DD145705A1

DD145705A1 - METHOD OF GENERATING ORGAN SPECIFIC RETROVIRUS IMMUNE PREVENTION AGENTS FOR PROPHYLAXIS, THERAPY AND DIAGNOSTICS

Info

Publication number: DD145705A1
Application number: DD21530279A
Authority: DD
Inventors: Peter Solisch; Udo Meyer
Original assignee: Peter Solisch; Meyer Udo Aquaconsult Gmbh
Priority date: 1979-08-31
Filing date: 1979-08-31
Publication date: 1981-01-07

Abstract

Das Herstellungsverfahren von organspezifischen Retrovirusimmunpräparaten für Prophylaxe, Therapie und Diagnostik ist anwendbar auf dem Gebiet der Humanmedizin und ist dadurch gekennzeichnet, daß in befallenen Organen und Geweben bzw. ihren Tumoren ent haltene Retroviren direkt oder nach Zwischenschaltung von Zellkulturpassagen angereichert und gereinigt werden und daß die wirksamen, aber unschädlichen bzw. inaktivierten Virusbestandteile als organspezifisches Prophylaktikum, Therapeutikum bzw. Diagnostikum zur spezifischen serologischen und organspezifischen Diagnostik zellvermittelter Immunreaktionen bei durch Retroviren bedingten Infektionen (Geschwülste) des Menschen einsetzbar sind.The preparation method of organ-specific retrovirus immuno-preparations for prophylaxis, therapy and diagnostics is applicable in the field of human medicine and is characterized in that contained in affected organs and tissues or their tum ble retroviruses are enriched and purified directly or after the interposition of cell culture passages and that the effective , but harmless or inactivated viral components can be used as an organ-specific prophylactic, therapeutic or diagnostic agent for specific serological and organ-specific diagnostics of cell-mediated immune reactions in retrovirus-related infections (tumors) in humans.

Description

Herstellungsverfahren von organspgzif_ischen Retrovirtisimmun-. präparaten für Prophylaxe, Therapie und Diagnostik Preparation process of organzspgzifische n Retrovirtisimmun- . Preparations for prophylaxis, therapy and diagnostics

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft die massenweise, hochgereinigte'-Gewinmmg von humanen Retroviren aus erkrankten Geweben, Organen und deren Tumoren einschließlich ihrer Züchtung in Warmblüter-. zellkultur en. Die Erfindung betrifft'weiter die Anwendung der gewonnenen virushaltigen Immunpräparate zur organspezif !.sehen Diagnostik und Therapie, der durch Retroviren induzierten Infektionen des Menschen»The invention pertains to the mass, highly purified amounts of human retroviruses from diseased tissues, organs and their tumors, including their breeding in warm-blooded animals. cell culture. The invention relates further to the use of the obtained virus-containing immuno-preparations for organ-specific diagnosis and therapy of retrovirus-induced human infections.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Die in der Patentanmeldung A 61 K/214 631 "Verfahren zur Herstellung von Immunpräparaten gegen Geschwulstkrankheiten" geschützten Erfindungen haben zum Ziel, Infektionen und Geschwülste, die durch Retroviren ausgelöst v/erden, zu bekämpfen« Die Wirksamkeit der ^iren beruht auf ihrer außerordentlich großen Interspeziesverwandtschaft. Diese gestattet es, die Retrovirusinfektion des GesamtOrganismus, zu diagnostizieren, .zu therapier en oder Prophylaxe zu üben« Ein zusätzlicher gewe"bs- oder organspezifischer Effekt ist nicht vorhanden«The inventions protected in the patent application A 61 K / 214 631 "Process for the preparation of immuno-preparations against tumor diseases" are aimed at combating infections and tumors which are caused by retroviruses. The effectiveness of the organisms is based on their extremely great interspecies relationship. This makes it possible to diagnose the retroviral infection of the whole organism, to treat it or to practice prophylaxis "An additional body or organ-specific effect does not exist."

Ziel der Erfindung -Object of the invention

Der nützliche Effekt bei der Anwendung der Erfindung, der im Vergleich zu den bereits bekannten Lösungen erreicht wird.,- besteht in Folgendem: Die Retroviren werden aus erkrankten Geweben und Organen bzw.The useful effect in the application of the invention, which is achieved in comparison with the already known solutions., - consists in the following: The retroviruses are from diseased tissues and organs or

deren Tumoren oder über Zwischenschaltung von Warmbluterzellkulturpässagen gewonnen-, gereinigt, konzentriert und zu einem Immunpräparat aufgearbeitet, wobei die spesifische Dichte dieser Viren 1,Ί6 bis 1/18 g/ml beträgt und Berücksichtigung findet.. Das'Präparat wird auf Reinheit: geprüft.whose tumors or through the interposition of Warmbluterzellkulturpässagen won-, purified, concentrated and worked up to an immunoassay, the spesifische density of these viruses is 1, Ί6 to 1/18 g / ml and takes into account .. Die'Präparat is tested for purity.

Dem Herstellungverfahren liegt die Absicht zugrunde, das gesamte Virus mit allen virus- und herkunftsspesifischen Strukturen zu erhalten« Der bedeutendste Vorzug dieses Torgehens besteht darin, die diagnostische und therapeutische Spesifitat nicht nur für eine Retrovirusinfektion einzusetzen, sondern die Retrovirusinfektion eines bestimmten Organs oder Organsystems des Menschen, zu erkennen und zu behandeln.The manufacturing process is based on the intention to preserve the entire virus with all viral and source-specific structures. "The most important advantage of this Torgeht is to use the diagnostic and therapeutic Spesifitat not only for a retrovirus infection, but the retrovirus infection of a particular organ or organ system of the human to recognize and treat.

Wesen der Erfindung .Essence of the invention.

Die Retroviren besitsen auf ihrer Oberfläche nicht nur die zu -0 ihrer Virusart (Typ, Gruppe, Familie) gehörenden Strukturen (Antigene), sondern sie entnehmen den- Organen und Herkunfts-~ gewöben, d.h. ihrem "Vecrihehrüngsort spesifische Strükturelemen.t€ (Antigene). Somit sind die Retroviren auch den Zellober— flächen ihres Herkunftsortes entigenverv/andt.The retroviruses not only possess the structures (antigens) belonging to their type of virus (type, group, family) on their surface, but also derive them from the organs and lineages, i. Their retroviruses are also involved in the cell surface of their place of origin.

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Bei dem angewandten Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der Retroviren werden alle Retrovirusoberflächenstrukturen erhalten und ermöglichen die organspezifische Anwendung der Immunpräparate,' vorausgesetzt, daß Retroviruspräparationen entsprechend ihres Herkunftsgewebes, d.h. organspezifisch eingesetat werden« . The method used to recover and purify the retroviruses preserves all retrovirus surface structures and allows the organ-specific application of the immuno-preparations, provided that retrovirus preparations are made according to their source tissue, i. are organically specific ".

Es wurde gefunden, daß mit Hilfe von Anreicherungs- und Reinigungsverfahren einschließlich der Dichtegradientenzentrifugatiön und Chromatographie, Retroviren des Menschen zu hochgereinigten Immunpräparaten aufbereitet werden können· Für die Gewinnung dieser Viren werden infizierte Gewebe, Organe und deren Tumoren des Menschen verwendet. Die so gewonnenen Immunpräparate können direkt isoliert oder nach Zwischenschaltung von V/armblüterzellkulturpassagen gewonnen werden, . . '.. ' . ' . .' ' . It has been found that by means of enrichment and purification processes, including density gradient centrifugation and chromatography, human retroviruses can be prepared into highly purified immuno-preparations. For the recovery of these viruses, infected tissues, organs and their tumors of humans are used. The immune preparations obtained in this way can be isolated directly or obtained after the interposition of V / arm blood cell culture passages,. , '..'. '. . ' '.

Es wurde weiter gefunden, daß .nach Anwendung gebräuchlicher Reinigungsverfahren das ungeschädigte Virus.mit einer speai-' fischen Dichte τοη 1,15 bis 1,18 g/ml gewonnen werden kann und nach Prüfung auf Reinheit mit Hilfe der Elektronenmikroskopie, inimunchemischer und anderer Verfahren als diagnostisches therapeutisches Immunpräparat mit hoher Gewebs— und Organ- bzw. Krankheitsspesifität zur Verfügung steht.It has further been found that after applying conventional purification methods, the undamaged virus can be recovered at a spike density of 1.15 to 1.18 g / ml and, after testing for purity, by electron microscopy, inimunchemic and other methods is available as a diagnostic therapeutic immuno-preparation with high tissue and organ or disease soreness.

Die Anwendung kann erfolgen:The application can be done:

- sit und.ohne thermische Inaktivierung ...- sit and.without thermal inactivation ...

- mit und ohne inaktivierende Zusätze- with and without inactivating additives

- mit und ohne Adjuvantien- with and without adjuvants

-als komplettes.Virion oder als Mischantigen von immunisierenden· Virusbestandteilen bay/, als Präparat eines immunisierenden Virusbestandteiles . .. . , .as a complete virion or as a mixed antigen of immunizing virus components bay /, as a preparation of an immunizing viral component. ... ,.

- als wässrige Suspension oder als I^ophilisat- As an aqueous suspension or as Iphilisat

Die aus infizierten Geweben, Organen und deren Tumoren gewönnenen Operationspräparate werden in der 10 fachen Menge einer gepufferten Lösung homogenisiert. Das Homogenisat wird zur Be™' seitigung Von Zellbestandteilen zentrifugiert und anschließend mit der Ultrazentrifuge "oder anderen geeigneten Verfahren weiter gereinigt und konzentriert. Nach Aufspaltung des Virions in seine antigenen Komponenten und deren Isolierung können diese für die organspezifische Tumordiagnostik eingesetzt werden«The surgical preparations obtained from infected tissues, organs and their tumors are homogenized in 10 times the amount of a buffered solution. The homogenate is centrifuged for cell separation and then further purified and concentrated by ultracentrifuge or other suitable means, and after splitting the virion into its antigenic components and isolating them, they can be used for organ-specific tumor diagnosis.

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Ausführungsbeispiele ^: Exemplary embodiments ^:

· Das Retrovirus der Harnblasenpapillomatose und des Harnblasenkarzinoms des Menschen sowie das Retrovirus des Prostatakarzinoms des Menschen v/erden aus Operations-· präparieren gewonnen.. Die-Präparate werden sofort nach der Entnahme aufgearbeitet oder im tiefgefrorenen Zustand "bis zur "Verarbeitung gelagert,The retroviruses of human bladder papillomatosis and bladder carcinoma as well as the retrovirus of human prostate carcinoma are obtained from surgical preparation. The preparations are worked up immediately after removal or are stored in the deep-frozen state "until" processing,

Die Präparate werden in der 10 fachen Menge Tris-NaCl-The preparations are prepared in 10 times the amount of Tris-NaCl

Puffer, pH 7,6 (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl) im Eisbad ho-• mogenisiert und mindestens 4 Std. bei Kühlschranktemperatur eluiert. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 7000 g und O⁰C für 15 Min, aus der virushaltigen Flüssigkeit entfernt. Die Virusflüssigkeit wird anschließend 2 Std, bei etwa 100 000 g und O⁰C zentrifugiert. Die Sedimente werden in Tris-lfeCl-Puffer, pH 7>6 im Yerhältnis zum Ausgangsmaterial 100-1000 fach angeredchert aufgenommen, homogenisiert und mindestens 4 Std. bei Kühlschranktemperatur eluiert. Das durch Ultrazentrifugation angereicherte Virus v/ird durch Dichtegradientenzentrifugation in Saccharose (10-50^) bei 25 000 U/Min, und 0°C im 3x5 ml-Rotor bzw. im 3x35 ml-Rotor einer VAC 602 (VEB Zentrifugenbau Engelsdorf) für 16-22 Std. einer v/eiteren Reinigung unterzogen.Buffer, pH 7.6 (0.05 M Tris, 0.15 M NaCl) in an ice bath and • homogenized and eluted at refrigerator temperature for at least 4 hours. The cell detritus is removed by centrifugation at 7000 g and O ⁰ C for 15 min, from the virus-containing fluid. The virus fluid is then centrifuged for 2 hours at about 100,000 g and ⁰ ° C. The sediments are taken up in Tris-lfeCl buffer, pH 7> 6 in a ratio of 100-1000 times the starting material, homogenized and eluted for at least 4 hours at refrigerator temperature. The virus enriched by ultracentrifugation is purified by density gradient centrifugation in sucrose (10-50 °) at 25,000 rpm, and 0 ° C in the 3x5 ml rotor or in the 3x35 ml rotor of a VAC 602 (VEB Zentrifugebau Engelsdorf) 16-22 hrs. Before further cleaning.

Mittels Fraktionierung und Messung der UV-Adsorption · der einseinen Fraktionen im UV-Durchflußphotömeter Uvicord III bei 206 und 254 nm wird die virushaltige Dichteschiclit bestimmt und gewonnen. Die immunologisch wirk-. samen Bestandteile des Virus werden durch Aufspaltung in 8 M Harnstoff unter Zusatz von 0,05% Triton und anschließender chromatographischer Reinigung der einzelnen Proteinkomponehten gewonnen.By means of fractionation and measurement of the UV adsorption of the one-part fractions in UV flow-through photometer Uvicord III at 206 and 254 nm, the virus-containing density schizlite is determined and recovered. The immunologically effective. Components of the virus are obtained by splitting into 8 M urea with addition of 0.05% Triton and subsequent chromatographic purification of the individual protein components.

Die so hergestellten Antigene bzw. deren Antiseren können in markierter oder unmarkierter Form für die spezifische Diagnostik einer humoralen Immunität genannter Tumorerlirankungen eingesetzt werden. Als Antigene zur Ermittlung zellvermittelter Immunreaktionen sind sie zur . organspezifischen. Tumordiagnostik geeignet,.The antigens or their antisera thus produced can be used in labeled or unlabelled form for the specific diagnosis of a humoral immunity of tumor tumors mentioned. As antigens for the detection of cell-mediated immune reactions they are to. organ-specific. Tumor diagnostics suitable.

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2· Zur Verwendung als Impfstoff für die spezifische Organtumortherapie, bei denen Erkrankungen durch eine Retrovirusinfektion vorliegen, wird Organmaterial wie unter Punkt 1 beschrieben aufgearbeitet. Das durch Aufspaltung in 8 1 Harnstoff unter Zusatz von 0,05% iüriton gewonnene Antigengemisch wird durch Zusatz von Formalin in einer Endkonzentration von 1:4000 inaktiviert. Zur Verwendung als Impfstoff wird die inaktivierte Virusflüssigkeit mit.oder ohne Zusatz von Adjuvanzien in Mengen von 5 ml in Ampullen abgefüllt und bei 4⁰C aufbewahrt. Die impfstoffprüfung auf Antigengehalt und Reinheit wird elektronenmikoskopisch nach Kegativkontrastierung mit ^hosphorwoIframsäure vorgenommen. Die serologische Identität wird mit spezifischen Hyperimmunseren unter Verwendung der einfachen radialen Immundiffusion nach EiAHCIlJI (MAN-CINI, 0.,CARBOMRA, A.O., u. HEREMAlTS, J.P.: Immunochem. 2 (1965), 235) oder der Überwanderungselektrophorese (nach J¹RISMEL, H. : Immunologische Arbeitsmethoden, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1976) bestimmt. Die Sterilität wird nach den im AB 2 der DDR gegebenen Richtlinien durchgeführt. Die Unschädlichkeit wird im Tierversuch an Säuglingsmäu-seη, Meerschweinchen und Kaninchen bei verschiedenen Applikationsverfahren geprüft. Mit Antilymphozytenseren behandelte Mäuse dienen zum Ausschluß einer onkogenen Aktivität.2 · For use as a vaccine for specific organ tumor therapy in which diseases are due to a retrovirus infection, organ material is processed as described under point 1. The mixture of antigens obtained by splitting into 8 l urea with the addition of 0.05% iüriton is inactivated by the addition of formalin in a final concentration of 1: 4000. For use as a vaccine, the inactivated virus fluid with or without the addition of adjuvants in quantities of 5 ml is filled into ampoules and stored at 4 ⁰ C. The vaccine test for antigen content and purity is carried out by electron microscopy after negative contrast with phosphoric acid. The serological identity with specific hyperimmune sera using the simple radial immunodiffusion according EiAHCIlJI (MAN-CINI, 0., CARBOMRA, AO, u Here malts, JP., Immunochem 2 (1965), 235) or the Überwanderungselektrophorese (by J ¹ RISMEL , H.: Immunological working methods, VEB Gustav Fischer publishing house Jena, 1976) determined. The sterility is carried out according to the guidelines given in AB 2 of the GDR. The harmlessness is tested in animal experiments on infant mice, guinea pigs and rabbits in various application methods. Mice treated with antilymphocyte sera serve to exclude oncogenic activity.

Claims

invention claim

♦ 'A method for the preparation of preparations for the specific serological diagnosis or, ÄörganspesifischeEt diagnosis of cell-mediated Ißimunreaktionen as well as for parenteral administration as a vaccine in human tumorsj which are caused by retrovirusesj- primarily of papillomatosis and carcinoma of the bladder and prostate, characterized by the isolation and Purification of human retroviruses directly from affected organs and tissues or by their use as a complete virion or as a mixture of its immunologically active constituents or as a preparation of an immunologically active ingredient in concentrated or unfocussed form with inactivation additive as well as with or without adjuvants,