１ｇの湿潤重量当たり２１２μｇであると測定される。
表２
３ ２５℃ １６ ７．５４
３７℃ １６ ５３．４５
５０℃ １ １６１．５６
５０℃ ３＊１本 ２７０．３７
６０℃ ４．５ ２１２１
６０℃ ３Ｘ１．５本 ５７０．
４＊ ３回反復抽出 本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
３７℃ １６ ５３．４５
５０℃ １ １６１．５６
５０℃ ３＊１本 ２７０．３７
６０℃ ４．５ ２１２１
６０℃ ３Ｘ１．５本 ５７０．
４＊ ３回反復抽出 本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
１、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞を静菌剤と接触することにより不活性化する
ことからなる方法。
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞を静菌剤と接触することにより不活性化する
ことからなる方法。
２、前記静菌剤はチメロサールである、上記第１項記載
の方法。
の方法。
３、前記−百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）細胞は、組み換え変型を包含する、６９
にタンパク質を発現するビルレント菌株からなる、上記
第１項記載の方法。
ｔｕｓｓｉｓ）細胞は、組み換え変型を包含する、６９
にタンパク質を発現するビルレント菌株からなる、上記
第１項記載の方法。
４、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、複数の抽出工程からなり、各抽出工程は水性媒質中に
前記細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベーショ
ンし、これにより前記細胞からタンパク質を解放し、そ
してインキュベーション後細胞から解放されたタンパク
質を分離し、これによりタンパク質抽出物を得ることか
らなる方法。
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、複数の抽出工程からなり、各抽出工程は水性媒質中に
前記細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベーショ
ンし、これにより前記細胞からタンパク質を解放し、そ
してインキュベーション後細胞から解放されたタンパク
質を分離し、これによりタンパク質抽出物を得ることか
らなる方法。
５、前記インキュベーションは約り５℃〜約６０℃の温
度において約３０〜約９０分間実施する、上記第４項記
載の方法。
度において約３０〜約９０分間実施する、上記第４項記
載の方法。
６、前記複数の抽出工程は３からなる、上記第４項記載
の方法。
の方法。
７、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞からタンパク質抽出物を獲得し、そして前記
タンパク質抽出物を色素配位子のクロマトグラフィー支
持体へ適用することによって、前記タンパク質抽出物か
ら前記的６９．０００ダルトンの分子量を有する外膜タ
ンパク質を分離し、前記色素配位子の支持体へ結合した
タンパク質を溶離し、前記色素配位子のクロマトグラフ
ィー支持体からの溶離液をクロマトフオーカシング支持
体へ適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回収
することからなる方法。
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞からタンパク質抽出物を獲得し、そして前記
タンパク質抽出物を色素配位子のクロマトグラフィー支
持体へ適用することによって、前記タンパク質抽出物か
ら前記的６９．０００ダルトンの分子量を有する外膜タ
ンパク質を分離し、前記色素配位子の支持体へ結合した
タンパク質を溶離し、前記色素配位子のクロマトグラフ
ィー支持体からの溶離液をクロマトフオーカシング支持
体へ適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回収
することからなる方法。
８、前記色素配位子のクロマトグラフィー支持体はアフ
ィーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌＢｌｕｅ）からな
る、上記第７項記載の方法。
ィーゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−ｇｅｌＢｌｕｅ）からな
る、上記第７項記載の方法。
９、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞を静菌剤と接触させて前記細胞を不活性化す
ること；複数の抽出工程、各抽出工程は水性媒質中に不
活性化した細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベ
ーションし、これにより前記細胞からタンパク質を解放
し、そしてインキュベーション後細胞から解放されたタ
ンパク質を分離し、これによりタンパク質抽出物を得る
ことからなる；前記タンパク質抽出物を色素配位子のク
ロマトグラフィー支持体へ適用することによって、前記
タンパク質抽出物から前記約６９，０００ダルトンの分
子量を有する外膜タンパク質を分離すること；色素配位
子の支持体へ結合したタンパク質を溶離し、前記色素配
位子の支持体からの溶離液をクロマトフオーカシング支
持体へ適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回
収することからなる方法。
ｓｉｓ）細胞から約６９．０００ダルトンの分子量を有
する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって
、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞を静菌剤と接触させて前記細胞を不活性化す
ること；複数の抽出工程、各抽出工程は水性媒質中に不
活性化した細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベ
ーションし、これにより前記細胞からタンパク質を解放
し、そしてインキュベーション後細胞から解放されたタ
ンパク質を分離し、これによりタンパク質抽出物を得る
ことからなる；前記タンパク質抽出物を色素配位子のク
ロマトグラフィー支持体へ適用することによって、前記
タンパク質抽出物から前記約６９，０００ダルトンの分
子量を有する外膜タンパク質を分離すること；色素配位
子の支持体へ結合したタンパク質を溶離し、前記色素配
位子の支持体からの溶離液をクロマトフオーカシング支
持体へ適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回
収することからなる方法。
１０、上記第１項記載の方法に従い抽出および精製され
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
１１、上記第４項記載の方法に従い抽出および精製され
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
１２、上記第７項記載の方法に従い抽出および精製され
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
１３、上記第９項記載の方法に従い抽出および精製され
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
た、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タン
パク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。
１４、免疫原性量の上記第９項記載のワクチンを温血動
物に投与することからなる、温血動物において百日咳菌
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６
９．０００ダルトン（６９Ｋ）の外膜タンパク質に対す
る抗体の応答を誘発する方法。
物に投与することからなる、温血動物において百日咳菌
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６
９．０００ダルトン（６９Ｋ）の外膜タンパク質に対す
る抗体の応答を誘発する方法。
１５、温血動物に上記第９項記載のワクチンを免疫原性
量でいずれかの投与の道筋で投与することからなる、温
血動物において百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）で引き起こされる病気に対して免疫
化する方法。
量でいずれかの投与の道筋で投与することからなる、温
血動物において百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）で引き起こされる病気に対して免疫
化する方法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞から約６９，０００ダルトンの分子量を有す
る外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって、
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）細胞を静菌剤と接触することにより不活性化すること
からなる方法。 ２、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞から約６９，０００ダルトンの分子量を有す
る外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって、
複数の抽出工程からなり、各抽出工程は水性媒質中に前
記細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベーション
し、これにより前記細胞からタンパク質を解放し、そし
てインキュベーション後細胞から解放されたタンパク質
を分離し、これによりタンパク質抽出物を得ることから
なる方法。 ３、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞から約６９，０００ダルトンの分子量を有す
る外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって、
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）細胞からタンパク質抽出物を獲得し、そして前記タン
パク質抽出物を色素配位子のクロマトグラフィー支持体
へ適用することによって、前記タンパク質抽出物から前
記約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパ
ク質を分離し、前記色素配位子の支持体へ結合したタン
パク質を溶離し、前記色素配位子のクロマトグラフィー
支持体からの溶離液をクロマトフォーカシング支持体へ
適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回収する
ことからなる方法。 ４、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）細胞から約６９，０００ダルトンの分子量を有す
る外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって、
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）細胞を静菌剤と接触させて前記細胞を不活性化するこ
と；複数の抽出工程、各抽出工程は水性媒質中に不活性
化した細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベーシ
ョンし、これにより前記細胞からタンパク質を解放し、
そしてインキュベーション後細胞から解放されたタンパ
ク質を分離し、これによりタンパク質抽出物を得ること
からなる；前記タンパク質抽出物を色素配位子のクロマ
トグラフィー支持体へ適用することによって、前記タン
パク質抽出物から前記約６９，０００ダルトンの分子量
を有する外膜タンパク質を分離すること；色素配位子の
支持体へ結合したタンパク質を溶離し、前記色素配位子
の支持体からの溶離液をクロマトフォーカシング支持体
へ適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回収す
ることからなる方法。 ５、上記第１項記載の方法に従い抽出および精製された
、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパ
ク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。 ６、上記第２項記載の方法に従い抽出および精製された
、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパ
ク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。 ７、上記第３項記載の方法に従い抽出および精製された
、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパ
ク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。 ８、上記第４項記載の方法に従い抽出および精製された
、約６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパ
ク質からなる、細胞を含まない百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン。 ９、免疫原性量の上記第６項記載のワクチンを温血動物
に投与することからなる、温血動物において百日咳菌（
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の６９，
０００ダルトン（６９Ｋ）の外膜タンパク質に対する抗
体の応答を誘発する方法。 １０、温血動物に上記第６項記載のワクチンを免疫原性
量でいずれかの投与の道筋で投与することからなる、温
血動物において百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）で引き起こされる病気に対して免疫化
する方法。
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