MXPA03006275A - Metodo y composiciones para modular la regulacion de la respuesta de linfocitos citotoxicos por el factor inhibidor de la migracion de macrofagos. - Google Patents

Abstract

Se divulga la regulacion de la expresion de la actividad CTL por el factor inhibidor de la migracion de macrofagos (MIF). En un modelo de raton que utiliza el tumor EL4, esplenocitos cultivados a partir de ratones cebados con tumor secretan altos niveles de MIF despues de estimulacion por antigenos invitro. Esplenocitos paralelos tratados con anti-MIF mAb neutralizante presentaron un incremento significativo de la respuesta de linfocitos citotoxicos contra celulas tumorales en comparacion con cultivos de control tratados con mAb, con expresion elevada de IFN ?. La histologia de tumores a partir de animales tratados con anti-MIF mostro un incremento de la infiltracion tanto de celulas T CD4+ como de celulas T CD8+, asi como de celulas tumorales apoptoticas, lo que es consistente con el incremento observado de la actividad de linfocitos citotoxicos (CTL) in vivo por anti-MIF, lo que fue asociado con la expresion incrementada de la cadena ?c comun del receptor de IL-2 que media la suprevivencia de las celulas T CD8+. Las celulas CD8+ de ratones que llevan tumores tratados con anti-MIF presentaron una migracion incrementada en tumores de ratones de control. Se divulgan metodos para incrementar una respuesta de linfocitos citoxicos por inhibicion de MIF.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR LA REGULACIÓN DE LA RESPUESTA DE LINFOCITOS CITOTÓXICOS POR EL FACTOR INHIBIDOR DE LA MIGRACIÓN DE MACRÓFAG05 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para modular (incrementar o disminuir) una respuesta de linfocitos citotóxicos a un antigeno, como por ejemplo un antígeno asociado con tumor, mediante la disminución o el incremento del nivel de factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) al cual los linfocitos CD8+ y/o CD4+ están expuestos antes, durante o después de la exposición al antígeno. La invención se refiere además a composiciones y métodos para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades, especialmente tumores, mediante la modulación de una respuesta de linfocitos citotóxicos a un antígeno utilizando enfoques inmunoterapéuticos basados en células. ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Datos provenientes de estudios clínicos tanto experimentales como con seres humanos indican que antígenos asociados con tumores son suficientes para provocar una respuesta de linfocitos citotóxicos anti tumor (CTL) que pueden producir una regresión significativa de tumores (Jager, E., y colaboradores, "CTL-Defined Cáncer Vaccines: Perspectives for Active Inununotherapeutic Interventions in Minimal Residual Disease" [Vacunas contra cáncer definidas por CTL: perspectivas de intervenciones inmunoterapéuticas activas en enfermedad residual mínima] , Cáncer Metástasis Rev., 18, 143 (1999), Dunbar, y colaboradores, "Cutting Edge: Rapid Cloning of Tumor-specifie CTL Suitable for Adoptive immunotherapy of Melanoma" [Tecnología de punta: clonación de CTL específico para tumor adecuado para una inmunoterapia adoptiva de melanoma], J. Immunol., 162, 6959 (1999)). Remisiones de melanoma de largo plazo han sido logradas en algunos casos mediante el empleo de estrategias inmunoterapéuticas basadas en células enfocadas a mejorar la citotoxicidad de CTL por inmunización con péptidos (Thurner, B., y colaboradores, "Vaccination with Mage-3 Al Peptide-Pulsed Mature, Monocyte-Derived Dendritic Cells Expands Specific Cytotoxic T Cells and induces Regression of Some Metastases in Advanced Stage IV Melanoma" [Vacuna con células dendríticas derivadas de monocitos maduros pulsados con péptidos Mage-3 Al amplían las células T citotóxicas específicas e induce una regresión de algunas metástasis en melanoma avanzado en la etapa IV], J. Exp. Med., 190:1669 (1999)). Sin embargo, a pesar de la presencia de antígenos específicos para tumores presentados en el contexto de MHC clase I, se detecta con poca frecuencia in vivo una respuesta inmune robusta que mata los tumores. La generación de CTLs específicos para tumores requiere de un procesamiento apropiada de antígenos tumorales, el despliegue de antigenos tumorales por moléculas MHC de clase I, linfocitos T que expresan receptores de células T de especificidad apropiada para reconocer antigenos tumorales, y presentación de antigeno inicial al sistema inmune en un contexto inmunológico- Esta respuesta de CTL no solamente debe ser iniciada sino también debe ser vigorosa y sostenida para lograr una regresión exitosa del tumor. La actividad de varias citocinas para incrementar varios aspectos de la respuesta CTL ha sido entendida desde hace algún tiempo. La expresión temprano de IL-2 por ejemplo, es un factor critico en la proliferación y el desarrollo del potencial lítico por CTLs (Yamasaki, y colaboradores, "Iminunoregulatory Effects of Interleukin 2 and Interferon on Syngeneic Murine Malignant Glioma-Specific Cytotoxic T-Lymphocytes" [Efectos inmuno-reguladores de la interleucina-2 y de interferon sobre linfocitos T citotóxicos específicos para glioma maligno de murino singeneico] , Cáncer Res., 48, :2981 (1988)). Además, ^FN(Yamasaki, y colaboradores, "Immunoregulatory Effects of Interleukin 2 and Interferon on Syngeneic Murine Malignant Glioma-Specific Cytotoxic T-Lymphocytes" [Efectos inmuno-reguladores de la interleuclna-2 y de interferon sobre linfocitos T citotóxicos específicos para glioma maligno de murino singenéico] , Cáncer Res., 48, 2981 (1988)), IL-1 e IL-6 (Renauld, y colaboradores, "Accessory Signáis Inmurinecytolytic T Cell Responses. Dual Requirement for IL-1 and IL-6" [Señales accesorias de respuestas de células T inmurincitolíticas . Requisito doble de IL-1 e IL-6], J. Inmunol . , 143, 1894(1989)), IL-2 junto con IL-6 (Smyth, y colaboradores "IL-2 and IL-6 Synergize to Augiaent the Pore Forraing Protein Gene Expression and Cytotoxic Potential of Human Peripheral Blood T Cells" [IL-2 e IL-6 tienen una acción sinérgica para incrementar la expresión de gen de proteina de formación de poros y el potencial citotóxico de células T de sangre periférica humana], J. Immunol., 145, 1159 (1990)), IL-7 (Kasper, y colaboradores, wIL-7 Stimulates Protective Immunity in Mice Against the Intracellular Pathogen, Toxoplasma gondii" [IL-7 estimula la inmune protectora en ratones contra el patógeno intracelular, toxoplasma gondii], J Immunol., 155, 47 98 (1995)), IL-10 (Chen, y colaboradores, "IL-10: a Novel Cytotoxic T Cell Differentiation Factor" [IL-10: un factor de diferenciación de células T citotóxicas novedosas] , J. Immunol., 147, 528 (1991)), e IL-12 (Gately, y colaboradores, "Administration of Recombinant IL-12 to Normal Mice Enhances Cytolytic Lymphocyte Activity and Induces Production of IFN-gamma in vivo" [Acml nistración de IL-12 recombinante a ratones normales incrementa la actividad citolitica de linfocitos que induce la producción de IFN-gamma in vivo] , Int. Immunol, 6, 157 (1994), Gately, y colaboradores, "Regulation of Human Cytolytic Lymphocyte Responses by Interleukin-12" [Regulación de respuestas linfocíticas y citoliticas humanas por Interleucina-12 ] , Cell Immunol, 143:127 (1992), Mehrotra, y colaboradores, "Effects of IL-12 on the Generation of Cytotoxic Activity in Human CD8+ T Lymphocytes" [Efecto de IL-12 en la generación de actividad citotóxica en linfocitos T CD8+ humanos], J. Immunol-, 151, 2444 (1993)) han sido identificadas todas como desempeñando una función en la activación, proliferación y/o diferenciación de CTLs. Estos mediadores promueven la actividad CTL mediante el incremento de la presentación de antigeno, función de células T auxiliares de CD4+, adhesión de células de macrófago, o bien mediante el incremento de la expresión de moléculas co-estimuladoras críticas. Efectos anti-tumor mediados por la administración de citocinas recombinantes, incluyen IL-1 (Ciolli y colaboradores, "Combined Interleukin 1/interleukin 2 Therapy of Mice Injected with Highly Metastatic Friend Leukemia Cells: Host Antitumor Mechanisms and Marked Effects on Established Metestases" [Terapia combinada interleucina-1/interleucina-2 de ratones inyectados con células de leucemia altamente metastásicas: Mecanismos antxtumorales del huésped y efectos notables sobre metástasis establecida], J. Exp. Med., 173:313 (1991)), IL-2 (Rosenberg, y colaboradores, "Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2" [Regresión de metástasis pulmonares establecidas y tumor subcutáneo mediada por la administración sistémica de interleucina-2 recombinante en altas dosis], J. Exp. Med., 161, 1169 (1985)), IL-12 (Nastala, y colaboradores, "Recombinant IL- 1 2 Administration Induces Tumor Regression in Association with INF Gamma Production" [La administración de IL-1 2 recombinante induce una regresión tumoral en asociación con la producción de INF gamma], J. Immunol. , 153: 1697 (1994), Hashimoto, y colaboradores, "Cytotoxic NK 1.1 Ag + Alpha Beta T cells with Intermedíate TCR Induced in the Liver of Mice by IL-12" [Células T a NK 1.1 Ag+ alfa beta citotóxicas con TCR intermedia inducida en higado de ratones por IL-12], J. Immunol., 154:4333 (1995), Brunda, y colaboradores, "Interleukin-12 : Murine Models of a Potent Antitumor Agent" [Interleucina-12 : Modelos de murino de un agente anti-tumor potente], Ann. N. Y. Acad. Sci., 795, 266-274, 266 (1996)), iFNa (Brunda, y colaboradores, "The Anti-tumor Effect of Recombinant Interferon Alpha or Gamma is Influenced by Tumor Location" [El efecto anti-tumor de alfa o gamma Interferon recombinante es influenciado por la ubicación del tumor], Int. J. Cáncer, 40:807 (1997), Sayers, y colaboradores, "Antitumor Effects of Alpha-Interferon and Gamma-Interferon on a Murine Renal Cáncer (Renca) in vitro and in vivo" [Efectos anti-tumor de alfa-interferon y gamma-interferon sobre cáncer renal de murino (Renca) in vitro e in vivo] . Cáncer Res., 50, 5414 (1990)), iFNy (Giovarelli, y colaboradores, wInterferon-Activated Tumor Inhibition in vivo. Small Amounts of Interferon-Gamma Inhibít Tumor Growth by Eliciting Host Systemic Immunoreactivity" [La inhibición de tumor activada por interferon in vivo. Pequeñas cantidades de interferon-gamma inhiben el crecimiento tumoral mediante la provocación de una inmunoreactividad sistémica en el huésped], Int. J. Cáncer, 37, 141 (1986)) y CÉTNIMule, y colaboradores, "Antítumor Effect of Recombinant Tumor Necrosis Factor alpha Against Murine Sarcomas at Visceral Sites: Tumor Size Influences the Response to Therapy" [Efecto anti-tumor de factor de necrosis tumoral recombinantes alfa contra sarcomas de murino en sitios viscerales : El tamaño del tumor influencia la respuesta terapéutica], Cáncer Immunol. Immunother., 26, 202 (1998)) han sido observados en ratones que portan tumores. En contraste, solamente algunas citocinas, incluyendo IL-4 (Good y colaboradores, "IL -2 and 11-4 Can Co-Modulate the Generation of Cytotoxic T Cells Through CD8- CD4- Splenic Lymphocytes" [IL-2 e IL-4 pueden co-modular la generación de células T citotóxicas a través de linfocitos esplénicas CD8-CD4-], Immunology, 67:225 (1989), Yamashita, y colaboradores, "Suppressive Activity of Interleukin 4 on Tie Induction of Antigen-Specific Cytotoxic T Cells in Humans" [Actividad supresora de interleucina-4 sobre la inducción de unión de células T citotóxicas específicas para antígeno en seres humanos], Jpn. J. Cáncer Res., 82, 585 (1991)) y TGFB (Jin y colaboradores, "TGF Beta Down-Regulates TLiSAl Expression and Inhibits the Differentiation of Precursor Lymphocytes into CTL and LAK cells" [TGF beta regula de manera descendente la expresión de TLiSAl e inhibe la diferenciación de linfocitos de precursores en células CTL u LAK], Immunalogy 66, 570 (1989)) han sido observadas para suprimir la diferenciación CTL o actividad lítica. IL-4 inhibe la secreción de IEfN a partir de células CD8+ (Erard, y colaboradores, "Switch of CD8 T Cells to Noncytolytic CD8- CD4- Cells that Make TH2 cytokines and Help B Cells" [El cambio de células CD8 a células CD8- CD4 no citolíticas que forman la citocina TH2 y ayudan a células B], Science, 260, 1802 (1993), Croft, y colaboradores, "Generation of Polarized Antigen- specific CD8 Effector Populations :Reciprocal Action of Interleukin (IL)-4 and IL-12 in Promoting Type 2 Versus Type 1 Cytokine Profiles" [Generación de poblaciones de efectos CDB específico para antígenos polarizados: Acción recíproca de intervención (lL)-4 e IL-12 en la promoción de perfiles de citocina de tipo 2 versus tipo 1], J. Exp. Med. , 180, 1715 (1994)) y parece limitar la activación y diferenciación de células CD8+ con alto potencial citolítico (Noble, y colaboradores, '"IFN-Gamma and IL-4 Regúlate the Growth and Differentiation of CD(8) T cells into Subpopulations with Distinct Cytokine Profiles" [IFN-Gamma e IL-4 regulan el crecimiento y la diferenciación de células T CD8+ en sub-poblaciones con perfiles de citocinas claros], J. Immunol., 155, 2928 (1995)). Además, la iniciación de CTL en ausencia de IL-4 provoca una respuesta más potente después de reto. Los mecanismos por los cuales estas pocas citocinas inhiben la actividad citolitica CTL no están bien definidos. Las funciones biológicas del mediador de proteina conocido como factor de inhibición de migración de macrófagos (MIF) ha sido estudiado solamente recientemente (reseñado en (Metz, y colaboradores, "Role of Macrophage Migration Inhibítory Factor in the Regulation of the Immune Response" [Función del factor de inhibidor de migración de macrófagos en la regulación de la respuesta inmuneJ . Ad . Inrmunol., 66, 197-223 (1997))). Aún cuando MIF fue descrito primero hace casi cuatro décadas como una actividad soluble producido por linfocitos T activados (Bloom, y colaboradores, "Mechanisms of a Reaction in vitro Associated with Delayed-Type Hypersensitivity" [Mecanismo de una reacción in vitro asociada con la hipersensibilidad de tipo retardado] , Science, 111, 514. (1966), David, "Delayed-Type Hypersensitivity in vitro; its Mediation by Cell-Free Substances Formed by Lymphoid-Antigen Interaction" [hipersensibilidad de tipo retardada in vitro: su mediación por sustancias libres de células formadas por interacción linfoides-antigenos] , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 56, 72 (1966)]), el interés por MIF fue reavivado cuando el homólogo de ratón de esa proteina fue identificado como secretado a partir de la glándula pituitaria anterior (Bernbagen, y colaboradores, WMEP is a Pituitaxy-Derived Cytokine that Potentiates Lethal Endotoxaemia" [MEP es una citocina derivada de pituitaxi que potencia la endotoxaemia letal] , Nature 365, 756 (1993) [errata publicada aparece en Nature Noviembre 23 de 1995, 378 {6555) :419] ) . Poco después macrófagos que habian sido previamente considerados como un blanco de acción de MIF fueron encontrados como una fuente significativa de MIF al ser activados por toxinas microbianas o las citocinas TNFot e IFNy (Calandra, y colaboradores, The Macrophage is an Important and Previously Unrecognized Source of Macrophage Migration Inhibitory Factor" [El macrófago es una fuente importante y previamente no reconocida de factor inhibidor de la migración de macrófagos], J. Exp. Med., 179, 1985 (1994)). Estudios in vivo establecieron también que MIF desempeña una función critica en la respuesta de huésped a la endotoxina. La administración de MIF recombinante (rMlF) junto con LPS exacerbo el carácter letal de LPS, mientras la neutralización de anticuerpos anti-MIF protegen ratones contra endotoxaemia letal (Bernbagen, y colaboradores, "MEP is a Pituitaxy-Derived Cytokine that Potentiates Lethal Endotoxaemia" [MEP es una citocina derivada de pituitaxi que potencia la endotoxaemia letal], Nature 365, 756 (1993) [errata publicada aparece en Nature Noviembre 23 de 1995, 378 (6555) : 19] ) , exotoxemia (Calandra, y colaboradores, "Macrophage Migration Inhibitory Factor is a critical ediator of the Activation of Immune Cells by Exotoxins of Gram-Positive Bacteria" [El factor de inhibidor de migración de macrófagos es un mediador critico de la activación de células inmunes por exotoxinas de bacterias gram positivas]., Proc. NAT'l. Acad. Sci. U.S.A., 95, 113883 (1998)), y peritonitis (Calandra, y colaboradores, "Protection From Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor" [Protección contra choque séptico por neutralización de factor inhibidor de migración de macrófagos] , Nat. Med., 6, 164 (2000)). Estudios de la función de MIF han establecido también que esta proteina es requerida para la expresión de IL-2 durante la respuesta de activación de células T y para la producción de anticuerpos por células B (Bacher y colaboradores "An Essential Regulatory Role for Macrophage Migration Inhibito Factor in T-Cell Activation" [Una función reguladora esencial para el factor de inhibición de migración de macrófagos en la activación de células T], Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 93, 7849 (1996) ) . Dos reportes recientes han identificado una función no anticipada para MIF en crecimiento tumoral (Chesney, y colaboradores, "An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogenesis and the Growth of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en la angiogénesis y el crecimiento de linfoma de murino], Mol. Med. , 5, 181 (1999), Shimizu, y colaboradores, "High Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and its Role in Tumor Cell Growth and Angiogenesis" [Expresión elevada de factor inhibidor de migración de macrófagos en células de melanoma de ser humano y su función en el crecimiento de células tumorales y la angiogénesis] , Biochem. Biophys. Res. Co mun., 264, 75 1 (1999)). Los inventores de la presente invención observaron que la administración de un anticuerpo monoclonal anti-MIF (mAb) a ratones redujo significativamente el crecimiento y la vascularización de linfoma de células B implantado subcutáneamente, singenéico, 38C13 (Chesney, y colaboradores, "An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogenesis and the Growth of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en la angiogénesis y el crecimiento de linfoma de murino}., Mol. Med., 5, 181 (1999)). Se obtuvo evidencia que este efecto anti-tumor se debía, en parte, a un requerimiento para MIF en proliferación de células endoteliales y la respuesta de angiogénesis tumoral (Chesney, y colaboradores, "An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogénesis and the Growth of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de maerófagos (MIF) en la angiogénesis y el crecimiento de linfoma de murino], Mol. Med., 5, 181 (1999) ) . De manera similar, un tratamiento con mAb anti-MIF de ratones que portan el tumor melanoma humano, G361, disminuyó significativamente el crecimiento tumoral y la neovascularización (Shimizu, y colaboradores, "High Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and its Role in Tumor Cell Growth and Angiogénesis" [Expresión elevada de factor inhibidor de migración de macrófagos en células de melanoma de ser humano y su función en el crecimiento de células tumorales y la angiogénesis]., Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 75 1 (1999) ) . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento por los presentes inventores que la expresión de MIF es regulada de manera ascendente durante la respuesta de CTL y que la inhibición de MIF utilizando mAb especifico promueve la actividad CTL in vitro e in vivo. En particular, se divulga aquí la evidencia experimental que la neutralización de MIF puede promover la actividad de CTL, inhibir el crecimiento tumoral, e incrementar el enfoque de linfocitos T hacia sitios de invasión de tumor in vivo. Asi, resultados a partir de estudios CTL in vitro en el Ejemplo, abajo, revelan que la inmunoneutralización de MIF durante la fase de inicio in vitro incrementó la producción de IFNy en cultivos de CTL. El reconocimiento que la secreción de MIF es incrementada por la activación de células Th2, pero no de células Thl (Bacher y colaboradores wAn Essential Regulatory Role for Macrophage igration Inhibito Factor in T-Cell Activation" [Una función reguladora esencial para el factor de inhibición de migración de macrófagos en la activación de células T], Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 93, 7849 (1996)), hace posible que la estimulación de antigeno soluble induzca la expresión de MIF que inhibe a su vez la activación de CTL in vivo mediante la supresión de producción de citocinas Thl, incluyendo iFNy.

Estudios previos han mostrado que MIF desempeña una función esencial en la respuesta de activación a varios mltógenos o antigeno soluble, un efecto mediado por células T auxiliares CD4+. Células T activadas con antigeno o mitógeno expresan cantidades significativas de ARNm de MIF y proteina, y la inmunoneutralización de MIF inhibe la producción de IL-2 y la proliferación de células T in vitro y disminuye la respuesta de células T auxiliar al antigeno soluble in vivo (Bacher y colaboradores wAn Essential Regulatory Role for Macrophage Migration Inhibito Factor in T-Cell Activation" [Una función reguladora esencial para el factor de inhibición de migración de macrófagos en la activación de células T]., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 93, 7849 (1996)). El presente estudio muestra que la expresión de MIF es regulado en manera ascendente en la respuesta a la estimulación de antigeno tumoral y que la neutralización de MIF no afecta la secreción de IL-2 ni la proliferación inducida por antigeno de células CD8+ T. Sin embargo, el tratamiento anti-MIF incrementó significativamente la expresión de la subuyiidad c de receptor de IL-2 que se requiere para la señalización intracelular (Nelson, y colaboradores, "Cytoplasmic Domains of the lnterleukin-2 Receptor Beta and Gamma C ains Medíate the Signal for T-cell Proliferation" [Dominio citoplásmicos de las cadenas beta y gamma de receptor de interleucina-2 median la señal para proliferación de células T] , Nature, 369, 333 (1994)) y es importante para la supervivencia de células CD8+ T (Dai, y colaboradores, "The Role of the Common Cytokine Receptor Gamma-chain in Regulating lLl-2-Dependent, Activation Induced CD8+ T Cell Death" [La función de la cadena gamma de receptor de citocina común en la regulación de la muerte de células T CD8+ inducido por activación dependiente de IL1-2], J. Immunol., 163, 3131 (1999)) . Por consiguiente, el incremento de la citotoxicidad de células T por neutralización de MIF no puede ser atribuido a un incremento apreciable de la proliferación de células CD8+ T, sino a una supervivencia incrementada de una población de células CD8+ T citollticas. Después del inicio de la actividad citolitica por células CD8+ T, esta actividad citolltica debe ser sostenida para promover una regresión exitosa de tumor. Por consiguiente, la inhibición de MIF podría actuar para prolongar la vida de CTL de tal manera que una actividad anti tumor CTL significativa se vuelva manifiesta tanto in vitro como in vivo. El tratamiento con mAb anti-MIF de ratones que portan tumores EG.7 inhibió significativamente el crecimiento tumoral en el contexto de una actividad CTL incrementada. Además, células CD8† T transferidas a partir de ratones que portan tumores tratados con anti-MIF inhibieron el crecimiento tumoral en ratones receptores. Dado el incremento observado en cuanto al número de células tumorales apoptóticas encontradas dentro del cuerpo del tumor, es razonable concluir que una citotoxicidad incrementada o sostenida de CTL contribuyó directamente a la supresión del crecimiento tumoral en ratones tratados anti-MIF. Reportes recientes han mostrado que las células tumorales producen más MIF que las células no transformadas (Shimizu, y colaboradores, wHigh Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and its Role in Tumor Cell Growth and Angiogénesis" [Expresión elevada de factor inhibidor de migración de macrófagos en células de melanoma de ser humano y su función en el crecimiento de células tumorales y la angiogénesis] , Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 75 1 (1999), Takahashi, y colaboradores "Involvement of Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the Mechanism of Tumor Cell Growth" [Participación de factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en el mecanismo de crecimiento de células tumorales], Mol. Med., 4 707 (1998), Meyer-Siegler, y colaboradores, "Enhanced Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Prostatic Adenocarcinoma Metastases" [Expresión incrementada de factor inhibidor de migración de macrófagos en metástasis de adenocarcinoma de próstata], Urology, 48,448 (1996)). Las células tumorales pueden escapar la muerte por CTLs a través de la pérdida del antigeno tumoral reconocido por los CTLs o bien por la regulación descendente de la expresión de MHC que vuelve la célula tumoral resistente a la lisis mediado por CTL aún cuando expresa el antigeno tumoral apropiado (Ress, y colaboradores, "Selective MHC Expression in Tumours Modulates Adaptive and límate Antitumour Responses" [Expresión selectiva de MHC en tumores modula respuestas anti-tumor adaptables e innatas] [Véase comentarios], Cáncer Immunol. Immunother, 48, 374 (1999)). Aún cuando las células EG.7 secretan constitutivamente MIF (~10 ng/ml por 10to células), ni rMIF ni un anticuerpo anti-MIF influenció la expresión MHC clase I por células EG.7. Los datos presentes muestran que un mecanismo adicional para la evasión tumoral de la respuesta inmune del huésped ocurre por secreción de células tumorales de MIF se lleva a una disminución de la supervivencia de células CD8\ Varios estudios han mostrado la expresión de FasL por ciertas células tumorales y esto plantea la posibilidad que los cánceres puedan ser sitios de privilegio inmune. Por ejemplo, la apóptosis de linfocitos que infiltran tumores ha sido demostrada in situ en melanomas que expresan FasL y carcinomas hepatocelulares (Strand, y colaboradores, "Lymphocyte Apóptosis. Induced by CD95 (APO ~ I /Fas) Ligand-Expressing Tumor Cells—a Mechanism of Immune Evasión?" [Apóptosis de linfocitos inducida por células tumorales que expresan ligando CD95 (APO-I/Fas) - ¿Un mecanismo de evasión inmune?] [véase comentarios], Nat. Med., 2, 1361 (1996)) . Sin embargo, datos más recientes in vitro e in vivo han puesto la hipótesis original en tela de juicio. Estos estudios han revelado que ciertos tumores no presentan la expresión de FasL (Chappell, y colaboradores, wHuman Melanoma Cells do not Express Fas (Apo-I/CD95) Ligand" [Células de melanoma de ser humano no expresan ligando Fas (Apo-I/CD95>) ] , Cáncer Res., 59, 59 (1999), Arai, y colaboradores, "Gene Transfer of Fas Ligand Induces Tumor Regression in vivo" [Transferencia de gen de ligando Fas induce la regresión tumoral in vivo] , Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A, 94, 13862 (1997)) y que la transfección de ciertas células tumorales con ADNc de FasL no promovió la evasión del sistema inmune por células tumorales, sino que indujo la regresión del tumor (Arai, y colaboradores, "Gene Transfer of Fas Ligand Induces Tumor Regression in vivo" [Transferencia de gen de ligando Fas induce la regresión tumoral in vivo], Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A, 94, 13862 (1997), Kang, y colaboradores, "Fas Ligand Expression on Islets as well as Múltiple Cell Lines Results in Accelerated Neutrophilic Rejection" [La expresión de ligando Fas en isletas asi como lineas de células múltiples resulta en un rechazo neutrofílico acelerado], Transplant. Proc, 30,538 (1998)). Estudios adicionales han mostrado que la expresión de FasL promueve rechazo rápido de injerto (Seino, y colaboradores, "Contribution of Fas Ligand to Cardiac Allograft Rejection" [Contribución de ligando Fas a rechazo de aloinjerto cardiaco], Int. Immunol., 8,1347 (1996), Seino, y colaboradores "Rejection of Fas Ligand-Expressing Grafts" [Rechazo de injertos que expresan ligandos Fas], Transplant. Proc, 29, 1092 (1997)) e inflamación (Allison, y colaboradores "Transgenic Expression of CD95 Ligand on Islet Beta Cells Induces la Granulocytic Infiltration but Does Not Confer Inunune Privilege upon Islet Allografts" [Expresión transgénica de ligando de CD95 en células beta de isleta induce una infiltración granulocitica pero no confiere privilegio inmune a aloinjertos de isletas] [véase comentarios], Proc. Nat'l- Acad. Sci. U.S.A, 94, 3943 (1997) ) . Este estudio no examinó la expresión de FasL dentro del tumor, pero los presentes hallazgos muestran que seria informativo examinar el efecto de MIF/anti-MIF sobre la expresión de FasL en estos sistemas. El presente estudio identifica también una función importante para MIF en el tráfico de células T. Un incremento de la acumulación tanto de células CD4+ y CD8† en los tumores de ratones tratados con anti-MlF se observó. La destrucción de tumor por linfocitos que infiltran los tumores (TILs) involucra según se sabe tanto células T CD4+ como células CD8+. El tratamiento de tumores de mama en ratas con IL-2 y TILs promueve la regresión del tumor por la inducción de la apóptosis de células tumorales (Liu, y colaboradores "Suppressive Effect of Corticosteroids on the Gene Expression of Interleukin-5 and Eosinophil Activation in Asthmatics" [Efecto supresor de corticosteroides sobre la expresión génica de interleucina-5 y activación de eosinófilos en asmáticos], Chung. Hua. Nei . Ko. Tsa. Chih. 35, 231 (1996)) y una acumulación rápida de TILs en melanoma humano se relaciona con un resultado más favorable para el paciente (Thor, y colaboradores, "In situ T cells in Melanoma" [Células T in situ en melanoma] [Véase comentarios] . C ncer Immunol. Immunother., 48, 386 (1999)). La observación que el anticuerpo anti-MIF incrementa la migración de células CD8'' y CD8+ en la masa tumoral proporciona el medio adicional a través del cual un anticuerpo anti-MlF puede afectar la función de células T anti-tumor y puede involucrar mecanismos tales como una expresión alterada de quimiocina o receptor de quimiocina. Además de modular la actividad CTL, NIF parece desempeñar una función en otros aspectos de la formación del tumor. Dos laboratorios independientes han mostrado que la neutralización de NIF inhibe significativamente la angiogénesis tumoral (Chesney, y colaboradores, "An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogénesis and the Growth of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en la angiogénesis y el crecimiento de linfoma de murino], Mol. Med., 5, 181 (1999), Shimizu, y colaboradores, "High Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and its Role in Tumor Cell Growth and Angiogénesis" [Expresión elevada de factor inhibidor de migración de macrófagos en células de melanoma de ser humano y su función en el crecimiento de células tumorales y la angiogénesis], Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 75 1 (1999)), y Hudson y colaboradores revelaron recientemente que la adición de rMIF a fibroblastos inhibe las funciones p53 (tanto proliferación como apóptosis) mediante la supresión de actividad de transcripción (Hudson, y colaboradores "A Proinflammatory Cytokine Inhibits p53 Tumor Suppressor Activity" [Una citocina proinf1 matoria inhibe la actividad supresora de tumor p53] [Véase comentarios]. J. Exp. Med., 190, 1375 (1999)). Aún cuando varias células efectoras inmunes de huésped participan en la muerte de las células tumorales, los CTLs específicos para antigeno tumoral son muy efectivos para mediar la muerte de las células tumorales, aún en una baja densidad de antigeno expresada en las células objetivo (Matsumura, y colaboradores, "Emerging Principies for the Recognition of Peptide Antigens by MHC Class I Molecules" [Principios emergentes para el reconocimiento de antígenos de péptido por moléculas MHC Clase I] [Véase comentarios], Science, 257, 927 (1992) ) . Por consiguiente, el incremento terapéutico de CTLs de CD8+ por la inmunoneutralización de MIF proporciona una base novedosa para inmunoterapias anti-tumor basadas en células . Por consiguiente, la presente invención ofrece métodos y composiciones para modular (incrementar o disminuir) una respuesta de linfocitos citotóxicos a un antígeno, como por ejemplo un antígeno asociado con tumor, mediante la disminución o el incremento del nivel de factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) al cual los linfocitos CD8+ y/o CD4+ están expuestos antes, durante y después de la exposición al antígeno, ya sea ex vivo o in vivo, o ambos.

Asi, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar células, de preferencia células T, con mayor preferencia células T CD8+, como terapia contra el cáncer para su administración a un sujeto con cáncer u otra condición que requiera de una respuesta CTL para inmunoterapia efectiva. Este método comprende el cultivo de las células en presencia de un inhibidor o antagonista de MIF. En este método, el antagonista MIF se selecciona dentro del grupo que consiste de anticuerpos de anti-MIF, ADNc de antisentido de MIF, y antagonistas de enlace ligando : receptor de MIF. En una modalidad preferida de este método, dicho método incluye el cultivo de las células en presencia de anticuerpos anti-MIF que neutralizan o desactivan la actividad MIF. De preferencia, los anticuerpos anti-MIF utilizados en el método de la invención son monoclonales y seleccionados dentro del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y anticuerpos monoclonales de cadena única. En otro aspecto, de la presente invención se refiere a un método para preparar una composición celular como una inmunoterapia para incrementar una respuesta CTL, de preferencia una terapia del cáncer para su administración a un sujeto con cáncer, que comprende la incubación de células de la composición en presencia de (a) por lo menos un antigeno que es un objetivo de una respuesta CTL deseada, de preferencia antigeno tuntoral, y (b) anticuerpos anti- IF. En otro aspecto de la invención, la presente invención se refiere a un método para preparar células autólogas para su administración a un sujeto con cáncer, que comprende el paso de incubar las células en presencia de un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de anticuerpos anti-MIF, fragmentos de enlace con MIF de los mismos, o ambos. Una modalidad preferida de este método comprende un paso de incubar las células en presencia de (a) por lo menos un antigeno tumoral y (b) un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de anticuerpos anti-MIF, fragmentos de unión con MIF de los mismos, o ambos- De preferencia, las células autólogas comprenden células inmunes, con mayor preferencia células T, y con preferencia aún mayor, células T CD8+. En otro aspecto, la invención ofrece una composición celular para su administración a un sujeto que requiere de una respuesta de CTL incrementada a un antigeno, por ejemplo, un sujeto con cáncer. Esta composición comprende células incubadas con anticuerpos anti-MIF. En una modalidad de esta composición celular, las células incubadas con anticuerpos anti-MIF son también incubadas con por lo menos un antigeno al cual se desea una respuesta de CTL incrementada, como por ejemplo un antigeno tumoral. De preferencia, en esta composición celular, la incubación con anticuerpos anti-MIF es ex vivo, y la composición celular puede incluir células aisladas a partir de anticuerpos anti-MIF no unidos después de incubación con anticuerpos anti-MIF- Células en esta composición celular pueden también ser aisladas tanto de anticuerpos anti-MIF no unidos como de antigeno no unido, por ejemplo, antigeno tumoral, con los cuales están incubadas. De preferencia, en las composiciones celulares de la invención las células comprenden células inmunes, con mayor preferencia células T, y con preferencia aún mayor células T CD81". DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 - mAb anti-MIF, pero no rMIF ni IgG do control, incrementa la actividad de CTL in TÍtro- Ratones C56BL/6 cebados con células EG.7 7 dias antes fueron la fuente de células de bazo (véase Materiales y Métodos) . Cultivos de células de bazo estimulados con células EG.7 irradiadas durante 5 dias en presencia de rMIF (A) , anti-MIF (B) , o bien IgGi de control (C) . Células objetivo EG.7 frescas fueron agregadas a células de bazo en varias proporciones de células E:T y, después de 4 horas de incubación a 37°C, se miodió la citotoxicidad por liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) . (D) El efecto de mAb de anti-MIF sobre la actividad de CTL in vitro al agregar anticuerpos al principio de co-cultivos EG.7 irradiado con esplenocito (E:T = 20:1) (Dia 0) versus adición el Dia 2.*, p<0.05 según la prueba t de Student vs. sin adición. Figura 2 - La secreción de MIF e IFlf es incrementada cuando células do bazo son cultivadas con células EG.7 irradiadas. Células de bazo fueron aisladas a partir de ratones cebados con EG.7 y estimuladas durante 1 ó 2 dias con o sin células EG.7 irradiadas junto con Ab de control de isotipo (control) o bien mAb anti-MIF (anti-MIF) (50 . Sobrenadantes de cultivo fueron analizados por ELISA especifico para MIF (A) e I^N (B) , de conformidad con lo descrito en Materiales y Métodos. Los valores de TNFa e IL-12 fueron por debajo del limite de detección. *, p<0.05 por prueba t de Student para control+EG-7 vs. control-E . . Figura 3.- El tratamiento con mAb anti-MIF de ratones portadores de tumor EG.7 incrementa la actividad de CTL e inhibe el crecimiento tumoral . Ratones C57BL/6 (n=5 por grupo) fueron inyectados con células EG.7 y después tratados con ya sea PBS, IgG de control, o bien mAb anti-MIF (0.5 mg) diariamente. El día 7, los bazos fueron cosechados y células de bazo aisladas fueron co-cultivadas con células EG.7 irradiadas durante 5 dias, en dicho momento se midió la lisis de las células en un ensayo in vitro de CTL de 4 h por liberación de LDH (A) . El tamaño del tumor fue determinado el dia 7 (B) . *, p<0.05 por prueba t de Student de tratamiento anti-MIF vs. tratamiento con IgG de control. Figura 4 - El tratamiento con mAb anti-MIF de ratones que portan tumor EG.7 inoromenta la infiltración de llnfocitos T en tumores. Ratones (n = 5 por grupo) fueron tratados diariamente durante 7 dias con IgG de control o mAb anti-MIF. Después, tumores EG.7 fueron extirpados y secciones de tumor fueron marcadas con anticuerpos monoclonales CD4 PE-anti ratón (L3T4) o CD8 FITC-anti ratón (ly-2) . Células T CD8+ y CD4+ fueron enumeradas por microscopía de fluorescencia y expresadas como el incremento porcentual promedio (+ desviación estándar) en células infiltrantes inmuno-reactivas en los tumores de animales tratados con anti-MIF en comparación con animales de control tratados con IgG. Secciones incubadas con un anticuerpo de control de isotipo fluorescente no mostraron inmuno reactividad. *, p<0.05 por prueba t de Student comparando animales tratados con anti-MIF vs. animales tratados con IgG de control. Figura 5 - El trataauento con mM> anti-MIF promueve la apóptosis de células tumoralos EG.7. Células apoptóticas fueron detectadas in situ mediante el marcado de interrupciones de cadena de AD por el método TÚNEL . Numerosas células EG.7 apoptóticas (color café oscuro) están visibles en el tejido tumor obtenido a partir de ratones tratados con mAb anti-MIF (A) . En contraste, un número menor de cuerpos apoptóticos se observan en tumores obtenidos a partir de ratones tratados con IgG de control (B) . Secciones (lOOx) mostradas son representativas de 10 secciones tumorales (n = 5 animales por grupo) . Figura 6 — La expresión da IL—2 yc es» regulada de manera ascendente por tratamiento con anticuerpo anti-MIF in vivo.

Células de bazo fueron recogidas a partir de ratones naives o bien ratones que portan tumor EG.7 (n = 3 ratones por grupo) tratados diariamente durante 7 dias con anti-MIF o bien IgG de control. Bazos fueron combinados a partir de grupos individuales y teñidos para marcadores superficiales CD8 e IL-2Ra (A), ß (B) , o Ye (C) después de controlar en la población de células T CD8+. El histograma sombreado representa las células teñidas con el anticuerpo de control de isotipo. Figura 7 - El tratamiento de ratones portadores de tumor donadores con anticuerpo anti-MIF incrementa la migración de linfocitos T transferidos a tumores EG.7 de ratones portadores de tumores receptores y promueve la actividad anti tumor de células T CD8* en ratones receptores. Células de bazo no fraccionadas (A) o bien células T esplénicas CD8+ purificadas (B) provenientes de ratones normales (control) o ratones portadores de tumores fueron aislados 8 dias después de tratamiento anti-MIF o bien tratamiento con IgG de control (0.5 mg x 7 dias) y marcadas con el colorante fluorescente PKH-26. Células marcadas fueron después transferidas i.v. en ratones receptores que portan tumores (n = 5 por grupo) . Un dia después, los tumores fueron extirpados, se prepararon secciones de criostato, y el número de células fluorescentes por campo de alta potencia (HPF) fue enumerado (media + desviación estándar). *,p<0.05; **,P<0.01 vs. ratones tratados con anticuerpo de control según la prueba t Student. (C) ratones C57BL/6 fueron inyectados con 5 x 10 células EG.7 (i.p.) y tratados con «Ab anti-MIF o bien IgG de control (0.5 mg/dla) durante 7 días. Células T CD8+ esplénicas purificadas fueron transferidas (5 x 106 células/ratón; i.v.) en ratones receptores que hablan sido inoculados s.c. con 5 x 10b células EG.7 24 horas previamente fn = 5 por grupo) . Se midieron los pesos de los tumores (media desviación estándar) . *, p<0.05 vs. ratones tratados con anticuerpos de control según la prueba t de Student . DESCRIPCIÓN DETALLADA. DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye composiciones y métodos que inhiben la liberación de MIF y/o la actividad in vitro e in vivo para el tratamiento de condiciones que requieren de una respuesta de CTL, que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, tumores (cancerosos o benignos), infecciones virales, infecciones parasíticas, incluyendo por ejemplo malaria y/o infecciones bacterianas. La inhibición de la actividad de MIF de conformidad con la presente invención puede lograrse de varias formas, que pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, el uso de factores que se unen a MIF y neutralizan su actividad biológica; el uso de antagonistas de receptores de MIF; el uso de compuesto que inhibe la liberación de MIF a partir de fuentes celulares en el cuerpo; y el uso de secuencias de nucleótido derivadas de secuencias codificadoras, no codificadores y/o reguladoras de MIF para prevenir o reducir la expresión de MIF. Cualquiera de los anteriores puede utilizarse individualmente o en combinación para inhibir la actividad de MIF en el tratamiento de las condiciones relevantes, y además, puede combinarse con cualquier otra terapia que incrementa CTL incluyendo, por ejemplo, inmunización de péptido, terapia con citocinas, y similares. Factores que se enlazan con MIF y neutralizan su actividad biológica, que se conocen a continuación como socios de enlace de MIF, pueden emplearse de conformidad con la presente invención como tratamientos de condiciones que requieren de una respuesta de CTL. Mientras que los niveles de proteina MIF pueden incrementarse debido a secreción por el tumor o por activación de células auxiliares T Th2, la interacción de socios de enlace con MIF inhibidores con proteina de MIF impide un incremento concomitante de la actividad de MIF. Tales factores pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, anticuerpos de anti-MIF, fragmentos de anticuerpo, receptores de MIF, y fragmentos de receptores de MIF. Varios procedimientos conocidos en la técnica pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos para epitopos de MIF producido rccoebiriantemente (por ejemplo, utilizando técnicas de ADN recombinante descritas infra) , o bien purificado naturalmente. Anticuerpos neutralizantes, es decir, los que coKipiten para los sitios de enlace del receptor de MIF o bien obstruyen estéricamente los sitios de enlace del receptor de MIF se prefieren especialmente para diagnósticos y terapias. Tales anticuerpos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, cadena individual policlonal, monoclonal, monoclonal humanizada, quimérica, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Para la producción de anticuerpos, varios animales huéspedes pueden ser inmunizados por una inyección de MIF y/o una porción de MIF. Tales animales huéspedes pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, conejos, ratones y ratas, solamente mencionar algunos. Varios adyuvantes pueden ser utilizados para incrementar la respuesta inmunológica, según la especie huésped, incluyendo sin limitarse a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Anticuerpos monoclonales de MIF pueden prepararse mediante la utilización de cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante lineas de células continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein, (Nature, 1975, 256:495-497), la técnica de hibridoma de células B humana (Kosbor y colaboradores, 1983, Inmunology Today, 4:72; Cote y colaboradores, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci., 80:2026-2030) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé y colaboradores, 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy [Anticuerpos Monoclonales y Terapia contra el Cáncer], Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) . Además, técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y colaboradores, 1984, Proc. Nati. Acad- Sci., 81:6851-6855; Neuberger y colaboradores, 1984, Nature, 312:604-608; Takeda y colaboradores, 1985 Nature, 314:4521-454) por empalme de los genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad con antigeno apropiada junto con genes provenientes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada pueden emplearse. Alternativamente, técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Patente Norteamericana No. 4,946,778) pueden ser adaptados para producir anticuerpos de cadena simple específicos para MIF.

La técnica de hibridoma ha sido utilizada para generar anticuerpos monoclonales de anti-MIF- Véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,030,615 de Bucala y colaboradores, cuyos contenidos enteros se incorporan aqui por referencia. Hi-bridomas que secretan anticuerpos monoclonales de IgG dirigidos tanto contra formas humanas como contra formas de murino de MIF han sido aislados y caracterizados por su capacidad para neutralizar la actividad biológica de MIF. Se mostró que anticuerpos monoclonales anti-MIF inhiben la estimulación la muerte de parásitos intracelulares por acción de macrófagos. Los anticuerpos monoclonales anti-MIF han sido utilizados para desarrollar un ensayo de tamizado ELISA especifico y sensible para MIF. Fragmentos de anticuerpo que reconocen epitopos de MIF específicos pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero sin limitarse a ellos: los fragmentos F(ab' )i que pueden ser producidos por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos de Fab que pueden ser generados mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, bibliotecas de expresión de Fab pueden ser construidos (Huse y colaboradores, 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para MIF.

Receptores de MIG, fragmentos de receptor de MIF, y/o análogos de receptor de MIF pueden, de conformidad con la presente invención, ser utilizados como inhibidores de la actividad biológica de MIF. Mediante la unión con proteina de MIF, estas clases de moléculas pueden inhibir la unión de MIF con receptores celulares de MIF, trastornando asi el mecanismo a través del cual MIF ejerce su actividad biológica. Pequeñas moléculas orgánicas que imitan la actividad de tales moléculas están también dentro del alcance de la presente invención. Receptores de MIF pueden incluir cualquier molécula de superficie celular que se une con MIF en una forma especifica para secuencia de aminoácidos y/o especifica estructuraimente. Fragmentos de receptores de MIF pueden también ser utilizados como agentes inhibidores de MIF, y cualquier fragmento de receptor de MIF que posee una deleción amino, carboxi, y/o interna que se une específicamente con MIF para inhibir la actividad biológica de MIF se contempla dentro del alcance de la presente invención. Una deleción amino y/o carboxi se refiere a una molécula que posee truncados de terminales amino y/o carboxi de por lo menos un residuo de aminoácido. Una deleción interna se refiere a moléculas que poseen una o varias deleciones no terminales de por lo menos un residuo de aminoácido. Entre estos fragmentos de receptor de MIF se encuentran receptores truncados en los cuales el citoplasma o una plasma del dominio citoplásmico ha sido removido, y fragmentos en los cuales el dominio citoplásmico y el (los) dominio (s) de transmembrana han sido removidos para proporcionar un receptor de MIF soluble que contiene la totalidad de una parte del dominio extracelular de receptor de MIF. Análogos de receptores de MIF que se unen específicamente con MIF pueden también ser utilizados para inhibir la actividad de MIF. Tales análogos de receptores de MIF pueden incluir receptor de MIF o bien fragmentos de receptor que poseen adicionalmente uno o varios aminoácidos adicionales ubicados en el extremo amino, extremo carboxi, o bien entre dos residuos adyacentes de aminoácido de receptor de MIF. Los aminoácidos adicionales pueden ser parte de un péptido heterólogo funcionalmente unido a la funcionalidad o una parte de la proteina de la proteína de receptor de MIF para formar una proteina de fusión de receptor de MIF. Por ejemplo, y sin pretender limitar la invención, el receptor de MIF o una parte truncada del mismo, puede ser manipulado como una proteína de fusión con una porción de Fe deseada de una inmunoglobulina . Análogos de receptor de MIF pueden también incluir receptor de MIF o bien fragmentos de receptor de MIF que poseen además una o varias sustituciones de aminoácidos de naturaleza conservadora o no conservadora. Sustituciones de aminoácidos conservadoras consisten del reemplazo o varios aminoácidos con aminoácidos de carga similar, tamaño similar, y/o caracteristicas de hidrofobicidad similares, como por ejemplo, una sustitución de ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D) . Sustituciones no conservadoras consisten del reemplazo de uno o varios aminoácidos por aminoácidos que poseen una carga diferente, un tamaño diferente y/o caracteristicas de hidrofobicidad diferentes como por ejemplo, la sustitución de un ácido glutámico (E) por valina (V) . Los receptores de MIF, fragmentos de receptores de MIF y/o análogos pueden ser elaborados utilizando técnicas de ADN recombinante . Moléculas que inhiben la actividad biológica de MIF mediante la unión con receptores de MIF pueden también ser utilizadas para el tratamiento de condiciones que requieren una respuesta de CTL. Tales moléculas pueden incluir, sin limitarse a estos ejemplos, anticuerpos de receptor anti-MIF y análogos de MIF. Anticuerpos de receptor anti-MIF serán formados y utilizados para neutralizar la función de receptor de MIF. Anticuerpos contra la totalidad de una parte de una proteina de receptor de MIF pueden ser producidos, por ejemplo, de conformidad con las técnicas descritas en la Patente Norteamericana No. 6,080,407, supra. Análogos de MIF pueden incluir moléculas que se unen con el receptor de MIF pero no presentan una actividad biológica. Tales análogos compiten con MIF para enlace con el receptor de MIF. y por consiguiente, cuando se utilizan in vivo, pueden actuar para bloquear los efectos de MIF en el progreso de la toxicidad mediada por citocina- Varias técnicas bien conocidas por parte de los expertos en la materia pueden utilizarse para diseñar análogos de MIF. Técnicas de ADN recombinante pueden utilizarse para producir protelna de MIF modificadas que contienen, por ejemplo, inserciones de aminoácidos, deleciones y/o sustituciones que proporcionan análogos de MIF con capacidades de enlace con receptor pero sin actividad biológica. Alternativamente, análogos de MIF pueden ser sintetizados utilizando métodos químicos (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual [Clonación Molecular; Un Manual de Laboratorio], Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989)). Receptores de MIF y/o lineas de células que expresan receptores de MIF pueden ser utilizados para identificar y/o ensayar antagonistas potenciales de MIF. Como se enseña en la Patente Norteamericana No. 6,070,407, supra, ciertos esteroides, comúnmente considerados como ya sea inactivos o bien wanti-esteroidales" inhiben de hecho la liberación de MIF; por e emplo, 20a dihidrocortisol . Estos esteroides, o bien cualquier otro coaipuesto que inhibe la liberación de MIF preformado, pueden ser utilizados en combinación con otros agentes anti-MIF de la presente invención.

Inhibidores de la actividad biológica de MIF tales como anticuerpos anti-MIF, receptores de MIF, fragmentos de receptores de MIF, análogos de receptores de MIF, anticuerpos receptores anti-MIF. Análogos de MIF e inhibidores de liberación de MIF, pueden ser admi istrados empleando técnicas bien conocidas por parte de los expertos en la materia. De preferencia, los agentes son formulados y administrados de manera sistémica- Técnicas para la formulación y administración pueden encontrarse en "Remington' s Pharmaceutical Sciences", 18", Edición, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. Vias adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, transmucosal, o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares asi como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, o intraoculares, solamente para mencionar algunas vias de administración adecuadas. Con mayor preferencia, se utiliza la administración intravenosa. En el caso de inyección, los agentes de la inyección pueden ser formulados en soluciones acuosas, de preferencia en amortiguadores fisiológicamente compatibles como por ejemplo solución de Hanks, solución de Ringer, o bien amortiguador salino fisiológico. Para la administración transmucosal, agentes de penetración apropiados para la barrera a permear son utilizados en la formulación. Tales agentes de penetración son generalmente conocidos en la técnica. Concentraciones efectivas y frecuencia de dosificación de los compuestos inhibidores de MIF de la presente invención a administrar pueden ser determinadas a través de procedimientos bien conocidos en la técnica, que abordan parámetros tales como vida media biológica, biodisponibilidad, y toxicidad. En el caso de anticuerpos anti-MIF, una concentración de dosificación preferida puede estar dentro de un rango de aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, prefiriéndose aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En el caso de anticuerpos u otros compuestos inhibidores que presentan vidas medias largas en circulación, una administración simple puede ser suficiente para mantener la concentración circulante requerida. En el caso de compuestos que presentan vidas medias más cortas, dosis múltiples pueden ser necesarias para establecer y mantener la concentración requerida de circulación. Inhibidores de MIF pueden ser administrados a pacientes solos o bien en combinación con otras terapias. Tales terapias incluyen la administración secuencial o concurrente de inhibidores o antagonistas de tumores o virus para los cuales se desea una respuesta de CTL. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran métodos que utilizan agentes anti-MIF que son secuencias de oligoribonucleótidos, incluyendo moléculas de ADN y ARN de antisentido y ribozimas que funcionan para inhibir la traducción de ARNm de MIF y/o receptor de MIF. Moléculas de ADN y ARN de antisentido actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm mediante la unión con ARNm enfocado y previniendo la traducción de proteína, ya sea por inhibición de unión y/o translocalización de ribosoma o bien mediante el hecho de provocar la degradación nucleasa de la molécula de ARNm misma. Las ribozimas son moléculas de ARNm enzimáticos capaces de catalizar la disociación especifica de ARN. EL mecanismo de acción de ribozima incluye la hibridación específica para secuencias de la molécula de ribozima con ARN objetivo complementario, seguido por una disociación endonucleolítica- Dentro del alcance de la presente invención se encuentran moléculas de ribozima de motivo de cabeza de martillo manipuladas que catalizan específica y eficientemente la disociación endonucleolítica de secuencias de ARNm de MIF y/o receptor de MIF. Tanto moléculas de ADN como de ARN de antisentido y ribozimas de la presente invención pueden prepararse a través de cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ácido nucleico. Estos métodos incluyen técnicas para simplificar químicamente oligodesoxiribonucleótidos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, moléculas de AR pueden ser generadas a través de transcripción in vltro e in vivo de secuencia de ADN que codifican la molécula de ARN de antisentido. Tales secuencias de ADN pueden estar incorporadas en una amplia gama de vectores de incorporan promotores adecuados de ARN polimerasa tales como los promotores T7 o SP6 polimerasa. Alternativamente, constructos de ADNc de antisentido que sintetizan ARN de antisentido ya sea constitutiva o induciblemente, según el promotor utilizado, pueden ser introducidos de manera estable en lineas de células. Varias modificaciones a las moléculas de ADN pueden ser introducidas como un medio para incrementar la estabilidad intracelular y vida media. Modificaciones posibles incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, la adición de secuencias de flanco de ribo- o desoxinucleótidos en los extremos 5r y/o 3' de la molécula o bien el uso de fosforotioato o 2'-0-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro de la estructura de oligodesoxiribonucleótido. Para usos terapéuticos anti-MIF, los oligonucleótidos inhibidores pueden ser formulados y utilizados con células in vi tro y/o administradas a través de varios medios, incluyendo administración sistémica, localizada o tópica. Técnicas para la formulación de administración pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición. El modo de administración puede ser seleccionado para optimizar la administración a un órgano blanco deseado en el cuerpo - EJEMPLO Materiales y métodos Animales experimentales y lineas celulares. Ratones C57BL/ 6 (H-20) (hembras de 8 a 12 semana de edad) fueron comprados en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Todos los procedimientos con los animales fueron llevados a cabo de conformidad con los lincamientos del NSUH Institutional Animal Care and Use Commi ttee [Comité institucional de NSUH en materia de uso y cuidado de los animales] de conformidad con un protocolo aprobado- Células EG.7 (producidos por transfección de EL con un ADNc que codifica OVA (11) ) y células EL4 (ambas timomas de murino H-2D, MHC clase II negativo) asi como las células YAC-1 fueron obtenidas en ATCC (RocJcville, NM) . Se preparó MIF de murino recombinante (rMIF) de conformidad con lo descrito previamente (Bendrat, y colaboradores "Biochemical and Mutational Investigations of the Enzymatic Activity of Macrophage Migration Inhibitory Factor" [Investigaciones bioquímicas y mutaciones de la actividad enzimática de factor inhibidor de mutación de macrófagos] . , Biochemistry 36, 15356 (1997); Bernhagen, y colaboradores, "Purification, Bioactivity, and Secondary Structure Analysis of Mouse and Human Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) " [Purificación, bio-activiciad, y análisis de estructuras secundarias de factor inhibidor de migración de macrófagos de ratón y ser humano (MIF)]-/ Biochemistry, 33, 14144 (1994)) (< 1 pg endotoxina^g de proteina) . Se preparó mAb anti-MIF neutralizante (clon XIV. 15.5, IgGi, isotipo) de conformidad con lo previamente descrito (Chesney, y colaboradores, wAn Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogenesis and the Growth of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en la angiogénesis y el crecimiento de linfoma de murino]. Mol. Med., 5, 181 (1999) , Calandra, y colaboradores, 4%MIF as a Glueocorticoid-induced Modulator of Cytokine Production" [MIF como modulador inducido por gluecortxcoxdes de la producción de citocinas] , Nature, 377, 68 (1995)). Un anticuerpo de control de isotipo (IgGi) fue purificado bajo condiciones similares utilizando el hibridoma. 5D4-11, que secreta un anticuerpo especifico para el virus de dengue de tipo 3 (ATCC) . CD3 Ab, anti-ratón de FITC rata, CD4 anti-ratón de PE-rata, CD8 Ab anti-ratón de PerCP-rata, CD25 Ab anti-ratón de PE-rata, CD28 Ab anti-ratón de PE-rata, CD44 Ab anti-ratón de FITC-rata, CD25 anti-ratón de PE-rata (IL-2Ra), CD28 Ab anti-ratón de PE-rata, CD44 Ab anti-ratón de FITC-rata, CD25 anti-ratón de PE-rata (IL-2R<x), CD122 anti-ratón de PE-rata (11,-21$), CD132 anti-ratón de PE-rata (cadena ? compartida), y H-2Kb anti-ratón de PE-rata fueron comprados en PharMingen (San Diego, CD) . Generación de CTL específico para antígeno. La generación de CTL especifico para OVA ha sido descrito previamente (Moore, y colaboradores, "Introduction of Soluble Protein into the Class I Pathway of Antigen Processing and Presentatlon" [Introducción de proteina soluble en la via de clase I de procesamiento y presentación de antigenos}, Cell, 54 777 (1998) ) . En resumen, células de bazo fueron obtenidas a partir de ratones cebados 1-2 semanas antes por inyección i.p. de 5 x 10" células EG.7. Células de bazo aislada (3 10ó) fueron incubadas con células EG.7 irradiadas (20,000 rad; 106 células) durante 5 días (en presencia o ausencia de citocinas o anticuerpos - véase abajo) . Células efectoras utilizadas en el ensayo de CTL in vitro (véase abajo) fueron cosechadas a partir de estos cultivos y reconocieron el péptido de OVA257-264 (SIINFKEL) en el contexto de H-2K° (Ke, y colaboradores, "Ovalbumin Injected with Complete Freund' s Adjuvant Stimulates Cytolytic Responses" [Ovalbumina inyectada con adyuvante completo de Freund estimula la respuestas citoliticas] , Eur. J. Immunol., 25, 549 (1995)). Para estudiar el efecto de la neutralización de MIF in vivo, ratones cebados por EG.7 recibieron la inyección de mAb anti-MIF o bien IgG de control (0.5 mg, i.p.) el dia del implante de células tumorales y después diariamente durante 1 semana.

Células de bazo provenientes de ratones tratados con anti-MIF o bien IgG de control fueron después aisladas y evaluadas para determinar la actividad CTL in vi tro de conformidad con lo descrito abajo. Ensayo de citotoxicidad mediada por células. Células blanco EG.7 (5 x 105/pozos) fueron agregadas a diluciones en serie de células de bazo de efector (preparadas de conformidad con lo descrito arriba) en placas de fondo redondo de 96 pozos en proporciones E:T de 1:1 a 30:1 junto con varias concentraciones de mAb anti-MIF IgG de control, o bien rMlF purificado. Después de 4 horas a una temperatura de 37°Cf la citotoxicidad fue cuantificada por medición de la enzima citosólica, lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante de cultivo (n = 3) utilizando el ensayo Cyto Tox 96° (Promega Madison, I) . La "lisis especifica" para cada proporción E:T es expresada de la siguiente manera: lisis especifica = [ (liberación experimental) - (liberación espontánea) / (máximo objetivo - liberación espontánea objetivo)}. La liberación espontánea de LDH en ausencia de CTL fue inferior al 10% de la liberación celular máxima por lisis con detergente. Todos los procedimientos experimentales y ensayos fueron efectuados dos o más veces, con resultados similares. Ensayo de NK. Células YAC-1 sensibles a NK fueron utilizadas como objetivos y ensayos de NK fueron efectuados de conformidad con lo previamente descrito (Hashimoto, colaboradores, "Differential Antitumor Effects of Administration of Recombinant IL-18 or Recombinant IL-12 Are Mediated Pri arily by Fas-Fas Ligand- and Perforin-Induced Tumor Apoptosis, Respectively" [Efectos anti-tumor diferenciales de la administración de IL-18 recombinantes o IL-12 recombinantes son mediados primariamente por apoptosis tumoral inducida por ligando Fas-Fas y perforina, respectivamente]., J. Innnunol., 163:583 (1999)). Análisis citométrico de flujo. Suspensiones de células individuales libres de eritrocitos fueron preparadas a partir de los bazos de ratones experimentales de conformidad con lo indicado y analizado por citometría de flujo. Todos los anticuerpos marcados con fluorescencia fueron comprados en PharMingen y utilizados de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Células (lOValícuota) fueron resuspendidas en PBS que contenia 3% de BSA y 0.15 por ciento de azida de sodio (FACS-amortiguador) e incubadas con anticuerpos marcados con fluorescencia durante 30 minutos (4°C) seguido por dos lavados en amortiguador de FACS. Datos de fluorescencia fueron adquiridos en un citómetro de flujo FACSCalibur® (Becton, DicJcinson, Mountainview, CA) y analizado utilizando la programática CELLQuest (Becton Dickinson) . Este experimento fue repetido una vez con resultados similares. Análisis de producción de citocinas. La producción de citocinas fue medida por análisis de sobrenadante de cultivo por ELISA emparedadas utilizando kits de lFl#y# TNFa, IL-2, y IL-12 de murino adquiridos en R & D Systems (Minneapolis, MN) . El análisis ELISA para ???G de murino fue efectuado de conformidad con lo descrito previamente {Calandra, y colaboradores, "MIF as a Glueocorticoid-induced Modulator of Cytokine Production" {MIF como modulador inducido por gluecorticoides de la producción de citocinas], Nature, 377, 68 (1995) ) . La inclusión de mAb anti-MIF neutralizante en los cultivos formó complejos con MIF biológicamente activo, volviendo e MIF inactivo pero sigue siendo detectable por ELISA posteriormente. Crecimiento tumoral in vivo. Experimentos para determinar el efecto de mAb anti-MIF sobre el crecimiento tumoral de EG.7 fueron efectuados en ratones C57BL/6 siguiendo métodos descritos previamente (Chesney, y colaboradores, "An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogenesis and the Gro th of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en la angiogenesis y el crecimiento de linfoma de murino]., Mol. Med., 5, 181 (1999)). Células EG.7 cultivadas fueron lavadas, resuspendidas en PBS, y 5 x 10ó células (suspendidas en 0.1 mi de PBS) fueron inyectadas s.c. en el flanco superior de ratones (n - 5 por grupo) . Ratones recibieron una inyección i.p. de 0.3 mi de PBS, o bien Igd, anticuerpo de control de isotipo (0.5 mg) , o bien mAB antl-MIF purificado (0.5 mg) 1 hora después y después cada 24 horas durante 7 días. Se estimó el tamaño del tumor el dia 7 a partir de mediciones lineales ortogonales efectuadas con calibradores Vernier de conformidad con la fórmula: peso (mg) = [(ancho, mm)¿ x (longitud, mm) ] /2 {Taetle, y colaboradores, "Use of Nude Mouse Xenografts as Preclinical Drug Screens: in Vivo Activity of Established Chemotherap Agents Against Melanoma and Ovarían Carcinoma Xenografts" [Uso de xenoinjertos de ratón desnudo como tamiz farmacológico preclínico: actividad in vivo de agentes quimioterapéuticos establecidos contra xenoinjertos de melanoma y carcinoma ovariana], Cáncer Treat. Rep., 71, 297 (1987)). Este experimento fue repetido dos veces con resultados similares. Estudios histológicos. Tumores a partir de ratones tratados con IgG de control y anti-MIF fueron extirpados a los 7 días. Secciones de tumor congeladas fueron teñidas utilizando mAbs PE-CD4(L3T4) y FI C-CD8 (Ly-2) (PharMingen) . Las células T CD8+ y CD4+ fueron contadas bajo un microscopio de fluorescencia y expresadas como porcentaje de incremento del número promedio de células teñidas por sección de tumor en comparación con secciones provenientes de ratones tratados con IgG de control. Se contaron diez campos por sección utilizando un objetivo lOx (n = 5 ratones por grupo) . Secciones de control incubadas con un anticuerpo de control de isotipo conjugado con fluorescencia no presentaron inmunoreactividad. Detección de apóptosis in situ. Células sometidas apóptosis fueron detectadas utilizando marcado de extremo de corte de dUTP biotina mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) de conformidad con el procedimiento recomendado por el fabricante (R & D System) . Para análisis estadístico células apoptóticas fueron contadas por microscopía de luz (lOOx) y expresadas como la media (± S.D) de células apoptóticas por sección de tumor. Se analizaron cinco campos aleatorios por sección (1 sección por ratón, 5 ratones por grupo) y la prueba t de Students fue utilizada para determinar la significación (p<0.05) . Ensayo de migración de células linfoides in vivo. Ratones que no cortan tumores o ratones que cortan tumores Eg.7 de tamaño similar (,) 7 dias después de inyección de células tumorales) , de conformidad con lo descrito previamente por Zou y colaboradores (Zou y colaboradores, "Tumor-Bearing Mice Exhibit a Progressive Inc ease in Tumor Antigen-Presenting Cell Function and a Reciprocal Decrease in Tumor Antigen-Responsive CD4+T Cell Activity" [Ratones portadores de tumores presentan un incremento progresivo de la función de células de presentación de antigeno tumoral y una disminución reciproca de la actividad de células T CD4+ que responden a antígeno tumoral], J. I munol . , 148:648 (1992)), tratadas con inyección diaria de anti-MlF (0.5 mg/ratón, i.p.) o bien igG de control, fueron utilizados como la fuente de células para este ensayo. Células de bazo no fraccionadas o células de T CD8+ esplénicas purificadas (1 x 10b células/ml) fueron obtenidas y marcadas con PKH-26, un colorante fluorescente rojo de inserción en membrana (Sigma, St . Louis, MO) . Ensayos de migración de linfoides in vivo fueron efectuados de conformidad con lo descrito previamente (n = 5 ratones por grupo) (Rosenblatt-Velin, y colaboradores, "Transíormed and Nontransformed Human T Lymphocytes Migrate to Skin in a Chimeric Human Skin/SCID Mouse Model" {Los linfocitos T de ser humano transformados y no transformados migran hacia la piel en un modelo de ratón de piel humana SCID quimérico], J. Invest. Dermatol., 109, 744 (1997)). En resumen, células marcadas fueron inyectadas (i.v.) en ratones receptores portadores de tumores. Se removieron masas tumorales 24 horas después y se prepararon secciones de criostato. Secciones fueron teñidas con FITC-anti-CD4 o FITC-anti-CD8 para determinar el tipo de células T. La presencia de células donadores fluorescentes PKH-26 fue cuantificada por microscopía y expresada como el número promedio de células donadores marcadas por campo de tejido tumoral seccionado. Para cada sección (1 por ratón), diez campos fueron enumerados utilizando un objetivo lOx. Estos experimentos fueron repetidos dos veces con resultados similares.

Inmunoterapia adoptiva. Ratones C57BL6 fueron inyectados con 5 x 10b células EG.7 (s.c.) ? después tratados con mAb anti-MIF o bien IgG de control (0.5 mg/dia, i.p.) diariamente durante 7 dias (n = 5 por grupo) . Un dia después de la última inyección, células de bazo fueron aisladas y T esplénicas CD8+ fueron purificadas empleando columnas de enriquecimiento de CD8+ (R & D Systems) . Esplenocitos no fraccionados fueron células T CD8+ (5 x 106 3 células/ratón) fueron después transferidas (i.v.) en ratones de receptores que han sido inyectadas con 5 x 10° células EG-7 (i.p.) un dia antes. Se determinó el peso de los tumores los dias 1-13 de conformidad con lo descrito arriba. Este experimento fue repetido una vez con resultados similares. Resultados El anticuerpo anti-MIF incrementa la actividad de CTL in vi tro. Estudios previos establecieron que la proteina MIF y MRNA son expresados como parte de la respuesta de activación de linfocitos T y macrófagos (Calandra, y colaboradores, "The Macrophage is an Iraportant and Previously Unrecognized Source of Macrophage Migration Inhibitory Factor" (El macrófago es una fuente importante y previamente no reconocida de factor inhibidor de la migración de macrófagos]., J. Exp. Med., 179, 1985 (1994), Bacher y colaboradores '\?? Essential Regulatory Role for Macrophage Migration Inhlbito Factor in T-Cell Activation" [Una función reguladora esencial para el factor de inhibición de migración de macrófagos en la activación de células T]., Proc. Nati. Acad. Sci- U.S.A., 93, 7849 (1996), Bernbagen, J., Colaboradores, wAn Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Tuberculin Delayed-Type Hypersensitivity Reaction" {Una función esencial para el factor inhibidor de la migración de macrófagos en la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado de tuberculina] , J. Exp. Med 183:277 (1996)). Para evaluar una función potencial para MI en la respuesta del huésped a la invasión tumoral, los inventores examinaron primero si rMIF o un mAb anti-MIlT neutralizante influenció respuestas de células T citotóxicas especificas para antigeno y in vitro. Esplenocitos de ratones cebados por implantación de células Eg.7 fueron aislados, y estos cultivos de células de bazo fueron estimulados durante 5 dias con células EG.7 irradiadas en presencia ya sea de rMIF, mAb anti-MIF neutralizante o bien, igG de control de isotipo. Como se muestra en la figura IB, la adición de mAb anti-MIF a 50 µg/ml regulo de manera ascendente significativamente la respuesta T CTL in vitro, mientras que la adición de rMIF exógeno (figura 1A) o IgG de control (figura 1C) no afecto la actividad de CTL. Estudios de control mostraron que el tratamiento con mAb anti-MIF de esplenocitos o células EG.7 solo no influenció su característica de supervivencia o crecimiento, y que un pre-tratamiento in vitro con mAb anti-MIF no causo de manera independiente el desarrollo de citotoxicidad en cultivos de esplenocito no condicionado. Una función potencial para MIF en la fase de efector de a respuesta de CTL fue también estudiada mediante la adición de mAb anti-MIF o rMlF durante el período de ensayo de 4 horas final de cultivo de esplenocitos con células objetivo EG.7. No se observó ningún efecto de estos agentes sobre la actividad citotóxica in vitro durante este período de ensayo. En contraste, se observó que mAb anti-MIF era más activo en cuanto a la aumentación de respuesta de CTL in vitro cuando está presente en los primeros dos días del período de co-cultivo de 5 días (figura ID) . Estos datos indican que la inmunoneutralización de MIF durante la fase temprana de la activación de células T citotóxica in vitro potencia la actividad CTL posterior. De manera no inesperada, por consiguiente, se encontró que la estimulación in vitro de células efectoras de esplenocitos con células blanco EG.7 irradiadas produjo un incremento significativo en cuanto a la cantidad de MIF detectable en sobrenadante de cultivo en comparación con esplenocitos obtenidos a partir de ratones portadores de tumores cultivados en ausencia de células EG.7 irradiadas (figura 2A) . Sin embargo, no se observó ningún efecto significativo sobre la actividad de CTL después de la adición de rMlF bioactivo a cultivos de esplenocitos en paralelo, lo que sugiere que puede existir ya una respuesta celular máxima a MIF que es producido de manera endógena en estos cultivos (mayor que 30 ng/ml) (Figura 1A) . Después se examinó el efecto de la inmunoneutralización de MIF sobre la producción de citocinas conocidas por desempeñar una función importante en la expresión de la citotoxicidad de células T in vitro. Niveles de IFNy, TNFot, IL-2, e IL-12 presentes en los sobrenadantes de cultivo fueron medidos por ELISA específico. Entre estos, solamente ? lintsté un incremento significativo en cuanto a concentración durante el período de co-cultivo de dos días cuando mAb anti-MIF es más activo para incrementar la actividad CTL en comparación con los cultivos tratados con mAb de control (Figura 2B) . En contraste, la incubación de cultivos de esplenocito a partir de ratones portadores de tumor EG.7 en presencia de mAb anti-MIF y células EG.7 irradiadas no alteró significativamente la expresión de proteína de IL-2, IL-12, o TNFa en comparación con cultivos de control tratados con IgG. Células EG.7 cultivadas solas no presentaron niveles detectables de MIF, INFv. IL-2, TNFa, o IL-12. Por análisis citométrico de flujo, ni el tratamiento con rMIF ni el tratamiento anti-MIF de co-cultivos tuvo influencia sobre el porcentaje células que presentaron los marcadores de superficie celular CD+, CD4+, CD8+, CD28+, CD44al o. El tratamiento con mAb anti-MIF in vivo incrementa la actividad de CTL. La respuesta de CTL de esplenocitos cosechados a partir de ratones tratados con mAb anti-MlF versus un igGi de control de isotipo fueron comparados después, durante el periodo de cebado de tumor EG.7 in vivo. Estos experimentos mostraron que la administración diaria de mAb anti-Ml durante una semana después del cebado con células EG.7 (el dia 0) incremento significativamente la generación de actividad CTL en proporciones E:T de 30 y 10 (Figura 3A) . La inclusión de IgG de control no produjo una actividad incrementada de CTL en este sistema experimental ya sea en comparación con PBS solo o sin adición. Estudios recientes han establecido un efecto anti-tumor significativo de mAb anti-MIF en ratones portadores del linfoma de células B 38C13 (Chesney, y colaboradores, An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogenesis and the Growth of a Murine Lymphoma" [Una función esencial para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) en la angiogénesis y el crecimiento de linfoma de murino]., Mol. Med., 5, 181 (1999)) y del melanoma G361 (Shimizu, y colaboradores, "High Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and its Role in Tumor Cell Growth and Angiogenesis" [Expresión elevada de factor inhibidor de migración de macrófagos en células de melanoma de ser humano y su función en el crecimiento de células tumorales y la angiogénesis]., Biochem. Biop ys. Res. Común., 264, 75 1 (1999)) . De conformidad con estos datos y según la actividad observada duplicada de CTL por antí-MIF descrito arriba, encontramos que la administración de mAb anti-MIF a ratones que portan un tumor de linfoma EG.7 durante una semana resultó también en una reducción significativa de dos veces en cuanto al tamaño del tumor en comparación con ratones tratados con igG de control o PBS (Figura 3B) . Además, detectamos una infiltración aproximadamente tres veces mayor de células CD8+ y CD4+ después de tratamiento con mAb anti-MIF (Figura 4) .

Linfocitos T citotóxicos matan objetivos de células tumorales mediante la inducción de la apóptosis (Berke, G. y colaboradores, "The CTL' s Kiss of Death" [El beso de la muerte de los CTL], Cell, 81, 9 (1995)) . De manera consistente con el incremento observado de actividad CTL de huésped por tratamiento anti-MIF se encontró un incremento significativo (4-5 veces) en cuanto al número de células apoptóticas en las masas tumorales obtenidas a partir de ratones tratados con anti-MIF (Figura 5A), en comparación con tumores obtenidos a partir de ratones tratados con IgG de control (Figura 5B) . Esta diferencia en cuanto a apóptosis fue cuantificada por análisis del número promedio de células apoptóticas por campo de alta potencia en secciones tumorales provenientes de ratones tratados con anti-MIF (194 + 63 células/100 x campo) vs. el número encontrado en ratones tratados con IgG de control (43 + 22 células/100 x campo) y se encontró que era estadísticamente significativa (p<0.01). Se reportó previamente que rMIF inhibe la actividad de células NK in vitro (Apte, y colaboradores, "Role of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Inhibíting NK Ce11 Activity and Preserving Inánime Privilege" [La función del factor inhibidor de migración de macrófagos en la inhibición de la actividad de células NK y la conservación del privilegio inmune], J. Immunol . , 160, 5693 (1998)). Por consiguiente, el efecto inhibidor de mAb anti-MIF sobre el crecimiento tumoral in vivo puede ser el resultado de una actividad de células NK incrementada. Mientras se observó un incremento en cuanto a la actividad de células NK de preparaciones de células de bazo enteras provenientes de ratones portadores de EG.7 en comparación con ratones de control sin tumores, no se observó ningún cambio en la actividad de este tipo en ratones tratados con anticuerpos de anti-MIF. Estudios previos inostraron que la expresión de MIF durante la activación de células T CD4† impulsada por antígeno in vivo desempeña una función importante en la respuesta inmune (Bacher y colaboradores wAn Essential Regulatory Role for Macrophage Migration Inhibito Factor in T-Cell Activation" [Una función reguladora esencial para el factor de inhibición de migración de macrófagos en la activación de células T]., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 93, 7849 (1996)). Por consiguiente, se determinó después si la actividad citolítica incrementada observada con tratamiento con mAb anti-MIF estaba asociada con una proliferación incrementada inducida por antígenos de células T CD8+. De conformidad con Bacher y colaboradores (Bacher y colaboradores wAn Essential Regulatory Role for Macrophage Migration Inhibito Factor in T-Cell Activation" [Una función reguladora esencial para el factor de inhibición de migración de macrófagos en la activación de células T]., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. ., 93, 7849 (1996}), no se encontró ningún aumento de la proliferación de células T en presencia de tratamiento con mAb anti-MIF in vivo. Se examinó también el efecto de anti-MIF sobre la expresión de receptores para IL-2. El receptor para IL-2 es multimérico, consistiendo de una cadena (CD25) expresada de manera variable que regula la afinidad con IL-2, así como dos subunidades de señalización, las cadenas (CD122) y ? c> (CD132) (reseñadas en (Nelson, y colaboradores, "Biology of the Interleukin-2-Receptor" [Biología del receptor de interleucina-2] , Adv. Iramunol., 70, 1-81, 1 (1998))) . La subunidad yc> (conocida también como la cadena gamma común) es una subunidad compartida de los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, e IL-15. El reclutamiento de yc> es requerido para señalización intracelular (Nelson y colaboradores, "A Membrane-proximal Región of t e Interleukin-2 Receptor Gamma C Chain Sufficient for Jak Kinase Activation and Induction of Proliferation in T Cells" [Una región próxima membrana de la cadena gamma C de receptor de interleucina-2 suficiente para la activación de Jale quinasa y la inducción de la proliferación en células T], Mol. Cell Biol., 16, 309 (1996), Nelson, y colaboradores, "Cytoplasmic Domains of the Interleukin-2 Receptor Beta and Gamma Chains Medíate the Signal for T-cell Proliferation" [Dominio citoplásmicos de las cadenas beta y gamma de receptor de interleucina-2 median la señal para proliferación de células T] , Nature, 369, 333 (1994)), y su expresión es critica para la supervivencia de células T CD8+ maduras in vivo (Dai, y colaboradores, "The Role of the Common Cytokine Receptor Gamma-chain in Regulating ILl-2-Dependent, Activation Induced CD8+ T Cell Death" [La función de la cadena gamma de receptor de citocina común en la regulación de la muerte de células T CD8+ inducido por activación dependiente de IL1-2], J. Immunol . , 163, 3131 (1999)). Por consiguiente, se examinó el efecto del tratamiento anti-MIF sobre la expresión de yc. El tratamiento con mAb anti-MIF de ratones portadores de tumor incrementó significativamente la expresión de la cadena c pero no de las subunidades a o ß del receptor para IL-2 en células T CD8+ (Figura 6), en comparación con animales portadores de tumor tratados con IgG de control.

El anticuerpo anti-MIF promueve la migración de linfocitos T en tejido tumoral e incrementa la actividad anti~tumor específica de células T CD8 Para mostrar adicionalmente que el efecto anti-tumor in vivo de mAb anti-MIF era atribuible a efectos específicos sobre células T, se evaluó los efectos de tratamiento anti-MIF sobre el tráfico de linfocitos T en tumores . Ratones de control o ratones portadores de tumores EG.7 fueron tratados ya sea con anti-MIF o bien IgG de control durante 7 días, y células de bazo no fraccionadas o células T CDQ† esplénicas purificadas fueron recogidas para marcado con PKH-26. Los esplenocítos no fraccionados marcados o bien las células CD8+ purificadas fueron transferidos en receptores portadores de tumor EG.7. La entrada de células donadores marcadas con PKH-26 en tumores de ratones receptores durante 24 horas fue cuantificada por microscopía fluorescente de secciones de criostato obtenidas a partir de tejido tumoral extirpado (Figuras 7A y 7B, respectivamente). Estos experimentos mostraron que células de bazo o células T CD8† purificadas obtenidas a partir de los ratones portadores de tumores, tratados con mAb anti-MIF penetraron en el tejido tumoral en mayor número {un incremento >dos veces) que células comparables obtenidas a partir de los ratones portadores de tumores, tratados con mAb de control. Finalmente, se probó el efecto de células CD8† transferidas de manera adoptiva (obtenidas de animales tratados con mAb anti-MIF) sobre el crecimiento tumoral in vivo. Cinco millones de esplenocitos no fraccionados o células t esplénicas CD8+ purificadas (Figura 7 C) provenientes de ratones donadores portadores de tumores EG.7 tratados con IgG de control o mAb anti-MIF fueron transferidos a ratones que habían sido inyectados s.c. con células de tumor EG.7, 24 horas antes. El crecimiento tumoral in vivo fue después monitoreado durante dos semanas. Como se muestra en la Figura 7C, la transferencia adoptiva de células T CD8+ obtenidas a partir de ratones portadores de tumores, tratados anti-MIF a ratones portadores de tumores no tratados mostró un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento tumoral subsecuente en ratones receptores. En contraste/ no se observó ninguna diferencia significativa en cuanto a peso de tumor después de la transferencia de esplenocitos no fraccionados (5 x 10° células; que contienen tanto células T como B CD4+ y CD8+) obtenidas a partir de ratones portadores de tumor tratados anti-MIF versus ratones portadores de tumor tratados con IgG de control. Estos datos indican la importancia de un número crítico de células T CD8† obtenidas a partir de animales portadores de tumores tratados anti-MIF para mediar una inhibición significativa del crecimiento tumoral en experimentos de transferencia adoptiva. La invención ha sido descrita detalladamente con referencia a modalidades representativos y será aparente a una persona con conocimientos ordinarios en la materia que cambios y modificaciones pueden efectuarse sin salirse del espiritu y alcance de la invención presentada en las reivindicaciones siguientes .

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES Un método para preparar células como una terapia contra el cáncer para su administración a un sujeto con cáncer, dicho método comprende el cultivo de las células en presencia de un antagonista de MIF. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antagonista de MIF se selecciona dentro del grupo que consiste de anticuerpos anti-MIF, ADNc de antisentido para MIF, y antagonistas de enlace ligando: receptor de MIF. Un método para preparar células como una terapia contra el cáncer para su administración a un sujeto con cáncer, dicho método comprende el cultivo de las células en presencia de anticuerpos anti-MIF. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde los anticuerpos anti-MIF son monoclonales. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde los anticuerpos anti-MIF monoclonales se seleccionan dentro del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y anticuerpos monoclonales de cadena simple. Un método para preparar una composición celular como una terapia contra el cáncer para su administración a un sujeto con cáncer, dicho método comprende la incubación de células de la composición en presencia de (a) por lo menos un antigeno tumoral y (b) anticuerpos anti-MlF. . Un método para preparar células autólogas para su administración a un sujeto con cáncer, que comprende el paso de incubar las células en presencia de un agente, dicho agente se selecciona dentro del grupo que consiste de anticuerpos anti-MIF, fragmentos de unión con MIF del mismo, o ambos. . Un método para preparar células autólogas para su administración a un sujeto con cáncer, que comprende el paso de incubar las células en presencia de (a) por lo menos un antigeno tumoral y (b) un agente, dicho agente se selecciona dentro del grupo que consiste de anticuerpos anti-MIF, fragmentos de enlace con MIF de los mismo, o ambas cosas. . El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde las células autólogas comprenden células inmunes. 0. E1 método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células autólogas comprenden células T. 1. E1 método de conformidad con la reivindicación 7, en donde las células autólogas comprenden células CD8*.
2. 2. Una composición celular para su administración a un sujeto con cáncer, que comprende células incubadas con anticuerpos anti-MIF.
3. 3. La composición celular de conformidad con la reivindicación 12, en donde las células incubadas con anticuerpos anti-MIF son también incubadas con por lo menos un antigeno tumoral. . La composición celular de conformidad con la reivindicación 12, en donde la incubación con anticuerpos anti-MIF es ex vivo. 5. La composición celular de conformidad con la reivindicación 12 aislada a partir de anticuerpos anti- MIF no unidos - 6. La composición celular de conformidad con la reivindicación 13 aislada a partir de anticuerpos anti- MIF no unidos y antigeno tumoral no unido. 7. La composición celular de conformidad con la reivindicación 13, en donde las células comprenden células inmunes . 8. La composición celular de conformidad con la reivindicación 13, en donde las células comprenden células T. 9. La composición celular de conformidad con la reivindicación 13, en donde las células comprenden células CD8†.