KR20150136389A

KR20150136389A - 관절염 예방 또는 치료용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 관절염 예방 또는 치료 방법

Info

Publication number: KR20150136389A
Application number: KR1020140063827A
Authority: KR
Inventors: 최은화
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2015-12-07
Also published as: US20170224772A1; WO2015182953A1

Abstract

CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 키트, 및 이를 이용한 관절염 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이에 의하면, 관절염을 예방 또는 치료하는데 우수한 효과가 있다.

Description

관절염 예방 또는 치료용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 관절염 예방 또는 치료 방법{Composition and kit for the prevention or treatment of arthritis, and method for preventing or treating arthritis using the same}

CTLA4 및 면역글로불린 불변 영역의 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 관절염 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

관절염(arthritis)은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증이 생긴 것으로, 통증, 부종, 발열의 증상이 나타난다. 관절염 중 류마티스 관절염은 전신성 만성 염증 질환이고 자가면역성 질환이다. 류마티스 관절염의 치료제는 비스테로이드성 항염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs: NSAID), 항류마티스 약물(disease-modifying anti-rheumatic drugs: DMARD), 부신 피질 호르몬, 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 길항제 등이 있다.

T 세포의 활성은 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)에서 제공되는 2가지 신호가 필요하다. 첫째는 APC의 MHC(major histocompatibility complex)에 의해 항원이 제공되는 것을 T 세포 수용체/CD3 복합체가 인식하는 신호이고, 둘째는 T 세포의 분화를 유도하는 신호로서 T 세포의 CD28과 APC의 공자극 신호(costimulation signal)라고도 알려져 있다. 세포독성 T-림프구 항원 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4: CTLA4)는 CD152로도 알려져 있고 면역계를 하향조절하는 단백질 수용체로서 CTLA4는 T 세포의 표면에 존재한다. T 세포의 활성은 T 세포의 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 활성이 자극되고, CTLA4 수용체를 자극함으로써 T 세포의 활성을 중지한다. CTLA4 수용체와 APC의 B7의 결합력은 CD28 수용체와 APC의 B7의 결합력 보다 강하기 때문에 CTLA4 수용체는 T 세포의 공자극 신호를 차단할 수 있고, 그 결과 T 세포의 활성을 중지시킬 수 있다.

CTLA4의 세포외 도메인과 및 면역글로불린 IgG1의 Fc 영역의 융합 단백질(CTLA4Lg)인 아바타셉트는 류마티스 관절염 치료제로서, 미국에서는 식품의약국(FDA)의 승인을 거쳐 임상에 적용되고 있고(Bristol-Myers Squibb, 상품명 Orencia), 국내에서는 중등증 내지 중증의 활동성 류마티스 관절염 성인 환자와 소아 특발성 관절염 환자에 대한 단독요법 또는 TNF 길항제를 제외한 항류마티스약물(DMARD)과 병용해 사용할 수 있도록 승인되었다.

그러나, CTLA4Lg 융합 단백질의 생체 내 반감기가 생체 내 작용기간이 짧기 때문에(건강한 개체에서 약 16.7일, 류마티스 환자에서 약 13.1일, 성인 류마티스 환자에 피하 투여되었을 경우 약 14.3일), CTLA4Lg 융합 단백질을 지속적으로 투여를 해야 하고, 고가의 비용이 들고, 관절에 표적화가 되지 않는 문제가 있다.

따라서, CTLA4Lg 융합 단백질을 지속적으로 발현하고, 류마티스 관절염의 질환 부위인 관절로 표적화되는 약학적 조성물이 여전히 요구된다.

CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

CTLA4 또는 이의 단편을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

상기 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용한 관절염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

세포독성 T-림프구 항원 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4: CTLA4)는 CD152로도 알려져 있고, 면역계를 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA4는 항원에 대한 세포성 면역을 담당하는 T 세포의 표면에 존재한다. CTLA4는 T 세포의 공자극(costimulatory) 단백질인 CD28과 유사하고, T 세포의 CTLA4와 CD28은 모두 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)의 CD80(B7-1로도 불림) 및 CD86(B7-2로도 불림)에 결합한다. CD28은 T 세포에서 자극 신호를 전달하는 반면에, CTLA4는 T 세포에서 저해 신호를 전달한다. CTLA4는 세포외 도메인, 막투과성 도메인, 및 세포내 꼬리를 함유한다. CTLA4는 GenBank Accession No. NP_001032720(인간 CTLA4) 또는 NP-033973(마우스 CTLA4)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, GenBank Accession No. NM_001037631(인간 CTLA4) 또는 NM-009843(마우스 CTLA4)의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 CTLA4 또는 이의 단편은 CTLA4 세포외 도메인을 포함할 수 있다. CTLA4 단편은 CTLA4 세포외 도메인을 포함하는 CTLA4의 일부일 수 있다. 상기 CTLA4 세포외 도메인은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것일 수 있다. 이러한 CTLA4 또는 이의 단편은 인간, 개, 고양이, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 피그 등의 포유동물의 생체 내에서 분리한 천연형, 형질전환된 동물 세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형, 또는 이의 유도체, 또는 유전자 합성(gene synthesis)에 의한 산물일 수 있다.

면역글로불린 불변 영역(immunoglobulin constant region)은 전장 항체에서 면역글로불린 중 Fab( Fragment, antigen binding: Fab) 영역을 제외한 영역이다. 상기 면역글로불린 불변 영역은 인간, 개, 고양이, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 피그 등의 포유동물의 생체 내에서 분리한 천연형, 형질전환된 동물 세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체, 또는 유전자 합성 (gene synthesis)에 의한 산물일 수 있다. 면역글로불린 불변 영역은 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD의 불변영역, 또는 이들의 조합일 수 있다. 면역 글로불린 불변 영역은 Fc 영역(Fragment crystallizable region)을 포함할 수 있다. Fc 영역은 면역 글로불린은 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하고, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 불변영역, 또는 이들의 조합일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입, 보다 구체적으로는 서브클래스로 감마 1(γ1), 감마 2(γ2), 감마 3(γ3), 감마 4(γ4), 알파 1(α1) 및 알파 2(α2)의 불변 영역을 가지고 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입의 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 감마 1 불변 영역일 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.

용어 "중간엽 줄기 세포(meshenchymal stem cell: MSC)"는 골세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 및 지방세포(adipocyte)를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질 세포(multipotent stromal cell)을 말한다. 중간엽 줄기 세포는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 힘줄(tendon), 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육 세포(muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 지방 조직, 골수(bone marrow), 말초신경 혈액, 제대혈, 골막(periosteum), 진피(dermis), 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포는 지방 조직으로부터 분리되거나 지방 조직으로부터 분리된 세포로부터 배양된 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포는 인간 중간엽 줄기 세포일 수 있다.

상기 CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단으로부터 제1 폴리펩티드과 제2 폴리펩티드가 결합된 단백질일 수 있다.

상기 융합 단백질은 중간엽 줄기 세포로부터 분비될 수 있다. 세포로부터 분비를 위해, 상기 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에 신호 펩티드와 더 융합될 수 있다. 용어 "신호 펩티드(signal peptide)"는 신호 서열(signal sequence), 선도 서열(leader sequence) 또는 선도 펩티드(leader peptide)로도 불린다. 단백질 번역 과정에서 전구체 폴리펩티드가 소포막에 결합하면 막 결합형 폴리솜이 형성되고, 폴리펩티드 사슬이 합성되면서 소포의 막을 통과한다. 막 통과와 동시에 소포 내막에 존재하는 신호 펩티드 가수분해효소가 신호 펩티드를 절단 및 제거하고, 합성된 폴리펩티드는 소포의 내막에 존재하고, 합성된 폴리펩티드는 엑소시토시스(exocytosis)에 의해 세포 밖으로 분비된다. 예를 들어, 신호 펩티드는 온코스타틴(oncostatin) M 신호 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.

상기 관절염(arthritis)은 예를 들어, 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 통풍(gout), 세균성 관절염(septic arthritis), 소아기 류마티스 관절염(Juvenile idiopathic arthritis), 또는 루푸스(Lupus)일 수 있다.

상기 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소투여용 제제일 수 있다. 예를 들어, 물, 식염수, 또는 이외에 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클, 방부제, 또는 결합제 등과 조합하여, 약학적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 피내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 또는 정맥 투여일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 중간엽 줄기 세포는 냉동 보관할 수 있고, 공지된 방법에 따라 냉동 또는 해동될 수 있다. 상기 중간엽 줄기 세포는 세포 보존액에 보관될 수 있다. 예를 들어, FBS (fetal bovine serum), DMSO (dimethylsulfoxide), 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물에 보관할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 조성물은 예를 들어 1 mL당 약 1x10⁶개 내지 1x10⁷개의 세포가 존재할 수 있지만, 조건에 따라 다른 수의 세포가 존재할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 용량은 넓은 범위로 변하며 각각의 특별한 경우의 개별적인 요구 조건에 따라 결정된다. 예를 들어, 비경구 투여의 경우, 상기 중간엽 줄기 세포의 1일 투여량은 1일 1x10⁴내지 1x10⁷ 개의 세포/kg 체중일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 알려진 다른 관절염 치료제와 함께 동시 또는 순차로 투여될 수 있다.

CTLA4 또는 이의 단편을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 키트가 제공된다.

CTLA4 또는 이의 단편, 면역글로불린 불변 영역, 중간엽 줄기 세포, 관절염, 예방, 및 치료는 전술한 바와 같다.

발현 벡터(expression vector)는 도입하고자 하는 유전자를 세포 내에서 발현시킬 수 있는 벡터를 말한다. 예를 들어, 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, SV40 벡터, 폴리오마바이러스 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 피카르노바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 미니서클(minicircle) DNA 벡터, 펩티드 벡터 등의 비바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발현 벡터는 CTLA4 또는 이의 단편을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 중간엽 줄기 세포에 상기 발현 벡터를 도입하기 위해 필요한 형질 감염 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 형질 감염 시약은 리포펙타민(lipofectamin)일 수 있다.

CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

상기 투여는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 피내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 또는 정맥 투여일 수 있다. 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 용량은 넓은 범위로 변하며 각각의 특별한 경우의 개별적인 요구 조건에 따라 결정된다. 예를 들어, 비경구 투여의 경우, 상기 중간엽 줄기 세포의 1일 투여량은 1일 1x10⁴내지 1x10⁷ 개의 세포/kg 체중일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

상기 개체는 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 양, 쥐, 및 원숭이를 포함한 포유동물로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 관절염은 류마티스 관절염일 수 있다.

일 구체예에 따르면, CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포는 관절염의 질환 부위인 관절에 중간엽 줄기 세포가 분포되어 CTLA4를 포함하는 융합 단백질이 효율적으로 작용할 수 있고, 중간엽 줄기 세포로부터 CTLA4를 포함하는 융합 단백질이 지속적으로 발현되어 생체 내에서 장기간 작용이 가능하고, 중간엽 줄기 세포 자체의 면역 조절 능력과의 시너지 효과가 있으며, 우수한 연골 보호 효능이 있다. 따라서, CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 키트, 및 이를 이용한 관절염 예방 또는 치료 방법에 의하면, 관절염을 예방 또는 치료하는데 우수한 효과가 있다.

도 1a는 마우스 CTLA4Ig-pLenti6/V5 TOPO 발현 플라스미드의 모식도이고, 도 1b는 형질 도입된 지방 유래 중간엽 줄기 세포의 사진이다.
도 2는 면역화 후 경과일(일)에 따른 관절염 중증도 점수를 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 각각 군에 대한 혈청 중 혈청 중 항-타입 II 콜라겐 항체, C-텔로펩티드 I, 및 C-텔로펩티드 II의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 H&E 또는 사프라닌 O로 염색한 무릎 관절 조직의 사진이고, 도 4b는 연골 손상의 중증도를 0(손상 없음) 내지 4(중증 손상)의 점수로 나타낸 그래프이고, 도 4c는 형태학적 기형의 중증도를 0(기형 없음) 내지 4(중증 기형)의 점수로 나타낸 그래프이다.
도 5는 형광 물질로 표지한 줄기 세포를 마우스 꼬리 정맥에 투여한 후 수득된 마우스의 조직의 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 . CTLA4Ig 발현 중간엽 줄기 세포에 의한 류마티스 관절염 예방 또는 치료 효과의 확인

1-1. CTLA4Ig 발현 중간엽 줄기 세포의 준비

기증자의 동의 하에 인간 복부 피하 지방 조직을 지방 흡입으로 수득하였다. 인간 지방 조직-유래 중간엽 줄기 세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell: hASC)는 지방 기질 혈관 분획으로부터 분리하고 Good Manufacturing Practice condition(K-STEMCELL, Co., Ltd Co., Ltd.) 하에서 배양하였다. 삼성 의료원 임상 시험 심사 위원회(Institutional Review Board: IRB) 승인된 시험 하에서 개인 식별 정보를 제거한 hASC를 준비하여 사용하였다.

표적 단백질로서 마우스 CTLA4 단백질의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 마우스 면역글로불린 A(Immunoglobulin: IgA)의 힌지-CH2-CH3 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 표적 유전자가 표적 부위에서 분비될 수 있도록 온코스타틴 신호 서열을 이용하였다.

구체적으로, 5' 말단으로부터 인간 온코스타틴 M 신호 서열(서열번호 1, GenBank Accession No. NM_020530.3의 53 내지 127 뉴클레오티드), 마우스 CTLA4의 세포외 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 2, GenBank Accession No. NM_009843.4의 258 내지 629 뉴클레오티드), 및 마우스 면역글로불린 감마 1 불변(murine immunoglobulin gamma 1 constant) 영역의 힌지-CH2-CH3 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3, GenBank Accession No. AB097849의 772 내지1452 뉴클레오티드)을 융합시키고, 융합된 유전자를 pLenti6/V5-D-TOPO^®(Life Technologies)에 클로닝하여, 마우스 CTLA4Ig-pLenti6/V5 TOPO 발현 플라스미드를 준비하였다. 인간 온코스타틴 M 신호 서열은 표적 단백질을 생체 체액으로 분비시키는 신호 서열이고, CTLA4는 B7:CD28 공동자극(co-stimulatory) 신호를 저해하고, 면역글로불린 A(Immunoglobulin: IgA)의 힌지-CH₂-CH₃ 도메인은 인 비보(in vivo)에서 표적 단백질의 반감기를 연장하기 위한 것이다. 도 1a는 마우스 CTLA4Ig-pLenti6/V5 TOPO 발현 플라스미드의 모식도를 나타낸다(SP: 신호 서열, V: 마우스 CTLA4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, H: 힌지 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, CH2: CH2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, CH3: CH3 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열).

중간엽 줄기 세포로 표적 유전자인 마우스 CTLA4Ig 융합 유전자의 도입은 ViraPower™ Lentiviral Expression System(Life Technologies)을 이용하여 수행하였다. ViraPower packaging mix와 상기 준비된 마우스 CTLA4Ig-pLenti6/V5 TOPO 발현 플라스미드를 293FT 세포주(Life Technologies)에 리포펙타민® 2000(Life Technologies)을 사용하여 공-형질도입하였다. 바이러스 입자를 수득하고 상기 준비된 hASC에 형질도입하였다. 도 1b는 형질 도입된 지방 유래 중간엽 줄기 세포의 이미지이다. 5 ㎍/㎖의 블라스티시딘(Life Techniloties)을 사용하여 마우스 CTLA4Ig 융합 유전자가 도입된 세포주를 선별하였다. 선별된 세포가 CTLA4를 발현하고 세포 외로 분비하는지 확인하기 위해, 세포 배양액 상층액을 수집하고 CTLA4 DuoSet® ELISA Development kit(R&D systems, Cat. No. DY476)를 사용하여 ELISA(enzyme-linked enzyme-linked immunospecific assay) 법으로 마우스 CTLA4Ig 융합 단백질의 농도를 결정하고, CTLA4Ig 발현 중간엽 줄기 세포(CTLA4Ig-hASC)를 선별하였다.

1-2. 류마티스 관절염 동물 모델의 준비 및 CTLA4Ig 발현 중간엽 줄기 세포의 투여

Chicken 타입 II 콜라겐(Sigma-Aldrich)은 4℃에서 2 mg/ml의 농도로 0.05%(v/v) 아세트산(Sigma-Aldrich)에 혼합하였다. 이 혼합물과 프로인트 완전 아주반트(Freund's complete adjuvant: CFA)(Sigma-Aldrich)를 동량으로 섞은 후, 호모게나이저(Polytron PT3100D)를 사용하여, 30000 rpm에서 3분 동안 균질화시켜 투여용 항원 물질을 준비하였다. 1차 면역화를 위해 투여용 항원 물질을 마우스(DBA/1 마우스, 6주령)의 꼬리에 피하 주사하였다(제1일). 3주 후 CFA를 프로인트 불완전 아주반트(Freund's incomplete adjuvant: IFA)(Sigma-Aldrich)로 대체하고, 같은 방법으로 부스팅(boosting) 하였다.

마우스를 5개 군으로 나누고, 하기 표 1과 같이 식염수, hASC, 및 CTLA4Ig-hASC를 면역화 후 제63일, 제70일, 제77일, 및 제84일에 마우스 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 류마티스 관절염에 대한 효과를 비교하기 위해, 류마티스 관절염 치료제로 사용되는 1mg/체중 kg의 메토트렉세이트(methotrexate: MTX)(Medac)를 3회/주의 빈도로 총 12회 복강내 투여하였다.

군	동물 모델	투여 물질, 투여 방법, 및 투여 횟수
정상군(n=10)	류마티스 관절염을 유발하지 않은 정상 마우스	150 ㎕의 식염수, 미정맥투여, 총 4회 실시
음성 대조군(n=13)	류마티스 관절염 유발 마우스	150 ㎕의 식염수, 미정맥투여, 총 4회 실시
hASC 군(n=12)		2x10⁶개의 hASC/150 ㎕의 둘베르코 인산 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline: dPBS), 미정맥투여, 총 4회 실시
CTLA4Ig-hASC 군(n=13)		2x10⁶개의 CTLA4Ig-hASC/150 ㎕의 dPBS, 미정맥투여, 총 4회 실시
MTX 군(n=7)		1 mg/체중 kg, 3회/주, 총 12회, 복강내 투여

마지막 이식 후 1주일에 모든 동물을 희생하고 혈액 및 조직을 수득하였다.

1-3. 관절염 중증도 평가

실시예 1-2의 마우스에서 면역화 후 62일부터 앞발과 뒷발의 관절염 중증도를 주당 3회 부종 및 발적의 정도에 따라 0점(관절염 없음)에서 4점(중증 관절염)의 점수로 평가하였다. 각각의 다리마다 마우스 당 최대 16점으로 평가하였다. 임상 점수는 면역화 후 90일까지 각각의 마우스에서 측정하였다. 각 군에서 수득된 데이터는 일원 배치 분산분석(oneway ANalysis Of VAriance: ANOVA) 후 Turkey의 다중 비교 검정을 이용하여 비교하였다.

도 2는 면역화 후 경과일에 따른 관절염 중증도 점수를 나타낸 그래프이다(●: 정상군, ◆: 음성 대조군, ■: hASC 군, ▲: CTLA4Ig-hASC 군, ×: MTX 군). 도 2에서 식염수, hASC, 및 CTLA4Ig-hASC를 투여한 시점을 "↑"로 표시하고, 음성 대조군에 대해 유의성 있는 차이를 "*"로 표시하였다(p<0.05).

도 2에 나타난 바와 같이, hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군이 3회의 투여 후 음성 대조군에 비해 유의하게 관절염 중증도 점수가 감소하였고, MTX 군은 음성 대조군과 유사한 관절염 점수 패턴을 나타내었다.

1-4. 혈청 중 항-타입 II 콜라겐 항체, 타입 I 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드, 및 타입 II 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드의 검출

실시예 1-2에서 수득된 혈청 중 항-마우스 타입 II 콜라겐 항체, 파골세포성 골 흡수(osteoclastic bone resorption) 과정에서 유출되는 타입 I 콜라겐인 타입 I 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드(C-텔로펩티드 I), 및 연골 분해 산물인 타입 II 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드(C-텔로펩티드 II)를 ELISA 방법을 이용하여 검출하였다.

구체적으로, 혈청 중 항-마우스 타입 II 콜라겐 항체, C-텔로펩티드 I, 및 C-텔로펩티드 II를 각각 항-마우스 타입 II 콜라겐 ELISA 키트(Astarte Biologics), RatLap™ EIA kit(Immunodiagnostic Systems Ltd.), 및 타입 II 콜라겐 ELISA 키트(CUSABIO)를 사용하여 측정하였다. 측정 방법은 각각 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.

도 3a는 각 군에 대한 항-마우스 타입 II 콜라겐 항체의 농도(U/ml)를 나타내는 그래프(▨: 처리 전, ▧: 처리 후)이고(C: 음성 대조군, H: hASC 군, CT: CTLA4Ig-hASC 군, MTX: MTX 군), 두 개의 관련된 시료(처리 전과 후)의 평균 값을 비교하기 위해 짝지어진 t-검정(†, p<0.05)과 윌콕슨 부호 순위 검정(‡, p<0.05)을 이용하였다. 도 3b 및 도 3c는 각각 군에 대한 C-텔로펩티드 I 및 C-텔로펩티드 II의 농도를 나타내고(N: 정상군, C: 음성 대조군, H: hASC 군, CT: CTLA4Ig-hASC 군, MTX: MTX 군), 일원 배치 분산분석(oneway ANalysis Of VAriance: ANOVA) 후 Turkey의 다중 비교 검정을 이용하여 비교하였다. 음성 대조군에 대해 유의성 있는 차이를 "*"로 표시하였다(p<0.05).

도 3a에 나타난 바와 같이, 혈청 중 항-마우스 타입 II 콜라겐 자가 항체의 농도는 CTLA4Ig-hASC 군에서 처리 전과 비교하여 처리 후 유의성 있게 낮았다. 또한, 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, 혈청 중 C-텔로펩티드 I의 농도는 음성 대조군, hASC 군, CTLA4Ig-hASC 군, 및 MTX 군에서 유의성 있게 차이가 있지 않았으나, 혈청 중 C-텔로펩티드 II의 농도는 음성 대조군 보다 정상군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았다.

1-5. 조절 T 세포 및 CD138 세포의 비율에 대한 유세포 분석

실시예 1-2에서 수득된 마우스 비장 세포에서 조절 T 세포 및 CD138 세포(형질 세포 또는 B 세포 전구체)의 비율을 확인하기 위해 조절 T세포의 마커인 CD4, CD25, 및 Foxp3, 및 CD138 세포의 마커인 CD138을 이용하였다. 자가 면역 반응 과정에서 형성된 형질 세포는 자가 항체의 생산을 담당하고, B 세포와 관련된 체액성 면역 반응은 만성 자가 면역 질환의 진행에 필수적이다.

마우스 비장 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate: FITC) 래트 항-마우스 CD4 항체(BD biosciences), 알로피코시아닌(allophycocyanin: APC) 래트 항-마우스 CD25 항체(BD biosciences), 피코에리트린(phycoerythrin: PE) 항-마우스 Foxp3 항체(BD biosciences), 및 PE 래트 항-마우스 CD138 항체(BD biosciences)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.

CD4+Foxp3+ 세포의 비율은 정상군, 음성 대조군, hASC 군, CTLA4Ig-hASC 군, 및 MTX 군에서 각각 5.7±1.1%, 3.4±0.4%, 3.4±0.3%, 6.3±4.6%, 및 4.4±3.3%였다. CD138 세포의 비율은 정상군, 음성 대조군, hASC 군, CTLA4Ig-hASC 군, 및 MTX 군에서 각각 13.8±3.0%, 18.8±1.9%, 7.2±0.6%, 7.7±0.6%, 및 17.2±2.4%였다. 따라서, 마우스 비장 세포에서 조절 T 세포의 증식은 대조군과 처리군 간에 유의성 있는 차이가 없었으나, CD138 세포의 비율은 음성 대조군보다 비율은 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았다.

1-6. 혈청 중 사이토카인의 농도 측정

hASC 또는 CTLA4Ig-hASC의 이식에 따른 사이토카인 발현의 변화를 확인하기 위해, 실시예 1-2 에서 수득된 혈청, 무릎 추출물, 비장 세포, 및 림프절 세포를 준비하였다.

각 군의 비장 세포를 분리하고, 2.5×10⁵개/웰의 림프절 세포를 100 ㎍/ml 타입 II 콜라겐(Sigma Aldrich), 2.5 ㎍/ml 콘카나발린 A(concanavalin A: ConA)(Sigma Aldrich), 2.5 ㎍/ml 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS)(Sigma Aldrich)를 포함하거나 포함하지 않고 최종 부피 200 ㎕로 96-웰 플레이트(Nunc)에서 배양하였다. 세포는 가습된 공기에서 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 비장 세포 배양 상층액을 수득하고 -70℃에서 보관하였다. 동일한 방법으로 림프절 세포를 ConA를 포함하여 배양하고, 림프절 세포 배양 상층액을 수득하였다.

수득된 혈청, 무릎 추출물, 비장 세포 배양 상층액, 및 림프절 세포 배양 상층액의 사이토카인의 농도를 multiplex cytokine/chemokine kit (Milliplex MAP mouse cytokine/chemokine kit, Millipore)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 사이토카인으로서 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-alpha: TNF)-α, 인터페론(interferon: IFN)-α, 인터루킨(interleukin: IL)-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-17, 케라틴 생성 세포-유래 케모카인(keratinocyte-derived chemokine: KC), 단핵구 화학주성 단백질(monocyte chemotactic protein: MCP)-1, 대식구 염증 단백질(macrophage inflammatory protein: MIP)-2, RANTES(regulated-upon-activation normal T-cell expressed and secreted)를 측정하였다.

혈청 및 무릎 추출물 중 사이토카인의 농도(pg/ml)를 각각 표 2 및 표 3에 나타내고, 타입 II 콜라겐, ConA, 및 LPS의 존재 하에서 배양된 비장 세포 배양액 중 사이토카인의 농도(pg/ml)를 각각 표 4 내지 표 6에 나타내고, ConA의 존재 하에서 배양된 림프절 세포 배양액 중 사이토카인의 농도(pg/ml)를 표 7에 나타내었다.

각 군으로부터 수득된 데이터는 크루스칼 왈리스 검정(Kruskal Wallis test, †: P<0.05) 또는 맨-휘트니 U 검정(Mann Whitney U test)을 이용하여 비교하였다(*: 음성 대조군으로부터 유의성 있는 차이를 표시함(p<0.05)).

혈청	정상군	음성 대조군	hASC 군	CTLA4Ig-hASC 군	MTX 군
IL-6^†	6.08±1.80*	117.00±54.69	45.46±19.75	27.41±9.00	161.10±59.69
TNF-α^†	4.76±0.70*	10.13±0.96	8.16±0.76	7.97±0.88	5.22±1.37
IL-12p70^†	3.05±1.38	123.46±127.26	22.62±17.34	검출되지 않음*	검출되지 않음*
MIP-2^†	98.03±8.50	104.06±7.72	85.80±14.52	70.79±14.33*	17.36±8.79*

무릎 추출물	정상군	음성 대조군	hASC 군	CTLA4Ig-hASC 군	MTX 군
IL-1β^†	7.16±1.93	8.61±2.17	2.98±1.46	1.72±0.84*	4.54±2.88
IL-6	2.72±0.41	16.42±5.88	11.46±6.78	5.64±3.50	19.37±11.87
KC^†	23.66±2.44*	260.33±100.9	127.21±62.81	94.07±42.98	305.82±147.86
MIP-2^†	23.21±2.57	70.17±20.86	14.67±7.81*	5.00±3.15*	50.36±19.78
RANTES^†	1.78±0.10	1.81±0.14	0.66±0.12*	0.28±0.06*	0.20±0.07*

비장-타입 II 콜라겐	음성 대조군	hASC 군	CTLA4Ig-hASC 군	MTX 군
IL-10^†	4.19±1.28	22.98±4.99*	14.41±3.53*	3.75±0.89
IL-17^†	2.09±1.01	1.37±0.61	0.31±0.15*	4.73±2.01
MCP-1^†	418.43±114.45	197.63±41.61	159.24±40.98*	591.43±222.2

비장-ConA	음성 대조군	hASC 군	CTLA4Ig-hASC 군	MTX 군
IL-10^†	93.33±14.66	458.89±58.59*	352.16±42.3*	80.76±23.19
IL-17	968.29±148.82	582.81±212.81	595.95±134.07	1345.14±590.38
IL-1α	23.00±3.13	13.61±3.74	13.92±2.30	21.02±3.77
IL-6	282.31±44.29	156.14±16.09	182.71±19.49	279.78±71.12
KC^†	14.78±1.53	6.80±0.85*	8.52±1.51*	10.78±1.86
MCP-1^†	235.18±46.06	124.30±19.88	114.62±23.29	549.99±220.33

비장-LPS	음성 대조군	hASC 군	CTLA4Ig-hASC 군	MTX 군
IL-1α	98.45±9.69	73.52±8.27	77.31±9.79	112.01±27.82
IL-2^†	7.63±1.47	22.47±2.74*	16.73±3.33*	11.02±3.36
IL-4†	0.60±0.19	3.12±0.25*	1.78±0.37*	0.37±0.24
IL-6†	4396.93±379.32	2933.08±255.77*	3190.74±408.24*	4676.79±1097.10
KC^†	243.19±19.28	143.47±18.02*	164.54±24.14*	199.78±50.25
MCP-1^†	173.25±22.77	72.76±13.79*	104.31±21.29*	250.79±87.01
MIP-2^†	2313.30±177.31	1430.13±174.98*	1591.59±225.99*	2022.27±409.37
RANTES^†	148.05±11.35	98.09±7.65*	107.45±13.43*	128.44±24.46
TNF-α^†	105.96±10.27	72.22±9.25	78.06±11.50	90.65±20.41

림프절-ConA	정상군	음성 대조군	hASC 군	CTLA4Ig-hASC 군	MTX 군
IL-10^†	51.91±23.04	35.19±6.34	94.71±36.96*	62.04±8.31*	23.11±4.08

표 2에 나타난 바와 같이, 혈청 중 IL-12p70과 MIP-2의 농도는 음성 대조군보다 CTLA4Ig-hASC 군과 MTX 군에서 유의성 있게 낮았다. 표 3에 나타난 바와 같이, 무릎 추출물에서 RANTES의 농도는 음성 대조군 보다 hASC 군, CTLA4Ig-hASC 군, 및 MTX 군에서 유의성 있게 낮았고, MIP-2 농도는 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았고, IL-1β의 농도는 음성 대조군 보다 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았다. 표 4에 나타난 바와 같이, 타입 II 콜라겐에 의해 자극된 비장 세포 배양액에서, IL-10의 농도는 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 높았고, IL-17과 MCP-1은 음성 대조군 보다 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았다. 표 5에 나타난 바와 같이, ConA에 의해 자극된 비장 세포 배양액에서, KC의 농도는 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았고, IL-10은 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 높았다. hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 IL-17, IL-1α, IL-6, 및 MCP-1의 농도는 감소하는 경향을 보였다. 표 6에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 자극된 비장 세포 배양액에서, IL-6, KC, MCP-1, 및 RANTES의 농도는 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 낮았고, IL-2와 IL-4는 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 높았다. 그러나, MTX 군은 음성 대조군과 비교하여 사이토카인 농도에 유의성 있는 변화가 나타나지 않았다. 표 7에 나타난 바와 같이, ConA에 의해 자극된 림프절 세포 배양액에서 IL-10의 농도는 음성 대조군 보다 hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군에서 유의성 있게 높았다.

1-7. 조직 병리학적 평가 및 원위 관절의 형태학적 기형 확인

류마티스 관절염에 의한 연골 손상 및 골 손상 정도를 파악하기 위해 무릎 연골 조직을 염색하고, 원위 관절의 형태학적 기형을 확인하기 위해 마이크로-컴퓨터 단층 이미지를 수득하였다.

제1차 면역화 후 13주에 실시예 1-2의 동물로부터 무릎 연골 조직을 수득하고, 수득된 무릎 연골 조직을 10%(v/v) 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin)(Sigma-Aldrich)으로 고정하고 rapid decalcifier(Thermo Scientific)으로 상온에서 24 시간 동안 교반하면서 칼슘을 제거하였다. 골 조직이 면도날로 쉽게 잘리면 칼슘이 완전히 제거된 것으로 간주되었다. 칼슘이 제거된 골 조직을 탈수시키고 파라핀에 포매(embedded)시켰다. 조직 병리학적 손상을 평가하기 위해, 파라핀 포매된 조직을 두께 4 ㎛의 절편으로 절단하고, 자일렌에서 파라핀을 제거하고, 등급 알콜(graded alcohol)로 재수화시키고, 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin: H&E)(DAKO), 및 사프라닌(Safranin) O(IHC world)로 염색하였다. 염색된 결과를 도 4a 및 4B에 나타내었다. 도 4a는 H&E 또는 사프라닌 O로 염색한 무릎 관절 조직의 사진이고(40배 확대, 화살표: 중증 연골 파괴), 도 4b는 연골 손상의 중증도를 0(손상 없음) 내지 4(중증 손상)의 점수로 나타낸 그래프이다.

원위 관절의 형태학적 기형을 확인하기 위해 실시예 1-2에서 수득된 마우스의 발을 4 %(v/v) 포르말린(Sigma-Aldrich)으로 고정하고, 마이크로- CT 스캐너인 Inveon Preclinical CT(Siemens Healthcare)를 사용하여 40 ㎛ 두께, 노출 시간 0.6초, 양성자 에너지 70 keV, 및 전류 400 ㎂로 이미지를 수득하고, IRW 소프트 웨어(Siemens Healthcare)로 3차원 이미지를 재구성하였다.

도 4c는 형태학적 기형의 중증도를 0(기형 없음) 내지 4(중증 기형)의 점수로 나타낸 그래프이다(C: 음성 대조군, H: hASC 군, CT: CTLA4Ig-hASC 군, MTX: MTX 군). 그룹 간 분석은 일원 배치 분산분석(oneway ANalysis Of VAriance: ANOVA) 후 Turkey의 다중 비교 검정을 이용하여 비교하였다. 음성 대조군에 대해 유의성 있는 차이를 "*"로 표시하였다(p<0.05).

도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, hASC 군과 CTLA4Ig-hASC 군의 연골은 관절 연골의 파괴가 감소한 반면에, 음성 대조군과 MTX 군은 중증 연골 손상을 보였다. 반면에 이러한 결과는 혈청 중 혈청 중 C-텔로펩티드 II의 농도의 결과와 일치하였다. 또한, 도 4c에 나타난 바와 같이, 음성 대조군의 12 마리 중 4마리, hASC 군의 12 마리 중 2마리, CTLA4Ig-hASC 군의 13 마리 중 2마리, 및 MTX 군의 7 마리 중 4마리가 원위 관절의 중증 형태학적 기형을 보였다. CTLA4Ig-hASC의 이식이 연골 보호 효과가 크다는 것이 확인되었다.

1-8. 투여된 hASC 의 체내 분포 확인

마우스 꼬리 정맥으로 투여한 줄기 세포가 어느 조직에 분포하는지 확인하기 위해, 실시예 1-2에 기재된 바와 같이 류마티스 관절염이 유도된 마우스(n=3)에 붉은 색 형광 물질인 Cell Tracker™ CM-Dil(Life Technologies)을 제조자의 프로토콜에 따라 표지한 2x10⁶개의 hASC 또는 CTLA4Ig-hASC를 꼬리 정맥으로 투여하였다(면역화 후 제63일, 제70일, 제77일, 및 제84일: 총 4회 실시). 음성 대조군으로 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 같은 부피의 dPBS를 투여하고, 비교군으로서 정상 마우스(n=3)에 CM-Dil로 표지한 2x10⁶개의 hASC를 같은 방법으로 투여하였다.

CM-Dil으로 표지한 줄기 세포를 마우스에 마지막 투여 후 1주일 째 (제1차 면역화 후 13주째) 부검하고, 비장, 림프절, 폐, 간, 신장, 심장, 무릎 관절(대퇴경골 관절)을 수득하였다. 수득된 시료에 Tissue-Tek® optimum cutting temperature(O.C.T.)(Sakura Finetek)를 제조자의 프로토콜에 따라 인큐베이션한 다음, 시료를 -80℃에서 보관하였다.

보관된 비장, 림프절, 폐, 간, 신장, 및 심장 조직을 동결 절편법(frozen section)을 이용하여 조직 절편 시료를 수득하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole: DAPI)을 함유하는 마운팅 메디아(mounting medium)(Vector Laboratories, Inc.)으로 마운팅하였다. 무릎 관절 조직은 4%(w/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde: PFA)(Sigma Aldrich)/인산 완충 식염수(phosphate buffered sailne: PBS)(pH 7.4)로 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 고정하고, 5%(w/v) 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA)(Sigma Aldrich)/PBS(pH 7.4)(Biosesang Inc.)로 4℃에서 약 21일 동안 인큐베이션하여 칼슘을 제거하였다. 칼슘을 제거한 무릎 관절 조직을 10%, 20% 및 30% 수크로스(Sigma Aldrich)/PBS용액에서 순차적으로 4℃에서 각 3시간씩 탈수시키고, O.C.T. 조성물(Sakura Finetek)에 포매시켰다. 조직 절편 시료를 레이저 스캐닝 공초점(confocal) 마이크로스코프 LSM700(Carl Zeiss)를 사용하여 CM-Dil로 표지된 줄기 세포를 관찰하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서 hASC는 비장에서 많이 검출되고 폐, 림프절, 간, 신장, 및 무릎 관절에서 검출되었다. 또한, 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서 CTLA4Ig-hASC는 비장, 림프절, 폐, 간, 신장, 및 무릎 관절에서 검출되었다. 한편, 정상 마우스에서 hASC는 폐에서 많이 검출되었고, 비장과 간에서 검출되었으나, 무릎 관절에서는 검출되지 않았다.

<110> SAM SUNG ELECTRONICS <120> Composition and kit for the prevention or treatment of arthritis, and method for preventing or treating arthritis using the same <130> PN105380 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding human oncostatin M signal peptide <400> 1 atgggggtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatg 75 <210> 2 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding mouse CTLA4 extracellular domain <400> 2 atacaggtga cccaaccttc agtggtgttg gctagcagcc atggtgtcgc cagctttcca 60 tgtgaatatt caccatcaca caacactgat gaggtccggg tgactgtgct gcggcagaca 120 aatgaccaaa tgactgaggt ctgtgccacg acattcacag agaagaatac agtgggcttc 180 ctagattacc ccttctgcag tggtaccttt aatgaaagca gagtgaacct caccatccaa 240 ggactgagag ctgttgacac gggactgtac ctctgcaagg tggaactcat gtacccaccg 300 ccatactttg tgggcatggg caacgggacg cagatttatg tcattgatcc agaaccatgc 360 ccggattctg ac 372 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding hinge-CH2-CH3 region of human immunoglobulin gamma 1 constant region <400> 3 gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc 60 ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg 120 tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat 180 gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc 240 cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa 300 tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 360 ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 420 gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 480 tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca 540 gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga 600 aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc 660 ctctcccact ctcctggtaa atga 684 <210> 4 <211> 1162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target polynucleotide <400> 4 ggatcccacc atgggggtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact 60 cctgtttcca agcatggcga gcatgtctga agccatacag gtgacccaac cttcagtggt 120 gttggctagc agccatggtg tcgccagctt tccatgtgaa tattcaccat cacacaacac 180 tgatgaggtc cgggtgactg tgctgcggca gacaaatgac caaatgactg aggtctgtgc 240 cacgacattc acagagaaga atacagtggg cttcctagat taccccttct gcagtggtac 300 ctttaatgaa agcagagtga acctcaccat ccaaggactg agagctgttg acacgggact 360 gtacctctgc aaggtggaac tcatgtaccc accgccatac tttgtgggca tgggcaacgg 420 gacgcagatt tatgtcattg atccagaacc atgcccggat tctgacgaat tcgtgcccag 480 ggattgtggt tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt 540 ccccccaaag cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt 600 ggtagacatc agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga 660 ggtgcacaca gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt 720 cagtgaactt cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt 780 caacagtgca gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc 840 gaaggctcca caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt 900 cagtctgacc tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg 960 gaatgggcag ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc 1020 ttacttcgtc tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt 1080 cacctgctct gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca 1140 ctctcctggt aaatgactcg ag 1162

Claims

세포독성 T-림프구 항원 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4: CTLA4) 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 CTLA4 또는 이의 단편은 CTLA4 세포외 도메인을 포함하는 것인 약학적 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 CTLA4 세포외 도메인은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 Fc 영역(Fragment crystallizable region)을 포함하는 것인 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 감마 1 불변 영역인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포는 인간 중간엽 줄기 세포인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 중간엽 줄기 세포로부터 분비되는 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에 신호 펩티드와 더 융합된 것인 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 신호 펩티드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것인 약학적 조성물.
CTLA4 또는 이의 단편을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및
중간엽 줄기 세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 키트.
청구항 13에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
청구항 13에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
청구항 13에 있어서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 키트.
CTLA4 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 중간엽 줄기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 투여는 비경구 투여인 것인 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 개체는 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 양, 쥐, 및 원숭이를 포함한 포유동물로부터 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것인 방법.