JP2004531237A - マクロファージ遊走阻止因子による細胞障害性リンパ球応答の調節を調整するための方法及び組成物 - Google Patents
マクロファージ遊走阻止因子による細胞障害性リンパ球応答の調節を調整するための方法及び組成物 Download PDFInfo
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Abstract
マクロファージ遊走阻止因子(MIF)によるCTL活性の発現の制御が開示される。EL4腫瘍を使用したマウスモデルにおいて、腫瘍で初回感作されたマウスに由来する培養脾細胞は、インビトロで、抗原刺激の後、高レベルのMIFを分泌する。中和抗MIF mAbにより処理された平行脾細胞は、コントロールmAbで処理された培養物と比較して有意な腫瘍細胞に対するCTL応答の増加を、上昇したIFNγの発現と共に示した。CD8+T細胞の生存を媒介するIL−2受容体の共通γc鎖の増強された発現と関連していた、観察された抗MIFによるインビボのCTL活性の増強と一致して、抗MIFで処理された動物に由来する腫瘍の組織学は、CD4+T細胞及びCD8+T細胞両方の浸潤の増加、並びにアポトーシス腫瘍細胞の増加を示した。抗MIFで処理された腫瘍保持マウスのCD8+細胞は、コントロールマウスの腫瘍への増加した遊走を示した。MIFの阻害によりCTL応答を増強するための方法が、開示される。
Description
【技術分野】
【0001】
発明の背景
発明の領域
本発明は、抗原への曝露の前、途中、又は後に、CD8+リンパ球及び/又はCD4+リンパ球が曝されるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)のレベルを減少又は増加させることによる、腫瘍関連抗原のような抗原に対する細胞障害性リンパ球の応答の調整(増加又は減少)のための方法及び組成物に関するものである。本発明は、さらに、細胞に基づく免疫療法的アプローチを使用して、抗原に対する細胞障害性リンパ球の応答を調整することによる、疾患、特に腫瘍の予防及び治療のための組成物及び方法に関するものである。
【0002】
技術の背景
実験的研究及びヒト臨床研究の両方から明らかとなったデータは、腫瘍関連抗原が、有意な腫瘍退行を生じさせうる抗腫瘍細胞障害性リンパ球(CTL)応答を誘発するのに十分であることを示している(27、28)。ペプチド免疫化によりCTL細胞障害性を増強することを目指した、細胞に基づく免疫療法的戦略を利用することにより、少数の症例において、長期の黒色腫の緩解が達成された(29)。しかしながら、MHCクラスIに含まれる腫瘍特異抗原の存在にも関わらず、激しく腫瘍を死滅させる免疫応答はin vivoではほとんど検出されない。腫瘍特異CTLの生成は、腫瘍抗原の適切なプロセシング、MHCクラスI分子による腫瘍抗原の提示、腫瘍抗原を認識するための適切な特異性のT細胞受容体を発現しているTリンパ球、及び免疫学的環境における免疫系への初期の抗原提示を必要とする。腫瘍退行の成功を達成するためには、このCTL応答が、開始するのみならず、活発であり、かつ持続しなければならない。
【0003】
CTL応答の様々な面を増強するいくつかのサイトカインの活性は、以前より正しく理解されている。例えば、IL−2の初期の発現は、CTLによる溶解能の増殖及び発達における重要因子である(30)。さらに、IFNγ(30)、IL−1及びIL−6(31)、IL−6と一緒のIL−2(32)、IL−7(33)、IL−10(34)、及びIL−12(35〜37)は、全て、CTLの活性化、増殖、及び/又は分化において役割を果たすことが認められている。これらのメディエーターは、抗原提示、CD4+ヘルパーT細胞機能、マクロファージ細胞接着を増強することにより、又は重要な共刺激分子の発現を増加させることにより、CTL活性を促進する。IL−1(38)、IL−2(39)、IL−12(40〜42)、IFNα(43、44)、IFNγ(45)、及びTNFα(46)を含む組換えサイトカインの投与によって媒介される抗腫瘍効果が、腫瘍保持マウスにおいて示されている。
【0004】
対照的に、IL−4(47、48)及びTGFβ(49)を含む少数のサイトカインのみが、CTLの分化又は溶解活性を抑制することが示されている。IL−4は、CD8+T細胞からのIFNγの分泌を阻害し(50、51)、高い細胞溶解能を有するCD8+T細胞の活性化及び分化を制限するようである(52)。さらに、IL−4の不存在下でのCTL初回感作は、チャレンジ後に、より強力な応答を生じさせる。これらの少数のサイトカインがCTL細胞溶解活性を阻害する機序は、明確にはなっていない。
【0005】
マクロファージ遊走阻止因子(MIF)として既知のタンパク質メディエーターの生物学的機能は、最近、精密に検討されるようになったばかりである((1)に概説)。MIFは、最初、ほぼ40年前に、活性化されたTリンパ球によって産生される可溶性の活性として記載されたが(2、3)、このタンパク質のマウスホモログが下垂体前葉から分泌されることが同定された際に、MIFへの関心は再燃した(4)。その後すぐ、従来はMIF作用の標的であると考えられていたマクロファージが、微生物毒素又はサイトカインTNFα及びIFNγによる活性化の際のMIFの重要な起源であることが見出された(5)。インビボでの研究は、MIFが、内毒素に対する宿主応答においても重要な役割を果たすことを確立した。LPSと一緒の組換えMIF(rMIF)の投与は、LPSの致死性を激化させ、中和抗MIF抗体は、致死性の内毒血症(4)、外毒血症(6)、及び腹膜炎(7)からマウスを防御する。MIF機能に関する研究は、T細胞活性化応答中のIL−2の発現、及びB細胞による抗体産生にも、このタンパク質が必要であることを確立した(8)。
【0006】
二つの最近の報告は、腫瘍成長における予期しないMIFの役割を発見した(9、10)。本発明者らは、抗MIFモノクローナル抗体(mAb)のマウスへの投与が、同系の皮下に埋め込まれたB細胞リンパ腫38C13の成長及び血管新生を有意に減少させることを観察した(9)。この抗腫瘍効果は、内皮細胞増殖及び腫瘍血管形成応答におけるMIFの必要性に、一部、よるものであるという証拠が得られた(9)。同様に、ヒト黒色腫腫瘍G361を保持しているマウスの抗MIF mAb処理は、腫瘍成長及び新血管新生を有意に減少させた(10)。
【0007】
発明の概要
本発明は、MIF発現がCTL応答中にアップレギュレートされること、並びに特定のmAbを使用したMIFの阻害がin vitro及びin vivoでのCTL活性を促進することの本発明者らによる発見に、一部、基づいている。特に、MIFの中和が、CTL活性を促進し、腫瘍成長を阻害し、そしてin vivoの腫瘍侵襲部位へのTリンパ球ホーミングを増加させうるという実験的証拠が、本明細書に開示される。従って、下記実施例におけるin vitroのCTL研究からの結果は、in vitroの初回感作期におけるMIFの免疫中和が、CTL培養物中のIFNγ産生を増加させたことを明らかにしている。Thl細胞ではなくTh2細胞の活性化によってMIF分泌が増強されることを考慮すると(8)、可溶性抗原刺激がMIF発現を誘導し、次にそれが、IFNγを含むThlサイトカインの産生を抑制することにより、in vivoのCTL活性化を阻害するのかもしれない。
【0008】
従来の研究は、CD4+ヘルパーT細胞によって媒介される効果である、様々な分裂促進物質又は可溶性抗原に対する活性化応答において、MIFが本質的な役割を果たしていることを示した。分裂促進物質又は抗原により活性化されたT細胞は、多量のMIF mRNA及びタンパク質を発現し、MIFの免疫中和は、in vitroではIL−2産生及びT細胞増殖を阻害し、in vivoでは可溶性抗原に対するT細胞ヘルパー応答を減少させる(8)。本研究は、MIF発現が腫瘍抗原刺激に応答してアップレギュレートされること、及びMIFの中和が、IL−2分泌又は抗原により誘導されるCD8+T細胞の増殖には影響しないことを示している。しかしながら、抗MIF処理は、細胞内シグナリングに必要であり(25)CD8+T細胞生存にとって重要な(26)IL−2受容体γcサブユニットの発現を有意に増加させた。従って、MIF中和によるT細胞細胞障害性の増強は、CD8+T細胞の増殖の認めうるほどの増加には起因するのではなく、細胞障害性CD8+T細胞の集団の増強された生存に起因するのかもしれない。腫瘍退行の成功を促進するためには、CD8+T細胞による細胞溶解活性の開始の後、この細胞溶解活性が持続しなければならない。従って、MIFの阻害は、in vitroでもin vivoでも、有意なCTL抗腫瘍活性が顕在化するよう、CTLの寿命を延長するよう作用するであろう。
【0009】
EG.7腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理は、増強されたCTL活性と関連して、腫瘍成長を有意に阻害した。さらに、抗MIF処理された腫瘍保持マウスから移植されたCD8+T細胞は、レシピエントマウスにおける腫瘍成長を阻害した。腫瘍の集合体(corpus)内に見い出されるアポトーシス腫瘍細胞の数の増加が観察されたことから、増強された又は持続したCTLの細胞障害性が、直接、抗MIF処理されたマウスにおける腫瘍成長の抑制に寄与したと結論付けることは合理的である。
【0010】
最近の報告は、腫瘍細胞が非形質転換細胞より多くのMIFを産生することを示した(10、53、54)。腫瘍細胞は、適切な腫瘍抗原を発現している場合ですら、CTLによるか又はCTLにより媒介される溶解に対する抵抗性を腫瘍細胞に与えるMHC発現のダウンレギュレーションによって認識される腫瘍抗原の消失を介して、CTLによる死滅を逃れることができる(55)。EG.7細胞はMIFを構成性分泌しているが(106個の細胞により、およそ10ng/ml)、rMIFも抗MIF抗体も、EG.7細胞によるMHCクラスI発現には影響を及ぼさなかった。当データは、CD8+T細胞生存の減少をもたらす腫瘍細胞によるMIF分泌によって、腫瘍の宿主免疫応答の回避のための付加的な機序が起こることを示す。
【0011】
いくつかの研究は、いくつかの腫瘍細胞によるFasLの発現を示しており、これは、がんが免疫特権部位であるかもしれないという興味深い可能性を高める。例えば、腫瘍浸潤リンパ球のアポトーシスが、FasLを発現している黒色腫及び肝細胞がん腫においてin situで証明されている(57)。しかしながら、より最近のin vitro及びin vivoのデータは、最初の仮説に異議を唱えた。これらの研究は、いくつかの腫瘍がFasL発現(58、59)を欠いており、いくつかの腫瘍細胞のFasL cDNAによるトランスフェクションが、腫瘍細胞による免疫系の回避を促進するのではなく、腫瘍退行を誘導したことを明らかにした(59、60)。さらなる研究は、FasL発現が迅速な移植片拒絶(61、62)及び炎症(63)を促進することを示した。この研究は、腫瘍内のFasLの発現を調査していないが、本所見は、これらの系におけるFasL発現に対するMIF/抗MIFの効果を調査することが有益であろうことを示している。
【0012】
本研究は、T細胞輸送におけるMIFの重要な役割も同定した。抗MIF処理されたマウスの腫瘍内のCD4+T細胞及びCD8+T細胞の両方の蓄積の増加が観察された。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)による腫瘍破壊は、CD4+T細胞及びCD8+T細胞の両方を含むことが既知である。IL−2及びTILによるラットにおける乳房腫瘍の治療は、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導により腫瘍退行を促進し(64)、ヒト黒色腫内のTILの大量な蓄積は、患者のより順調な結果と関連している(65)。抗MIF抗体が腫瘍塊へのCD4+T細胞及びCD8+T細胞の遊走を増加させるという観察は、変更されたケモカイン又はケモカイン受容体の発現のようなメカニズムを含んでいてもよい、抗MIF抗体が抗腫瘍T細胞機能に影響する付加的な手段を提供する。
【0013】
CTL活性の調整に加え、MIFは、腫瘍形成のその他の面においても役割を果たすようである。二つの独立した研究室が、MIF中和が、腫瘍血管形成を有意に阻害することを示し(9、10)、ハドソン(Hudson)及び共同研究者らは、繊維芽細胞へのrMIFの添加が、転写活性を抑制することにより、p53機能(増殖及びアポトーシスの両方)を阻害することを、最近明らかにした(66)。多様な宿主免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞の死滅に参与しているが、腫瘍抗原特異CTLは、標的細胞上で発現された低い抗原密度ですら、腫瘍細胞死滅を媒介する効果が高い(67)。従って、MIF免疫中和による治療的なCD8+CTLの増強は、細胞に基づく抗腫瘍免疫療法の新規な基礎を提供する。
【0014】
従って、本発明は、ex vivoもしくはin vivo、又はその両方において、抗原への曝露の前、途中、又は後に、CD8+リンパ球及び/又はCD4+リンパ球が曝されるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)のレベルを減少又は増加させることによる、腫瘍関連抗原のような抗原に対する細胞障害性リンパ球の応答の調整(増加又は減少)のための方法及び組成物を提供する。
【0015】
従って、本発明の一つの面において、有効な免疫療法のためのCTL応答を必要とするがん又は別の状態を有する対象への投与のためのがん療法としての細胞、好ましくはT細胞、より好ましくはCD8+T細胞を調製する方法を提供する。この方法は、MIFのアンタゴニスト又は阻害剤の存在下で細胞を培養することを含む。この方法において、MIFアンタゴニストは、抗MIF抗体、MIFアンチセンスcDNA、及びMIFリガンド:受容体結合のアンタゴニストからなる群より選択される。好ましい実施態様において、この方法は、MIF活性を中和又は不活化する抗MIF抗体の存在下で細胞を培養することを含む。好ましくは、本発明の方法において使用される抗MIF抗体は、モノクローナルであり、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び単鎖モノクローナル抗体からなる群より選択される。
【0016】
もう一つの面において、本発明は、(a)所望のCTL応答の標的である少なくとも1個の抗原、好ましくは腫瘍抗原、及び(b)抗MIF抗体の存在下で組成物の細胞をインキュベートすることを含む、CTL応答を増強するための免疫療法、好ましくはがんを有する対象への投与のためのがん療法としての細胞組成物を調製する方法に関する。
【0017】
本発明のさらにもう一つの面は、抗MIF抗体、そのMIF結合断片、又はそれら両方からなる群より選択される薬剤の存在下で細胞をインキュベートする工程を含む、がんを有する対象への投与のための自家細胞を調製する方法に関する。この方法の好ましい実施態様は、(a)少なくとも1個の腫瘍抗原、及び(b)抗MIF抗体、そのMIF結合断片、又はそれら両方からなる群より選択される薬剤の存在下で、細胞をインキュベートする工程を含む。自家細胞は、好ましくは免疫細胞、より好ましくはT細胞、さらに好ましくはCD8+T細胞を含む。
【0018】
もう一つの面において、本発明は、増強された抗原に対するCTL応答を必要とする対象、例えばがんを有する対象への投与のための細胞組成物を提供する。この組成物は、抗MIF抗体と共にインキュベートされた細胞を含む。この細胞組成物の一つの実施態様において、抗MIF抗体と共にインキュベートされた細胞は、さらに、腫瘍抗原のような、増強されたCTL応答が望まれる抗原少なくとも1個と共にインキュベートされている。好ましくは、この細胞組成物において、抗MIF抗体とのインキュベーションはex vivoであり、細胞組成物は、抗MIF抗体とのインキュベーションの後に未結合の抗MIF抗体から単離された細胞を含みうる。この細胞組成物中の細胞は、共にインキュベートされた未結合の抗MIF抗体及び未結合の抗原、例えば腫瘍抗原の両方から単離されていてもよい。好ましくは、本発明の細胞組成物において、細胞は、免疫細胞、より好ましくはT細胞、さらに好ましくはCD8+T細胞を含む。
【0019】
発明の詳細な説明
本発明は、これらに限定はされないが、腫瘍(がん性もしくは良性)、ウイルス感染、例えばマラリアを含む寄生虫感染、及び/又は細菌感染を含む、CTL応答を必要とする任意の状態の治療のための、in vitro及びin vivoでMIFの放出及び/又は活性を阻害する組成物及び方法を含む。
【0020】
本発明によるMIF活性の阻害は、これらに限定はされないが、MIFと結合し、その生物学的活性を中和する因子の使用;MIF受容体アンタゴニストの使用;体内の細胞起源からのMIFの放出を阻害する化合物の使用;並びにMIF発現を防止するか又は減少させるためのMIFコーディング配列、非コーディング配列、及び/又は制御配列に由来するヌクレオチド配列の使用を含む、多数の方式で達成されうる。これらのうちのいずれもが、関連状態の治療においてMIF活性を阻害するために個々に又は組み合わされて利用されうるし、さらに、例えばペプチド免疫感作、サイトカイン療法等を含むその他のCTL増強療法と組み合わされてもよい。
【0021】
以後、MIF結合パートナーと呼ばれる、MIFと結合し、その生物学的活性を中和する因子は、CTL応答を必要とする状態の治療として本発明に従い使用されうる。MIFタンパク質のレベルは、腫瘍による分泌又はTh2 Tヘルパー細胞の活性化によって増加しうるが、阻害性MIF結合パートナーのMIFタンパク質との相互作用は、付随するMIF活性の増加を妨害する。そのような因子は、これらに限定はされないが、抗MIF抗体、抗体断片、MIF受容体、及びMIF受容体断片を含みうる。
【0022】
当分野において既知の様々な手法が、(例えば、下記の組換えDNA技術を使用して)組換え作製されたMIF、又は天然に精製されたMIFのエピトープに対する抗体の作製のため使用されうる。中和抗体、即ちMIF受容体の結合部位に関して競合するか、又はそれを立体的に遮断するものは、診断剤及び治療剤にとって特に好ましい。そのような抗体は、これらに限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーにより作製されたフラグメントを含みうる。
【0023】
抗体の作製のため、様々な宿主動物が、MIF及び/又はMIFの一部の注射によって免疫感作されうる。そのような宿主動物は、これらに限定はされないが、ほんの少数挙げるとすれば、ウサギ、マウス、及びラットを含みうる。これらに限定はされないが、フロイント(完全及び不完全)、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びBCG(bacille Calmette−Guerin)及びコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)のような潜在的に有用なヒトのアジュバントを含む、様々なアジュバントが、宿主種に依って、免疫学的応答を増加させるために使用されうる。
【0024】
MIFに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することにより調製されうる。これらは、これらに限定はされないが、コーラー(Kohler)及びミルステイン(Milstein)により最初に記載されたハイブリドーマ技術(Nature,1975,256:495−497)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.,1983,Immunology Today,4:72;Cote et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.,80:2026−2030)、及びEBVハイブリドーマ技術(Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,77−96頁)を含む。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製のため開発された技術(Morrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454)が使用されうる。別法として、単鎖抗体の作製のために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、MIF特異単鎖抗体を作製するために適合させることもできる。
【0025】
ハイブリドーマ技術は、抗MIFモノクローナル抗体を製造するために利用されている。例えば、内容が完全に参照により本明細書に組み込まれるブカラ(Bucala)らの米国特許第6,030,615号を参照のこと。ヒト型及びマウス型両方のMIFに対するIgGモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが単離されており、MIF生物学的活性を中和する能力に関して特徴決定されている。抗MIFモノクローナル抗体は、マクロファージによる細胞内寄生虫の死滅の刺激を阻害することが示された。抗MIFモノクローナル抗体は、MIFに関する特異的かつ高感度のELISAスクリーニングアッセイを開発するためにも利用されている。
【0026】
特定のMIFエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって製造されうる。例えば、そのような断片は、これらに限定はされないが、抗体分子のペプシン消化により作製されうるF(ab′)2フラグメント、F(ab′)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより製造されうるFab断片を含む。別法として、MIFに対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするため、Fab発現ライブラリーが構築されてもよい(Huse et al.,1989,Science,246:1275−1281)。
【0027】
MIF受容体、MIF受容体断片、及び/又はMIF受容体アナログは、本発明に従い、MIF生物学的活性の阻害剤として使用されうる。MIFタンパク質と結合することによって、これらの分子クラスは、MIFの細胞MIF受容体との結合を阻害し、それにより、MIFが生物学的活性を発揮する機序を抑止することができる。そのような分子の活性を模倣する小さい有機分子も、本発明の範囲内である。MIF受容体は、アミノ酸配列特異的かつ/又は構造特異的にMIFと結合する任意の細胞表面分子を含みうる。MIF受容体の断片も、MIF阻害剤として使用可能であり、MIFと特異的に結合してMIFの生物学的活性を阻害する、アミノ、カルボキシ、及び/又は内部の欠失を保有しているMIF受容体断片も、本発明の範囲内にあるものとする。アミノ及び/又はカルボキシの欠失とは、少なくとも1個のアミノ酸残基のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端の短縮を保有している分子をさす。内部の欠失とは、少なくとも1個のアミノ酸残基の1個以上の非末端欠失を保有している分子をさす。これらのMIF受容体断片には、細胞質ドメイン又は細胞質ドメインの一部が欠失している短縮型受容体、並びにMIF受容体細胞外ドメインの全部もしくは一部を含有している可溶性MIF受容体が生成するよう、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインが欠失している断片も含まれる。
【0028】
MIFと特異的に結合するMIF受容体アナログも、MIF活性を阻害するために使用されうる。そのようなMIF受容体アナログは、アミノ末端、カルボキシ末端、又は2個の隣接したMIF受容体アミノ酸残基間に位置する1個以上の付加的なアミノ酸をさらに保有しているMIF受容体又は受容体断片を含みうる。付加的なアミノ酸は、MIF受容体融合タンパク質を形成させるためMIF受容体タンパク質の全部又は一部に機能的に付加された異種ペプチドの一部であってもよい。例えば、制限するものではないが、MIF受容体、又はその短縮された一部は、免疫グロブリンの所望のFc部分を有する融合タンパク質として改変されうる。MIF受容体アナログは、保存的又は非保存的な性質の1個以上のアミノ酸置換をさらに保有しているMIF受容体又はMIF受容体断片も含みうる。保存的アミノ酸置換は、例えばグルタミン酸(E)からアスパラギン酸(D)へのアミノ酸置換のように、1個以上のアミノ酸を、同様の電荷、サイズ、及び/又は疎水性特徴のアミノ酸に交換することからなる。非保存的置換は、例えばグルタミン酸(E)からバリン(V)への置換のように、1個以上のアミノ酸を、相違する電荷、サイズ、及び/又は疎水性特徴を保有するアミノ酸と交換することからなる。MIF受容体、MIF受容体断片、及び/又はアナログは、組換えDNA技術を使用して作成されうる。
【0029】
MIF受容体と結合することによりMIFの生物学的活性を阻害する分子も、CTL応答を必要とする状態の治療のために利用されうる。そのような分子は、これらに限定はされないが、抗MIF受容体抗体及びMIFアナログを含みうる。抗MIF受容体抗体を産生させ、MIF受容体機能を中和するために使用することができる。MIF受容体タンパク質の全部又は任意の一部に対する抗体は、例えば米国特許第6,080,407号(前記)に記載された技術に従い作製されうる。
【0030】
MIFアナログは、MIF受容体と結合するが、生物学的活性は示さない分子を含みうる。そのようなアナログは、MIF受容体との結合に関してMIFと競合し、従って、in vivoで使用された場合、サイトカインにより媒介される障害性の進行におけるMIFの効果を阻止するよう作用することができる。当業者に周知の多様な技術が、MIFアナログを設計するために使用されうる。組換えDNA技術は、例えば、受容体結合能を有するが生物学的活性は有しないMIFアナログを生成させるアミノ酸の挿入、欠失、及び/又置換を含有している修飾型MIFタンパク質を作製するために使用されうる。別法として、MIFアナログは、化学的方法を使用して合成されてもよい(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.(1989)参照)。MIF受容体及び/又はMIF受容体を発現する細胞系は、可能性のあるMIFアンタゴニストを同定及び/又はアッセイするために使用されうる。
【0031】
米国特許第6,080,407号(前記)において教示されたように、一般に不活性又は「抗ステロイド性」のいずれかであると考えられているある種のステロイド;例えば20αジヒドロコルチゾールは、実際、MIFの放出を阻害する。これらのステロイド、又は予め形成されたMIFの放出を阻害するその他の任意の化合物が、本発明において、その他の抗MIF剤との組み合わせ療法において使用されうる。
【0032】
抗MIF抗体、MIF受容体、MIF受容体断片、MIF受容体アナログ、抗MIF受容体抗体、MIFアナログ、及びMIF放出の阻害剤のようなMIFの生物学的活性の阻害剤は、当業者に周知の技術を使用して投与されうる。好ましくは、薬剤は、製剤化され全身投与される。製剤化及び投与のための技術は、「Remington′s Pharmaceutical Sciences」,第18版,1990,Mack Publishing Co.,Easton,Paに見出されうる。適当な経路は、ほんの少数挙げるとすれば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸管投与;筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、並びに直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、又は眼内注射を含む非経口送達を含みうる。最も好ましくは、投与は静脈内である。注射の場合、本発明の薬剤は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーのような生理学的に適合性のバッファーの中に製剤化されうる。経粘膜投与の場合には、透過性化される障壁にとって適切な浸透剤が、製剤の中に使用される。そのような浸透剤は、当分野において一般的に既知である。
【0033】
投与される本発明のMIF阻害化合物の投薬の有効な濃度及び頻度は、生物学的半減期、生物学的利用能、及び毒性のようなパラメーターを扱う、当業者に周知の手法により決定されうる。抗MIF抗体の場合、好ましい投薬濃度は、体重1kg当たり約0.1〜20mgの範囲であり、体重1kg当たり約10mgが最も好ましい。循環系における長い半減期を示す抗体又はその他の阻害化合物の場合には、単回投与が、必要とされる循環系中濃度を維持するのに十分であるかもしれない。より短い半減期を示す化合物の場合には、必要な循環系中濃度を確立し維持するのに、複数の用量が必要であるかもしれない。
【0034】
MIF阻害剤は、単独で又は他の療法と組み合わされて患者に投与されうる。そのような療法は、CTL応答が望ましい腫瘍又はウイルスの阻害剤又はアンタゴニストの連続投与又は同時投与を含む。
【0035】
発明の範囲内には、MIF及び/又はMIF受容体のmRNAの翻訳を阻害するよう機能するアンチセンスのRNA分子及びDNA分子、並びにリボザイムを含む、オリゴリボヌクレオチド配列である抗MIF剤を使用した方法が含まれる。アンチセンスのRNA分子及びDNA分子は、直接、標的とされたmRNAと結合し、リボソーム結合及び/もしくは転位の阻害、又はmRNA分子自体のヌクレアーゼによる分解の誘発のいずれかによって、タンパク質翻訳を防止することにより、mRNAの翻訳を阻止するよう作用する。リボザイムは、RNAの特異的な分解を触媒することができる酵素性RNA分子である。リボザイム作用の機序は、リボザイム分子の相補標的RNAへの配列特異的なハイブリダイゼーション、それに続くヌクレオチド分解(endonucleolytic cleavage)を含んでいる。本発明の範囲内には、MIF及び/又はMIF受容体のmRNA配列のヌクレオチド分解を特異的かつ効率的に触媒する、改変されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。本発明のアンチセンスのRNA分子及びDNA分子、並びにリボザイムは、いずれも、核酸分子の合成のための当分野において既知の任意の方法によって調製されうる。これらは、例えば固相ホスホラミダイト化学合成のような、当分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学合成するための技術を含む。別法として、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitro及びin vivoの転写によって製造されうる。そのようなDNA配列は、T7又はSP6ポリメラーゼプロモーターのような適当なRNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれた極めて多様なベクターに組み込まれうる。別法として、使用されるプロモーターに依って構成性又は誘導可能にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞系へと安定的に導入することもできる。
【0036】
DNA分子に対する様々な修飾が、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入されうる。可能な修飾は、これらに限定はされないが、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの隣接配列の、分子の5′末及び/もしくは3′末への付加、又はオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合の代わりのホスホロチオエートもしくは2′O−メチルの使用を含む。
【0037】
抗MIF治療的使用のため、阻害性オリゴヌクレオチドは、製剤化され、in vitroの細胞と共に使用されてもよいし、かつ/又は全身投与及び局所もしくは局部投与を含む多様な手段によって投与されてもよい。製剤化及び投与のための技術は、「Remington′s Pharmaceutical Sciences」,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版に見出され得る。投与の様式は、体内の所望の標的器官への送達が最大となるよう選択されうる。
【0038】
実施例
材料及び方法
実験動物及び細胞系 C57BL/6(H−2b)マウス(雌、8〜12週齢)は、ジャクソン研究所(Jackson Laboratory)(Bar Harbor,ME)より購入した。動物手法は、全て、承認されたプロトコールの下で、NSUH Institutional Animal Care and Use Comitteeのガイドラインに従い実施した。EG.7細胞(OVAをコードするcDNAによるEL4のトランスフェクションによって作製(11))、及びEL4細胞(いずれも、MHCクラスII陰性、H−2bマウス胸腺腫)、並びにYAC−1細胞は、ATCC(Rockville,NM)より得た。
【0039】
サイトカイン及び抗体 以前に記載されたようにして、組換えマウスMIF(rMIF)を調製した(12;13)(<1pg毒素/μgタンパク質)。中和抗MIF mAb(クローンXIV.15.5、IgG1、アイソタイプ)は、以前に記載されたようにして調製した(9、14)。アイソタイプコントロール抗体(IgG1)は、3型デング熱ウイルスに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ5D4−11(ATCC)を使用して、同様の条件の下で精製した。FITC−ラット抗マウスCD3 Ab、PE−ラット抗マウスCD4、PerCP−ラット抗マウスCD8 Ab、PE−ラット抗マウスCD25 Ab、PE−ラット抗マウスCD28 Ab、FITC−ラット抗マウスCD44 Ab、PE−ラット抗マウスCD25(IL−2Rα)、PE−ラット抗マウスCD28 Ab、FITC−ラット抗マウスCD44 Ab、PE−ラット抗マウスCD25(IL−2Rα)、PE−ラット抗CD122(IL−2Rβ)、PE−ラット抗マウスCD132(共通γ鎖)、及びPE−ラット抗マウスH−2Kbは、ファーミンゲン(PharMingen)(San Diego,CA)より購入した。
【0040】
抗原特異CTLの製造 OVA特異CTLの製造は、以前に記載されている(11)。簡単に説明すると、5×106個のEG.7細胞のi.p.注射によって1〜2週間前に初回感作されたマウスから、脾細胞を得た。単離された脾細胞(3×106個)を、(サイトカイン又は抗体(下記参照)の存在下又は非存在下で)照射済EG.7細胞(20,000rad;106個)と共に5日間インキュベートした。in vitroのCTL分析(下記参照)において使用されたエフェクター細胞は、これらの培養物から収集され、H−2Kb(15)の環境でOVA257−264(SIINFKEL)ペプチドを認識した。in vivoのMIF中和の効果を研究するため、EG.7で初回感作されたマウスに、腫瘍細胞移植の日、次いで1週間毎日、抗MIF mAb又はコントロールIgG(0.5mg、i.p.)の注射を与えた。次いで、抗MIF又はコントロールIgGにより処理されたマウスから脾細胞を単離し、下記のようにして、in vitroのCTL活性に関して査定した。
【0041】
細胞により媒介される細胞障害性アッセイ EG.7標的細胞(5×105個/ウェル)を、96穴丸底プレートに、1:1〜30:1のE:T比で、様々な濃度の抗MIF mAb、コントロールIgG、又は精製されたrMIFと共に、エフェクター脾細胞(前記のようにして調製)の段階稀釈物に添加した。37℃4hの後、CytoTox 96°アッセイ(Promega Madison,WI)を使用した、培養上清(n=3)中のサイトゾル酵素、乳酸脱水素酵素(LDH)の測定により、細胞障害性を定量した。各E:T比についての「特異溶解」は、以下のように表される:特異溶解=[(実験的放出)−(自然放出)/(標的最大−標的自然放出)]。CTLの非存在下での自然LDH放出は、界面活性剤による溶解による最大細胞放出の10%未満であった。全ての実験手法及びアッセイを2回以上実施し、同様の結果を得た。
【0042】
NKアッセイ NK感受性YAC−1細胞を標的として使用し、以前に記載されたようにして(16)、NKアッセイを実施した。
【0043】
フローサイトメトリー分析 赤血球を含まない単細胞懸濁液を、示されたような実験マウスの脾臓から調製し、フローサイトメトリーにより分析した。全ての蛍光標識抗体を、ファーミンゲン(PharMingen)より購入し、製造業者の推奨に従い使用した。細胞(106個/アリコート)を3%BSA及び0.1%アジ化ナトリウムを含有しているPBS(FACSバッファー)に再懸濁させ、30分間(4℃)、蛍光標識抗体と共にインキュベートした後、FACSバッファーで2回洗浄した。蛍光データは、ファックスキャリバー(FACScalibur)(登録商標)フローサイトメーター(Beckton,Dickinson,Mountainview,CA)において得、セルクエスト(CELLQuest)ソフトウェア(Beckton Dickinson)を使用して分析した。この実験をもう1回繰り返し、同様の結果を得た。
【0044】
サイトカイン産生の分析 サイトカイン産生は、R&Dシステムズ(Systems)(Minneapolis,MN)より購入したマウスIFNγ、TNFα、IL−2、及びIL−12のキットを使用したサンドイッチELISAによる培養上清の分析により測定した。マウスMIFに関するELISAは、以前に記載されたようにして(14)実施した。中和抗MIF mAbの培養物への包含は、生物学的に活性なMIFと複合体化し、MIFを不活性にするが、後のELISAにより依然として検出可能である。
【0045】
in vivoの腫瘍成長 EG.7腫瘍成長に対する抗MIF mAbの効果を測定する実験を、以前に記載された方法(9)に従い、C57BL/6マウスにおいて実施した。培養したEG.7細胞を洗浄し、PBSに再懸濁させ、5×106個の細胞(PBS 0.1mlに懸濁)をマウスの側腹上部へとs.c.注射した(各群n=5)。1h後、次いで7日間24時間毎に、0.3mlのPBS、又はIgG1アイソタイプコントロール抗体(0.5mg)、又は精製された抗MIF mAb(0.5mg)のi.p.注射をマウスに与えた。重量(mg)=[幅(mm)2×長さ(mm)]/2(17)という式に従い、ノギス(Vernier calipers)を用いてなされた直交直線測定から、7日目に腫瘍サイズを測定した。この実験を2回繰り返し、同様の結果を得た。
【0046】
組織学的研究 コントロールIgG及び抗MIFで処理されたマウスから、7日目に腫瘍を切除した。凍結腫瘍切片を、PE−CD4(L3T4)mAb及びFITC−CD8(Ly−2)mAb(PharMingen)を使用して染色した。CD8+T細胞及びCD4+T細胞を、蛍光顕微鏡下で計数し、コントロールIgGで処理されたマウスに由来する切片と比較した、腫瘍切片1個当たりの染色された細胞の数の平均値の増加(%)として表した。切片1個当たり10個の視野を、l0×対物レンズを使用して計数した(各群n=5)。蛍光コンジュゲートアイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートされたコントロール切片は、免疫反応性を示さなかった。
【0047】
in situアポトーシス検出 アポトーシス中の細胞を、製造業者の推奨する手法に従い(R&D Systems)、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)媒介dUTP−ビオチンニック末端標識(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)−mediated dUTP−biotin nick end labeling)(TUNEL)を使用して検出した。統計分析のため、アポトーシス細胞を、光学顕微鏡検(100×)によって計数し、腫瘍切片1個当たりのアポトーシス細胞数の平均(±S.D.)として表した。切片1個当たり5個のランダム視野(マウス1匹当たり1個の切片、各群5匹)を分析し、スチューデントt検定を、有意性(P<0.05)を決定するために使用した。
【0048】
in vivoリンパ細胞遊走アッセイ ゾウ(Zou)ら(18)によって以前に記載されたようにして、抗MIF(0.5mg/マウス、i.p.)又はコントロールIgGの毎日の注射により処理された非腫瘍保持マウス、又は(腫瘍細胞注射の7日後の)同様のサイズのEG.7腫瘍を保持しているマウスを、このアッセイのための細胞源として使用した。未分画脾細胞、又は精製された脾臓CD8+T細胞(1×106個/ml)を得、膜挿入赤色蛍光色素であるPKH−26(Sigma,St.Louis,MO)で標識した。以前に記載されたようにして(19)、in vivoリンパ球遊走アッセイを実施した(各群n=5)。簡単に説明すると、標識された細胞を、腫瘍保持レシピエントマウスに注射した(i.v.)。腫瘍塊を24h後に除去し、凍結切片を調製した。T細胞型を決定するため、FITC−抗CD4又はFITC−抗CD8で切片を染色した。PKH−26蛍光ドナー細胞の存在を、鏡検によって定量し、切片化された腫瘍組織の視野1個当たりの標識されたドナー細胞の数の平均として表した。各切片(マウス1匹当たり1個)について、10個の視野を、10×対物レンズを使用して数えた。これらの実験を2回繰り返し、同様の結果を得た。
【0049】
養子免疫療法 C57BL/6マウスに、5×106個のEG.7細胞を注射し(s.c)、次いで抗MIF mAb又はコントロールIgG(0.5mg/日、i.p.)で、7日間毎日、処理した(各群n=5)。最後の注射の1日後、脾細胞を単離し、CD8+脾臓T細胞をCD8+濃縮カラム(R&D Systems)を使用して精製した。次いで、未分画の脾細胞又はCD8+T細胞(5×1063個/匹)を、1日前に5×106個のEG7細胞を注射(i.p.)されたレシピエントマウスへと移植した(i.v.)。前記のようにして、1〜13日目に腫瘍重量を決定した。この実験をもう1回繰り返し、同様の結果を得た。
【0050】
結果
抗MIF抗体はin vitroでCTL活性を増強する 従来の研究は、マクロファージ及びTリンパ球の活性化応答の一部として、MIFのタンパク質及びMRNAが発現されることを明らかにした(5、8、20)。腫瘍侵襲に対する宿主応答におけるMIFの可能性のある役割を評価するため、本発明者らは、まず、rMIF又は中和抗MIF mAbが、in vitroで抗原特異的な細胞障害性T細胞応答に影響を及ぼすか否かを検討した。EG7細胞の埋め込みにより初回感作されたマウスから脾細胞を単離し、これらの脾細胞培養物を、rMIF、中和抗MIF mAb、又はアイソタイプコントロールIgGの存在下で、照射済EG.7細胞により5日間刺激した。図1Bに示されるように、50μg/mlの抗MIF mAbの添加は、in vitroのCTL応答を有意にアップレギュレートし、外因性rMIF(図1A)又はコントロールIgG(図1C)の添加は、CTL活性に影響しなかった。コントロール試験は、脾細胞の抗MIF mAbによる処理又はEG.7細胞が、単独では生存又は成長の特性に影響を及ぼさないこと、及び抗MIF mAbによるin vitro前処理が、非条件脾細胞培養物において細胞障害性の発生を独立して引き起こさないことを示した。
【0051】
EG.7標的細胞を含む脾細胞培養物の最後の4hのアッセイ期間中、抗MIF mAb又はrMIFを添加することにより、CTL応答のエフェクター期におけるMIFの可能性のある役割も研究した。このアッセイ期間中、in vitroの細胞障害活性に対するこれらの薬剤の効果は存在しなかった。対照的に、5日間共培養期間の最初の2日以内に存在した場合、抗MIF mAbの、in vitroでCTL応答を増大させる活性が最も高いことが観察された(図1D)。
【0052】
これらのデータは、in vitroの細胞障害性T細胞活性化の初期におけるMIFの免疫中和が、後のCTL活性を強化することを示している。従って、照射済EG.7標的細胞による脾細胞エフェクター細胞のin vitro刺激が、照射済EG.7細胞の非存在下で培養された腫瘍保持マウスから得られた脾細胞と比較した場合、培養物上清中に検出可能なMIFの量の有意な増加を与えたことは予想外のことではなかった(図2A)。それにもかかわらず、生体活性rMIFの平行脾細胞培養物への添加の後には、CTL活性に対する有意な効果は観察されず、このことは、これらの培養物において内因的に産生されたMIF(>30mg/ml)に対して最大の細胞応答が既に存在していたかもしれないことを示唆している(図1A)。
【0053】
次に、in vitroのT細胞細胞障害性の発現において重要な役割を果たすことが既知のサイトカインの産生に対するMIFの免疫中和の効果を調査した。培養上清中に存在するIFNγ、TNFα、IL−2、及びIL−12のレベルを、特異的なELISAによって測定した。これらのうちIFNγのみが、コントロールmAbで処理された培養物と比較して抗MIF mAbのCTL活性を増強する活性が最も高かった2日間の共培養期間中、有意な濃度の増加を示した(図2B)。対照的に、抗MIF mAb及び照射済EG.7細胞の存在下でのEG.7腫瘍保持マウスに由来する脾細胞培養物のインキュベーションは、コントロールIgGで処理された培養物と比較して、IL−2、IL−12、又はTNFαタンパク質の発現を有意に変化させなかった。単独で培養されたEG.7細胞は、検出可能なレベルのMIF、IFNγ、IL−2、TNFα、又はIL−12を示さなかった。フローサイトメトリー分析によって、共培養物のrMIF処理も抗MIF処理も、細胞表面マーカーCD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD44highを呈示する細胞の割合には影響を及ぼさないことが見い出された。
【0054】
in vivoの抗MIF mAb処理はCTL活性を増強する 次に、in vivoのEG.7腫瘍初回感作の期間に、抗MIF mAb対アイソタイプコントロールIgGで処理されたマウスから採集された脾細胞のCTL応答を、比較した。これらの実験は、EG.7細胞による初回感作(0日目)の後1週間毎日の抗MIF mAbの投与が、30及び10というE:T比でCTL活性の生成を有意に増強したことを示した(図3A)。コントロールIgGの包含は、この実験系において、PBS単独と比較しても又は添加なしと比較しても、増強されたCTL活性をもたらさなかった。
【0055】
最近の研究は、38C13 B細胞リンパ腫(9)及びG361黒色腫(10)を保持しているマウスにおける抗MIF mAbの有意な抗腫瘍効果を明らかにした。これらのデータ、及び前記の観察された抗MIFによるCTL活性の2倍の増強と一致して、本発明者らは、EG.7リンパ腫を保持しているマウスへの1週間の抗MIF mAbの投与が、コントロールIgG又はPBSで処理されたマウスと比較して、腫瘍サイズの有意な2倍の縮小ももたらすことを見出した(図3B)。さらに、本発明者らは、抗MIF mAb処理の後、ほぼ3倍多い腫瘍浸潤CD8+細胞及びCD4+細胞を検出した(図4)。
【0056】
細胞障害性Tリンパ球は、アポトーシスを誘導することにより腫瘍細胞標的を死滅させる(21)。観察された抗MIF処理による宿主CTL活性の増強と一致する、コントロールIgGで処理されたマウスから得られた腫瘍と比較した(図5B)、抗MIFで処理されたマウスから得られた腫瘍塊内のアポトーシス細胞の数の有意な増加(4〜5倍)(図5A)が見い出された。抗MIFで処理されたマウスに由来する腫瘍切片の高倍率視野当たりのアポトーシス細胞数の平均(194±63個/100×視野)対コントロールIgGで処理されたマウスの数(43±22個/100×視野)を解析することにより、このアポトーシスの差を定量し、統計的に有意であることを見出した(p<0.01)。
【0057】
rMIFはin vitroのNK細胞活性を阻害することが、以前に報告された(22)。従って、in vivoの腫瘍成長に対する抗MIF mAbの阻害効果は、増強されたNK細胞活性の効果であるのかもしれない。コントロールの非腫瘍保持マウスと比較した場合、EG.7保持マウスに由来する全脾細胞調製物のNK活性の増加が観察されたが、抗MIF抗体で処理されたマウスにおいては、この活性の変化は観察されなかった。
【0058】
過去の研究は、in vivoの抗原により発動されるCD4+T細胞活性化の際のMIF発現が、免疫応答において重要な役割を果たすことを示した(8)。従って、次に、観察された抗MIF mAb処理により増強された細胞溶解活性が、増加した抗原により誘導されるCD8+T細胞の増殖と関連しているか否かを測定した。ベイカー(Bacher)ら(8)によると、in vivoで、抗MIF mAb処理の存在下で、T細胞増殖の増大は見い出されなかった。
【0059】
IL−2受容体発現に対する抗MIFの効果も試験した。IL−2受容体は、IL−2の親和性を制御する可変的に発現された鎖(CD25)、並びに2個のシグナリングサブユニットβ(CD122)鎖及びγc(CD132)鎖からなる多量体である((23)に概説)。(共通ガンマ鎖としても知られている)γcサブユニットは、IL−2、IL−4、IL−7、IL−9、及びIL−15の受容体の共有されたサブユニットである。γcの動員は、細胞内シグナリングにとって必要であり(24、25)、その発現は、in vivoの成熟CD8+T細胞生存にとって重要であることが示されている(26)。従って、γc発現に対する抗MIF処理の効果を試験した。腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理は、コントロールIgGで処理された腫瘍保持マウスと比較して、γc鎖の発現を有意に増強したが、CD8+T細胞上のIL−2受容体のαサブユニット又はβサブユニットの発現は有意には増強しなかった(図6)。
【0060】
抗MIF抗体は、腫瘍組織へのTリンパ球の遊走を促進し、CD8+T細胞特異抗腫瘍活性を増大させる さらに、抗MIF mAbのin vivo抗腫瘍効果が、T細胞に対する特異効果に起因することを示すため、腫瘍へのTリンパ球の輸送に対する抗MIF処理の効果を評価した。コントロールマウス又はEG.7腫瘍保持マウスを、7日間、抗MIF又はコントロールIgGのいずれかで処理し、未分画脾細胞又は精製された脾臓CD8+T細胞をPKH−26による標識のため回集した。標識された未分画脾細胞又は精製されたCD8+細胞を、EG.7腫瘍保持レシピエントへと移植した。24時間にわたるレシピエントマウスの腫瘍へのPKH−26標識ドナー細胞の侵入を、切除された腫瘍組織から得られた凍結切片の蛍光顕微鏡検によって定量した(それぞれ図7A及び7B)。これらの実験は、抗MIF mAbで処理された腫瘍保持マウスから得られた脾細胞又は精製されたCD8+T細胞が、コントロールmAbで処理された腫瘍保持マウスから得られた比較可能な細胞より多数(≧2倍の増加)、腫瘍組織へと侵入したことを示した。
【0061】
最後に、in vivoの腫瘍成長に対する養子移植された(抗MIF mAbで処理された動物から得られた)CD8+細胞の効果を試験した。抗MIF mAb又はコントロールIgGで処理されたEG.7腫瘍保持ドナーマウスに由来する未分画脾細胞又は精製されたCD8+脾臓T細胞500万個を、24h前にEG.7腫瘍細胞をs.c.注射されたマウスへと移植した(図7C)。次いで、in vivoの腫瘍成長を2週間モニタリングした。図7Cに示されるように、抗MIFで処理された腫瘍保持マウスから得られたCD8+T細胞の、未処理腫瘍保持マウスへの養子移植は、レシピエントマウスにおけるその後の腫瘍成長に対する有意な阻害効果を示した。対照的に、抗MIFで処理された腫瘍保持マウス対コントロールIgGで処理された腫瘍保持マウスから得られた未分画脾細胞(5×106個;CD4+T細胞及びCD8+T細胞並びにB細胞の両方を含有している)の移植の後には、腫瘍重量の有意な差は観察されなかった。これらのデータは、養子移植実験における腫瘍成長の有意な阻害を媒介するための、抗MIFで処理された腫瘍保持動物から得られた臨界数のCD8+T細胞の重要性を示している。
【0062】
代表的な実施態様及び詳細を参照しつつ本発明を完全に記載してきたが、本明細書に既述されたような本発明の本旨又は範囲を逸脱することなく、本発明に変化及び修飾を施しうることは、当業者には明白であろう。
【0063】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0064】
【図1】抗MIF mAbはin vitroでCTL活性を増強するが、rMIF又はコントロールIgGは増強しない。7日前にEG.7細胞で初回感作されたC57BL/6マウスが脾細胞の起源であった(材料及び方法を参照のこと)。rMIF(A)、抗MIF(B)、又はコントロールIgG1(C)の存在下で、5日間、照射済EG.7細胞により刺激された脾細胞培養物。様々なE:T細胞比で、新鮮なEG.7細胞を脾細胞へと添加し、37℃での4hのインキュベーションの後、細胞障害性を乳酸脱水素酵素(LDH)放出により測定した。(D)脾細胞−照射済EG.7共培養物(E:T=20:1)の開始時(0日目)に抗体を添加した場合、対2日目に添加した場合の、in vitroのCTL活性に対する抗MIF mAbの効果。*、スチューデントt検定により、添加なしに対し、<0.05。
【図2】初回感作された脾細胞が照射済EG.7細胞と共に培養された場合、MIF及びIFNγの分泌が増強される。脾細胞をEG.7細胞で初回感作されたマウスから単離し、照射済EG.7細胞と、アイソタイプコントロールAb(コントロール)又は抗MIF mAb(抗MIF)(50μLg/ml)とで、1日又は2日間刺激した、又はしなかった。材料及び方法に記載されたようにして、培養上清を、MIF(A)及びIFNγ(B)に関する特異ELISAにより分析した。TNFα及びIL−12の値は、検出限界未満であった。*、スチューデントt検定により、コントロール+EG.7対コントロール−E.7で、p<0.05。
【図3】EG.7腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理はCTL活性を増加させ腫瘍成長を阻害する。C57BL/6マウス(各群n=5)にEG.7細胞を注射し、次いで、毎日、PBS、コントロールIgG、又は抗MIF mAb(0.5mg)のいずれかで処理した。7日目、脾臓を採集し、単離された脾細胞を、5日間、照射済EG.7細胞と共培養し、その間、4h CTL in vitroアッセイにおいて細胞溶解をLDH放出によって測定した(A)。腫瘍サイズは、7日目に決定した(B)。*、スチューデントt検定により、抗MIF処理対コントロールIgG処理で、<0.05。
【図4】EG.7腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理は腫瘍のTリンパ球浸潤を増加させる。マウス(各群n=5)を、コントロールIgG又は抗MIF mAbで7日間毎日処理した。次いで、EG.7腫瘍を切除し、腫瘍切片をPE−抗マウスCD4(L3T4)又はFITC−抗マウスCD8(ly−2)モノクローナル抗体で染色した。CD8+T細胞及びCD4+T細胞を、蛍光顕微鏡検により数え、コントロールIgGで処理された動物と比較した、抗MIFで処理された動物の腫瘍の中の免疫応答性浸潤細胞の増加率の平均(±S.D.)として表した。蛍光アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートされた切片は、免疫応答性を示さなかった。*、スチューデントt検定により、抗MIEF処理対コントロールIgG処理の比較で、p<0.05。
【図5】抗MIF mAb処理はEG.7腫瘍細胞アポトーシスを促進する。TUNEL方法によってDNA鎖破断を標識することによりin situでアポトーシス細胞を検出した。抗MIF mAbで処理されたマウスから得られた腫瘍組織には、多数のアポトーシス(暗茶色)EG.7細胞が可視である(A)。対照的に、コントロールIgGで処理されたマウスから得られた腫瘍には、より少数のアポトーシス小体が観察される(B)。示された切片(100×)は、10個の腫瘍切片(各群n=5)の代表である。
【図6】in vivoの抗MIF抗体処理によってIL−2Rγc発現がアップレギュレートされる。抗MIF又はコントロールIgGで7日間毎日処理された未感作マウス又はEG.7腫瘍保持マウス(各群n=3)より、脾細胞を収集した。個々の群からの脾臓をプールし、CD8+T細胞集団に対するゲーティングの後、CD8及びIL−2Rα(A)、β(B)、又はγc(C)表面マーカーに関して染色した。影付きのヒストグラムは、アイソタイプコントロール抗体で染色された細胞を表す。
【図7】抗MIF抗体によるドナー腫瘍保持マウスの処理は、レシピエント腫瘍保持マウスのEG.7腫瘍への移植されたTリンパ球の遊走を増加させ、レシピエントマウスにおけるCD8+T細胞抗腫瘍活性を促進する。正常(コントロール)マウス又は腫瘍保持マウスに由来する未分画の脾細胞(A)又は精製されたCD8+脾臓T細胞(B)を、抗MIF又はコントロールIgGによる処理(0.5mg×7日)の8日後に単離し、蛍光色素PKH−26で標識した。次いで、標識された細胞を腫瘍保持レシピエントマウス(各群n=5)へi.v.移植した。翌日、腫瘍を切除し、凍結切片を調製し、高倍率視野(HPF)1個当たりの蛍光細胞の数を数えた(平均±S.D.)。スチューデントt検定により、コントロール抗体に対し、*、p<0.05;**、p<0.01。(C)C57BL/6マウスに、5×106個のEG.7細胞を注射し(i.p.)、次いで、7日間、抗MIF mAb又はコントロールIgG(0.5mg/日)で処理した。24h前に5×106個のEG.7細胞をs.c.接種されたレシピエントマウス(各群n=5)へ、精製された脾臓CD8+T細胞を移植した(5×106個/匹;i.v.)。腫瘍重量(平均±S.D.)を測定した。*、スチューデントt検定により、コントロール抗体で処理されたマウスに対し、p<0.05。
【0001】
発明の背景
発明の領域
本発明は、抗原への曝露の前、途中、又は後に、CD8+リンパ球及び/又はCD4+リンパ球が曝されるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)のレベルを減少又は増加させることによる、腫瘍関連抗原のような抗原に対する細胞障害性リンパ球の応答の調整(増加又は減少)のための方法及び組成物に関するものである。本発明は、さらに、細胞に基づく免疫療法的アプローチを使用して、抗原に対する細胞障害性リンパ球の応答を調整することによる、疾患、特に腫瘍の予防及び治療のための組成物及び方法に関するものである。
【0002】
技術の背景
実験的研究及びヒト臨床研究の両方から明らかとなったデータは、腫瘍関連抗原が、有意な腫瘍退行を生じさせうる抗腫瘍細胞障害性リンパ球(CTL)応答を誘発するのに十分であることを示している(27、28)。ペプチド免疫化によりCTL細胞障害性を増強することを目指した、細胞に基づく免疫療法的戦略を利用することにより、少数の症例において、長期の黒色腫の緩解が達成された(29)。しかしながら、MHCクラスIに含まれる腫瘍特異抗原の存在にも関わらず、激しく腫瘍を死滅させる免疫応答はin vivoではほとんど検出されない。腫瘍特異CTLの生成は、腫瘍抗原の適切なプロセシング、MHCクラスI分子による腫瘍抗原の提示、腫瘍抗原を認識するための適切な特異性のT細胞受容体を発現しているTリンパ球、及び免疫学的環境における免疫系への初期の抗原提示を必要とする。腫瘍退行の成功を達成するためには、このCTL応答が、開始するのみならず、活発であり、かつ持続しなければならない。
【0003】
CTL応答の様々な面を増強するいくつかのサイトカインの活性は、以前より正しく理解されている。例えば、IL−2の初期の発現は、CTLによる溶解能の増殖及び発達における重要因子である(30)。さらに、IFNγ(30)、IL−1及びIL−6(31)、IL−6と一緒のIL−2(32)、IL−7(33)、IL−10(34)、及びIL−12(35〜37)は、全て、CTLの活性化、増殖、及び/又は分化において役割を果たすことが認められている。これらのメディエーターは、抗原提示、CD4+ヘルパーT細胞機能、マクロファージ細胞接着を増強することにより、又は重要な共刺激分子の発現を増加させることにより、CTL活性を促進する。IL−1(38)、IL−2(39)、IL−12(40〜42)、IFNα(43、44)、IFNγ(45)、及びTNFα(46)を含む組換えサイトカインの投与によって媒介される抗腫瘍効果が、腫瘍保持マウスにおいて示されている。
【0004】
対照的に、IL−4(47、48)及びTGFβ(49)を含む少数のサイトカインのみが、CTLの分化又は溶解活性を抑制することが示されている。IL−4は、CD8+T細胞からのIFNγの分泌を阻害し(50、51)、高い細胞溶解能を有するCD8+T細胞の活性化及び分化を制限するようである(52)。さらに、IL−4の不存在下でのCTL初回感作は、チャレンジ後に、より強力な応答を生じさせる。これらの少数のサイトカインがCTL細胞溶解活性を阻害する機序は、明確にはなっていない。
【0005】
マクロファージ遊走阻止因子(MIF)として既知のタンパク質メディエーターの生物学的機能は、最近、精密に検討されるようになったばかりである((1)に概説)。MIFは、最初、ほぼ40年前に、活性化されたTリンパ球によって産生される可溶性の活性として記載されたが(2、3)、このタンパク質のマウスホモログが下垂体前葉から分泌されることが同定された際に、MIFへの関心は再燃した(4)。その後すぐ、従来はMIF作用の標的であると考えられていたマクロファージが、微生物毒素又はサイトカインTNFα及びIFNγによる活性化の際のMIFの重要な起源であることが見出された(5)。インビボでの研究は、MIFが、内毒素に対する宿主応答においても重要な役割を果たすことを確立した。LPSと一緒の組換えMIF(rMIF)の投与は、LPSの致死性を激化させ、中和抗MIF抗体は、致死性の内毒血症(4)、外毒血症(6)、及び腹膜炎(7)からマウスを防御する。MIF機能に関する研究は、T細胞活性化応答中のIL−2の発現、及びB細胞による抗体産生にも、このタンパク質が必要であることを確立した(8)。
【0006】
二つの最近の報告は、腫瘍成長における予期しないMIFの役割を発見した(9、10)。本発明者らは、抗MIFモノクローナル抗体(mAb)のマウスへの投与が、同系の皮下に埋め込まれたB細胞リンパ腫38C13の成長及び血管新生を有意に減少させることを観察した(9)。この抗腫瘍効果は、内皮細胞増殖及び腫瘍血管形成応答におけるMIFの必要性に、一部、よるものであるという証拠が得られた(9)。同様に、ヒト黒色腫腫瘍G361を保持しているマウスの抗MIF mAb処理は、腫瘍成長及び新血管新生を有意に減少させた(10)。
【0007】
発明の概要
本発明は、MIF発現がCTL応答中にアップレギュレートされること、並びに特定のmAbを使用したMIFの阻害がin vitro及びin vivoでのCTL活性を促進することの本発明者らによる発見に、一部、基づいている。特に、MIFの中和が、CTL活性を促進し、腫瘍成長を阻害し、そしてin vivoの腫瘍侵襲部位へのTリンパ球ホーミングを増加させうるという実験的証拠が、本明細書に開示される。従って、下記実施例におけるin vitroのCTL研究からの結果は、in vitroの初回感作期におけるMIFの免疫中和が、CTL培養物中のIFNγ産生を増加させたことを明らかにしている。Thl細胞ではなくTh2細胞の活性化によってMIF分泌が増強されることを考慮すると(8)、可溶性抗原刺激がMIF発現を誘導し、次にそれが、IFNγを含むThlサイトカインの産生を抑制することにより、in vivoのCTL活性化を阻害するのかもしれない。
【0008】
従来の研究は、CD4+ヘルパーT細胞によって媒介される効果である、様々な分裂促進物質又は可溶性抗原に対する活性化応答において、MIFが本質的な役割を果たしていることを示した。分裂促進物質又は抗原により活性化されたT細胞は、多量のMIF mRNA及びタンパク質を発現し、MIFの免疫中和は、in vitroではIL−2産生及びT細胞増殖を阻害し、in vivoでは可溶性抗原に対するT細胞ヘルパー応答を減少させる(8)。本研究は、MIF発現が腫瘍抗原刺激に応答してアップレギュレートされること、及びMIFの中和が、IL−2分泌又は抗原により誘導されるCD8+T細胞の増殖には影響しないことを示している。しかしながら、抗MIF処理は、細胞内シグナリングに必要であり(25)CD8+T細胞生存にとって重要な(26)IL−2受容体γcサブユニットの発現を有意に増加させた。従って、MIF中和によるT細胞細胞障害性の増強は、CD8+T細胞の増殖の認めうるほどの増加には起因するのではなく、細胞障害性CD8+T細胞の集団の増強された生存に起因するのかもしれない。腫瘍退行の成功を促進するためには、CD8+T細胞による細胞溶解活性の開始の後、この細胞溶解活性が持続しなければならない。従って、MIFの阻害は、in vitroでもin vivoでも、有意なCTL抗腫瘍活性が顕在化するよう、CTLの寿命を延長するよう作用するであろう。
【0009】
EG.7腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理は、増強されたCTL活性と関連して、腫瘍成長を有意に阻害した。さらに、抗MIF処理された腫瘍保持マウスから移植されたCD8+T細胞は、レシピエントマウスにおける腫瘍成長を阻害した。腫瘍の集合体(corpus)内に見い出されるアポトーシス腫瘍細胞の数の増加が観察されたことから、増強された又は持続したCTLの細胞障害性が、直接、抗MIF処理されたマウスにおける腫瘍成長の抑制に寄与したと結論付けることは合理的である。
【0010】
最近の報告は、腫瘍細胞が非形質転換細胞より多くのMIFを産生することを示した(10、53、54)。腫瘍細胞は、適切な腫瘍抗原を発現している場合ですら、CTLによるか又はCTLにより媒介される溶解に対する抵抗性を腫瘍細胞に与えるMHC発現のダウンレギュレーションによって認識される腫瘍抗原の消失を介して、CTLによる死滅を逃れることができる(55)。EG.7細胞はMIFを構成性分泌しているが(106個の細胞により、およそ10ng/ml)、rMIFも抗MIF抗体も、EG.7細胞によるMHCクラスI発現には影響を及ぼさなかった。当データは、CD8+T細胞生存の減少をもたらす腫瘍細胞によるMIF分泌によって、腫瘍の宿主免疫応答の回避のための付加的な機序が起こることを示す。
【0011】
いくつかの研究は、いくつかの腫瘍細胞によるFasLの発現を示しており、これは、がんが免疫特権部位であるかもしれないという興味深い可能性を高める。例えば、腫瘍浸潤リンパ球のアポトーシスが、FasLを発現している黒色腫及び肝細胞がん腫においてin situで証明されている(57)。しかしながら、より最近のin vitro及びin vivoのデータは、最初の仮説に異議を唱えた。これらの研究は、いくつかの腫瘍がFasL発現(58、59)を欠いており、いくつかの腫瘍細胞のFasL cDNAによるトランスフェクションが、腫瘍細胞による免疫系の回避を促進するのではなく、腫瘍退行を誘導したことを明らかにした(59、60)。さらなる研究は、FasL発現が迅速な移植片拒絶(61、62)及び炎症(63)を促進することを示した。この研究は、腫瘍内のFasLの発現を調査していないが、本所見は、これらの系におけるFasL発現に対するMIF/抗MIFの効果を調査することが有益であろうことを示している。
【0012】
本研究は、T細胞輸送におけるMIFの重要な役割も同定した。抗MIF処理されたマウスの腫瘍内のCD4+T細胞及びCD8+T細胞の両方の蓄積の増加が観察された。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)による腫瘍破壊は、CD4+T細胞及びCD8+T細胞の両方を含むことが既知である。IL−2及びTILによるラットにおける乳房腫瘍の治療は、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導により腫瘍退行を促進し(64)、ヒト黒色腫内のTILの大量な蓄積は、患者のより順調な結果と関連している(65)。抗MIF抗体が腫瘍塊へのCD4+T細胞及びCD8+T細胞の遊走を増加させるという観察は、変更されたケモカイン又はケモカイン受容体の発現のようなメカニズムを含んでいてもよい、抗MIF抗体が抗腫瘍T細胞機能に影響する付加的な手段を提供する。
【0013】
CTL活性の調整に加え、MIFは、腫瘍形成のその他の面においても役割を果たすようである。二つの独立した研究室が、MIF中和が、腫瘍血管形成を有意に阻害することを示し(9、10)、ハドソン(Hudson)及び共同研究者らは、繊維芽細胞へのrMIFの添加が、転写活性を抑制することにより、p53機能(増殖及びアポトーシスの両方)を阻害することを、最近明らかにした(66)。多様な宿主免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞の死滅に参与しているが、腫瘍抗原特異CTLは、標的細胞上で発現された低い抗原密度ですら、腫瘍細胞死滅を媒介する効果が高い(67)。従って、MIF免疫中和による治療的なCD8+CTLの増強は、細胞に基づく抗腫瘍免疫療法の新規な基礎を提供する。
【0014】
従って、本発明は、ex vivoもしくはin vivo、又はその両方において、抗原への曝露の前、途中、又は後に、CD8+リンパ球及び/又はCD4+リンパ球が曝されるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)のレベルを減少又は増加させることによる、腫瘍関連抗原のような抗原に対する細胞障害性リンパ球の応答の調整(増加又は減少)のための方法及び組成物を提供する。
【0015】
従って、本発明の一つの面において、有効な免疫療法のためのCTL応答を必要とするがん又は別の状態を有する対象への投与のためのがん療法としての細胞、好ましくはT細胞、より好ましくはCD8+T細胞を調製する方法を提供する。この方法は、MIFのアンタゴニスト又は阻害剤の存在下で細胞を培養することを含む。この方法において、MIFアンタゴニストは、抗MIF抗体、MIFアンチセンスcDNA、及びMIFリガンド:受容体結合のアンタゴニストからなる群より選択される。好ましい実施態様において、この方法は、MIF活性を中和又は不活化する抗MIF抗体の存在下で細胞を培養することを含む。好ましくは、本発明の方法において使用される抗MIF抗体は、モノクローナルであり、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び単鎖モノクローナル抗体からなる群より選択される。
【0016】
もう一つの面において、本発明は、(a)所望のCTL応答の標的である少なくとも1個の抗原、好ましくは腫瘍抗原、及び(b)抗MIF抗体の存在下で組成物の細胞をインキュベートすることを含む、CTL応答を増強するための免疫療法、好ましくはがんを有する対象への投与のためのがん療法としての細胞組成物を調製する方法に関する。
【0017】
本発明のさらにもう一つの面は、抗MIF抗体、そのMIF結合断片、又はそれら両方からなる群より選択される薬剤の存在下で細胞をインキュベートする工程を含む、がんを有する対象への投与のための自家細胞を調製する方法に関する。この方法の好ましい実施態様は、(a)少なくとも1個の腫瘍抗原、及び(b)抗MIF抗体、そのMIF結合断片、又はそれら両方からなる群より選択される薬剤の存在下で、細胞をインキュベートする工程を含む。自家細胞は、好ましくは免疫細胞、より好ましくはT細胞、さらに好ましくはCD8+T細胞を含む。
【0018】
もう一つの面において、本発明は、増強された抗原に対するCTL応答を必要とする対象、例えばがんを有する対象への投与のための細胞組成物を提供する。この組成物は、抗MIF抗体と共にインキュベートされた細胞を含む。この細胞組成物の一つの実施態様において、抗MIF抗体と共にインキュベートされた細胞は、さらに、腫瘍抗原のような、増強されたCTL応答が望まれる抗原少なくとも1個と共にインキュベートされている。好ましくは、この細胞組成物において、抗MIF抗体とのインキュベーションはex vivoであり、細胞組成物は、抗MIF抗体とのインキュベーションの後に未結合の抗MIF抗体から単離された細胞を含みうる。この細胞組成物中の細胞は、共にインキュベートされた未結合の抗MIF抗体及び未結合の抗原、例えば腫瘍抗原の両方から単離されていてもよい。好ましくは、本発明の細胞組成物において、細胞は、免疫細胞、より好ましくはT細胞、さらに好ましくはCD8+T細胞を含む。
【0019】
発明の詳細な説明
本発明は、これらに限定はされないが、腫瘍(がん性もしくは良性)、ウイルス感染、例えばマラリアを含む寄生虫感染、及び/又は細菌感染を含む、CTL応答を必要とする任意の状態の治療のための、in vitro及びin vivoでMIFの放出及び/又は活性を阻害する組成物及び方法を含む。
【0020】
本発明によるMIF活性の阻害は、これらに限定はされないが、MIFと結合し、その生物学的活性を中和する因子の使用;MIF受容体アンタゴニストの使用;体内の細胞起源からのMIFの放出を阻害する化合物の使用;並びにMIF発現を防止するか又は減少させるためのMIFコーディング配列、非コーディング配列、及び/又は制御配列に由来するヌクレオチド配列の使用を含む、多数の方式で達成されうる。これらのうちのいずれもが、関連状態の治療においてMIF活性を阻害するために個々に又は組み合わされて利用されうるし、さらに、例えばペプチド免疫感作、サイトカイン療法等を含むその他のCTL増強療法と組み合わされてもよい。
【0021】
以後、MIF結合パートナーと呼ばれる、MIFと結合し、その生物学的活性を中和する因子は、CTL応答を必要とする状態の治療として本発明に従い使用されうる。MIFタンパク質のレベルは、腫瘍による分泌又はTh2 Tヘルパー細胞の活性化によって増加しうるが、阻害性MIF結合パートナーのMIFタンパク質との相互作用は、付随するMIF活性の増加を妨害する。そのような因子は、これらに限定はされないが、抗MIF抗体、抗体断片、MIF受容体、及びMIF受容体断片を含みうる。
【0022】
当分野において既知の様々な手法が、(例えば、下記の組換えDNA技術を使用して)組換え作製されたMIF、又は天然に精製されたMIFのエピトープに対する抗体の作製のため使用されうる。中和抗体、即ちMIF受容体の結合部位に関して競合するか、又はそれを立体的に遮断するものは、診断剤及び治療剤にとって特に好ましい。そのような抗体は、これらに限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーにより作製されたフラグメントを含みうる。
【0023】
抗体の作製のため、様々な宿主動物が、MIF及び/又はMIFの一部の注射によって免疫感作されうる。そのような宿主動物は、これらに限定はされないが、ほんの少数挙げるとすれば、ウサギ、マウス、及びラットを含みうる。これらに限定はされないが、フロイント(完全及び不完全)、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びBCG(bacille Calmette−Guerin)及びコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)のような潜在的に有用なヒトのアジュバントを含む、様々なアジュバントが、宿主種に依って、免疫学的応答を増加させるために使用されうる。
【0024】
MIFに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することにより調製されうる。これらは、これらに限定はされないが、コーラー(Kohler)及びミルステイン(Milstein)により最初に記載されたハイブリドーマ技術(Nature,1975,256:495−497)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.,1983,Immunology Today,4:72;Cote et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.,80:2026−2030)、及びEBVハイブリドーマ技術(Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,77−96頁)を含む。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製のため開発された技術(Morrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454)が使用されうる。別法として、単鎖抗体の作製のために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、MIF特異単鎖抗体を作製するために適合させることもできる。
【0025】
ハイブリドーマ技術は、抗MIFモノクローナル抗体を製造するために利用されている。例えば、内容が完全に参照により本明細書に組み込まれるブカラ(Bucala)らの米国特許第6,030,615号を参照のこと。ヒト型及びマウス型両方のMIFに対するIgGモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが単離されており、MIF生物学的活性を中和する能力に関して特徴決定されている。抗MIFモノクローナル抗体は、マクロファージによる細胞内寄生虫の死滅の刺激を阻害することが示された。抗MIFモノクローナル抗体は、MIFに関する特異的かつ高感度のELISAスクリーニングアッセイを開発するためにも利用されている。
【0026】
特定のMIFエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって製造されうる。例えば、そのような断片は、これらに限定はされないが、抗体分子のペプシン消化により作製されうるF(ab′)2フラグメント、F(ab′)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより製造されうるFab断片を含む。別法として、MIFに対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするため、Fab発現ライブラリーが構築されてもよい(Huse et al.,1989,Science,246:1275−1281)。
【0027】
MIF受容体、MIF受容体断片、及び/又はMIF受容体アナログは、本発明に従い、MIF生物学的活性の阻害剤として使用されうる。MIFタンパク質と結合することによって、これらの分子クラスは、MIFの細胞MIF受容体との結合を阻害し、それにより、MIFが生物学的活性を発揮する機序を抑止することができる。そのような分子の活性を模倣する小さい有機分子も、本発明の範囲内である。MIF受容体は、アミノ酸配列特異的かつ/又は構造特異的にMIFと結合する任意の細胞表面分子を含みうる。MIF受容体の断片も、MIF阻害剤として使用可能であり、MIFと特異的に結合してMIFの生物学的活性を阻害する、アミノ、カルボキシ、及び/又は内部の欠失を保有しているMIF受容体断片も、本発明の範囲内にあるものとする。アミノ及び/又はカルボキシの欠失とは、少なくとも1個のアミノ酸残基のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端の短縮を保有している分子をさす。内部の欠失とは、少なくとも1個のアミノ酸残基の1個以上の非末端欠失を保有している分子をさす。これらのMIF受容体断片には、細胞質ドメイン又は細胞質ドメインの一部が欠失している短縮型受容体、並びにMIF受容体細胞外ドメインの全部もしくは一部を含有している可溶性MIF受容体が生成するよう、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインが欠失している断片も含まれる。
【0028】
MIFと特異的に結合するMIF受容体アナログも、MIF活性を阻害するために使用されうる。そのようなMIF受容体アナログは、アミノ末端、カルボキシ末端、又は2個の隣接したMIF受容体アミノ酸残基間に位置する1個以上の付加的なアミノ酸をさらに保有しているMIF受容体又は受容体断片を含みうる。付加的なアミノ酸は、MIF受容体融合タンパク質を形成させるためMIF受容体タンパク質の全部又は一部に機能的に付加された異種ペプチドの一部であってもよい。例えば、制限するものではないが、MIF受容体、又はその短縮された一部は、免疫グロブリンの所望のFc部分を有する融合タンパク質として改変されうる。MIF受容体アナログは、保存的又は非保存的な性質の1個以上のアミノ酸置換をさらに保有しているMIF受容体又はMIF受容体断片も含みうる。保存的アミノ酸置換は、例えばグルタミン酸(E)からアスパラギン酸(D)へのアミノ酸置換のように、1個以上のアミノ酸を、同様の電荷、サイズ、及び/又は疎水性特徴のアミノ酸に交換することからなる。非保存的置換は、例えばグルタミン酸(E)からバリン(V)への置換のように、1個以上のアミノ酸を、相違する電荷、サイズ、及び/又は疎水性特徴を保有するアミノ酸と交換することからなる。MIF受容体、MIF受容体断片、及び/又はアナログは、組換えDNA技術を使用して作成されうる。
【0029】
MIF受容体と結合することによりMIFの生物学的活性を阻害する分子も、CTL応答を必要とする状態の治療のために利用されうる。そのような分子は、これらに限定はされないが、抗MIF受容体抗体及びMIFアナログを含みうる。抗MIF受容体抗体を産生させ、MIF受容体機能を中和するために使用することができる。MIF受容体タンパク質の全部又は任意の一部に対する抗体は、例えば米国特許第6,080,407号(前記)に記載された技術に従い作製されうる。
【0030】
MIFアナログは、MIF受容体と結合するが、生物学的活性は示さない分子を含みうる。そのようなアナログは、MIF受容体との結合に関してMIFと競合し、従って、in vivoで使用された場合、サイトカインにより媒介される障害性の進行におけるMIFの効果を阻止するよう作用することができる。当業者に周知の多様な技術が、MIFアナログを設計するために使用されうる。組換えDNA技術は、例えば、受容体結合能を有するが生物学的活性は有しないMIFアナログを生成させるアミノ酸の挿入、欠失、及び/又置換を含有している修飾型MIFタンパク質を作製するために使用されうる。別法として、MIFアナログは、化学的方法を使用して合成されてもよい(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.(1989)参照)。MIF受容体及び/又はMIF受容体を発現する細胞系は、可能性のあるMIFアンタゴニストを同定及び/又はアッセイするために使用されうる。
【0031】
米国特許第6,080,407号(前記)において教示されたように、一般に不活性又は「抗ステロイド性」のいずれかであると考えられているある種のステロイド;例えば20αジヒドロコルチゾールは、実際、MIFの放出を阻害する。これらのステロイド、又は予め形成されたMIFの放出を阻害するその他の任意の化合物が、本発明において、その他の抗MIF剤との組み合わせ療法において使用されうる。
【0032】
抗MIF抗体、MIF受容体、MIF受容体断片、MIF受容体アナログ、抗MIF受容体抗体、MIFアナログ、及びMIF放出の阻害剤のようなMIFの生物学的活性の阻害剤は、当業者に周知の技術を使用して投与されうる。好ましくは、薬剤は、製剤化され全身投与される。製剤化及び投与のための技術は、「Remington′s Pharmaceutical Sciences」,第18版,1990,Mack Publishing Co.,Easton,Paに見出されうる。適当な経路は、ほんの少数挙げるとすれば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸管投与;筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、並びに直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、又は眼内注射を含む非経口送達を含みうる。最も好ましくは、投与は静脈内である。注射の場合、本発明の薬剤は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーのような生理学的に適合性のバッファーの中に製剤化されうる。経粘膜投与の場合には、透過性化される障壁にとって適切な浸透剤が、製剤の中に使用される。そのような浸透剤は、当分野において一般的に既知である。
【0033】
投与される本発明のMIF阻害化合物の投薬の有効な濃度及び頻度は、生物学的半減期、生物学的利用能、及び毒性のようなパラメーターを扱う、当業者に周知の手法により決定されうる。抗MIF抗体の場合、好ましい投薬濃度は、体重1kg当たり約0.1〜20mgの範囲であり、体重1kg当たり約10mgが最も好ましい。循環系における長い半減期を示す抗体又はその他の阻害化合物の場合には、単回投与が、必要とされる循環系中濃度を維持するのに十分であるかもしれない。より短い半減期を示す化合物の場合には、必要な循環系中濃度を確立し維持するのに、複数の用量が必要であるかもしれない。
【0034】
MIF阻害剤は、単独で又は他の療法と組み合わされて患者に投与されうる。そのような療法は、CTL応答が望ましい腫瘍又はウイルスの阻害剤又はアンタゴニストの連続投与又は同時投与を含む。
【0035】
発明の範囲内には、MIF及び/又はMIF受容体のmRNAの翻訳を阻害するよう機能するアンチセンスのRNA分子及びDNA分子、並びにリボザイムを含む、オリゴリボヌクレオチド配列である抗MIF剤を使用した方法が含まれる。アンチセンスのRNA分子及びDNA分子は、直接、標的とされたmRNAと結合し、リボソーム結合及び/もしくは転位の阻害、又はmRNA分子自体のヌクレアーゼによる分解の誘発のいずれかによって、タンパク質翻訳を防止することにより、mRNAの翻訳を阻止するよう作用する。リボザイムは、RNAの特異的な分解を触媒することができる酵素性RNA分子である。リボザイム作用の機序は、リボザイム分子の相補標的RNAへの配列特異的なハイブリダイゼーション、それに続くヌクレオチド分解(endonucleolytic cleavage)を含んでいる。本発明の範囲内には、MIF及び/又はMIF受容体のmRNA配列のヌクレオチド分解を特異的かつ効率的に触媒する、改変されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。本発明のアンチセンスのRNA分子及びDNA分子、並びにリボザイムは、いずれも、核酸分子の合成のための当分野において既知の任意の方法によって調製されうる。これらは、例えば固相ホスホラミダイト化学合成のような、当分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学合成するための技術を含む。別法として、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitro及びin vivoの転写によって製造されうる。そのようなDNA配列は、T7又はSP6ポリメラーゼプロモーターのような適当なRNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれた極めて多様なベクターに組み込まれうる。別法として、使用されるプロモーターに依って構成性又は誘導可能にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞系へと安定的に導入することもできる。
【0036】
DNA分子に対する様々な修飾が、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入されうる。可能な修飾は、これらに限定はされないが、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの隣接配列の、分子の5′末及び/もしくは3′末への付加、又はオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合の代わりのホスホロチオエートもしくは2′O−メチルの使用を含む。
【0037】
抗MIF治療的使用のため、阻害性オリゴヌクレオチドは、製剤化され、in vitroの細胞と共に使用されてもよいし、かつ/又は全身投与及び局所もしくは局部投与を含む多様な手段によって投与されてもよい。製剤化及び投与のための技術は、「Remington′s Pharmaceutical Sciences」,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版に見出され得る。投与の様式は、体内の所望の標的器官への送達が最大となるよう選択されうる。
【0038】
実施例
材料及び方法
実験動物及び細胞系 C57BL/6(H−2b)マウス(雌、8〜12週齢)は、ジャクソン研究所(Jackson Laboratory)(Bar Harbor,ME)より購入した。動物手法は、全て、承認されたプロトコールの下で、NSUH Institutional Animal Care and Use Comitteeのガイドラインに従い実施した。EG.7細胞(OVAをコードするcDNAによるEL4のトランスフェクションによって作製(11))、及びEL4細胞(いずれも、MHCクラスII陰性、H−2bマウス胸腺腫)、並びにYAC−1細胞は、ATCC(Rockville,NM)より得た。
【0039】
サイトカイン及び抗体 以前に記載されたようにして、組換えマウスMIF(rMIF)を調製した(12;13)(<1pg毒素/μgタンパク質)。中和抗MIF mAb(クローンXIV.15.5、IgG1、アイソタイプ)は、以前に記載されたようにして調製した(9、14)。アイソタイプコントロール抗体(IgG1)は、3型デング熱ウイルスに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ5D4−11(ATCC)を使用して、同様の条件の下で精製した。FITC−ラット抗マウスCD3 Ab、PE−ラット抗マウスCD4、PerCP−ラット抗マウスCD8 Ab、PE−ラット抗マウスCD25 Ab、PE−ラット抗マウスCD28 Ab、FITC−ラット抗マウスCD44 Ab、PE−ラット抗マウスCD25(IL−2Rα)、PE−ラット抗マウスCD28 Ab、FITC−ラット抗マウスCD44 Ab、PE−ラット抗マウスCD25(IL−2Rα)、PE−ラット抗CD122(IL−2Rβ)、PE−ラット抗マウスCD132(共通γ鎖)、及びPE−ラット抗マウスH−2Kbは、ファーミンゲン(PharMingen)(San Diego,CA)より購入した。
【0040】
抗原特異CTLの製造 OVA特異CTLの製造は、以前に記載されている(11)。簡単に説明すると、5×106個のEG.7細胞のi.p.注射によって1〜2週間前に初回感作されたマウスから、脾細胞を得た。単離された脾細胞(3×106個)を、(サイトカイン又は抗体(下記参照)の存在下又は非存在下で)照射済EG.7細胞(20,000rad;106個)と共に5日間インキュベートした。in vitroのCTL分析(下記参照)において使用されたエフェクター細胞は、これらの培養物から収集され、H−2Kb(15)の環境でOVA257−264(SIINFKEL)ペプチドを認識した。in vivoのMIF中和の効果を研究するため、EG.7で初回感作されたマウスに、腫瘍細胞移植の日、次いで1週間毎日、抗MIF mAb又はコントロールIgG(0.5mg、i.p.)の注射を与えた。次いで、抗MIF又はコントロールIgGにより処理されたマウスから脾細胞を単離し、下記のようにして、in vitroのCTL活性に関して査定した。
【0041】
細胞により媒介される細胞障害性アッセイ EG.7標的細胞(5×105個/ウェル)を、96穴丸底プレートに、1:1〜30:1のE:T比で、様々な濃度の抗MIF mAb、コントロールIgG、又は精製されたrMIFと共に、エフェクター脾細胞(前記のようにして調製)の段階稀釈物に添加した。37℃4hの後、CytoTox 96°アッセイ(Promega Madison,WI)を使用した、培養上清(n=3)中のサイトゾル酵素、乳酸脱水素酵素(LDH)の測定により、細胞障害性を定量した。各E:T比についての「特異溶解」は、以下のように表される:特異溶解=[(実験的放出)−(自然放出)/(標的最大−標的自然放出)]。CTLの非存在下での自然LDH放出は、界面活性剤による溶解による最大細胞放出の10%未満であった。全ての実験手法及びアッセイを2回以上実施し、同様の結果を得た。
【0042】
NKアッセイ NK感受性YAC−1細胞を標的として使用し、以前に記載されたようにして(16)、NKアッセイを実施した。
【0043】
フローサイトメトリー分析 赤血球を含まない単細胞懸濁液を、示されたような実験マウスの脾臓から調製し、フローサイトメトリーにより分析した。全ての蛍光標識抗体を、ファーミンゲン(PharMingen)より購入し、製造業者の推奨に従い使用した。細胞(106個/アリコート)を3%BSA及び0.1%アジ化ナトリウムを含有しているPBS(FACSバッファー)に再懸濁させ、30分間(4℃)、蛍光標識抗体と共にインキュベートした後、FACSバッファーで2回洗浄した。蛍光データは、ファックスキャリバー(FACScalibur)(登録商標)フローサイトメーター(Beckton,Dickinson,Mountainview,CA)において得、セルクエスト(CELLQuest)ソフトウェア(Beckton Dickinson)を使用して分析した。この実験をもう1回繰り返し、同様の結果を得た。
【0044】
サイトカイン産生の分析 サイトカイン産生は、R&Dシステムズ(Systems)(Minneapolis,MN)より購入したマウスIFNγ、TNFα、IL−2、及びIL−12のキットを使用したサンドイッチELISAによる培養上清の分析により測定した。マウスMIFに関するELISAは、以前に記載されたようにして(14)実施した。中和抗MIF mAbの培養物への包含は、生物学的に活性なMIFと複合体化し、MIFを不活性にするが、後のELISAにより依然として検出可能である。
【0045】
in vivoの腫瘍成長 EG.7腫瘍成長に対する抗MIF mAbの効果を測定する実験を、以前に記載された方法(9)に従い、C57BL/6マウスにおいて実施した。培養したEG.7細胞を洗浄し、PBSに再懸濁させ、5×106個の細胞(PBS 0.1mlに懸濁)をマウスの側腹上部へとs.c.注射した(各群n=5)。1h後、次いで7日間24時間毎に、0.3mlのPBS、又はIgG1アイソタイプコントロール抗体(0.5mg)、又は精製された抗MIF mAb(0.5mg)のi.p.注射をマウスに与えた。重量(mg)=[幅(mm)2×長さ(mm)]/2(17)という式に従い、ノギス(Vernier calipers)を用いてなされた直交直線測定から、7日目に腫瘍サイズを測定した。この実験を2回繰り返し、同様の結果を得た。
【0046】
組織学的研究 コントロールIgG及び抗MIFで処理されたマウスから、7日目に腫瘍を切除した。凍結腫瘍切片を、PE−CD4(L3T4)mAb及びFITC−CD8(Ly−2)mAb(PharMingen)を使用して染色した。CD8+T細胞及びCD4+T細胞を、蛍光顕微鏡下で計数し、コントロールIgGで処理されたマウスに由来する切片と比較した、腫瘍切片1個当たりの染色された細胞の数の平均値の増加(%)として表した。切片1個当たり10個の視野を、l0×対物レンズを使用して計数した(各群n=5)。蛍光コンジュゲートアイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートされたコントロール切片は、免疫反応性を示さなかった。
【0047】
in situアポトーシス検出 アポトーシス中の細胞を、製造業者の推奨する手法に従い(R&D Systems)、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)媒介dUTP−ビオチンニック末端標識(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)−mediated dUTP−biotin nick end labeling)(TUNEL)を使用して検出した。統計分析のため、アポトーシス細胞を、光学顕微鏡検(100×)によって計数し、腫瘍切片1個当たりのアポトーシス細胞数の平均(±S.D.)として表した。切片1個当たり5個のランダム視野(マウス1匹当たり1個の切片、各群5匹)を分析し、スチューデントt検定を、有意性(P<0.05)を決定するために使用した。
【0048】
in vivoリンパ細胞遊走アッセイ ゾウ(Zou)ら(18)によって以前に記載されたようにして、抗MIF(0.5mg/マウス、i.p.)又はコントロールIgGの毎日の注射により処理された非腫瘍保持マウス、又は(腫瘍細胞注射の7日後の)同様のサイズのEG.7腫瘍を保持しているマウスを、このアッセイのための細胞源として使用した。未分画脾細胞、又は精製された脾臓CD8+T細胞(1×106個/ml)を得、膜挿入赤色蛍光色素であるPKH−26(Sigma,St.Louis,MO)で標識した。以前に記載されたようにして(19)、in vivoリンパ球遊走アッセイを実施した(各群n=5)。簡単に説明すると、標識された細胞を、腫瘍保持レシピエントマウスに注射した(i.v.)。腫瘍塊を24h後に除去し、凍結切片を調製した。T細胞型を決定するため、FITC−抗CD4又はFITC−抗CD8で切片を染色した。PKH−26蛍光ドナー細胞の存在を、鏡検によって定量し、切片化された腫瘍組織の視野1個当たりの標識されたドナー細胞の数の平均として表した。各切片(マウス1匹当たり1個)について、10個の視野を、10×対物レンズを使用して数えた。これらの実験を2回繰り返し、同様の結果を得た。
【0049】
養子免疫療法 C57BL/6マウスに、5×106個のEG.7細胞を注射し(s.c)、次いで抗MIF mAb又はコントロールIgG(0.5mg/日、i.p.)で、7日間毎日、処理した(各群n=5)。最後の注射の1日後、脾細胞を単離し、CD8+脾臓T細胞をCD8+濃縮カラム(R&D Systems)を使用して精製した。次いで、未分画の脾細胞又はCD8+T細胞(5×1063個/匹)を、1日前に5×106個のEG7細胞を注射(i.p.)されたレシピエントマウスへと移植した(i.v.)。前記のようにして、1〜13日目に腫瘍重量を決定した。この実験をもう1回繰り返し、同様の結果を得た。
【0050】
結果
抗MIF抗体はin vitroでCTL活性を増強する 従来の研究は、マクロファージ及びTリンパ球の活性化応答の一部として、MIFのタンパク質及びMRNAが発現されることを明らかにした(5、8、20)。腫瘍侵襲に対する宿主応答におけるMIFの可能性のある役割を評価するため、本発明者らは、まず、rMIF又は中和抗MIF mAbが、in vitroで抗原特異的な細胞障害性T細胞応答に影響を及ぼすか否かを検討した。EG7細胞の埋め込みにより初回感作されたマウスから脾細胞を単離し、これらの脾細胞培養物を、rMIF、中和抗MIF mAb、又はアイソタイプコントロールIgGの存在下で、照射済EG.7細胞により5日間刺激した。図1Bに示されるように、50μg/mlの抗MIF mAbの添加は、in vitroのCTL応答を有意にアップレギュレートし、外因性rMIF(図1A)又はコントロールIgG(図1C)の添加は、CTL活性に影響しなかった。コントロール試験は、脾細胞の抗MIF mAbによる処理又はEG.7細胞が、単独では生存又は成長の特性に影響を及ぼさないこと、及び抗MIF mAbによるin vitro前処理が、非条件脾細胞培養物において細胞障害性の発生を独立して引き起こさないことを示した。
【0051】
EG.7標的細胞を含む脾細胞培養物の最後の4hのアッセイ期間中、抗MIF mAb又はrMIFを添加することにより、CTL応答のエフェクター期におけるMIFの可能性のある役割も研究した。このアッセイ期間中、in vitroの細胞障害活性に対するこれらの薬剤の効果は存在しなかった。対照的に、5日間共培養期間の最初の2日以内に存在した場合、抗MIF mAbの、in vitroでCTL応答を増大させる活性が最も高いことが観察された(図1D)。
【0052】
これらのデータは、in vitroの細胞障害性T細胞活性化の初期におけるMIFの免疫中和が、後のCTL活性を強化することを示している。従って、照射済EG.7標的細胞による脾細胞エフェクター細胞のin vitro刺激が、照射済EG.7細胞の非存在下で培養された腫瘍保持マウスから得られた脾細胞と比較した場合、培養物上清中に検出可能なMIFの量の有意な増加を与えたことは予想外のことではなかった(図2A)。それにもかかわらず、生体活性rMIFの平行脾細胞培養物への添加の後には、CTL活性に対する有意な効果は観察されず、このことは、これらの培養物において内因的に産生されたMIF(>30mg/ml)に対して最大の細胞応答が既に存在していたかもしれないことを示唆している(図1A)。
【0053】
次に、in vitroのT細胞細胞障害性の発現において重要な役割を果たすことが既知のサイトカインの産生に対するMIFの免疫中和の効果を調査した。培養上清中に存在するIFNγ、TNFα、IL−2、及びIL−12のレベルを、特異的なELISAによって測定した。これらのうちIFNγのみが、コントロールmAbで処理された培養物と比較して抗MIF mAbのCTL活性を増強する活性が最も高かった2日間の共培養期間中、有意な濃度の増加を示した(図2B)。対照的に、抗MIF mAb及び照射済EG.7細胞の存在下でのEG.7腫瘍保持マウスに由来する脾細胞培養物のインキュベーションは、コントロールIgGで処理された培養物と比較して、IL−2、IL−12、又はTNFαタンパク質の発現を有意に変化させなかった。単独で培養されたEG.7細胞は、検出可能なレベルのMIF、IFNγ、IL−2、TNFα、又はIL−12を示さなかった。フローサイトメトリー分析によって、共培養物のrMIF処理も抗MIF処理も、細胞表面マーカーCD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD44highを呈示する細胞の割合には影響を及ぼさないことが見い出された。
【0054】
in vivoの抗MIF mAb処理はCTL活性を増強する 次に、in vivoのEG.7腫瘍初回感作の期間に、抗MIF mAb対アイソタイプコントロールIgGで処理されたマウスから採集された脾細胞のCTL応答を、比較した。これらの実験は、EG.7細胞による初回感作(0日目)の後1週間毎日の抗MIF mAbの投与が、30及び10というE:T比でCTL活性の生成を有意に増強したことを示した(図3A)。コントロールIgGの包含は、この実験系において、PBS単独と比較しても又は添加なしと比較しても、増強されたCTL活性をもたらさなかった。
【0055】
最近の研究は、38C13 B細胞リンパ腫(9)及びG361黒色腫(10)を保持しているマウスにおける抗MIF mAbの有意な抗腫瘍効果を明らかにした。これらのデータ、及び前記の観察された抗MIFによるCTL活性の2倍の増強と一致して、本発明者らは、EG.7リンパ腫を保持しているマウスへの1週間の抗MIF mAbの投与が、コントロールIgG又はPBSで処理されたマウスと比較して、腫瘍サイズの有意な2倍の縮小ももたらすことを見出した(図3B)。さらに、本発明者らは、抗MIF mAb処理の後、ほぼ3倍多い腫瘍浸潤CD8+細胞及びCD4+細胞を検出した(図4)。
【0056】
細胞障害性Tリンパ球は、アポトーシスを誘導することにより腫瘍細胞標的を死滅させる(21)。観察された抗MIF処理による宿主CTL活性の増強と一致する、コントロールIgGで処理されたマウスから得られた腫瘍と比較した(図5B)、抗MIFで処理されたマウスから得られた腫瘍塊内のアポトーシス細胞の数の有意な増加(4〜5倍)(図5A)が見い出された。抗MIFで処理されたマウスに由来する腫瘍切片の高倍率視野当たりのアポトーシス細胞数の平均(194±63個/100×視野)対コントロールIgGで処理されたマウスの数(43±22個/100×視野)を解析することにより、このアポトーシスの差を定量し、統計的に有意であることを見出した(p<0.01)。
【0057】
rMIFはin vitroのNK細胞活性を阻害することが、以前に報告された(22)。従って、in vivoの腫瘍成長に対する抗MIF mAbの阻害効果は、増強されたNK細胞活性の効果であるのかもしれない。コントロールの非腫瘍保持マウスと比較した場合、EG.7保持マウスに由来する全脾細胞調製物のNK活性の増加が観察されたが、抗MIF抗体で処理されたマウスにおいては、この活性の変化は観察されなかった。
【0058】
過去の研究は、in vivoの抗原により発動されるCD4+T細胞活性化の際のMIF発現が、免疫応答において重要な役割を果たすことを示した(8)。従って、次に、観察された抗MIF mAb処理により増強された細胞溶解活性が、増加した抗原により誘導されるCD8+T細胞の増殖と関連しているか否かを測定した。ベイカー(Bacher)ら(8)によると、in vivoで、抗MIF mAb処理の存在下で、T細胞増殖の増大は見い出されなかった。
【0059】
IL−2受容体発現に対する抗MIFの効果も試験した。IL−2受容体は、IL−2の親和性を制御する可変的に発現された鎖(CD25)、並びに2個のシグナリングサブユニットβ(CD122)鎖及びγc(CD132)鎖からなる多量体である((23)に概説)。(共通ガンマ鎖としても知られている)γcサブユニットは、IL−2、IL−4、IL−7、IL−9、及びIL−15の受容体の共有されたサブユニットである。γcの動員は、細胞内シグナリングにとって必要であり(24、25)、その発現は、in vivoの成熟CD8+T細胞生存にとって重要であることが示されている(26)。従って、γc発現に対する抗MIF処理の効果を試験した。腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理は、コントロールIgGで処理された腫瘍保持マウスと比較して、γc鎖の発現を有意に増強したが、CD8+T細胞上のIL−2受容体のαサブユニット又はβサブユニットの発現は有意には増強しなかった(図6)。
【0060】
抗MIF抗体は、腫瘍組織へのTリンパ球の遊走を促進し、CD8+T細胞特異抗腫瘍活性を増大させる さらに、抗MIF mAbのin vivo抗腫瘍効果が、T細胞に対する特異効果に起因することを示すため、腫瘍へのTリンパ球の輸送に対する抗MIF処理の効果を評価した。コントロールマウス又はEG.7腫瘍保持マウスを、7日間、抗MIF又はコントロールIgGのいずれかで処理し、未分画脾細胞又は精製された脾臓CD8+T細胞をPKH−26による標識のため回集した。標識された未分画脾細胞又は精製されたCD8+細胞を、EG.7腫瘍保持レシピエントへと移植した。24時間にわたるレシピエントマウスの腫瘍へのPKH−26標識ドナー細胞の侵入を、切除された腫瘍組織から得られた凍結切片の蛍光顕微鏡検によって定量した(それぞれ図7A及び7B)。これらの実験は、抗MIF mAbで処理された腫瘍保持マウスから得られた脾細胞又は精製されたCD8+T細胞が、コントロールmAbで処理された腫瘍保持マウスから得られた比較可能な細胞より多数(≧2倍の増加)、腫瘍組織へと侵入したことを示した。
【0061】
最後に、in vivoの腫瘍成長に対する養子移植された(抗MIF mAbで処理された動物から得られた)CD8+細胞の効果を試験した。抗MIF mAb又はコントロールIgGで処理されたEG.7腫瘍保持ドナーマウスに由来する未分画脾細胞又は精製されたCD8+脾臓T細胞500万個を、24h前にEG.7腫瘍細胞をs.c.注射されたマウスへと移植した(図7C)。次いで、in vivoの腫瘍成長を2週間モニタリングした。図7Cに示されるように、抗MIFで処理された腫瘍保持マウスから得られたCD8+T細胞の、未処理腫瘍保持マウスへの養子移植は、レシピエントマウスにおけるその後の腫瘍成長に対する有意な阻害効果を示した。対照的に、抗MIFで処理された腫瘍保持マウス対コントロールIgGで処理された腫瘍保持マウスから得られた未分画脾細胞(5×106個;CD4+T細胞及びCD8+T細胞並びにB細胞の両方を含有している)の移植の後には、腫瘍重量の有意な差は観察されなかった。これらのデータは、養子移植実験における腫瘍成長の有意な阻害を媒介するための、抗MIFで処理された腫瘍保持動物から得られた臨界数のCD8+T細胞の重要性を示している。
【0062】
代表的な実施態様及び詳細を参照しつつ本発明を完全に記載してきたが、本明細書に既述されたような本発明の本旨又は範囲を逸脱することなく、本発明に変化及び修飾を施しうることは、当業者には明白であろう。
【0063】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0064】
【図1】抗MIF mAbはin vitroでCTL活性を増強するが、rMIF又はコントロールIgGは増強しない。7日前にEG.7細胞で初回感作されたC57BL/6マウスが脾細胞の起源であった(材料及び方法を参照のこと)。rMIF(A)、抗MIF(B)、又はコントロールIgG1(C)の存在下で、5日間、照射済EG.7細胞により刺激された脾細胞培養物。様々なE:T細胞比で、新鮮なEG.7細胞を脾細胞へと添加し、37℃での4hのインキュベーションの後、細胞障害性を乳酸脱水素酵素(LDH)放出により測定した。(D)脾細胞−照射済EG.7共培養物(E:T=20:1)の開始時(0日目)に抗体を添加した場合、対2日目に添加した場合の、in vitroのCTL活性に対する抗MIF mAbの効果。*、スチューデントt検定により、添加なしに対し、<0.05。
【図2】初回感作された脾細胞が照射済EG.7細胞と共に培養された場合、MIF及びIFNγの分泌が増強される。脾細胞をEG.7細胞で初回感作されたマウスから単離し、照射済EG.7細胞と、アイソタイプコントロールAb(コントロール)又は抗MIF mAb(抗MIF)(50μLg/ml)とで、1日又は2日間刺激した、又はしなかった。材料及び方法に記載されたようにして、培養上清を、MIF(A)及びIFNγ(B)に関する特異ELISAにより分析した。TNFα及びIL−12の値は、検出限界未満であった。*、スチューデントt検定により、コントロール+EG.7対コントロール−E.7で、p<0.05。
【図3】EG.7腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理はCTL活性を増加させ腫瘍成長を阻害する。C57BL/6マウス(各群n=5)にEG.7細胞を注射し、次いで、毎日、PBS、コントロールIgG、又は抗MIF mAb(0.5mg)のいずれかで処理した。7日目、脾臓を採集し、単離された脾細胞を、5日間、照射済EG.7細胞と共培養し、その間、4h CTL in vitroアッセイにおいて細胞溶解をLDH放出によって測定した(A)。腫瘍サイズは、7日目に決定した(B)。*、スチューデントt検定により、抗MIF処理対コントロールIgG処理で、<0.05。
【図4】EG.7腫瘍保持マウスの抗MIF mAb処理は腫瘍のTリンパ球浸潤を増加させる。マウス(各群n=5)を、コントロールIgG又は抗MIF mAbで7日間毎日処理した。次いで、EG.7腫瘍を切除し、腫瘍切片をPE−抗マウスCD4(L3T4)又はFITC−抗マウスCD8(ly−2)モノクローナル抗体で染色した。CD8+T細胞及びCD4+T細胞を、蛍光顕微鏡検により数え、コントロールIgGで処理された動物と比較した、抗MIFで処理された動物の腫瘍の中の免疫応答性浸潤細胞の増加率の平均(±S.D.)として表した。蛍光アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートされた切片は、免疫応答性を示さなかった。*、スチューデントt検定により、抗MIEF処理対コントロールIgG処理の比較で、p<0.05。
【図5】抗MIF mAb処理はEG.7腫瘍細胞アポトーシスを促進する。TUNEL方法によってDNA鎖破断を標識することによりin situでアポトーシス細胞を検出した。抗MIF mAbで処理されたマウスから得られた腫瘍組織には、多数のアポトーシス(暗茶色)EG.7細胞が可視である(A)。対照的に、コントロールIgGで処理されたマウスから得られた腫瘍には、より少数のアポトーシス小体が観察される(B)。示された切片(100×)は、10個の腫瘍切片(各群n=5)の代表である。
【図6】in vivoの抗MIF抗体処理によってIL−2Rγc発現がアップレギュレートされる。抗MIF又はコントロールIgGで7日間毎日処理された未感作マウス又はEG.7腫瘍保持マウス(各群n=3)より、脾細胞を収集した。個々の群からの脾臓をプールし、CD8+T細胞集団に対するゲーティングの後、CD8及びIL−2Rα(A)、β(B)、又はγc(C)表面マーカーに関して染色した。影付きのヒストグラムは、アイソタイプコントロール抗体で染色された細胞を表す。
【図7】抗MIF抗体によるドナー腫瘍保持マウスの処理は、レシピエント腫瘍保持マウスのEG.7腫瘍への移植されたTリンパ球の遊走を増加させ、レシピエントマウスにおけるCD8+T細胞抗腫瘍活性を促進する。正常(コントロール)マウス又は腫瘍保持マウスに由来する未分画の脾細胞(A)又は精製されたCD8+脾臓T細胞(B)を、抗MIF又はコントロールIgGによる処理(0.5mg×7日)の8日後に単離し、蛍光色素PKH−26で標識した。次いで、標識された細胞を腫瘍保持レシピエントマウス(各群n=5)へi.v.移植した。翌日、腫瘍を切除し、凍結切片を調製し、高倍率視野(HPF)1個当たりの蛍光細胞の数を数えた(平均±S.D.)。スチューデントt検定により、コントロール抗体に対し、*、p<0.05;**、p<0.01。(C)C57BL/6マウスに、5×106個のEG.7細胞を注射し(i.p.)、次いで、7日間、抗MIF mAb又はコントロールIgG(0.5mg/日)で処理した。24h前に5×106個のEG.7細胞をs.c.接種されたレシピエントマウス(各群n=5)へ、精製された脾臓CD8+T細胞を移植した(5×106個/匹;i.v.)。腫瘍重量(平均±S.D.)を測定した。*、スチューデントt検定により、コントロール抗体で処理されたマウスに対し、p<0.05。
Claims (19)
- がんを有する対象への投与のためのがん療法としての細胞の調製方法であって、MIFアンタゴニストの存在下で細胞を培養することを含む方法。
- MIFアンタゴニストが、抗MIF抗体、MIFアンチセンスcDNA、及びMIFリガンド:受容体結合のアンタゴニストからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- がんを有する対象への投与のためのがん療法としての細胞の調製方法であって、抗MIF抗体の存在下で細胞を培養することを含む方法。
- 抗MIF抗体がモノクローナルである、請求項3記載の方法。
- モノクローナル抗MIF抗体が、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び単鎖モノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
- がんを有する対象への投与のためのがん療法としての細胞組成物の調製方法であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原及び(b)抗MIF抗体の存在下で組成物の細胞をインキュベートすることを含む方法。
- がんを有する対象への投与のための自家細胞を調製する方法であって、抗MIF抗体、そのMIF結合断片、又はそれら両方からなる群より選択される作用物質の存在下で細胞をインキュベートすることを含む方法。
- がんを有する対象への投与のための自家細胞を調製する方法であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原及び(b)抗MIF抗体、そのMIF結合断片、又はそれら両方からなる群より選択される作用物質の存在下で細胞をインキュベートすることを含む方法。
- 自家細胞が免疫細胞を含む、請求項7記載の方法。
- 自家細胞がT細胞を含む、請求項7記載の方法。
- 自家細胞がCD8+細胞を含む、請求項7記載の方法。
- 抗MIF抗体と共にインキュベートされた細胞を含む、がんを有する対象への投与のための細胞組成物。
- 抗MIF抗体と共にインキュベートされた細胞が、さらに少なくとも1つの腫瘍抗原と共にインキュベートされたものである、請求項12記載の細胞組成物。
- 抗MIF抗体とのインキュベーションが生体外でのことである、請求項12記載の細胞組成物。
- 未結合の抗MIF抗体から単離された、請求項12の細胞組成物。
- 未結合の抗MIF抗体及び未結合の腫瘍抗原から単離された、請求項13記載の細胞組成物。
- 細胞が免疫細胞を含む、請求項13記載の細胞組成物。
- 細胞がT細胞を含む、請求項13記載の細胞組成物。
- 細胞がCD8+細胞を含む、請求項13記載の細胞組成物。
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